Modelo matemtico del crecimiento de bacterias

CONCEPTO Y EXPRESIN MATEMTICA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO. Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un nico microorganismo (ciclo celular) sino al demogrfico de una poblacin. En este tema nos centraremos en el crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir tambin para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. El crecimiento de los virus se produce de otra forma diferente y ser tratado al final de este captulo. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria considerada de forma aislada. A lo largo del ciclo celular, tiene lugar la replicacin del material de la bacteria, la sntesis de sus componentes celulares, el crecimiento para alcanzar un tamao doble del inicial y su divisin por biparticin de la bacteria para dar lugar a dos clulas hijas. La duracin del ciclo celular coincide con el tiempo de generacin y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de todos sus individuos. Este crecimiento suele ser asincrnico puesto que cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en una poblacin se encuentran clulas que acaban de dividirse, otras que estn replicando su ADN y elongndose, otras que estn iniciando la divisin celular, etc. En un crecimiento sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrnicos son muy difciles de mantener por lo que su importancia est principalmente ligada a los estudios bsicos de biologa microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento prximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronizacin del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrnicas. Las poblaciones de bacterias pueden crecer de una forma explosiva acumulando grandes nmeros en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto nocivo (infecciones o intoxicaciones) de los microorganismos depende de su nmero en la mayora de los casos, entender cmo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir dichos efectos nocivos. Se denomina crecimiento equilibrado a aqul en el que todos la biomasa, nmero de clulas, cantidad de protenas, de ADN, etc., evolucionan en paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en condiciones naturales.

Por tanto, es principalmente un concepto de aplicacin en el laboratorio. Sin embargo, es til porque permite estudiar el crecimiento de microorganismos. Las bacterias crecen siguiendo una progresin geomtrica en la que el nmero de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de generacin (). De esta forma, podemos calcular el nmero de bacterias (N) al cabo de un nmero de generaciones (n) usando la ecuacin siguiente: N = N0 2n siendo N0 el nmero de clulas en el momento actual. El nmero de generaciones se puede calcular de la siguiente forma: n=t/ donde t es el tiempo transcurrido. Los tiempos de generacin de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de de 20 min). Esto lleva a que una nica clula (N0 = 1) creciendo con un = 20 min, llegue a poder producir 4.7 x 1021 clulas en 24 horas. Si la bacteria crece en un medio lquido, las clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente en la mayora de los casos formando una suspensin de clulas libres. Cuando una clula aislada comienza a crecer sobre un substrato slido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula viva y aislada que se encuentra en un substrato y en condiciones ambientales adecuadas y produce una colonia en un breve lapso de tiempo. Una UFC tambin puede corresponder a ms de una clula cuando stas forman parte de grupos unidos fuertemente (estreptococos o diplococos, por ejemplo) ya que cada grupo formar una sola colonia. Cuando algunos tipos de bacterias o de levaduras patgenas crecen sobre superficies forman biopelcuas (biofilms) en los que las clulas se asocian entre s mediante capas de polisacridos que forman una pelcula que recubre la superficie sobre la que se encuentran las clulas. Los biofilms son muy importantes porque los microorganismos que los forman resultan ms resistentes a antibiticos y al ataque de clulas del sistema inmune y, por consiguiente, las infecciones que producen son ms difciles de tratar. La presencia de biopelculas es un problema serio en los implantes ortopdicos, catteres, etc. El sarro de los dientes es un ejemplo de biofilm. CONCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMO.

Desde el punto de vista microbiolgico, un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. El fundamento de esta definicin es que si un microorganismo ha perdido la capacidad de dividirse no podr formar una colonia sobre un medio de cultivo y no ser posible detectar su presencia por los mtodos microbiolgicos tradicionales. Es decir: cuando no se produce aumento en el nmero de microorganismos no hay crecimiento. Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiolgico y continuar desarrollando una actividad metablica que se traduzca, por ejemplo, en liberacin de toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacin (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones fsicas o qumicas del entorno. En estos casos, podramos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables. QU NECESITA UN MICROORGANISMO PARA CRECER? El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias produce un gran nmero a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de tiempo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia de individuos iguales. Para crecer, un microorganismo necesita nutrientes que le aporten energa y elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en:

autotrofos: si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) heterotrofos si utilizan carbono orgnico.

