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Similar ecuacin de equilibrio se puede escribir para el agua H2O ------- H+ + OHsiendo la Ka = [H+] [OH-] , despejando Ka y considerando que [H2O] en agua Pura [H2O] es constante, tenemos que Ka [H2O] = Kw = [H+] [OH-] = 10-14 Siendo Kw = producto inico del agua, de acuerdo al cul en toda solucin acuosa se cumple que [H+] [OH-] = 10-14 A partir del producto inico del agua se pueden derivar los conceptos de pH y la escala de pH. As, tomando logaritmos negativos de Kw = [H+] [OH-] = 10-14 nos da lo siguiente -log Kw = -log H + -log OH- = -log 10-14, si -log = p, Entonces pKw = pH + pOH.
El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la informacin contenida. Cualquier reproduccin de parte o totalidad de la informacin, por cualquier medio, existir la obligacin de citar que su fuente es "Universidad Santo Toms" con indicacin La Universidad se reserva el derecho a cambiar estos trminos y condiciones de la informacin en cualquier momento.
Tenemos entonces que: pH = -log [H+] o log 1/ [H+], pOH = -log [OH-] y pH + pOH = 14. Este valor de pKw determina una escala de pH que va de 0 ([H+] =10) a 14 ([H+] = 10-14). Se hace notar que la escala de pH es una escala de acidez, tal como el pH es una medida de acidez. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. Calcular la [H+], la [OH-], el pH y el pOH de una solucin de HNO3 Calcular la [H+] de una muestra de a) plasma pH 7.4 Calcular el pH de una solucin de cido actico 0.02 M Una solucin 0.15 M de cido ascrbico (vitamina C) Calcular su Ka. tiene un pH = 5.4. b) orina pH 5.2
Los glbulos rojos de un individuo en condiciones normales producen aproximadamente 0.35 moles de cido lctico al da. Asumiendo un volumen sanguneo (volemia) de 5 litros y que el cido lctico se acumula en la sangre determine el cambio de pH sanguneo producido en un da. Calcular el pH de 100 ml de cido clorhdrico 0.1 M al cul se adicionan 20 ml de NaOH 0.1 M En la titulacin de una muestra de 10 ml de jugo gstrico se gastaron 0.7 ml de NaOH 0.1 M. Cul es el pH de la muestra de jugo gstrico? Busque informacin con respecto a lo que se entiende por acidez valorable o titulable y acidez real. En base a esa informacin explique que significa que una muestra de orina de pH = 5.5, tenga una acidez valorable de fosfato igual a 6 mmol de NaOH.
6. 7. 8.
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pH = pKa + log
La Capacidad Amortiguadora () es una medida de la resistencia a los cambios de pH de una solucin amortiguadora cuando un cido o una base son agregados a sta. Este parmetro es expresado como los moles de cido o base necesarios para cambiar el pH de un litro de una solucin reguladora en una unidad. Mientras ms grande el valor de , mayor la resistencia de la solucin amortiguadora a cambios de pH.
En este laboratorio, la ecuacin de Henderson Hasselbalch ser usada para determinar la cantidad del par base conjugada cido dbil necesario para producir un una solucin amortiguada a pH fisiolgico. OBJETIVOS: Conocer el funcionamiento y preparacin de soluciones reguladoras. Determinar la capacidad reguladora de una solucin tampn.
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Procedimiento Preparacin de solucin reguladora. 1. En base a los siguientes equilibrios cido-base determine que sistema cido dbil base conjugada considerara para preparar una solucin amortiguadora que presente un pH aproximado de 7,40.
H 3PO 4 (ac) H + (ac) + H 2 PO 4 - (ac) K a1 = 7,5 x10 3 ; pK a1 = 2,12 H 2 PO 4 - (ac) H + (ac) + HPO 4 - 2 (ac) K a2 = 6,2x10 -8 ; pK a2 = 7,21 HPO 4 - (ac) H + (ac) + PO 4 -3 (ac)
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2. Calcular la razn [base conjugada]/[cido dbil] empleando la ecuacin de Henderson Hasselbalch. Calcular la cantidad de base conjugada necesarios para preparar 250 mL de buffer, conociendo la concentracin del cido dbil: Grupo I. 0,1 M de cido dbil. Grupo II. 0,5 M de cido dbil Grupo III. 1,0 M de cido dbil 3. Chequear resultados con el profesor. 4. Preparar solucin amortiguadora. Determinacin de capacidad amortiguadora 1. Calibrar pH-metro. Seguir instrucciones del profesor para calibrar y limpiar pH-metro. 2. Medir pH de solucin amortiguadora preparada. 3. Llenar una bureta de 50 mL con solucin amortiguadora y otra bureta de 50 mL con solucin estandarizada de NaOH ( 0,1 M) 4. Transferir 50 mL de solucin amortiguadora en un vaso de precipitado de 250 mL. 5. Adicionar alcuotas de solucin de NaOH (10 mL) a la solucin reguladora. Despus de cada adicin, anotar el volumen de NaOH adicionado y el pH de la solucin. Completar Tabla I. 6. Continuar hasta adicionar 100 mL de solucin de NaOH. 7. Completar Tabla II. 8. Graficar pH versus moles de NaOH adicionados. 9. Calcular el pH terico de cada solucin empleando la ecuacin de Henderson Hasselbalch, y compararlos con los valores experimentales.
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Tabla I
pH
Tabla II V. Buffer (L) V. NaOH (L) Moles NaOH Cambio de pH (pH) Capacidad Reguladora,
Referencias Qumica. R. Chang. Sptima Edicin. Editorial Mc.Graw-Hill. 2002. Quantitative Chemical Analysis. D. Harris. Fifth Edition. Freeman and Company. 1998.
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OBJETIVOS Una vez desarrollada esta actividad prctica los alumnos conocern algunos mtodos de reconocimiento de las protenas y sus fundamentos tericos ACTIVIDADES 1. Reconocimiento de protenas plasmticas El plasma sanguneo tiene un contenido de protenas de aproximadamente 7 g /100 ml (g/dl), de los cuales aproximadamente 4 g corresponden a albmina y el resto est constituido por anticuerpos, factores de coagulacin, apoprotenas de las lipoprotenas, enzimas proteicas, etc. Este contenido de protenas puede variar de acuerdo a las condiciones nutricionales o el estado de salud del individuo. a) Reconocimiento por absorbancia a 280 nm de luz ultravioleta (UV). Las protenas absorben luz ultravioleta a 280 nm, longuitud de onda a la que absorben los aminocidos aromticos (triptofano, tirosina y fenilalanina) de las protenas, especialmente el grupo indol de triptofano. Esta propiedad se puede aprovechar para reconocer la presencia de protenas En esta actividad se utilizar plasma (u ovoalbmina) diluido 1: 20 con suero fisiolgico (NaCl 0.9 % p/v), una solucin de seroalbmina de bovino (SAB) 5 mg/ml y una solucin de NaCl 0.9 % p/v, segn el cuadro siguiente Tubos Na Cl 0,9 % p/v SAB 5mg / ml Plasma diluido 1 3 ml 2 3 ml 3 3 ml -
Leer en el espectrofotmetro a 280 nm (UV) en cubetas de cuarzo. (El vidrio detiene la luz UV). Comparar resultados y discutir la utilizacin de tubos con SAB y con la solucin de NaCl.
