UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS DEPARTAMENTO DE ENTOMOLOGIA

Orientador: Prof. Alcides Moino Jnior

AVALIAO DA COMPATIBILIDADE DE NEMATIDES ENTOMOPATOGNICOS (RHABDITIDA: STEINERNEMATIDAE E HETERORHABDITIDAE) COM PRODUTOS FITOSSANITRIOS

Aluno: Rodolfo Paulussi

Pr-projeto apresentado ao Departamento de Entomologia da Universidade Federal de Lavras como parte das exigncias do curso de Agronomia, para a obteno do ttulo de Engenheiro Agrnomo.

LAVRAS/MG NOVEMBRO/2006

1-) INTRODUO
Nematides so organismos de vida livre, predadores ou parasitos. Muitas das espcies parasticas causam doenas importantes em plantas, animais e humanos. Outras espcies so benficas, atacando insetos-pragas, sendo conhecidas por nematides entomopatognicos. Dentre os nematides entomopatognicos, h aqueles que so parasitos obrigatrios de insetos, como o caso da famlia Mermithidae, que so vermes encontrados normalmente na cavidade geral do corpo, podendo aparecer no tubo digestivo ou na rea genital do inseto, e que possuem um desenvolvimento caracterstico, com formas de tamanho notvel, geralmente de 0,5 a 2,0 cm, podendo chegar a tamanho superior a 20,0 cm, em algumas espcies, e que invariavelmente, causam a morte do hospedeiro (Ferraz 1998). O grupo com maior potencial de uso como agente de controle biolgico, e que tem despertado maior interesse de pesquisadores em vrias partes do mundo, aquele que rene nematides capazes de parasitar insetos, mas que conservam a habilidade de se desenvolver e reproduzir sob condies de vida livre, nutrindo-se de fungos e bactrias disponveis no ambiente (parasitismo facultativo). Alguns desses pertencem ordem Tylenchida, que congrega nematides dotados de estilete bucal, em sua maioria parasitos de plantas. Dentre estes, na famlia Neotylenchidae, encontram-se nematides que se alimentam de fungos, e que podem, eventualmente, apresentar comportamento entomopatognico. Neste caso, tem-se um exemplo de utilizao de nematides para fins de controle biolgico no Brasil, com a espcie Deladenus siricidicola, que vem sendo aplicada para o controle da vespa da madeira (Sirex noctilio), introduzida em plantaes de Pinus, mais precisamente na regio sul do pas. Nematides da ordem Rhabditida pertencentes s famlias Steinernematidae e Heterorhabditidae, por outro lado, destacam-se neste ltimo grupo, pois tm uma relao simbitica com bactrias que so introduzidas por suas formas infectivas na hemocele dos insetos, causando septicemia e morte do hospedeiro em 24 a 48 horas. Em seguida, desenvolvem-se at a forma adulta, completando o ciclo de vida dentro de alguns dias e originando centenas de milhares de novos juvenis infectivos, que emergem do inseto morto procura de novos hospedeiros (Ferraz 1998). Esses nematides 2

apresentam diversas vantagens para uso como agentes de controle biolgico, tais como: ao sinergstica com outros entomopatgenos, boa capacidade de adaptao a novos ambientes, capacidade de busca de novos hospedeiros, alta especificidade, e, por fim, resistncia a muitos princpios ativos de produtos fitossanitrios, caracterstica muito interessante para o uso em programas de manejo integrado de pragas. Poucos so os trabalhos com nematides entomopatognicos no Brasil, mas o interesse por essa linha de pesquisa tem crescido ultimamente, principalmente devido a algumas iniciativas de grupos de pesquisadores na promoo de workshops, encontros e cursos
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e ao potencial de

