Quim. Nova, Vol. 31, No.

7, 1775-1783, 2008 Anestsicos locAis: interAo com membrAnAs biolgicAs e com o cAnAl de sdio voltAgem-dependente daniele ribeiro de Araujo e eneida de paula Departamento de Bioqumica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, CP 6109, 13083-970 Campinas - SP, Brasil leonardo Fernandes Fraceto* Departamento de Engenharia Ambiental, Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, Campus Sorocaba, Av. Trs de Maro, 511, 18087-180 Sorocaba - SP, Brasil Recebido em 28/11/06; aceito em 30/11/07; publicado na web em 11/9/08

LOCAL ANESTHETICS: INTERACTION WITH BIOLOGICAL MEMBRANES AND WITH THE VOLTAGE-GATED SODIUM CHANNEL. Many theories about the mechanism of action of local anesthetics (LA) are described in the literature. Two types of theories can be distinguished: those that focus on the direct effects of LA on their target protein in the axon membranes, i.e. the voltage-gated sodium channel and the ones that take into account the interaction of anesthetic molecules with the lipid membrane phase for the reversible nerve blockage. Since there is a direct correlation between LA hydrophobicity and potency, it is crucial to take this physico-chemical property into account to understand the mechanism of action of LA, be it on the sodium channel protein, lipid(s), or on the whole membrane phase.

Keywords: local anesthetic; membrane; voltage-gated sodium channel.

introdUo Anestsicos locais (AL) compreendem um grande nmero de molculas, de diferentes estruturas qumicas, como amino-steres, amino-amidas, amino-cetonas, amidas, lcoois, tio-steres, tioamidas, derivados de uria, politeres,1 derivados de monoterpenos do carano2 etc, capazes de bloquear reversivelmente a conduo do estmulo nervoso. As aes estimulatrias e euforizantes da cocana, presente em grandes quantidades nas folhas de Erythroxylon coca, so conhecidas h sculos pelos povos andinos. Mas foi somente em 1860 que a cocana foi isolada pela primeira vez por Albert Niemann, que constatou que a mesma causava entorpecimento da lngua. As propriedades anestsicas da cocana levaram sua classificao como o primeiro anestsico de ao local. Em 1884, Carl Koller introduziu a cocana na prtica clnica como um anestsico para cirurgia oftalmolgica3 e at o incio do sculo XX era possvel encontrar produtos cujo princpio ativo era a cocana (Figura 1). Experincias posteriores, realizadas por Sigmund Freud e outros, demonstraram o grande potencial para desenvolvimento de dependncia qumica, o que levou proibio do uso da cocana em 1914.

Figura 1. Estrutura qumica da cocana *e-mail: leonardo@sorocaba.unesp.br

Diferentes AL utilizados atualmente na clnica originam-se dessas primeiras observaes clnicas.4,5 A tentativa de diminuir o potencial txico da cocana levou ao desenvolvimento de anlogos sintticos e, em 1890, sintetizou-se a benzocana, um ster derivado do cido benzico, assim como a cocana. Mas foi em 1904 que apareceu o primeiro AL sinttico com potencial uso infiltrativo, a procana, que se tornou o prottipo dos AL durante quase meio sculo.6 Outros derivados do cido para-amino benzico, como a procana, foram sintetizados depois e mostraram-se mais potentes (tetracana) e menos txicos (clorprocana) que a mesma (Tabela 1). A toxicidade de metablitos do cido para-amino benzico7 e a rpida metabolizao da ligao ster por esterases plasmticas limitavam o uso dos amino-steres, o que impulsionou a busca de novos compostos com atividade anestsica, levando sntese dos AL tipo amino-amida, a partir de 1943 (Tabela 1), os quais atualmente so os agentes mais amplamente utilizados. As amino-amidas so menos potentes que os amino-steres, porm seu grau de toxicidade sistmica relativamente menor,4 alm de serem biotransformadas pelo fgado via citocromo P450, o que confere uma meia-vida plasmtica mais longa em relao aos amino-steres.6,8 Analisando a Tabela 1 v-se que a estrutura qumica tpica dos anestsicos locais se caracteriza por uma regio hidroflica (normalmente um grupamento amina) e outra hidrofbica (em geral um anel aromtico) separadas por um grupo polar do tipo ster ou amida. Uma interessante exceo a benzocana, que no possui um grupamento amina ionizvel e cujo bloqueio nervoso tem caractersticas especiais.9 Os anestsicos locais apresentam valores de pKa entre 7,6-8,9 (Tabela 2), o que pode gerar diferenas na proporo entre a forma neutra (maior partio em membranas10-13) e a carregada (que responsvel pela velocidade de ao4). A Figura 2 mostra uma representao esquemtica da ionizao e da partio diferencial das formas protonada e neutra dos AL, na fase aquosa e membranar, conforme descrito na literatura.10-13

