Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Separarea Cromatografica
Separarea Cromatografica
133
este un schimbător de ioni, iar faza mobilă este apoasă cu pH controlat.
Din punct de vedere constructiv se disting: cromatografia pe coloană şi
cromatografia planară (pe hârtie sau pe strat subţire). In prezent, cromatografia pe
coloană, în una din clasele menţionate anterior reprezintă una dintre cele mai importante
tehnici de investigare a probelor multicomponent în chimia analitică. După cum spune şi
denumirea, rolul central în separarea cromatografică îl are coloana cromatografică, în
care se găseşte faza staţionară.
60
Absorbanta (mAU)
3
55
50 4
45 8
40
35 9
30 7 10
2 11
25 14
20 1
15 56
12
10 13
5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
T im p (m in )
Semnalul cromatografic este numit pic cromatografic, a cărui formă redă de fapt o
imagine a echilibrelor de distribuţie ale moleculelor de analit între faza mobilă şi faza
staţionară, care se petrec în coloana cromatografică. Parametrii matematici ai unui pic
cromatografic ideal (picul 5 din Fig. 9.1, apropiat de forma Gauss) sunt daţi în figura de
mai jos, care la rândul lor sunt utilizaţi la determinarea aşa-numiţilor parametri
cromatografici ai unei separări.[85]
134
15
Semnal
14
13
12
11
Punct de inflexiune
10
9
8 Y0 σ σ
7
6
w1/2
5
4
Y0/2 Linia de bază
3 Y0/10
2 w10%
1
0
7.2 7.3 7.4 7.5 tR 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 min
Fig. 9.2. Parametrii unui pic cromatografic ideal (de formă Gauss).
4( t − t R ) 2
− ⋅ln 2
w1/ 2
Y = Y0 ⋅ e (9.1)
Y0
Y= (9.2)
2( t − t R ) 2
1+ [ ]
w1 / 2
unde, de asemenea: Y0 este înălţimea picului pentru t = tR, iar w1/2 este lăţimea picului la
jumătatea înălţimii (semi-lăţime).[87] Forma celor două funcţii nu diferă foarte mult, aşa
după cum se poate observa din regresiile respective aplicate unui pic real în figura
următoare, prelucrat din cele redate în Fig 9.1.
135
65
Gauss 65 Cauchy
60 60
Semnal
55 55
50 50
Semnal
45 45
40 40
35 35
30 30
25 25
20 20
15 15
10 10
5 5
0 0
4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5
Timp de retentie (min) Timp de retentie (min)
Fig. 9.3. Modelarea unui pic cromatografic real (punctat gros) prin
funcţia Gauss, respectiv prin funcţia Cauchy (linie continuă).
Pentru un pic simetric de tip Gauss, lăţimea acestuia măsurată între punctele de
inflexiune este 2σ. Cum punctele de inflexiune sunt mai dificil de evidenţiat, se preferă a
se măsura lăţimea picului la jumătatea înălţimii acestuia, notată mai sus cu w1/2. Intre w1/2
şi σ exista relaţia simplă:
Aria picului (A) care este o mărime cantitativă, ce depinde de cantitatea de analit
injectată în coloana cromatografică, se obţine din integrarea funcţiei Gauss:[88]
1 π
A= Y0 ⋅ w1 / 2 ⋅ (9.4)
2 ln 2
π
A= Y0 ⋅ w1 / 2 (9.5)
2
136
va integra picul cromatografic. Această situaţie este ilustrată în figura de mai jos, cu
alegerea greşită şi corectă a punctelor de integrare.
Semnal
Pic
cromatografic
de integrat
X Y
Linia medie
de bază
tR (min)
Fig. 9.4. Fereastra unei porţiuni dintr-o cromatogramă în care picul cromatografic
este corect integrat prin alegerea punctelor X şi Y în linia media a semnalului de bază
(ales neconstant – cu drift).
A pic = a + b ⋅ Q injectat
analit (9.6)
A pic,i
Fi = (9.7)
Qinjectat
analit , i
137
Atunci când picul cromatografic creşte ca arie, porţiunea de arie rezultată prin
integrarea mai puţin corectă, ilustrată în figura de mai sus, devine nesemnificativă în
raport cu aria acestuia, astfel că în practică nu se mai măreşte imaginea semnalului de
fond pentru a găsi punctele corecte de integrare.
De foarte multe ori, forma picurilor este asimetrică. In acest caz, alegerea unei
funcţii utile în descrierea formei picului cromatografic este mai dificilă. De regulă,
asimetria se datorează unei aşa-zise cozi („tailing”) a picului cromatografic, care poate fi
în faţa picului („pre-tailing”) sau în spatele picului (post-tailing”).[89]
Simetria unui pic cromatografic (notată cu Sim) poate fi exprimată în mai multe
moduri. Dacă aceasta se măsoară în punctele de inflexiune a curbei picului redat în Fig.
