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Reposio de aula: 1/10/2011
Tipo de Vetores
Regio Regulatria
Promotor
Regio Codificadora
Gene
Vetor de clonagem
Vetor de expresso
Gene reporter
Gene presente em plasmdio cuja expresso facilmente visualizada. Codifica uma protena de fcil deteco e mensurvel, se possvel.
S e q u e n c i a
XhoI
XhoI
Grfico da luciferase
Levedura trasnformada com vetor com o gene da glicoamilase (placa de meio de cultura com amido corada com vapor de iodo)
GFP expression in haematopoietic colonies from transgenic mice ( carrying the green fluorescent protein (GFP)-reporter gene under the control of Kit (stem cell factor receptor) regulatory elements. Adult multipotential cells can be monitored for their ability to engraft, differentiate and regenerate different tissues
Programa
Gene reporter
Desfosoforilao do DNA PCR (Polimerase Chain Reaction) PCR em Tempo Real Seqenciamento de DNA
Desfosforilao
Remoo dos grupos 5 P das extremidades do DNA pela fosfatase alcalina para impedir a recircularizao do vector (aumenta a eficincia de clonagem).
5 P Digesto com enzima de restrio
3OH 3OH 5 P Tratamento com fosfatase alcalina 3OH 3OH
Programa
Gene reporter
Desfosoforilao do DNA PCR (Polimerase Chain Reaction) PCR em Tempo Real Seqenciamento de DNA
Polimerizao de DNA
Polimerizao de DNA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
Polimerizao de DNA
T T C T
G
T A
Polimerizao de DNA
T T C
Polimerizao de DNA
T C
Polimerizao de DNA
A
Polimerizao de DNA
T GA A G A T G T T T T GA G C TA C T T GT G C A C C GA T C C G CA C A CC 5 3 ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA |||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
Polimerizao de DNA
A T GA C C T T G A T T A C A GT C G T G G T C TA C G T G T C GA C CA CA C 5 3 ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG |||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
Polimerizao de DNA
G C C A T T T T T A G G C T T G T G T C C A T C TA C GA A CC G AC GA A C
Polimerizao de DNA
A
G C C A T T T T C GT G G T T T C A T C TA C G A G C G GA A C CA A CC A 5 3 ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3
Polimerizao de DNA
G G C T T T T T CG A C A G T A T T C TA C G G T C A G C G A GA A A C C C AC
5
Um Pouco de Histria.....
1983 Kary Mullis
"for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method Nobel Prize in Chemistry - 1993
1944
Thermus aquaticus
Bactria que vive em altas temperaturas DNA polimerase resistente a altas temperaturas (Taq DNA polymerase)
Hibridizao
A hibridizao se baseia em uma das principais caractersticas da dupla-fita de DNA a complementaridade das seqncias das duas fitas As fitas podem ser separadas pela ao da temperatura A dupla fita pode se restabelecer perfeitamente a partir de duas fitas separadas previamente
Hibridizao
Hibridizao
As fitas de DNA podem ser separadas pela ao do calor
Primers
dNTPs (nucleotdeos)
Tampo da Enzima
Taq Polimerase Magnsio (MgCl2)
2 min
45 seg 45 seg
1 min
10 min
96oC
96oC
54oC 30-40 X
72oC
72oC
20oC
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. A. Erlich., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase (1988) Science 239: 487-491
As Mquinas de PCR
Ciclo 1
96oC
DNA original = 1
Cpia original = 0
Cpia delimitada = 0
96oC
DNA original = 1
Cpia original = 0
Cpia delimitada = 0
54oC
DNA original = 1
Cpia original = 0
Cpia delimitada = 0
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 0 +
Cpia delimitada = 0
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 0 +
Cpia delimitada = 0
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 0 +
Cpia delimitada = 0
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 1
Cpia delimitada = 0
Ciclo 2
96oC
DNA original = 1
Cpia original = 1
Cpia delimitada = 0
96oC
DNA original = 1
Cpia original = 1
Cpia delimitada = 0
54oC
DNA original = 1
Cpia original = 1
Cpia delimitada = 0
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 1 +
Cpia delimitada = 0 +
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 1 +
Cpia delimitada = 0 +
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 1 +
Cpia delimitada = 1
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 1 +