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b.- Reconocimiento de protenas con el reactivo de Biuret (mtodo colorimtrico) Este mtodo se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el in Cu++ del reactivo y los nitrgenos amdicos del enlace peptdico. Por lo tanto este reactivo reconoce especficamente la presencia de enlaces peptdicos. Se utiliza como blanco el reactivo de Biuret a la misma concentracin de los tubos muestra y estndar. Preparar los siguientes tubos.
Tubos 1 2 3 NaCl 0,9 % p/v 1ml 1ml 2 ml SAB 5 mg/ml 1 ml Plasma diludo 1 ml Reactivo de Biuret 4 ml 4ml 4ml Mezclar bien, sin agitar, y leer despus de 30 minutos a 540 nm (luz visible) en cubetas de vidrio. Como alternativa se puede calentar a 50C en bao de agua por 5 minutos para desarrollar color y leer despus de enfriar en corriente de agua. Discuta sus resultados e identifique en el procedimiento los tubos con muestra y estndar Compare y discuta los resultados obtenidos con ambos mtodos (UV y colorimtrico) Reactivos y Soluciones 1. 2. 3. 4. Reactivo de Biuret Solucin NaCl 0.9 % p/v Plasma diluido 1 : 20 v/v con NaCl 0.9 % p/v Solucin estndar de seroalbmina de Bovino (SAB) 5 mg / ml en NaCl 0.9 % p/v
Equipo y materiales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Espectrofotmetro UV- Visible Cubetas de cuarzo y de vidrio Tubos de ensayo de 10 ml y gradillas Matraces Erlermeyer de 100 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Bao de agua a 50C Balanza analtica
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Tubos NaCl 0.9% p/v SAB 100ug/m Plasma diluido Reactivo de Biuret
Mezclar bien, sin agitar y leer despus de 30 minutos a 540 nm en cubetas de vidrio. Se puede calentar en bao a 50C por 5 minutos y leer despus de enfriar en agua corriente. Determinar el contenido de protenas de la muestra a partir de la curva estndar y a partir de la DO promedio calculada por mg de estndar. Compare y discuta sus resultados. Calcule la concentracin total de protenas del plasma en mg/dl. Cmo determinara usted la concentracin de hemoglobina de una muestra de sangre? Infrmese al respecto. Reactivos y Soluciones 1. 2. 3. 4. Reactivo de Biuret Solucin NaCl 0.9 % p/v Plasma diluido 1 : 20 v/v con NaCl 0.9 % p/v Solucin estndar de seroalbmina de Bovino (SAB) 5 mg / ml en NaCl 0.9 % p/v
Equipo y materiales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Espectrofotmetro UV- Visible Cubetas de cuarzo y de vidrio Tubos de ensayo de 10 ml y gradillas Matraces erlermeyer de 100 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Bao de agua a 50C Balanza analtica
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c) A un pH igual al pHi la carga neta de la lisina es 0. Determine cul es este pH y escriba la estructura inica correspondiente. Nota: para los ejercicios 1, 2 y 3 utilice los valores de pK de la tabla al final de la gua. 2. a) Escriba la estructura completa de los siguientes pptidos i. -glu- cis - gli ii. leu - met ala iii. fen - tir - arg - trip b) A qu polo migrar cada pptido en una electroforesis a pH 7.0? 3. Dada la siguiente secuencia de aminocidos pK=9.5 H O H O H O +H3N - C - C - N - C - C - N - C - C - OCH2 H (CH2)3 H H NH C NH2 NH2 pK= 12.5 a) Cuntos aminocidos estn representados? b) Encierre en un recuadro los enlaces peptdicos c) Cul ser la carga neta de esta molcula a pH 7.0? 4. Que entiende por: a) b) c) d) Estructura primaria Estructura secundaria Estructura terciaria Estructura cuaternaria de una protena pK=2.4
Indique en cada caso el (los) tipo (s) de enlace qumico que estabilizan la estructura correspondiente y entre que grupos qumicos se producen. 5. a) Qu aminocidos favorecen y cuales interrumpen la estructura de alfa hlice? b) Qu tipo de estructura secundaria predomina en protenas globulares y fibrilares? c) Qu entiende por dominios de organizacin de las protenas y cual es su rol funcional? 6. Una protena globular contiene entre otros los siguientes aminocidos: Metionina, aspartato, fenilalanina, tirosina, arginina y leucina. En un medio acuoso
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a) Cules de estos aminocidos estarn probablemente situados cerca de la superficie? b) Cules de estos radicales podran interactuar entre s? Indique el tipo de interaccin que presentaran. 7. Cmo se puede determinar la composicin aminoacdica de la oxitocina (un nonapptido)? Explique brevemente. 8. Cmo se explica el efecto tampn de las protenas y en que rango de pH es ms evidente? 9. a) Cmo afectan a la solubilidad de las protenas los cambios de pH y de concentracin de sales? Explique considerando los diferentes tipos de protenas. b) Qu entiende por punto isoelctrico de una protena? c) Qu entiende por denaturacin de una protena? Qu agentes denaturantes fsicos y qumicos conoce y cmo afectan a la estructura de las protenas? Valores de pK de los aminocidos ms comunes Aminocido Abreviatura Smbolo pKCOOH pKNH2 pKR Glicina (Gli) G 2.34 9 Alanina (Ala) A 2.35 9.69 Leucina (Leu) L 2.36 9.60 Metionina (Met) M 2.28 9.21 Isoleucina (Ileu) I 2.36 9.68 Fenilalanina (Fen) F 1.83 9.13 Valina (Val) V 2,29 9.74 Serina (Ser) S 2.19 9.21 Prolina (Pro) P 2.95 10.65 Triptofano (Trip) W 2.38 9.38 Ac. Glutmico (Glu) G 2.13 9.76 4.31 Histidina (His) H 1.82 9.17 6.0 Arginina (Arg) R 2.17 9.04 12.48 Lisina (Lis) K 2.18 8.95 10.53 Tirosina (Tir) Y 2.20 9.11 10.07 Cistena (Cis) C 1.92 10.78 8.33 BIBLIOGRAFIA 1. Lehninger A, Nelson D, & M Cox. 1995. Principios de bioqumica. Captulos 5 y 6 Ed Omega. 2. Murray, Mayes, Granner y Rodwell. Bioqumica de Harper Appleton-Lange Eds. 22 .Edicin, Captulos 4, 5 y 6.