Los microorganismos de importancia clnica son todos ellos hetertrofos. La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%) y debe estar disponible, normalmente, en forma de NH4 o de aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; fsforo (3%) y debe estar en forma de PO43-, azufre que representa en torno al 1% y procede de aminocidos sulfurados o de SO42-; y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.

La elaboracin de medios de cultivo que permitan aislar microorganismos a fin de iniciar posteriores cultivos puros requiere proporcionar los nutrientes antes citados y, en ciertos casos, algunos aminocidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicin qumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o bien slidos si se aade algn agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar). En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser:

selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar colonias de microorganismos hemolticos) selectivo-diferenciales cuando combinan las dos caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una poblacin mixta de gran tamao.

DETECCIN Y MEDIDA DEL CRECIMIENTO Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos; los principales son: recuento directo, medida de la masa de las clulas, recuento d viables, medida del nmero de partculas, medida de parmetros bioqumicos y medida de la actividad metablica.

Recuento directo: consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy pequeos de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cmaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de clulas sea del orden de 105 por ml. Medida de la masa de clulas: el sistema se basa en que las clulas en suspensin dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en suspensin y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parmetro de medida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de clulas debe ser del orden de 105 por ml. Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo slido adecuado para estimar el nmero de

viables contando el nmero de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una UFC. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadstico, es necesario contar ms de 300 UFC. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, stos se pueden recolectar por filtracin a travs de una membrana (de 0.2 m de tamao de poro) y posterior colocacin de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias.

Medida del nmero de partculas usando contadores electrnicos de partculas. Estos sistemas no nos indican si las partculas corresponden a clulas vivas o muertas; pero nos pueden dar una idea del tamao de las partculas. Medida de parmetros bioqumicos tales como la cantidad de ADN, ARN, protenas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen. Medida de actividad metablica de las bacterias como que respiran producen una disminucin del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a oxidacin-reduccin tales como el azul de metileno).

CICLO DE CRECIMIENTO DE POBLACIONES. En un cultivo bacteriano en medio lquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano:

Fase lag o de adaptacin: Durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (de abundancia de nutrientes) para poder iniciar el crecimiento exponencial. Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen los nutrientes del medio a velocidad mxima. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica con el modelo matemtico descrito anteriormente. Esta fase corresponde a la de infeccin y multiplicacin dentro del organismo del agente infeccioso. Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase de exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia en el curso de las infecciones o intoxicaciones producidas por bacterias.

Los microorganismos entran en fase estacionaria bien porque se agota algn nutriente esencial del medio, porque los productos de desecho que han liberado durante la fase de crecimiento exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano o por la presencia de competidores u otras clulas que limiten su crecimiento. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en muchos ambientes naturales.

Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo.

Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los medios lquidos se presentan tambin en los slidos. La cintica de crecimiento, en este caso, slo se puede seguir utilizando unos sistemas de deteccin especiales siendo el ms sencillo, la medida del nmero de clulas viables por unidad de superficie o por unidad de masa. FACTORES FSICOS Y QUMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO BACTERIANO.

Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento en funcin de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de la cual no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura ptima a la que la velocidad es mxima. Por encima de esta temperatura ptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.

El aumento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas con la temperatura. Se denomina

coeficiente de temperatura a la relacin entre el incremento de la velocidad de reaccin y el de temperatura. En trminos generales, la velocidad de las reacciones bioqumicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10C la temperatura a la que tienen lugar. La falta de crecimiento a temperaturas bajas se debe a la reduccin de la velocidad de las reacciones bioqumicas y al cambio de estado de los lpidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de protenas y a las alteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular es lento y las clulas paran de crecer; aunque suelen morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la ptima, se produce la muerte celular rpidamente y las clulas no pueden recuperar su capacidad de divisin si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fro.