9.2, Sim devine:
σ'
Sim = (9.8)
σ
Simetria poate fi măsurată mai exact la jumătatea înălţimii picului cromatografic, atunci
când w1/2 este împărţită de verticala din maximul picului în două părţi: B în partea dreaptă
şi C în partea stângă. In acest caz simetria devine:
B
Sim = (9.9)
C
B
Sim = 10% (9.10)
C10%
t 'R = t R − t 0 (9.11)
t −t t'
k' = R 0 = R (9.12)
t0 t0
138
Din punct de vedere practic, minimul separării cromatografice a doi compuşi
injectaţi (notaţi în ordinea eluţiei crescătoare cu i şi j) în coloana cromatografică se obţine
atunci când picurile lor cromatografice ajung în semnalul liniei de bază. Gradul de
separare cromatografică este exprimată prin rezoluţia cromatografică (Rs). Pentru picuri
simetrice formula de calcul a acestui parametru este dată de expresia:
( t R , j − t R ,i ) ( t R , j − t R ,i )
Rs = = 2⋅ (9.13)
0,5 ⋅ ( w i + w j ) ( w1 + w 2 )
In felul acesta se poate deduce că minimul lui Rs pentru ca cele două picuri
cromatografice i şi j să fie separare în linia de bază este 1. Dacă picurile nu sunt
separate, măsurarea pentru wi şi wj nu poate avea loc. Ţinând cont că: wi = 2·w1/2,i şi wj =
2·w1/2,j, formula rezoluţiei devine:
t R , j − t R ,i
Rs = (9.14)
w 1 / 2, i + w 1 / 2, j
t 'R , j k' j
α ij = = ≥1 (9.15)
t 'R , i k 'i
t R ,i 2
Ni = ( ) (9.16)
σi
t R ,i
N i = 5,54 ⋅ ( )2 (9.17)
w 1 / 2, i
139
N k 'i
Rs = ⋅ ⋅ (α ij − 1) (9.18)
4,7 k 'i +1
Ecuaţia de bază pentru rezoluţia între 2 picuri cromatografice inegale ca arie, notate cu i
şi j poate fi propusă prin modificarea celei de mai sus, în forma:
N k'
Rs = ⋅ ⋅ (α ij − 1) (9.19)
4,7 k '+1
, unde k ' este media aritmetică a celor doi factori de capacitate pentru analiţii i şi j, k’i şi
respectiv k’j. Cu aceste precizări, rezoluţia dintre cele două picuri cromatografice devine:
k 'i + k ' j
Maximul raportului este 1, atunci când k’i şi k’j sunt foarte mari. Pe de altă parte,
k 'i + k ' j +2
pentru k’ mare, picurile cromatografice devin foarte largi, cu timp de retenţie foarte mare,
uneori greu de integrat. De aceea, valoarea lui k’ între 1 şi 20 este considerată ca
acceptabilă.
Aceasta teorie este una dintre cele mai importante teorii în modelarea procesului
cromatografic, iniţiată de Martin şi Singh şi apoi dezvoltată de Said.[91] Teoria talerelor
descrie practic curba de eluţie (cromatograma) unui anumit compus chimic. Această
teorie propune că un analit participant la un proces cromatografic participă la un echilibru
de repartiţie (distribuţie) între faza mobilă şi faza staţionară, pe o porţiune mai mult sau
mai puţin îngustă din coloana cromatografică. Această imagine (modelare) conduce
imediat la o conexiune cu teoria distilării, care consideră că o coloană este structurată
într-un număr de celule sau talere, numite în cazul procesului cromatografic talere
teoretice. Fiecare taler are o lungime finită, în care analitul se găseşte (staţionează) un
anumit interval de timp. Cu cât un taler are dimensiunea mai mică, cu atât mai eficient
este procesul de partiţie al analitului între cele două faze; cu micşorarea dimensiunii unui
taler, numărul acestora atribuit unei coloane cromatografice creşte. Ca urmare, numărul
de talere teoretice atribuit unei coloane cromatografice a fost identificat cu eficienţa
coloanei.
Teoria talerelor arată că lăţimea unui pic cromatografic (dispersia unui pic
cromatografic) este invers proporţională cu rădăcina pătrată a eficienţei, sau altfel spus:
cu cât eficienţa este mai mare, cu atât picul cromatografic este mai îngust.