Reviso

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tabela 1. Estrutura qumica dos anestsicos locais

Estrutura 1 Anestsico local Benzocana Procana Tetracana R1 -H -H -C4H9 R2 -CH3 -CH2-N(C2H5)2 -CH2-N(CH3)2 Sntese pKa 1890 1905 1930 8,9 8,6
Figura 2. Representao esquemtica da partio/distribuio dos AL entre gua e membrana, onde: ALH+, molcula de AL com grupamento amino protonado (forma ionizada); AL:, AL com grupamento amino desprotonado (forma neutra); P, coeficiente de partio; Ka, constante de dissociao em gua; Km, constante de dissociao em membrana

Estrutura 2

Lidocana

-CH3

1943

7,9

Etidocana

-CH3

1970

7,7

Por serem molculas anfiflicas, os AL tm grande afinidade pelas membranas celulares. Em membranas excitveis, eles inativam canais de sdio voltagem-dependentes, impedindo o influxo de ons necessrios despolarizao da membrana.4 As amino-amidas, como a lidocana e a bupivacana, e aminosteres, como a tetracana e benzocana, so muito usados clinicamente.11 A importncia clnica da lidocana, uma amino-amida de carter ionizvel, e as propriedades particulares da benzocana (citadas acima), um ster de baixa solubilidade e bastante empregado em anestesia tpica, nos levaram a escolher essas duas molculas como modelos de estudo. Hipteses pArA o mecAnismo de Ao dos Anestsicos locAis

Prilocana

-H

1972

7,7 As teorias propostas para explicar os mecanismos de ao dos AL podem ser classificadas em duas categorias: a que atribui o efeito anestsico ligao destes compostos protena canal de sdio e a que considera a interao dos AL com os componentes lipdicos da membrana (conhecida como hiptese do lipdio) como determinante para o fechamento dos canais de sdio. efeito direto dos Al no canal de sdio Na primeira categoria enquadram-se inmeras tentativas de explicar a ligao direta dos AL em um ou mais stios especficos do canal de sdio voltagem-dependente, alterando sua conformao e levando inativao temporria do canal.12 Trabalhos na literatura mostram vrias evidncias da interao de AL com outras protenas alm do canal de sdio voltagem dependente, dentre elas, as sinalizadoras como: calmodulina, canais de potssio, receptores de acetilcolina, ATPases microssomais e mitocondriais, citocromo oxidase, protena G, protena EnvZ - que age na transduo de sinais por ativao da porina e protena quinase C, receptores de serotonina 1A, protena tirosina kinase e receptores de opiides.13-18 Desde os trabalhos pioneiros de Hodgkin e Huxley,19 em 1953, sabe-se que os anestsicos locais tm efeito direto nos canais de sdio e que interagem com diferentes graus de afinidade com essas protenas, dependendo de seu estado funcional (ativado, inativado, em repouso). Inicialmente postulou-se que essa afinidade diferencial estaria relacionada presena das formas carregada e neutra dos anestsicos em pH fisiolgico. Esta idia foi bastante fortalecida quando, na dcada de 70, alguns pesquisadores verificaram que anlogos quaternrios de AL (sempre carregados) bloqueavam a conduo nervosa somente quando aplicados internamente na face citoplasmtica - de axnios gigantes de lula perfundidos. Tais