utilizao de espcies e/ou raas autctones ainda desconhecidas no Brasil (Grewal et al. 2001). O desenvolvimento de produtos base de nematides entomopatognicos enfrenta obstculos que podem ser superados com o desenvolvimento de estratgias adequadas para a sua utilizao, estudos relacionados produo, formulao e armazenamento, escolha de pragas-alvo adequadas, como insetos subterrneos e de hbito crptico, e com uma estratgia de marketing que ressalte as vantagens da utilizao desses agentes de controle (Alves et al. 1998a). Segundo Grewal et al. (2001), os nematides entomopatognicos so comumente aplicados em locais e ecossistemas que rotineiramente recebem outros insumos que podem interagir com os nematides, incluindo pesticidas qumicos, fertilizantes e corretivos de solo, podendo ser desejvel a aplicao conjunta destes para economizar tempo e dinheiro. De maneira geral, os juvenis infectivos (J3) so tolerantes a exposies curtas (2 a 6 horas) a vrios agroqumicos, incluindo herbicidas, fungicidas, acaricidas e inseticidas (Rovesti & Deso 1990, Ishibashi 1993) e, assim, podem ser aplicados ao mesmo tempo. Por outro lado, alguns produtos podem reduzir a infectividade e a sobrevivncia dos nematides (Grewal et al. 1998). Outros produtos podem, inclusive, agir de forma sinrgica com nematides entomopatognicos, e assim incrementam a sua eficcia em aplicaes inundativas (Koppenhoffer & Kaya 1998, Nishimatsu & Jackson 1998). Sendo assim, um dos principais aspectos a serem abordados o estudo da compatibilidade de nematides entomopatognicos com produtos fitossanitrios utilizados nas diferentes culturas, de forma a possibilitar o uso associado dos nematides com determinados produtos que possam
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apresentar caractersticas de sinergismo, ou mesmo visando a conservao desses agentes de controle biolgico em ambientes onde j ocorram, que uma estratgia de baixo custo e ambientalmente segura (Alves et al. 1998b). tambm importante a definio ou o encaminhamento de um protocolo que oriente a realizao desses estudos, visando padronizao que permita a comparao dos resultados obtidos pelos diferentes grupos de pesquisa, para que se possa indicar ou sinalizar na direo da utilizao de produtos fitossanitrios menos agressivos aos nematides entomopatognicos. Nesse sentido, tivemos a oportunidade de discutir esses aspectos em painel realizado no ltimo Congresso Brasileiro de Entomologia (Manaus/AM) (Moino Jr. et al, 2002), no qual encaminhamos proposta de protocolo a ser melhor discutida, adaptada e ampliada, com base no protocolo internacional preconizado por Vainio (1992). Em vista dessas necessidades e subsdios, este projeto tem como objetivo principal a realizao de estudos que avaliem a compatibilidade de produtos fitossanitrios das diversas categorias (inseticidas, fungicidas, herbicidas, nematicidas), utilizados em culturas de importncia econmica, sobre nematides entomopatognicos (Rhabditida: Steinernematidae e Heterorhabditidae), preenchendo uma grande lacuna existente na pesquisa com esses agentes de controle biolgico no Brasil, contribuindo para o uso integrado desses organismos em sistemas agrcolas com insero na filosofia do Manejo Integrado de Pragas (MIP).

_____________________________ Workshop: Nematides entomopatognicos (Rhabditida: Steinernematidae & Heterorhabditidae) - um recurso pouco explorado no Brasil; 30 de agosto de 2000; CCA/UFSCar, Araras/SP; 64 participantes; Dr. Parwinder Grewal (Ohio State University, EUA);
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Curso Nacional de Controle Biolgico de Pragas por Nematides Entomopatognicos; 24 a 28 de

setembro de 2001; CCTA/LPP/UENF, Campos dos Goytacazes/RJ; 23 participantes; Dra. Patricia Stock (University of California-Davis, EUA) e Dr. Itamar Glazer (Volkani Center, Israel).

2-) MATERIAL E MTODOS

2.1. Protocolo de Vainio (1992) O Experimento ser realizado na Cidade de Lavras, no laboratrio do Departamento de Entomologia da Universidade Federal de Lavras. Ser executado segundo o protocolo preconizado por Vainio (1992), com algumas pequenas adaptaes, descritas a seguir, para juvenis infectivos das duas espcies mantidas em larvas de G. mellonella, abrangendo os dois principais gneros de nematides entomopatognicos, Steinernema e Heterorhabditis. Os nematides sero obtidos de lagartas de G. mellonella, mantidos suspenso aquosa a 58o C no caso dos steinernematdeos, a 25 1 C no caso dos heterorhabditdeos e estocados por at uma semana antes da utilizao no experimento. O produto fitossanitrio ser preparado com o dobro da maior concentrao de ingrediente ativo recomendado pelo fabricante, isto , 0,8 mL do produto por mL de gua. Desta soluo ser retirada uma alquota de 1 mL e colocada em tubos de vidro nos quais sero adicionados 2.500 JIs em 1 mL de gua destilada e agitados. O bioensaio ser conduzido em estufa incubadora (B.O.D) a 22-23 C e UR de 70 10 %. A viabilidade dos nematides ser avaliada 48, 120 e 168 horas aps exposio aos produtos. Assim, uma alquota de 0,1 mL da suspenso ser retirada e observados 100 JIs para determinao da mortalidade. Sero considerados mortos aqueles que no responderam a estmulo com estilete. A infectividade dos nematides ser testada nos mesmos perodos que a viabilidade. Os tubos sero completados com gua destilada (3 mL) e deixados para decantar por meia hora na geladeira. O sobrenadante (cerca de 3mL) ser descartado e a lavagem repetida por trs vezes. Aps a lavagem, 0,2 mL ser retirado do fundo de cada tubo e pipetado em placas de Petri (9 cm de dimetro) com papel filtro. Cada placa receber dez lagartas de ltimo nstar de G. mellonella e sero mantidas em cmaras climatizadas nas mesmas condies que o teste anterior durante cinco dias. As lagartas mortas sero transferidas para placas de Petri (9 cm de dimetro) contendo uma folha de papel filtro seco e mantidas no escuro por mais trs dias sendo submetidas dissecao para a avaliao da presena de nematides. 5

Os valores de mortalidade de lagartas e nematides sero submetidos a anlise de varincia. As diferenas estatsticas sero determinadas usando o teste de Scott-Knott (p < 0,05).O protocolo preconiza que valores de mortalidade ou reduo de infectividade maiores de 50% caracterizam o produto como incompatvel com os nematides testados.