Cpia delimitada = 1
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 2
Cpia delimitada = 1
Ciclo 3
96oC
DNA original = 1
Cpia original = 2
Cpia delimitada = 1
96oC
DNA original = 1
Cpia original = 2
Cpia delimitada = 1
54oC
DNA original = 1
Cpia original = 2
Cpia delimitada = 1
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 2 +
Cpia delimitada = 1 +
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 2 +
Cpia delimitada = 1 +
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 2 +
Cpia delimitada = 4
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 2 +
Cpia delimitada = 4
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 3
Cpia delimitada = 4
Ciclo 4
96oC
DNA original = 1
Cpia original = 3
Cpia delimitada = 4
96oC
DNA original = 1
Cpia original = 3
Cpia delimitada = 4
54oC
DNA original = 1
Cpia original = 3
Cpia delimitada = 4
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 3 +
Cpia delimitada = 4 +
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 3 +
Cpia delimitada = 4 +
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 3 +
Cpia delimitada = 4 +
72oC
DNA original = 1
Cpia original = 4
Cpia delimitada = 11
Ciclo
1 2 3 4 5 6 7 10 20 30 35 40 50
Cpia delimitada
0 1 4 11 26 57 120 1.013 1.048.555 1.073.741.793 34.359.738.332 1.099.511.627.735 1.125.899.906.842.570
A quantidade de produto de PCR depende do nmero de cpias de molde (M) presentes no incio da reao
P = (2)n M
PCR product
4T 2T T
0 0 5 10 Cycle number 15 20
Quantidade de DNA
10
15
20
25
30
35
Ciclos de PCR
Gel de Agarose
Quantidade de DNA
10
15
20
25
30
35
Ciclos de PCR
Gel de Agarose
Concluso......
no quantitativa
Primers
dNTPs (nucleotdeos)
Tampo da Enzima
Taq Polimerase Magnsio (MgCl2)
DNA Molde
DNA cromossomal
DNA plasmidial
Clulas intactas
No amplifica RNA!! Quantidade Teoricamente: a partir de 1 moleulas de DNA em geral de 1000 a 100.000 molculas (50ng-100ngDNA) Qualidade: no necessrio purificar o DNA, evitar colocar inibidores da enzima e DNA muito quebrado.
Primers- iniciadores
5
Moleculas de ~20 nucleotdeos (pb), fita simples Bases homlogas que flanqueiam a regio que se deseja amplificar PCR: um par de primers
Primers- iniciadores
Temperatura de melting: na qual 50% do DNA est denaturado
Primers- iniciadores
Primers- iniciadores
5
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
Gel de Agarose
Figura 4: Eletroforese de gel de agarose 1,5%. 1: Ladder 1 Kb plus; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14: produtos de amplificao da reao de PCR dos fragmentos 1, 2, 3, 4 ,5, 6 e 7, respectivamente. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15: PCR controles negativos.
Programa
Quantidade de DNA
Ciclos de PCR
Usar uma mquina que verifique a fluorescncia em cada ciclo (Real Time-PCR)
5700
Applied Biosystems
iCycler
BioRad
7700
Applied Biosystems
LightCycler
Roche
7500
Applied Biosystems
FluorTracker
Stratagene
FluorImager
Molecular Dynamics
Threshould = linha que corta as curvas de amplificao no mesmo ponto, Ct (cycle threshold)= ciclo onde a reao cruza o limiar de deteco (threshold) (incio da fase exponencial (ciclo do PCR)
14
P = (2)n M
Treshold cycle
Intensificao da emisso de fluorescncia quando ligado fita dupla de DNA A quantidade de fluorescncia proporcional a quantidade de DNA Corante no-especfico
Desantagem:
Pouco especfico Todo e qualquer produto formado contribuir para o aumento da fluorescncia
Amplicon
ANNEALING
EXTENSION
A atividade exonuclesica 5-3 da Taq polimerase hidroliza a sonda e permite que o reporter se afaste do quencher
Amplicon
5-3 exonuclease
Reporter
Quencher
Amplicon
ANNEALING
EXTENSION
Amplicon
5-3 exonuclease
Reporter
Quencher
Excitation
Emission
Amplicon
ANNEALING
EXTENSION
Amplicon
5-3 exonuclease
Reporter
Quencher
Diagnstico de doenas, e acompanhamento do paciente (LMC fuso dos genes BCR e ABL)
Determinar carga viral Expresso gnica
Expresso gnica: RNAm Protena Localizao celular: protena Atividade biolgica: protena
Transcriptase Reversa
Ciclo de vida de um retrovrus
David Baltimore
Transcrio Reversa
Enzima de modificao
Sintetiza DNA apartir de um RNA molde Necessita de um primer: oligo(dT), ou random exmeros (random primers6nt).