Mepivacana

-CH3

1957

7,6

Bupivacana

-CH3

1957

8,1

Ropivacana

-CH3

1987

8,1

tabela 2. Propriedades dos anestsicos locais AL Potncia* Toxicidade (DL50 i.v.) mg/kg 367 13 19,5 6,7 280 7,8 Tempo de anestesia (h) 1 0,75 8 1,5 1,5 8 1,5 8 Meia-vida (h) 0,1 0,1 2,5 1,5 1,5 3,0 1,5 2,5 11,0

Procana Clorprocana Tetracana Benzocana Lidocana Prilocana Etidocana Mepivacana Bupivacana Dibucana
*

1 4 16 4 3 16 2 16 16

Concentrao para bloqueio, relativamente da procana.

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Anestsicos locais: interao com membranas biolgicas e com o canal de sdio

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resultados foram interpretados como indicativos de que a forma carregada dos AL seria a responsvel pelo efeito anestsico (ligao direta no canal) e que, como o stio de ligao seria acessvel apenas a partir da face interna da membrana,20,21 restaria forma neutra dos AL (mais hidrofbica) a funo de facilitar a penetrao dos anestsicos nas membranas. No entanto, a boa potncia anestsica de compostos como a benzocana e seus anlogos, que no se protonam em pH fisiolgico, no encontrava apoio nesta descrio de stio nico para os AL protonados.22 Alm disso, a grande variedade estrutural de molculas com ao anestsica local levava a crer na existncia de mais de um stio receptor, ou de mais de uma via para o mecanismo de ao desses frmacos.12 O desenvolvimento quase simultneo, na dcada de 80, de tcnicas de mutao stio-dirigida e patch-clamp permitiram estudar regies especficas do canal (candidatas a stios de ao dos AL) e tambm a eletrofisiologia de canais isolados, levando a um crescimento intenso nas pesquisas envolvendo protenas canal.23 Em 1994, Catterall e colaboradores, usando tcnicas de biologia molecular, conseguiram demonstrar a existncia de um stio hidrofbico na protena canal de sdio, para a forma neutra dos AL, situado no interior da bicamada, isto , em uma -hlice transmembranar (S6, no domnio IV da subunidade Figura 3) da protena canal de sdio voltagem-dependente de crebro de ratos. Estes autores mostraram que a substituio de resduos hidrofbicos como a fenilalanina (1764) por alanina fazia decrescer, de 10 a 100 vezes, o bloqueio causado por AL nestes canais.24,25