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Laboratorio N 4: Enzimologa I
INTRODUCCIN Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metablicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo adems a su regulacin. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar la estructura molecular de la enzima, provocando su desnaturalizacin. En general una reaccin qumica aumenta su velocidad de reaccin al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, este efecto se observa slo entre 0 y 40 C, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces dbiles, principalmente puentes de hidrgeno y la prdida de su conformacin nativa. Debido tambin a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables, los que derivan de los radicales de sus aminocidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de ionizacin de los grupos qumicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad cataltica. Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad mxima a un valor de pH denominado pH ptimo. Por tal motivo la actividad enzimtica se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH. OBJETIVOS Estas actividades prcticas tienen como objetivo que los alumnos 1. Se familiaricen con los procedimientos de laboratorio para manipular muestras biolgicas 2. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en muestras biolgicas 3. Comprueben el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura
ACTIVIDADES Objetivo: Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival. La amilasa salival es una enzima que rompe especficamente los enlaces glicosdicos 1-4 de los polisacridos. La hidrlisis del almidn por amilasa salival da como producto una mezcla de maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidn es un poliscarido formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta slo enlaces 1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces 1-4 y 1-6 El almidn se reconoce qumicamente por el color azul intenso que desarrolla en El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la 13
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presencia de yodo, por lo que la hidrlisis enzimtica del almidn se puede determinar por la prdida del color azul de una mezcla de reaccin. PROCEDIMIENTO A.- Efecto de la Temperatura sobre la hidrlisis enzimtica del almidn Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de la preparacin enzimtica, 1 ml de la solucin de cloruro de sodio, 1 ml de la solucin tampn fosfato pH 7.0 y 2 ml de solucin de almidn. Mezcle suavemente sin agitar e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones: tubo 1 a 0C (sobre hielo), el tubo 2 a 37C en un bao termorregulado, el tubo 3 a 100C (bao mara) y el tubo 4 a temperatura ambiente. Incluya un quinto tubo sin cloruro de sodio en la mezcla de Reaccin a temperatura ambiente. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. B.- Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de preparacin enzimtica, 1 ml de solucin de cloruro de sodio y 2 ml de solucin de almidn. Posteriormente adicione 1 ml de tampn fosfato pH 4.0 al tubo 1, 1 ml bufer pH 5.0 al tubo 2 , 1 ml buffer pH 6.0 al tubo 3 y 1 ml buffer pH 8.0 al tubo 4. Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. Reactivos y Materiales 1. Preparacin enzimtica: Lavado bucal con agua destilada, filtrado y mantenido en hielo. 2. Tampn fosfato 0.1 M, pH 7.0, pH 5.0, pH 6.0 y pH 8.0 3. solucin de Cloruro de sodio 0.03 M 4. solucin de almidn 1% p/v 5. solucin de lugol 6. Bao termoregulado y de agua hirviendo
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Laboratorio N 5: Enzimologa II
INTRODUCCIN La catalasa es una enzima tetramrica, de naturaleza hemoproteica, que contiene un grupo hem en el sitio cataltico de cada subunidad. La catalasa es una enzima universalmente presente en los organismos aerbicos. Su presencia parece estar relacionada con un sistema de defensa contra los efectos txicos de la utilizacin de oxgeno por los organismos aerbicos. En las clulas eucariticas se encuentra asociada con los peroxisomas de clulas animales, glioxisomas de clulas vegetales y glbulos rojos de organismos superiores. La catalasa cataliza la degradacin del H2O2, producto txico del metabolismo aerbico, mediante dos formas de reaccin: cataltica y peroxidativa, segn las siguientes reacciones 1) catalasa + H2O2 ------------------------- catalasa- H2O2 (compuesto I) 2) catalasa- H2O2 + H2O2 --------------- catalasa + 2 H2O + O2 3) catalasa- H2O2 + RCH2OH ------ catalasa + RCOH + 2 H2O Las reacciones 1 y 2 corresponden a la reaccin cataltica y las reacciones 1 y 3 corresponden a la reaccin peroxidativa. En la clula intacta la catalasa funciona en forma peroxidativa , mientras que en condiciones de ensayo de laboratorio lo hace en forma cataltica. La reaccin cataltica presenta cintica de primer orden, tal que V = k [H2O2]. Se puede seguir la reaccin determinando el consumo de H2O2 en el tiempo y calculando el valor de la constante de primer orden k a partir de la siguiente frmula k = log Co / Ct x 2.3/t, donde Co y Ct son las concentraciones de H2O2 al tiempo 0 y al tiempo t (seg) respectivamente, en tanto que t es la variacin en el tiempo en segundos. Ensayo enzimtico de catalasa La actividad de catalasa se puede determinar en muestras biolgicas midiendo la disminucin en el tiempo de la concentracin de H2O2 mediante absorcin de luz UV a 240 nm (espectrofotometra UV) o por titulacin del H2O2 remanente con KmnO4 (permanganometra). En este trabajo prctico se determinar la actividad de muestras de hgado y hemolizados, determinando la concentracin de H2O2 por absorcin UV. OBJETIVOS Esta actividad prctica tiene como objetivos que los alumnos: 1. Conozcan algunos procedimientos clsicos para determinar la actividad de la enzima catalasa en muestras hepticas y sanguneas
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2. Observen la variacin de la concentracin de sustrato en el tiempo, determinen la constante de velocidad de primer orden de la reaccin catalizada y sean capaces de expresar grficamente sus resultados A. Muestras, Reactivos y Materiales 1. Muestras a) Se utilizarn sobrenadantes de homogenizados de hgado al 10% p/v en buffer fosfato pH 7.0, 50 mM , tratados con Triton X-100 y conservados a 4C (refrigerado) hasta las determinaciones. b) Los hemolizados se preparan a partir de glbulos rojo lavados 3 veces con NaCl isotnico y hemolizados con 4 volmenes de agua destilada (hemolizado Stock) y se conservan a 4C hasta las mediciones. En caso de guardar para otro da se deben congelar las muestras (sin diluir) 2. Soluciones a) Tampn fosfato pH 7.0, 50 mM. Se preparan soluciones de Na2HPO4 y NaHPO4 0.2 M se mezclan 122 ml de Na2HPO4 y 78 ml de NaHPO4 y se completan a 1 L con agua destilada en un matraz aforado, conservndose en fro. b) Solucin de H2O2 300 mM (Stock). 3.4 ml de H2O2 30 % se diluyen a 100 ml con tampn fosfato. Conservar en fro. O bien usar H2O2 comercial de 10 volmenes como stock. Materiales a) b) c) d) e) f) g) h) i) Tubos de ensayo de 20 ml Pipetas de 1 , 2 y 5 ml Vasos de precipitado de 50 ml Matraces Erlermeyer de 50 ml y 100 ml Propipetas Papel absorbente (toallas de papel) Marcador para vidrio Espectrofotmetro UV y cubetas Cronmetro (Timer)
B. ACTIVIDADES 1. Tomar 2 ml de solucin H2O2 Stock y diluir a 20 ml con tampn fosfato en matraz Erlermeyer de 50 ml (solucin sustrato) 2. Preparar diluciones 1: 100 del extracto de hgado y 1: 50 de hemolizados con tampn fosfato 3. Tomar 3 ml de la solucin sustrato y leer DO a 240 nm, da [H2O2] a tiempo 0. 4. Echar a andar la reaccin agregando rpidamente (soplando fuerte) 1 ml de la dilucin de enzima al matraz con solucin sustrato y agite inmediatamente por rotacin. Simultneamente tome el tiempo en segundos.