Transcrio Reversa
Controle interno
A diferena de expresso detectada no PCR em tempo real deve-se pipetagem de maior quantidade de amostra?
Quantificar um gene com expresso constante (similar) em tecidos ou clulas em estudo, e no altervel com o tratamento.
Resultado final: valore de expresso do gene alvo normalizado pelo controle interno.
Controle interno
IL-1 induces MCP1 expression in HASMCs. (A) HASMCs were treated with 5 ng/ml IL1 for the indicated times. Total RNA was isolated and RT-PCR analysis was performed using MCP1 gene-specific primers and the internal control gene, -actin. Exp Mol Med. 2009 Oct;41(10):757-764.
Hora do lanche......
Programa
Em 2005.
52.016.762 seqncias 56.037.734.462 nucleotdeos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/genbankstats.html
(1918)
(1932)
1977: Gilbert desenvolve um outro mtodo baseado em degradao qumica dos nucleotdeos
(Mtodo Qumico)
Seqenciamento de DNA
Manual X
Automtico
A
T
C
G
T
A
G
C
O Dideoxi-Nucleotdeo
O Dideoxi-Nucleotdeo
C A
T G
Polimerizao de DNA
o dideoxi
C
C T
G
T A
Polimerizao de DNA
o dideoxi
C
T C
Polimerizao de DNA
o dideoxi
C
Polimerizao de DNA
o dideoxi
Polimerizao de DNA
o dideoxi
T T GA CC A G A T T T C A GT C G T G G A T C TA C G T G T C GA C C CA C A
Seqenciamento de DNA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
Seqenciamento de DNA
ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
Seqenciamento de DNA
DNA molde Primers dNTPs Tampo Polimerase
ddATPs
dCTP*
ddGTPs
ddTTPs
ddCTPs
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
~0.1 cm
~60 cm
~20 cm
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Filme de Raio X
G G A T A T A A C C C C T G T
Seqenciamento Manual
Seqenciamento Manual
Reao Gel Eletroforese
Filme de Raio X
Leitura
Estrutura do Cromforo
Seqenciamento Automtico
ATGCTTCT ATGCTTCTG ATGCTTCTGG ATGCTTCTGGC ATGCTTCTGGCA ATGCTTCTGGCAG ATGCTTCTGGCAGA ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATC ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTG ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT AATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
T A G C
PCR X Sequenciamento
Seqenciamento Automtico
Reao de sequenciamento termociclador DNA Primer (nico) dNTPs (nucleotdeos) ddNTPs marcados Tampo da Enzima Taq polimerase
1. 96 C 1 min 2. 25 ciclos: 96 C 10 sec 50 C 5 sec 60 C 4 min 3. 4 C for ever 4. Purificao por precipitao
Seqenciamento Automtico
Laser
Seqenciamento Automtico
Seqenciadores de Gel
ABI Prism 377
Imagem do Gel
Imagem do Gel
1 capilar
4 capilares
16 capilares
48 capilares
96 capilares
MegaBace 1000
96 capilares
MegaBace 4000
384 capilares
A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 3.000pb / 6 meses 3.000pb / 180 dias 3.000pb / 4.320 horas 3.000pb / 259.200 minutos 0,01pb / minuto 1pb / 100 minutos
A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto
1600 1400 1200 1000 800
3100: 3130xl
3730: 3700: 3730xl MB 1000 MB 4000:
66pb / minuto
200pb / minuto 400pb / minuto
Capilares
1.600pb / minuto
Em 2005.