interaes no especficas entre anestsicos locais e membranas Na hiptese do lipdio considera-se que as alteraes causadas pelos anestsicos nas propriedades estruturais e dinmicas da matriz lipdica levariam a mudanas conformacionais no canal de sdio, explicando sua inativao.30 Estudos clssicos da literatura mostram que os AL agem sobre sistemas membranares, alterando-os de diversas maneiras. Analisando apenas a fase lipdica membranar, foram observados efeitos de expanso da bicamada e diminuio na temperatura de transio de fase principal, o que aumentaria a fluidez e a permeabilidade da membrana.13 A incorporao de AL pela fase lipdica causa uma expanso da rea superficial de monocamadas31 e bicamadas;32,33 esta expanso seria favorecida pela diferena entre o comprimento da molcula do AL (mais curto) e dos fosfolipdios. Assim, abaixo do seu ponto de insero o anestsico criaria um volume livre, que seria compensado com uma mudana conformacional das cadeias acilas dos lipdios adjacentes, causando diminuio no comprimento total da bicamada e expanso lateral da mesma.34,35 De fato, Hill36 observou uma diminuio da espessura da bicamada, seguindo alteraes da temperatura de transio de fase causadas por anestsicos gerais, locais e lcoois. Diminuies na temperatura de transio de fase foram observadas por diferentes grupos de pesquisadores utilizando vrias tcnicas. Lee,37,38 empregando calorimetria, registrou diminuio da temperatura de transio de fase de vesculas, constitudas pelo lipdio dipalmitoil fosfatidilcolina, causada pela partio dos AL benzocana, procana, tetracana, lidocana e dibucana, em concentraes iguais s necessrias para 50% de bloqueio na conduo do estmulo nervoso. Esses achados foram depois descritos tambm para a forma neutra da procana, tetracana, lidocana e bupivacana, pela tcnica de espalhamento de luz.39 O efeito dos AL no empacotamento dos fosfolipdios em membranas modelo e biolgicas foi bastante estudado por ressonncia paramagntica eletrnica (RPE) e outras tcnicas espectroscpicas, como ressonncia magntica nuclear (RMN), infravermelho e fluorescncia.13 Atravs da tcnica de absoro no infravermelho, demonstrouse a incorporao da dibucana e procana em monocamadas de palmitoiloleil fosfatidilcolina, estudando as bandas de absoro dos compostos, entre 1400 e 1800 cm-1.40 A combinao de estudos de infravermelho com variao de presso possibilitou a Auger e colaboradores demonstrarem que a tetracana, incorporada em membranas sintticas (dimiristoilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilserina e dipalmitoilfosfatidilcolina) e biolgicas, expulsa da bicamada por aumento da presso.41,42 Esse achado veio explicar observaes anteriores, in vivo, de reverso do efeito de anestsicos com aumento de presso43 e explicar porque os AL penetram menos em membranas biolgicas, com a diminuio da temperatura.44 Ainda utilizando infravermelho, um estudo mostrou a diferente insero de dois anestsicos locais (lidocana e benzocana) em vesculas unilamelares de fosfatidilcolina de ovo.45 Neste estudo, a lidocana (na forma neutra) e a benzocana inserem-se prximas regio do glicerol, enquanto que a lidocana carregada se localiza prxima ao grupamento fosfato/colina dos fosfolipdios. Medidas de fluorescncia revelaram importantes informaes sobre a localizao de AL em vesculas fosfolipdicas. Estudos utilizando o AL tetracana como supressor de fluorescncia de marcadores fluorescentes incorporados em diferentes profundidades no interior da bicamada indicaram uma insero da forma neutra do anestsico nas regies menos polares, alm de detectar diferentes mobilidades locais nas cadeias acilas dos fosfolipdios.46,47

Figura 3. Representao da subunidade do canal de sdio de crebro de mamferos e arranjo dos quatro domnios ao redor do poro central deste. Cada domnio apresenta seis hlices transmembranares (S1-S6)

Atualmente, a forma mais aceita de interpretar os inmeros resultados envolvendo a interao entre anestsicos locais e protena canal dada pela hiptese da afinidade modulada pelo receptor (receptor-modulated) formulada por Hille, em 1977, que admite a existncia de um ou mais stios de ligao (receptor) para os AL no canal de sdio. As diferentes afinidades desses frmacos pelo(s) stio(s) seriam moduladas pelo estado conformacional do canal, sendo maior a afinidade pelo estado inativo ou em repouso que pelo estado aberto.26,27 Em 1987, Starmer28 props, alternativamente, a hiptese do receptor guardado ou protegido (guarded receptor), que assume que os rearranjos conformacionais do canal de sdio que acompanham a despolarizao permitem o acesso da molcula do anestsico ao seu stio receptor, cuja afinidade seria sempre constante. Esta proposta, no to conhecida ou aceita quanto a de Hille, tem a vantagem de conceber interaes entre o AL e outros estados conformacionais do canal, que no somente o inativado. Assim, os AL poderiam agir como efetor alostrico que, ao interagir em seu(s) stio(s) especfico(s) estabilizariam o canal no estado inativado, j que os quatro domnios da subunidade alfa esto envolvidos na inativao lenta produzida pelos AL.29