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5. Tome muestras de 3ml cada 20 segundos y lea rpidamente su DO a 240 nm. Registre el tiempo exacto, en segundos, al momento de la lectura. 6. Completar la tabla siguiente Tubos Tiempo (s) Concentracin H2O2 [H2O2]0 / [H2O2]t 0 1 2 3 4 A partir de los moles de H2O2 en 3 ml determinar la concentracin molar de H2O2 en la solucin sustrato. 7. Construir grficos [H2O2] versus tiempo y log [H2O2] versus tiempo. Comparar y discutir en relacin al tipo de cintica de la reaccin 8. Calcular la actividad de catalasa a partir de la ecuacin siguiente k = log Co / Ct x 2.3 / t ( k = seg. 1)
La actividad de catalasa se puede expresar tambin como unidades internacionales U.I., siendo 1 U.I. = k x 13 / 6.93 x 10 -3
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2. Qu efecto tiene una enzima sobre: la velocidad de reaccin, el equilibrio de la reaccin, el orden de reaccin, la energa de activacin y el E de una reaccin enzimtica? Qu relacin puede establecer entre E de activacin y velocidad de Reaccin? 3. Considerando la naturaleza proteica de las enzimas qu precauciones se deben tomar para manipular y realizar el ensayo de la actividad de una enzima? Qu ventajas puede tener analizar una reaccin enzimtica en condiciones de velocidad inicial (Vo)? 4. Dada una cierta reaccin catalizada por una enzima en presencia de un exceso de sustrato. Indique: a) Que ocurre con la velocidad inicial (Vo), la velocidad mxima (Vmx) y la constante de Michaelis (KM) si la concentracin de enzima aumenta al doble. b) Que ocurre con Vo, Vmx y KM si se adiciona una sustancia que aumenta al doble la afinidad de la enzima por el sustrato. 5. Dada la ecuacin general de una reaccin enzimtica k1 k2 E + S <----->ES <-----> E + P k-2 k-1 a) b) c) d) Escriba la expresin de velocidad a baja y alta concentracin de sustrato Cul es la expresin de KM en funcin de las constantes de velocidad? En qu caso KM sera igual a k2 / k1? Considerando una situacin de estado estacionario escriba una ecuacin que exprese la concentracin de ES en funcin de [S], [E] y KM
6. Dados los siguientes datos experimentales del estudio de la actividad de una enzima a 25 C S Vo (M) (M min-1) 28 2,5x10-6 -6 4,0x10 40 70 1x10-5 2x10-5 95 -5 112 4x10 1x10-4 128 -3 2x10 139 1x10-2 140 a) Utilizando anlisis grfico determine el valor de Vmx y KM b) Es posible determinar estos parmetros por simple inspeccin de los datos en la tabla? c) Es posible calcular el G de la reaccin? Porqu?
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7. Se ha estudiado la enzima malato deshidrogenasa de hgado de paloma , enzima que cataliza la reduccin de piruvato en lactato segn la siguiente reaccin global Piruvato + NADPH + H+ <----------> L- Lactato + NADP+ La reaccin se puede seguir por disminucin de absorbcin de luz (absorbancia) a 340 nm, correspondiente a la oxidacin del NADPH. Se ha medido la velocidad de reaccin expresada en mU a diferentes concentraciones de piruvato y a 25C, lo que se muestra en la siguiente tabla Piruvato (mM) Velocidad de reaccin (mU) 1,5 4,0 2,5 6,0 3,5 7,5 6,0 10,4 12,0 14,0 a) Determine la velocidad mxima de la reaccin y la Km de piruvato. b) Si los potenciales de reduccin de lactato y NAD+ son -0.19 volts y -0.32 volts. c) Respectivamente Cul ser el G de esta reaccin? Tiende a formar lactato? d) Qu reacciones se acoplan en esta reaccin de oxido-reduccin? e) Si las concentraciones en un sistema celular a 37C son 80 mM de lactato y 20 mM de piruvato Cul ser el valor de G para este sistema? 8. Cmo puede distinguir experimentalmente si un inhibidor acta en forma competitiva o no-competitiva? 9. a) Qu entiende por enzima alostrica? y Cmo puede reconocerla? Explique sobre la base de una enzima con efecto heterotrpico. b) D dos ejemplos de enzimas alostricas indicando sus efectores positivos y negativos. 10. a) Qu entiende por regulacin por modificacin covalente? b) Qu efecto tiene la fosforilacin y la defosforilacin sobre la actividad de una enzima? D 2 ejemplos.
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En ausencia o deficiencia de oxgeno, ocurre respiracin celular anaerbica o fermentacin, en que el piruvato (producto de la gliclisis) se transforma en etanol (levaduras) o acido lctico (msculo). En presencia de oxgeno suficiente ocurre respiracin celular aerbica, en que el piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil CoA, el cual a travs del ciclo de Krebs origina CO2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial, donde son reoxidados por O2, produciendo ATP y H2O. Esta va aerbica es la principal va de produccin de ATP. Algunas clulas como los glbulos rojos y las bacterias anaerbicas estrictas tienen en la fermentacin la nica va de produccin de ATP, en tanto que otras clulas como las levaduras, que son anaerobios facultativos, en ausencia de O2 realizan fermentacin y en presencia de l, realizan fermentacin y respiracin celular. OBJETIVOS 1. Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular anaerbica (fermentacin) en levaduras. 2. Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la respiracin celular. 3. Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH e inhibidores en la interpretacin de sus resultados.