52.016.762 seqncias 56.037.734.462 nucleotdeos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/genbankstats.html
A Velocidade de Seqenciamento
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Manual 1 4 16 48 96 384
Capilares
Bactria
1,6 Mb - 1.700 genes
Fleichmann et al. (1995), Science 269:496
O Genoma Humano
International Human Genome Consortium, Initial sequencing and analysis of the human genome (2001) Nature, 409: 860-921. Venter, J.C. Adams, M.D., Myers, E.W., Li, P.W., Mural, R.J., et al., The sequence of the human genome Science, 291: 1304-1351.
Futuro.......
Ultra-Low-Cost Sequencing (ULCS)
Hybridization sequencing
Cyclic-array sequencing
Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) Pyrosequencing
J Foi Notcia......
Usos do sequnciamento
Identificar genes Rastrear mutaes me pacientes Fazer diagnstico em famlias (cancer, RET BRCA1,2doena de Hungtington)
Usos do sequenciamento
Homozigose Deteco de mutaes em pacientes
Usos do sequenciamento
Heterozigose Deteco de mutaes em pacientes
Programa
(1959)
(1960)
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. (1998) Nature 391(6669):806-11
DROSHA
Presente no ncleo das clulas Corta os Pri-microRNAs, produzindo os Pre-microRNAs
DICER
Membro da famlia das RNase III
(degrada RNA dupla-fita)
Pre-microRNA
siRNA (21-23nt)
19 nt duplex
2-3 nt 3 overhangs
RISC
RNAi Silencing Complex Usa o microRNA como guia para reconhecer e cortar o mRNA do gene-alvo
Depois, exonucleases celulares degradam o mRNA cortado
RNA de Interferncia
(RNAi)
RNA de Interferncia
(RNAi)
Resumindo.......
Para serve?
Mecanismo de defesa celular contra infeco viral Mecanismo de regulao da expresso gnica (microRNA)
Pirosequenciamento
Na reao......
DNA molde
Primer
Enzimas
DNA Polimerase ATP sulfurylase Luciferase Apyrase
Substratos
APS (adenosine 5 phosphosulfate)
Luciferin
Obs: deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPaS) usado no lugar do dATP
Pirosequenciamento
C ........
Pirograma
AGGGGTGGCTTTGGGGTTGCAGTTG
O que um Gene?
Regio Regulatria
Regio Codificadora
RNAm
Codon de Incio da Traduo (AUG) Codon de Terminao da Traduo Sntese protica
Protena
Os genes dos procariontes so contnuos (1 triplete=1 aminocido). O gene o RNAm e as protenas so colineares
DNA
Sntese de RNA
Pre RNAm
1 2 3
Splicing
1
RNAm
Sntese proteca
1
Protena
DNA
Pre RNAm
1 2 Splicing 1 2 3 3
RNAm
Sntese proteca 1 2 3
Protena
Os eucariontes possuem genes interrompidos, formados por exons (codificantes) e introns (removidos no splicing) A ordem dos exons a mesma no gene, no RNAm e na protena O gene com introns maior que seu RNAm
Transcriptase Reversa
Ciclo de vida de um retrovrus
David Baltimore
Transcrio Reversa
Transcrio reversa usando oligo(dT)
A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 0,01pb / minuto 500pb / 2 horas 500pb / 120 minutos 4,2pb / minuto
A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 4 x 500pb / 2 horas 4 x 500pb / 120 minutos 2.000pb / 120 minutos 16,6pb / minuto
A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto
3100: 3130xl
16 x 500pb / 2 horas 16 x 500pb / 120 minutos 8.000pb / 120 minutos 66pb / minuto
A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto
66pb / minuto
48 x 500pb / 2 horas 48 x 500pb / 120 minutos 24.000pb / 120 minutos 200pb / minuto
A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto
3100: 3130xl
3730: 3700: 3730xl MB 1000
66pb / minuto
200pb / minuto 96 x 500pb / 2 horas 96 x 500pb / 120 minutos 48.000pb / 120 minutos 400pb / minuto
A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto
3100: 3130xl
3730: 3700: 3730xl MB 1000 MB 4000:
66pb / minuto
200pb / minuto 400pb / minuto