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Medidas de ressonncia paramagntica eletrnica (RPE) foram realizadas com AL modificados, isto , covalentemente ligados a radicais nitrxido48,49 e tambm empregando radicais nitrxido ligados a cidos graxos ou seus derivados.35,50-54 Esses estudos mostraram que a incorporao dos AL na bicamada lipdica acompanhada por uma diminuio de ordem e aumento na dinmica membranar. Em um estudo sistemtico envolvendo AL das sries amino-amida e amino-ster53 foi observado que o efeito de diminuio da organizao de membranas lipdicas no est relacionado diretamente hidrofobicidade ou classe dos AL. Esses resultados foram reforados por outro estudo realizado em nosso laboratrio, que correlacionou resultados de ressonncia magntica nuclear (RMN) e RPE na anlise da interao de AL com membranas multilamelares22 (grandes) e unilamelares (pequenas) de fosfatidilcolina de ovo.22,54 Foram encontradas evidncias de que parmetros estricos dos AL determinariam sua localizao preferencial no interior da bicamada. Os primeiros experimentos empregando RMN de hidrognio detectaram imobilizao da molcula do AL quando intercalado na bicamada lipdica,55-59 isto , um efeito semelhante ao observado por RPE com anlogos paramagnticos dos AL.48,49 Com experimentos de RMN de deutrio, 2H-RMN, e a utilizao de AL e lipdios seletivamente deuterados foi possvel, pela primeira vez, identificar as regies da membrana lipdica nas quais se inseriam preferencialmente os AL.60-65 O trabalho de Boulanger e colaboradores60 tornou-se citao obrigatria na rea, sendo citado at os dias de hoje por ter demonstrado, inequivocamente, a localizao diferencial das formas protonada (mais superficial) e neutra da tetracana em vesculas de fosfatidilcolina de ovo. Resultados semelhantes foram encontrados com o anestsico local dibucana por 2 H-RMN onde se observou uma localizao prxima aos primeiros carbonos do glicerol.66 Medidas de 1H-RMN foram favorecidas com o desenvolvimento de espectrmetros de RMN de alta resoluo e de novas tcnicas, que possibilitaram a obteno de informaes sobre a localizao dos AL. Trabalhos na literatura relatam sobre a perturbao da bicamada provocada pela insero de tetracana, procana e dibucana, bem como a sua localizao no interior das bicamadas,67-69 sendo estes de acordo com os achados de estudos utilizando 2H-RMN. No entanto, poucos relatos na literatura tratam da forma neutra dos AL,9,13,22,46,53,54,60-62,64,70,71 a despeito da maior interao desta com a fase lipdica da membrana e das evidncias de que o pK aparente de diferentes AL10,37,38,50 diminui significativamente na presena de membranas com interfaces zwitterinicas, com o conseqente efeito sobre a proporo da forma catinica e da forma neutra do AL. Acredita-se que a dificuldade imposta pela baixa solubilidade aquosa dos AL desprotonados, alm da falsa idia introduzida a partir dos trabalhos de Narahashi e Frazier20,21 de que a forma protonada dos AL seria a responsvel pelo mecanismo de ao dos AL, tenha limitado seu estudo at aqui. A importncia da forma neutra dos AL s foi retomada na dcada de 90, depois que os trabalhos de Ragsdale e colaboradores24,25 mostraram interao entre anestsicos no carregados e a protena canal de sdio. estrUtUrA do cAnAl de sdio voltAgemdependente O canal de sdio (Figura 3) uma glicoprotena de membrana que se encontra principalmente em axnios e msculo e ativada pela despolarizao da membrana abrindo seu poro central e permitindo a entrada de sdio, o que leva propagao do estmulo nervoso; seletiva ao on sdio (a passagem de K+ equivale a cerca de 8% da de Na+). Estudos indicam que os canais de sdio voltagemdependentes so compostos por uma subunidade (formadora do