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ACTIVIDADES Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae). La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin: C6H12O6 2CO2 + 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO2. Procedimientos. 1. Complete la siguiente batera de tubos: Tubos Suspensin de levadura 7% Solucin de glucosa Solucin NaF Agua destilada (43C) Solucin rojo neutro 1 1 ml 2 ml 2 1 ml 1 ml 1 ml 3 1 ml 1 ml 1 ml 4 1 ml 1 ml 1 ml
Agitar por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo. 2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionndolo girar rpidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Marcar el nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elstico los 4 frascos, ponerlos a incubar en un bao de agua a 43C. 3. Al cabo de 30 min. marque el nivel final de la solucin en el tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con agua. 4. Cual es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH. 5. Anote y discuta sus resultados. Soluciones: 1. Solucin de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de agua destilada a 43C y completar a 100 ml con agua destilada a 43C. 2. Solucin de glucosa 0,1 M 3. Solucin de NaF 0,1 M 4. Solucin rojo neutro 0,02 M Papel pH.
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En ausencia o deficiencia de oxgeno, ocurre respiracin celular anaerbica o fermentacin, en que el piruvato (producto de la gliclisis) se transforma en etanol (levaduras) o acido lctico (msculo). En presencia de oxgeno suficiente ocurre respiracin celular aerbica, en que el piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil CoA, el cual a travs del ciclo de Krebs origina CO2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial, donde son reoxidados por O2, produciendo ATP y H2O. Esta va aerbica es la principal va de produccin de ATP. Algunas clulas como los glbulos rojos y las bacterias anaerbicas estrictas tienen en la fermentacin la nica va de produccin de ATP, en tanto que otras clulas como las levaduras, que son anaerobios facultativos, en ausencia de O2 realizan fermentacin y en presencia de l, realizan fermentacin y respiracin celular. Respiracin aerbica en corazn o hgado de rata. La deshidrogenada succnica es una enzima del ciclo de Krebs, que cataliza la oxidacin de acido succnico a cido fumrico. Usando FAD+ como coenzima. Esta enzima es especifica para el acido succnico, pero puede ser inhibida competitivamente por el acido malnico.
+ FAD
+ FADH+
Succinato
Fumarato
Malonato
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En sistemas de ensayo con extractos de tejido, se puede utilizar azul de metileno como aceptor de electrones de H+ el cual en estado oxidado es azul y en estado reducido es incoloro. Por lo tanto se puede reconocer la actividad enzimtica por la decoloracin del azul de metileno en ausencia de oxgeno, ya que el oxigeno del aire reoxida el azul de metileno. OBJETIVOS 1. Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular aerbica en extractos de tejidos. 2. Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la respiracin celular. 3. Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH e inhibidores en la interpretacin de sus resultados. ACTIVIDADES 1. Complete la siguiente batera de tubos. Tubos Tampn fosfato Preparacin enzima Glucosa 0,1 M Succinato 0,1 M Malonato 0,1 M KCN 0,05 M 1 4 ml 1 ml 2 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 3 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 4 2 ml 1 ml 1 ml 0,5 ml 0,5 ml 5 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Nota: Agregar KCN con propipeta, NO USE LA BOCA PARA PIPETEARLO. 2. Mezclar por inversin y agregar 5 gotas de azul de metileno 0,02 % inclinando el tubo agregar por la pared del tubo una capa de aceite para aislar el aire de la mezcla de ensayo. 3. Incubar los tubos a 37C por una hora, observar y anotar los resultados. 4. Agite el tubo decolorado. Que observa? Explique. Analizar y discutir los resultados. Presentar un informe escrito. Soluciones: 5. Preparacin enzimtica de succinato deshidrogenada. Preparar un homogeneizado de corazn o hgado de rata al 20% p/v en tampn fosfato 100 mM a temperatura ambiente. Centrifugar a 1000 rpm aproximadamente y obtenga el sobrenadante que ser la preparacin enzimtica y consrvelo a 4C. 6. Solucin de glucosa 0,1 M 7. Solucin de azul de metileno 0,02 M 8. Solucin de succinato de sodio 0,1 M
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9. Solucin de malonato de sodio 0,1 M 10. Tampn fosfato 100mM 11. KCN 0,05 M Las soluciones 8 y 9 llevarlas a pH 7 con NaOH 0,2 M Nota: Soluciones NaF y KCN agregar con propipeta
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CUESTIONARIO 1. Escriba la estructura de cadena abierta y/o cclica de: a) D- deoxiribosa b) -D- glucopiranosa c) -D- fructofuranosa -6-P d) Sacarosa e) Glucosa - 1- P f) Glucosa - 6 P g) Gliceraldehdo -P 2. Qu entiende por: a) b) c) d) e) f) Enantimeros Anmeros Enlace glicosdico 1-4 Cetohexosa Homopolisacrido Glicosaminoglicanos
3. Considerando que el Go de oxidacin completa de la glucosa es - 686.000 cal / mol y que el Go de formacin del ATP es de -7.500 cal /mol Cul sera la produccin de ATP en moles por la oxidacin de un mol de glucosa asumiendo una eficiencia energtica del 100%? Cul es el rendimiento real en la clula? 4. *Para un individuo que realiza trabajo pesado se estima un requerimiento energtico de 147 cal / min/ k de peso. Calcule el consumo de ATP expresado en gramos de un individuo de 70 kilos que realiza 8 horas de trabajo pesado. (PM ATP = 507.2 g/ mol). 5. *Con respecto a la glucosa indique a) Por qu es el principal carbohidrato utilizado en la clula? b) Cul puede ser el origen de la glucosa utilizada por los tejidos? Esquematice. c) Como se regula el nivel de glucosa sangunea o glicemia? Esquematice. 6. Qu papel tiene el glicgeno almacenado en el hgado y en el msculo esqueltico? Cmo se regula su nivel? 7. Seale las diferentes vas metablicas que puede seguir la glucosa -6-fosfato en la clula, indicando su importancia y su localizacin celular 8. *Respecto a la gliclisis indique: a) En un esquema los productos e intermediarios de esta va b) Cul es el papel de las primeras fosforilaciones que sufre la glucosa al ingresar a la clula e incorporarse a la gliclisis? c) Analice la importancia de la gliclisis en el msculo y en el glbulo rojo El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la 27
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d) Cules son las etapas reguladas de esta va? Indique sus mecanismos de regulacin e) Cules son los productos de la glicolisis en condiciones aerbicas y con dficit de oxgeno en una clula muscular? Porqu siendo tan baja la produccin de ATP por la va anaerbica es tan alta su importancia para el trabajo muscular intenso? f) Qu efecto tiene en la glicolisis la adicin del i. Iodoacetato ii. Fluoruro iii. ATP iv. Fructosa 2,6 difosfato 9. Con respecto al ciclo de Krebs o ciclo del cido ctrico indique a) b) c) d) Cul es su importancia en el metabolismo? Porqu esta va es dependiente de oxgeno? Los sitios de la va en que se produce CO2, NADH, FADH2 y ATP Las etapas reguladas de esta va y los factores que la afectan
10. *Si tiene una preparacin de mitocondrias aisladas. a) Qu efecto tiene la adicin de KCN? y Qu consecuencias tiene para el ciclo de Krebs y la glicolisis? b) Qu tipo de sustancia es un compuesto desconocido que al agregarlo al sistema inhibe la fosforilacin oxidativa y aumenta el consumo de oxgeno? c) Cmo se explican las diferencias de produccin de ATP a partir de NADH citoslico y NADH mitocondrial? d) Cul es el mecanismo que explica la produccin de ATP a nivel mitocondrial?