Pentru aceasta să considerăm echilibrul de repartiţie cromatografică a unui analit
X, între o fază mobilă (notată cu indicele m) şi o fază staţionară (s):
Xm →
← Xs (9.21)
140
Acest echilibru este caracterizat de constanta respectivă de echilibru (K), dată de ecuaţia:
[ X]s
K= (9.22)
[X]m
Prin [X] este notată concentraţia analitului X în faza staţionară sau mobilă indicată prin
indicele respectiv. Prin diferenţierea ecuaţiei 9.22 se va obţine următoarea relaţie:
Teoria talerelor îşi propune să stabilească o relaţie între concentraţia analitului X în faza
mobilă după parcurgerea a n talere din coloana cromatografică. Pentru aceasta să
considerăm 3 talere „teoretice” consecutive, notate cu (p – 1), p şi (p + 1), iar parametrii
eluţiei cromatografice în aceste talere redaţi în Fig. 9.5.
Prin dv se notează variaţia de volum de faza mobilă ce trece din talerul (p – 1) în talerul
p, iar dm reprezintă variaţia de masă de analit din talerul p. Variaţia dm reprezintă
diferenţa de masă de analit X, atunci când volumul dv de fază mobilă iese din talerul (p –
1) şi intră în talerul p. In acest caz se poate scrie:
141
d[X]m, p [X]m, p −1 − [X]m, p
= (9.27)
dv v m + vs K
Numitorul din această ecuaţie este definit ca volumul talerului şi este notat cu vt. Numărul
de talere (ν) din coloana cromatografică având volumul V devine:
V V
ν= = (9.28)
v t v m + K ⋅ vs
dV
dν = (9.29)
v m + K ⋅ vs
d[X ] m,p
= [X ] m,p−1 − [ X] m,p (9.30)
dν
[X]0 ⋅ e − ν ⋅ ν p
[ X ]m , p = (9.31)
p!
L
H= (9.32)
N
Înălţimea redusă a talerului teoretic este dat de raportul H/dp, unde dp este
diametrul particulelor fazei staţionare.
Teoria talerelor redă din punct de vedere cantitativ o imagine asupra proceselor
care au loc în coloană şi exprimă calitatea unei coloane prin numărul de talere teoretice
142
atribuite procesului cromatografic pentru un anumit analit injectat în coloană. Cu toate
acestea, această teorie nu redă şi o explicaţie asupra mecanismelor şi fenomenelor care
stau la baza echilibrelor de distribuţie ale analiţilor între faza mobilă şi faza staţionară.
Teoria dispersiei frontului de analit în coloana cromatografică studiază
fenomenele care au loc la transferul probei în coloana cromatografică. Aceasta se
bazează pe viteza fazei mobile şi a parametrilor procesului, precum viteza transferului de
masă între cele două faze participante la procesul cromatografic, viteza de difuziune a
moleculelor de analit (solut) de-a lungul coloanei şi hidrodinamica fazei mobile. O
reprezentare a acestui fenomen este redată în figura următoare.
Fig. 9.6. Reprezentarea lărgirii frontului de analit la trecerea prin coloana cromatografică.
σ = l⋅ n (9.33)
Această relaţie simplă arată că împrăştierea zonei este proporţională cu lungimea porilor
şi rădăcina pătrată a numărului acestora.
Din teoria statistică se ştie că deviaţia standard nu este o mărime aditivă, în cazul
influenţei mai multor factori. In schimb, pătratul deviaţiei standard este aditiv şi este
demonstrat de teoria propagării erorilor (vezi cap. 1.5):
σ 2 = ∑ σ i2 (9.34)
i
143
, unde σi reprezintă deviaţia standard pentru fiecare din cele 3 procese discutate ca
influenţând lărgirea zonei moleculelor de analit.