poro do canal) podendo estar associada a quatro diferentes tipos de subunidades .72-74 No caso de canais de sdio de crebro de rato, experimentos usando anticorpos anti-peptdeos das subunidades 1 e 2 mostraram que a maior parte destes tm ambas subunidades .73,74 A subunidade tem 260 kDa e quatro domnios homlogos (IIV), cada qual contendo 6 hlices transmembranares;73,74 as subunidades tm 23 e 21 kDa cada, sendo que 2 est ligada subunidade por pontes dissulfeto, enquanto 1 liga-se no covalentemente a .23 Cada subunidade tem um grande segmento amino terminal extracelular, com vrias regies de consenso para N-glicosilao. Canais de msculo esqueltico tm a subunidade (260 kDa) e uma ou duas subunidades (com 38 kDa cada), enquanto os canais voltagemdependente de enguia e de corao de galinha apresentam apenas a subunidade .72 Canais de sdio pertencem mesma famlia dos canais de potssio e de clcio voltagem-dependentes, com os quais sua arquitetura molecular guarda vrias similaridades.74 O canal de sdio o mais estudado dos canais voltagemdependentes. A presena dessa protena determina a especializao funcional de muitos tipos de clulas, como neurnios sensoriais e clulas cardacas, principalmente em processos fisiolgicos, como dor, inflamao e contratilidade. A via mais eficaz para correlacionar a expresso de canais de sdio voltagem-dependentes com as caractersticas biofsicas de clulas excitveis determinar propriedades como velocidade de conduo do potencial de ao e influxo de sdio, o que tem auxiliado cada vez mais no entendimento de seu mecanismo de ao, bem como de agentes que agem sobre o canal como anestsicos locais e toxinas.75 Em 1952, Hodgkin e Huxley demonstraram que os fenmenos de abertura (gating) e permeao de ons estavam relacionados com mais de dois estados funcionais: aberto, fechado e inativado.19 Essa protena foi tambm o primeiro canal desse tipo a ser clonado23 e seu estudo beneficiou-se ainda do desenvolvimento, na mesma poca, da tcnica de patch-clamp, que permite a medida do potencial eltrico de canais isolados.76 A caracterstica dessa famlia de canais voltagem-dependentes a presena de quatro domnios transmembranares homlogos (canais de sdio e clcio) ou quatro subunidades homlogas (canais de potssio), onde cada domnio ou subunidade apresenta seis segmentos em -hlice, S1 a S6, como mostrado na Figura 3.72,74,77 Os domnios ou subunidades organizam-se de forma a apresentar um poro central seletivo ao sdio. Segundo Marban e colaboradores,74 os canais de sdio devem ter surgido a partir da mutao de canais de clcio que, por sua vez, evoluram por duplicao da informao gnica dos canais de potssio. Em cada domnio ou subunidade a -hlice S4 - contendo vrios resduos de aminocidos carregados positivamente - tem importncia fundamental no processo de abertura do poro em ambos os canais. Como esses canais voltagem-dependentes no possuem uma molcula ativadora especfica, as -hlices S4 formam a regio sensora ou de disparo do canal (voltage-sensing ou gating sensor).77 A mudana do potencial da membrana desestabiliza o segmento S4, cujas cargas positivas so mantidas por pareamento com cargas negativas de outros segmentos transmembranares. Com a despolarizao da membrana reduzem-se as foras que mantm as cargas positivas de S4 na sua posio e a hlice inteira sofre uma rotao (movimento espiral de cerca de 60 o, projetando-se em 5 para fora da bicamada, do lado extracelular). Esse movimento deixa uma carga negativa no pareada no interior da bicamada e expe uma carga positiva na superfcie externa da membrana, resultando na transferncia de carga lquida de +1.72 Outra similaridade entre os canais o filtro de seletividade, formado pelas alas extracelulares S5-S6 (denominadas segmentos