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Rf = Distancia recorrida por la sustancia (x) Distancia recorrida por el solvente (d) El Rf es una constante para cada sustancia en las condiciones establecidas
d Punto de aplicacin
Placa de cromatografa: Placa de vidrio (20 x 20 cm.) Para la cromatografa de adsorbcin se usan placas de vidrio de 20 x 20 cm., cubiertas con una capa fina (+ 0,25 mm) de gel de slice (Silica gel G), formada a partir de una pasta fluida (10 g de Silica gel G + 20 ml de agua destilada). La placa es posteriormente deshidratada o activada colocndola a 120C por 30 minutos. OBJETIVOS Esta actividad de trabajo de laboratorio tiene como objetivos que 1. Los alumnos conozcan mtodos generales de extraccin de lpidos 2. Conozcan mtodos cromatogrficos sencillos de separacin e identificacin de lpidos 3. Comprendan las propiedades fisicoqumicas de los lpidos involucradas en la extraccin y cromatografa de lpidos con solventes orgnicos ACTIVIDADES 1. Extraccin de lpidos de yema de huevo. Colocar una yema de huevo en un matraz de 250 ml (con tapa) y agregar 50 ml de etanol y 50 ml de ter, tapar hermticamente y agitar. Dejar reposar 10 minutos y filtrar con papel filtro. El filtrado ser utilizado como muestra para separar e identificar lpidos. 2. Aplicacin de muestras y desarrollo de la cromatografa Tomar cuidadosamente una placa de vidrio cubierta con slica gel y marcar cuidadosamente 5 puntos para la aplicacin de la muestra y los 4 estndar: Triglicridos, colesterol, cido esterico y fosfolpidos. Las muestras y los estndar se colocan en la placa a ms o menos 2 cm del borde inferior. Las sustancias se aplican con una micropipeta gota a gota de manera que la mancha sea del menor dimetro posible, para ello se aplica la gota y se seca con secador de pelo cada vez. Posteriormente se pone la placa cromatogrfica en una cmara con una mezcla de solvente cloroformo:metanol:amoniaco (75 : 25 : 4), previamente saturada, para correr la cromatografa. El nivel de solvente en la cmara no debe ser mayor a 1,5 cm. Al cabo de de hora a 1 hora se saca la placa y se marca el frente del solvente.
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Se seca la placa y se revela en una cmara con vapores de yodo o por pulverizacin (spray) con cido fosfomolbdico etanlico 10 % p/v y se colocan en la estufa a 110 C por 10 minutos. En este ltimo caso se deja evaporar el alcohol antes de ponerlo a la estufa. A partir de las manchas producidas por el revelado se calculan los Rfs y se comparan las muestras con los estndar para la identificacin de las sustancias de la muestra. Anote sus resultados y compare con los datos de la literatura. Discuta con respecto a los valores de Rf obtenidos y la composicin de lpidos de la yema de huevo. Material y Reactivos: 1. Huevos enteros ( se ocupar la yema como fuente de lpidos) 2. Mezcla Metanol Eter (1:1 v/v) 3. Mezcla Cloroformo - Metanol Amoniaco (75:25:4 v/v) o Eter de petroleo: ter etlico: cido actico (10 :90 :1) 4. Soluciones 2 mg/ml en metanol-eter (1:1) de colesterol, tripalmitina, lecitina y cido Esterico (soluciones estndar) 5. Acido fosfomolbdico 10% en etanol 6. Yodo metlico 7. Placas de cromatografa (20 cm x 20 cm) 8. Slica gel G 9. Cmaras cromatogrficas de vidrio, con tapas. 10. Estufa a 110C 11. Secador de pelo 12. Micropipetas o pipetas Pasteur Nota: Las placas cromatogrficas se deben preparar con bastante antelacin (3 o 4 das); deben estar totalmente secas. O bien, se compran listas, existen en el mercado placas preparadas para cromatografa de lpidos. BIBLIOGRAFA 1. Clark J.M. Jr. (ed) Experimental Biochemistry, W. H. Freeman and Co. 1964. Pgs. 43 51. 2. Abboot D. y Andrews R.S. Introduccin a la cromatografa, Editorial Alambra S.A. 2 Edicin , 1970. 3. Nelson D.L. y Cox M.M. Principios de Bioqumica de Lehninger, 3 Ed.2000. Cap.11.