Termenul procesului de difuziune obişnuită (σd) este definit prin ecuaţia de
difuziune a lui Einstein:
σ d2 = 2 ⋅ D ⋅ t (9.35)
L
t= (9.36)
u
2⋅D⋅L
σ d2 = (9.37)
u
L
n= (9.38)
dp
Deviaţia standard atribuită acestui proces (σE) poate fi derivată din ec. 9.33:
L 1/ 2
σE = dp ⋅ ( ) = (L ⋅ d p )1 / 2 (9.39)
dp
144
viteză de deplasare 0. Astfel, moleculele de solut se deplasează în faţă sau în spatele
zonei centrale la fiecare transfer între faze. Intervalul de timp necesar zonei solutului să
se deplaseze prin coloana de lungime L la o viteză δu este:
L
t= (9.40)
δ⋅u
Intervalul de timp în care fracţia (1 - δ) de molecule se găseşte în faza staţionară va fi:
(1 − δ) ⋅ L
t= (9.41)
δ⋅u
Numărul de desorbţii (ndes) care au loc în acest interval de timp va fi dat de intervalul de
timp, dat de relaţia 9.41, împărţit la 1/k2:
(1 − δ) ⋅ L 1
n des = ⋅ (9.42)
δ⋅u k2
2 ⋅ (1 − δ) ⋅ L 1
n des = ⋅ (9.43)
δ⋅u k2
In intervalul de timp în care o moleculă de solut este în faza staţionară, zona centrală a
frontului solutului se deplasează în faţă cu lungimea de δ⋅u/k2. Folosind ec. 9.33 prin
substituţia lui l cu δ⋅u/k2 şi n cu expresia de mai sus, se va obţine deviaţia standard (σk)
caracteristică procesului de transfer de masă între cele două faze (contribuţia de ne-
echilibru):
2 ⋅ δ ⋅ (1 − δ) ⋅ L ⋅ u 1 / 2
σk = [ ] (9.44)
k2
Această ecuaţie arată că prin creşterea vitezei de curgere u (imprimată de faza mobilă),
efectele de ne-echilibru cresc, măsura acestei creşteri fiind dată de σk.
Introducând expresiile lui σd, σE şi σk în rel. 9.34 se obţine expresia:
2 ⋅ δ ⋅ (1 − δ) 1
σ 2 = L ⋅ [d p + ⋅ u + 2D ⋅ ] (9.45)
k2 u
σ2
H= (9.46)
L
145
2 ⋅ δ ⋅ (1 − δ) 1
H = dp + ⋅ u + 2D ⋅ (9.47)
k2 u
Minimul înălţimii talerului, Hmin, se stabileşte din condiţia dH/du = 0 şi conduce la expresia
vitezei fazei mobile pentru care valoarea înălţimii talerului teoretic este minimă:
k 2 ⋅ D 1/ 2
u =[ ] (9.48)
δ ⋅ (1 − δ)
Ecuaţia 9.47 este cunoscută ca ecuaţia van Deemter şi scrisă în forma simplificată:
B
H=A+ + C⋅u (9.49)
u
Hmin
uoptim u (cm/s)
Reprezentarea grafică a acestei ecuaţii este dată în figura de mai sus. Din
această dependenţă a înălţimii talerului teoretic (H) determinat din mărimi ale separării
cromatografice funcţie de viteza fazei mobile (u) se stabileşte valoarea optimă uoptim
pentru care H este minim, şi prin urmare separarea are o eficienţă maximă.
146
definiţia de mai sus:
, în care:
ni,s – numărul de moli de analit i din faza staţionară;
ni,m – numărul de moli de analit i din faza mobilă;
Vf.s. – volumul fazei staţionare din coloana cromatografică;
Vf.m. – volumul fazei mobile din coloana cromatografică;
ϕ - raportul de volume al celor două faze (Vf.s./Vf.m.);
Ki – constanta de echilibru a partiţie analitului i între faza mobilă şi faza
staţionară.
Din punct de vedere termodinamic trebuie ţinut cont de relaţia generală a
constantei de echilibru Ki:
ΔG 0
−
Ki = e RT (9.51)
0
ΔG reprezintă variaţia de entalpie liberă standard Gibbs pentru transferul speciei i din
faza mobilă în faza staţionară şi la rândul său poate fi scrisă în funcţie de variaţie de
entalpie standard (ΔH0) şi variaţia de entropie standard (ΔS0):
ΔG 0 = ΔH 0 − T ⋅ ΔS0 (9.52)
Prin introducerea lui Ki şi ΔG0 în ecuaţia 9.51, urmată de logaritmare rezultă ecuaţia
fundamentală în cromatografie, ce descrie dependenţa factorului de capacitate de
temperatura la care are loc procesul de retenţie cromatografică (temperatura din coloana
cromatografică):
ΔS0 ΔH 0 1
ln k 'i = ln φ + − ⋅ (9.53)
R R T
Prin urmare, factorul de capacitate scade prin creşterea temperaturii coloanei
cromatografice. Dependenţa valorii ln k’ este lineară în raport cu inversul temperaturii
absolute, iar ecuaţia de mai sus este cunoscută în literatura de specialitate din domeniu
ca ecuaţia van’t Hoff. Din regresia ln k’ ~ 1/T se poate stabili variaţia de entalpie standard
ΔH0 din panta dreptei, iar din intersecţia cu ordonata (T → ∞) se poate determina cu o
bună aproximaţie (cunoscând parametrul constructiv ϕ) valoarea variaţiei de entropie
standard ΔS0 a procesului de transfer al analitului din faza mobilă în faza staţionară.
147