2.2. TESTES DE COMPATIBILIDADE IN VITRO DE PRODUTOS FITOSSANITRIOS COM NEMATIDES ENTOMOPATOGNICOS Os testes para avaliao da compatibilidade de produtos fitossanitrios utilizados em diversas culturas (fungicidas, inseticidas, herbicidas, nematicidas, etc.), sero realizados utilizando-se formulaes comerciais dos diferentes ingredientes ativos, de tal forma que se possa avaliar, inclusive, o efeito de diferentes formulaes de um mesmo ingrediente ativo, fato j evidenciado em trabalhos anteriores com fungos entomopatognicos. A unidade experimental para os testes composta de cinco tubos de vidro com capacidade volumtrica de 4 mL. Para a realizao dos testes de toxicidade (mortalidade), os produtos fitossanitrios sero dissolvidos em gua destilada, nas suas concentraes recomendadas, sendo o tratamento controle composto somente por gua destilada. Para os testes de infectividade (bioensaios), sero utilizados mais 15 tubos de vidro adicionais, totalizando 20 tubos por tratamento. Durante o perodo de incubao dos experimentos, os tubos sero mantidos em cmaras BOD temperatura de 25 1oC, umidade relativa de 70 10%, no escuro. Os nematides utilizados nos testes sero juvenis infectivos (J3) produzidos em larvas de G. mellonella, mantidos em supenso aquosa, e armazenados em geladeira pelo perodo mximo de uma semana antes da realizao dos testes. Larvas de G. mellonella sero tambm utilizadas para os bioensaios de infectividade. Os nematides sero quantificados em 1 mL de suspenso aquosa contendo de 2500 a 3000 juvenis infectivos, sendo adicionado 1 mL da soluo aquosa contendo o produto fitossanitrio em teste, com o dobro da concentrao recomendada. Dessa forma, ser obtida na diluio final, 6

uma suspenso de nematides (2 mL), em soluo aquosa do produto na sua concentrao recomendada. 2.2.1. TESTES DE TOXICIDADE (MORTALIDADE) Nos testes de toxicidade ser avaliada a mortalidade dos nematides aps 48, 120 e 168 horas (5 tubos/tratamento). A suspenso dever ser bem agitada, retirando-se uma alquota de 50 a 100 L, que ser analisada em microscpio estereoscpico. Ser feita uma contagem aleatria de 100 juvenis infectivos, considerando-se vivos aqueles com movimentao ativa ou com resposta de movimentao a estmulo com agulha metlica. Com os dados obtidos, ser determinada a porcentagem de mortalidade corrigida pela frmula de Abbott (em relao ao tratamento controle) para cada tratamento. 2.2.2. TESTES DE INFECTIVIDADE (BIOENSAIOS) Para os testes de infectividade, ser avaliada a capacidade infectiva dos nematides por meio de bioensaios com larvas de G. mellonella, aps 48, 120 e 168 horas, totalizando 5 tubos/tratamento/perodo de avaliao. Sero feitas trs lavagens das suspenses em gua destilada, colocando-se os tubos em geladeira por uma hora para decancatao dos nematides, descartando-se o sobrenadante, com a finalidade de retirar o excesso de produto da suspenso, para que no haja efeito sobre as larvas do inseto. Em seguida, ser retirada uma alquota de 200 L da suspenso, pipetando-a em placa de Petri com papel filtro ao fundo. Nessa placa, ser colocada uma larva de G. mellonella, mantendo-se as placas fechadas, nas mesmas condies do teste de toxicidade, por um perodo de cinco dias. Aps esse perodo, sero retiradas as larvas mortas, sendo transferidas para novas

placas com papel filtro, e mantidas nas mesmas condies por mais trs dias, quando as larvas sero dissecadas para verificao da presena ou no de nematides em seu interior. Com os dados obtidos ser determinada a infectividade dos nematides nos tratamentos, sendo os valores expressos em porcentagem de reduo da infectivdade com relao ao tratamento controle (gua destilada). 2.2.3. INTERPRETAO DOS RESULTADOS A SEREM OBTIDOS De acordo com os padres estabelecidos pelo IOBC (International Organization for Biological Control), preconizados no protocolo de Vainio (1992), valores de porcentagem de mortalidade corrigida, nos testes de toxicidade, e de porcentagem de reduo da infectividade, nos bioensaios de infectividade, que sejam inferiores a 50 %, indicam que o produto em teste pode ser considerado compatvel com o nematide. Por outro lado, valores maiores que 50 % indicam incompatibilidade do produto com o nematide entomopatognico. Conforme comentado anteriormente, alguns aspectos desse protocolo esto sendo estudados por colegas brasileiros, e podem vir a ser alterados, proporcionando uma maior preciso na indicao da compatibilidade dos produtos, o que foi considerado em discusses anteriores como o ponto mais frgil dessa metodologia. Se essas alteraes forem implementadas e apoiadas no decorrer deste trabalho, podero ser utilizadas na elaborao de tabelas de compatibilidade.

3-) REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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