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Con excepcin de los vegetales y algunos microorganismos, los organismos vivos tienen capacidad de sintetizar colesterol. En los mamferos el principal sitio de sntesis de colesterol es el hgado, el que es a la vez el principal sitio de degradacin de colesterol a cidos biliares. OBJETIVOS El desarrollo de esta gua de ejercicios pretende que los alumnos 1. Conozcan la composicin qumica y las propiedades de los lpidos 2. Conozcan y comprendan los procesos de transporte, las vas metablicas y mecanismos de regulacin en la utilizacin y biosntesis de los lpidos 3. Comprendan las relaciones del metabolismo de lpidos con otras vas metablicas y las alteraciones del metabolismo en patologas asociadas al metabolismo de lpidos. CUESTIONARIO 1. Escriba la estructura molecular de: a) cido graso C 20:4, 6,9,12,15 (serie 6) b) cido linolnico C 18:3, 3, 6,9 (serie 3) c) Tripalmitina d) Fosfatidil etanolamina e) Colesterol f) Etinil estradiol (anticonceptivo oral) Indique la polaridad y solubilidad en agua de cada compuesto. 2. Describa brevemente el proceso de digestin , absorbcin y transporte de lpidos 3. De qu manera afecta a la utilizacin de lpidos de la dieta: a) Una falla pancretica b) Una falla heptica 4. Esquematice el proceso de - oxidacin mitocondrial del cido esterico (C 18:0). Establezca a) El nmero de moles de NAD+, FA D+, ATP y CoASH requeridos b) Los moles de ATP producidos por la oxidacin completa del cido graso 5. Cmo se regula el nivel de cidos grasos libres en el plasma? Esquematice 6. Qu entiende por cetognesis? En que condiciones normales o patolgicas se puede producir un aumento de cuerpos cetnicos en el plasma? Explique 7. Explique brevemente Qu efecto tendr en la biosntesis de lpidos
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a) Un aumento del nivel de I. AcetilCoA II. Citrato III. Acidos grasos libres b) Una disminucin del nivel de I. Biotina II. NADPH III. Glucosa 8. Qu relaciones puede establecer entre el metabolismo de glucosa y la biosntesis de triglicridos? En base a estas relaciones explique porqu una dieta habitualmente rica en hidratos de carbono produce obesidad 9. Un investigador en la Antrtida decide utilizar mantequilla como fuente de energa. Explique qu le suceder al cabo de 15 das con respecto a: a) El nivel de cetognesis b) La utilizacin de sus protenas corporales 10. Esquematice el rol de las lipoprotenas plasmticas (QM, VLDL, LDL, HDL) en el transporte de lpidos.Qu importancia tiene su determinacin en el diagnstico de enfermedades cardiovasculares? 11. Esquematice las vas de utilizacin y sntesis de colesterol. Qu relacin tiene con la biosntesis de cidos biliares? 12. Podra prescindir de la presencia de lpidos en la dieta? Explique BIBLIOGRAFA 1. Nelson y Cox Bioqumica de Lehninger Captulos 11, 17 y 21
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El hombre bien alimentado, con una actividad moderada, consume aproximadamente 100 gramos de protena al da y excreta 16 gramos de nitrgeno, 95% del cul es eliminado por los riones y el 5% restante por las heces. Entre el 80% al 90% del nitrgeno excretado por los riones es en forma de urea, sintetizada exclusivamente por el hgado, con un alto costo energtico. Por cada mol de urea formada se requieren 3 moles de ATP, como se aprecia en la reaccin siguiente de la sntesis de urea 2 NH4+ + CO2 + 3 ATP + 3 H2O -------------> urea + 2 ADP + AMP + Pi Existen varios desrdenes metablicos asociados con deficiencias de enzimas de la sntesis de urea y cuyos sntomas ms frecuentes son vmitos, intolerancia a protenas, letargo, ataxia intermitente y retardo mental. CUESTIONARIO 1. Haga un esquema del ciclo del nitrogeno y discuta la importancia de los vegetales en la incorporacin del nitrgeno a la cadena alimenticia. 2. Qu entiende por Recambio de protenas y Balance Nitrogenado (BN)? 3. Qu entiende por aminocidos esenciales? Nmbrelos. Qu relacin puede establecer entre los aminocidos esenciales con el Valor Biolgico de las protenas y su efecto en el Balance Nitrogenado? 4. Qu mecanismos de transporte importancia del Glutatin? de aminocidos conoce? Cul es la
5. Complete el esquema siguiente indicando con flechas las relaciones entre los distintos metabolitos. Protenas de la dieta ----------> L aminocidos <---------> Protenas corporales Urea NH4+ Orina Aminaciones y Transaminaciones NH3 Glucosa cetocidos Acetil CoA y cuerpos cetnicos Acidos grasos CO2 + H2O
6. Con respecto al catabolismo de los aminocidos indique a) b) c) d) Cul es el destino de los aminocidos ingeridos en la dieta? Cul es la fuente endgena ms importante de aminocidos? Compare la importancia de las transaminasas y de glutamato deshidrogenada. Cul es el destino del NH3 producido por desaminacin oxidativa? 36
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e) Con respecto a la glutamina sintetasa y la gluaminasa, indique su importancia y su localizacin tisular y celular. 7. Qu interpretacin se puede dar a los aumentos de las transaminasas en el plasma o suero sanguneo? 8. Qu relacin (es) puede establecer entre el metabolismo de los aminocidos y el metabolismo de los hidratos de carbono? 9. En el estudio del metabolismo ha sido de gran importancia el uso de istopos para marcar nutrientes y metabolitos y seguir su camino en las vas metablicas. Al respecto indique como se explica que a) Si a un animal de experimentacin se administra una dieta completa adicionada con Alanina N15, presente cido glutmico- N15 y urea- N15? b) Cmo se explica la marca C14 y/o N15 en las protenas, hidratos de carbono, lpidos y cidos nucleicos de un animal que fue alimentado con alanina C14,N15? BIBLIOGRAFA 1. Syllabus de Bioqumica General Universidad Santo Tomas , Sesiones 18 y 19. 2. Nelson D.L. y Cox M. M. Principios de Bioqumica de Lehninger, Worth Publishers 3 Edicin 2000, Captulo 18. (Edicin en espaol de Editorial OmegaBarcelona). 3. Stryer N.V.L. Bioqumica Editorial Revert 4 Edicin, 1995. Captulo 25.
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universalmente presente en organismos fotosintetizadotes, es la protena ms abundante en la biosfera y cataliza la incorporacin de CO2 a la ribulosa-biP. La rubisco tambin acta como oxidasa catalizando la reaccin de la Ribulosa-biP con O2, reaccin conocida como fotorrespiracin y que interfiere con la fotosntesis. Las plantas desarrollaron sistemas que contrarrestan la fotorrespiracin, como son las plantas C4 y las plantas CAM. CUESTIONARIO 1. Dibuje un esquema del cloroplasto tal como se aprecia al microscopio electrnico. Anote el nombre de todas sus partes e indquelas con una flecha. 2. Con respecto al punto anterior elabore un cuadro indicando la funcin de cada una de las partes del cloroplasto 3. Cul es el origen de los cloroplastos? Refirase al origen evolutivo y su formacin en la clula. Discuta al respecto la importancia de la presencia de ADN. 4. Qu entiende por el esquema Z? Constryalo y explique como funciona. 5. Con respecto al esquema anterior indique: a) Qu entiende por los fotosistemas I y II? Indique su funcin. b) Qu entiende por fotofosforilacin y que efecto tiene en ella el bloqueo del fotosistema I y la ausencia total de NADP+? c) Cmo se explica el transporte de electrones entre ambos fotosistemas y que importancia tiene en la fotofosforilacin? 6. Qu entiende por ciclo de Calvin Benson?, Cul es su importancia y que relacin tiene con los fotosistemas? 7. Con respecto a la fijacin de CO2 indique a) Cul es la molcula aceptora de CO2? b) Qu papel juega la rubisco en este proceso? c) Cuales son los principales intermediarios y los productos finales? 8. a) Qu entiende por fotorrespiracin y que consecuencias tiene para la fotosntesis? b) Indique los diferentes mecanismos de fijacin de CO2 de las plantas, indicando ventajas y desventajas. BIBLIOGRAFA 1. Syllabus de Bioqumica General, Universidad Santo Toms, Sesin 11. 2. Purves y otros. Life: The Science of Biology, Sinauer- Freeman Edits. 5 Edition, Chapter 8
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3. Nelson, D.L. y Cox, M.M., Principios de Bioqumica de Lehninger, Edit. Omega, 2 Edicin, 1993. Capitulo 18 ( captulo 19 de la 3 Edicin) 4. Govindjee y Coleman, How plants make oxygen? Scientific American , Feb. 1990. 5. Sommerville C.R. et S.C. Les photosynthses des plantes. La recherch . Vol 15, N 154, Avril 1984. Nota: De las revistas Scientific American y la Recherche existen ediciones en Castellano.