Curva del Crecimiento Bacteriano. La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representacin grfica de la determinacin peridica del nmero de clulas viables por mililitro que existen en un lquido inoculado con clulas microbianas provenientes de un cultivo que ha crecido previamente hasta la saturacin. Dicha curva se divide en seis fases, como se representa en la figura, mismas que se simbolizan con letras de la A a la F. A continuacin tambin se muestra un cuadro con las caractersticas principales de cada fase y se desarrollan las fases ms relevantes. Parte de la Curva A B C D E F A : Fase de Rezago. Este periodo consiste en la adaptacin de las clulas microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las clulas microbianas se envuentran empobrecidas en cuanto a metabolitos y enzimas, esto debido a las condiciones desfavorables que representaba el cultivo previo. Por lo anterior, en este lapso de tiempo se forman las enzimas y los metabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento. Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan diferentes que las clulas sean genticamente incapaces de sobrevivir, por lo que slo unas cuantas mutantes podrn subsistir, y obviamente se requerir ms tiempo para que stas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de clulas. C : Fase Exponencial. Como el nombre lo indica, en esta fase las clulas se encuentran en un estado de crecimiento sostenido. Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante, pero ste material es en s cataltico y la masa aumenta de manera exponencial. Lo anterior continua hasta que uno o ms nutrimentos se agoten, o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos txicos que se inhiba el crecimiento. El nutrimento limitante para los organismos aerobios suele ser el oxgeno : cuando la concentracin bacteriana es de aproximadamente 1 x 107 / ml es Rezago Aceleracin Exponencial De retraso Estacionaria mxima Declinacin Fase Tasa de Crecimiento. Cero Creciente Constante Decreciente Cero Negativa (muerte)

necesario incrementar el ingreso de oxgeno mediante agitacin o burbujeo ; pero cuando la concentracin alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por ml, la tasa de difusin de oxgeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente. Durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las clulas (medida en gramos de biomasa producida por hora), cuando el crecimiento no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la constante de la tasa de crecimiento (k) por la concentracin de biomasa. La constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cul las clulas producen ms clulas, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de biomasa producidos por cada gramo de biomasa preexistente creados en una hora. El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa exponencialmente con respecto al tiempo. De lo anterior se deriva que, si graficamos el logaritmo de la concentracin de la biomasa (o celular) en funcin del tiempo, como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos una lnea recta como representacin de esta fase. Esta fase puede prolongarse indefinidamente si las clulas se transfieren repetidamente a un medio nuevo (fresco) de composicin idntica al anterior, lo cual se logra de manera automtica mediante dos aparatos : el quimiostato y el turbidostato. E : Fase Estacionaria Mxima. Como se explic en la descripcin de la fase anterior, ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulacin de metabolitos txicos el crecimiento cesa por completo despus de un periodo de decrecimiento en la tasa de crecimiento, lo cual corresponde a la fase D o de retraso. No obstante, por lo general en esta fase se puede observar recambio celular, lo cual se debe a que, aunque existe una prdida lenta de clulas por muerte, dicha prdida se compensa exactamente por la formacin de nuevas clulas a travs de crecimiento y divisn. As, la cifra de clulas viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteo aumente poco a poco el nmero de clulas, si se cuentan tambin las muertas. Para comprender lo anterior debemos considerar que, para una clula microbiana, muerte significa la prdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cul se comprueba cuando una clula es incapaz de producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva que designar a una clula microbiana como muerta no implica su destruccin fsica. La duracin de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio. F : Fase de Declinacin.

Esta fase, tambin conocida como fase de muerte, representa el decremento de clulas debido al aumento progresivo de la tasa de mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido. Por lo general, una vez que la mayora de las clulas ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un nmero pequeo de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o aos. Dicha persistencia puede deberse a que las clulas consiguen crecer gracias a los nutrimientos liberados por las clulas que mueren y se lisan, observndose recambio celular. Bibliografa.

Brooks, et. al., Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 16a ed., Manual Moderno, Mxico, 1999.