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Funcin
La replicacin del ADN garantiza la transmisin de la informacin gentica entre las generaciones, pero permitiendo algunos cambios o mutaciones que permiten la variabilidad entre los individuos y que a largo plazo hacen posible la evolucin. La replicacin del ADN requiere la participacin de enzimas (polimerasas, ligasas, nucleasas, helicasas, etc., adems secuencias especficas que actan como seales de inicio de la replicacin. La transcripcin a su vez requiere de enzimas particulares y secuencias de inicio y de trmino de la transcripcin, reconocidas por factores que regulan la transcripcin. Existen diferencias en la organizacin del ADN
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de eucariontes y procariontes que se reflejan en la regulacin de la replicacin, transcripcin y traduccin del material gentico. La sntesis de protenas reaalizado por los cidos ribonucleicos (Ribosomal, Mensajero y de Transferencia) y dirigidos por el cdigo gentico, se realiza en los ribosomas con el aporte de aminocidos, enzimas, factores de regulacin y una fuente de energa. La expresin de los genes es un fenmeno bajo estricta regulacin, ejercida a diferentes niveles segn la organizacin del material gnico (genoma) en los diferentes organismos, pero bsicamente se puede ejercer a nivel de la transcripcin y la traduccin. Tambin existen mecanismos de regulacin postranscripcionales y postraduccionales, los que son particularmente importante en eucariontes. OBJETIVOS El desarrollo del presente cuestionario persigue que los alumnos 1. Conozcan las evidencias experimentales que apoyan el papel del ADN como material gentico, su estructura molecular y su mecanismo de replicacin 2. Analicen la composicin qumica y las caractersticas ADN y del ARN moleculares del
3. Revisen los mecanismos de replicacin enzimtica del ADN y su relacin con fenmenos de mutacin y reparacin del ADN 4. Conozcan el papel del ADN y del ARN en la expresin de los genes a travs de la revisin y anlisis de los procesos de transcripcin y traduccin gnica. 5. Comprendan los mecanismos que regulan la expresin de los genes en la sntesis de molculas especficas de protenas CUESTIONARIO 1. Qu consideraciones apoyan el papel del ADN como material hereditario? 2. Indique una evidencia experimental que demuestra el papel del ADN como material hereditario? 3. En relacin a la composicin qumica del ADN indique que entiende por: a) b) c) d) Nucleosido Nucleotido, Indices de Chargaff, Efecto hipercrmico, 42
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e) Hebras antiparalelas f) Enlaces N-glicosdico y fosfodiester g) Replicacin semiconservativa 4. Compare la composicin qumica del ADN y el ARN Qu caractersticas presenta la estructura de doble hlice del ADN y que factores determinan esta estructura? 5. Qu evidencias experimentales demuestran un mecanismo de replicacin semiconservativo del ADN en procariontes y eucariontes? 6. Qu requerimientos presenta la la autoreplicacin del ADN? 7. Cmo se explica la replicacin bidireccional y simultnea de las dos hebras del DN, si la ADN polimerasa sintetiza slo en sentido 5 3 ? 8. Cmo se explica que la duplicacin de todo el ADN celular humano dure slo horas (+ o 10 hrs.), si por su velocidad de sntesis (aprox. 2000 p.b./min) debera tomar alrededor de 3 aos? 9. Qu tipo de mutaciones debe sufrir el ADN y cuales son sus consecuencias genticas? 10. Indique que evidencias apoyan la expresin gentica a travs del control de la sntesis de las protenas 11. Compare los procesos de replicacin y transcripcin del ADN. 12. Qu diferencias y semejanzas puede establecer en transcripcin de procariontes y eucariontes? los procesos de
13. En que consiste el procesamiento del ARN transcrito primario hasta ARNm maduro? 14. Responda las siguientes preguntas a) Qu entiende por: codn, anticodn, triplete sin sentido, codn de inicio b) Cules son las caractersticas del cdigo gentico? c) A la luz de la informacin actual se puede seguir manteniendo que el cdigo gentico es universal? d) Qu significa que el cdigo gentico sea degenerado? y cul sera a su juicio la importancia gentica de esta caracterstica del cdigo gentico? e) Qu importancia gentica tiene la hiptesis del balanceo en la lectura del codn por el anticodn?
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15. La siguiente secuencia de bases corresponde al segmento de la hebra de ADN que codifica el nonapptido oxitocina. I II III 5......... ACAATAAATTTGATTACAAGGACGACC........ 3 a) Escriba la secuencia del ARNm correspondiente b) Utilizando el cdigo gentico adjunto determine la secuencia de aminocidos de la oxitocina. c) Explique que efecto tendra en la sntesis del pptido una mutacin i.- de transicin de bases en I ii.- por transversin de bases en II iii.- por delecin de una citosina en III. Considere el antiparalelismo de los cidos nucleicos, el orden de las bases en el codn y el sentido de lectura de la traduccin. 16. Indique el papel que juegan en la sntesis de protenas los ARN mensajero, ribosomal y de transferencia. 17. Qu entiende por aminoacil ARNt sintetasa y cual es su importancia en el proceso de sntesis proteica? 18. Los antibiticos han sido de gran importancia en el estudio de la expresin gnica y la aplicacin teraputica de ellos requiere conocer su mecanismo de accin y la sensibilidad del patgeno (antibiograma). Al respecto indique cmo actan los siguientes antibioticos: a) b) c) d) e) f) g) Puromicina, Eritromicina, Tetraciclina, Cloramfenicol, Estreptomicina, Cicloheximida, Acido fusdico.
19. Compare los mecanismos generales de regulacin de la expresin gnica de procariontes y eucariontes. 20. Indique que entiende por: Modelo operon, gen regulador, gen estructural, enzima inducible, inductor, represor, regulacin positiva, regulacin negativa, regulacin posttranscripcional. BIBLIOGRAFA 1. Syllabus de Bioqumica Sesiones 22 a 27 2. Bioqumica de Lehninger 2 Edicin Cap 9, 24, 26, 27 y 28 3. Bioqumica de Harper Murray y otros, 22 Edicin Cap. 37 a 41
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