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P) dos domnios I a IV. Essa uma regio bastante conservada entre os canais de Na+, K+ e Ca+2 e considerada o filtro do canal, pois as alas se dobram sobre o poro, como demonstrado com resoluo de 3,2 por cristalografia de Raios-X dos canais de K+.78 Nos canais de sdio, outra regio extremamente importante o stio de inativao (inactivating gate), formado pela ala intramembranar entre os domnios III (S6) e IV (S1), que se projeta (como tampa ou porto) sobre o lmem interno do poro, inativando-o.77,79 Anticorpos preparados contra esse segmento so capazes de inibir completamente a inativao do canal.79 Estudos de mutao stio-especfica mostraram que os resduos isoleucina-fenilalanina-metionina (IFM, nas posies 1488, 1489, 1490 do canal de sdio de crebro humano), ali situados, so fundamentais para a inativao espontnea do canal e formariam o trinco do porto, mantendo-o fechado sobre o poro,77,79 como ilustrado na Figura 4. J os segmentos S5 e S6 de cada um dos domnios do canal de sdio so organizados na protena de forma a constituir a parte interior do poro do canal.80,81

tabela 3. Regies estudadas do canal de sdio e suas respectivas funes, de acordo com trabalhos de mutao stio especfica e eletrofisiologia Regio Hlice S4 (Domnio IV) Alas S5-S6 (Domnios I-IV) Funo Regio sensora (gating sensor) responsvel pela ativao do canal Filtro de seletividade inica, composto pelo dobramento das alas (segmentos P) Refs. 72-74, 82, 83, 86, 87 72-74, 83-85

Ala S6-S1 (Domnios III-IV)

Partcula de inativao 72-74, 82-88 (inactivating gate particle) ou tampa interna do canal; inclui tambm o stio de fosforilao por protena quinase C Formam o poro do canal Stios de fosforilao pela protena quinase dependente de AMPc 72-74, 82-88 72-74

Hlice S5 e S6 (Domnios I-IV) Ala S6-S1 (Domnio I e II)

Figura 4. Modelo para ativao e inativao do canal de sdio voltagem dependente

Stios de regulao - por fosforilao - pela protena quinase dependente de AMPc foram encontrados na isoforma neuronal e em vrias isoformas cardacas do canal, especificamente na ala intracelular entre os domnios I e II;74 a fosforilao diminui a amplitude da corrente e altera a condutncia total da clula. A protena quinase C tambm altera o funcionamento de todas as isoformas dos canais de sdio de mamferos. O stio de fosforilao uma serina, altamente conservada, na ala entre os domnios III e IV; a fosforilao pela protena quinase C reduz a condutncia mxima do canal e altera sua ativao.72-74,82-88 A Tabela 3 resume as informaes acima, apresentando regies especficas relacionadas a diferentes funes ou regulao do canal de sdio voltagem-dependente. compostos QUe interAgem especiFicAmente com o cAnAl de sdio e modiFicAm seU FUncionAmento Molculas que interagem especificamente com o canal de sdio incluem toxinas, anestsicos locais e anticonvulsivantes (carbamazepina, fenitona, cido valprico, entre outros).86 Vrias toxinas so capazes de impedir a conduo do estmulo nervoso ao se ligarem fortemente e especificamente ao canal de sdio voltagem-dependente. Estudos farmacolgicos com canais de sdio indicam que neurotoxinas agem em stios distintos no canal de sdio e apresentam como efeitos primrios alteraes na permeao inica (poro do canal) e na regio sensora de canais de sdio voltagemdependente.81 Estes sitios de ao foram encontrados por estarem alostericamente acoplados, sugerindo que mudanas conformacionais induzidas pela ligao de neurotoxinas alteram o equlbrio entre os estado aberto e os estados fechado/inativado.81 Um resumo das in-

Alas S3-S4 e Stios de glicosilao S5-S6 (Domnio I), Alas S1-S2 e S5-S6 (Domnio II) e ala S5-S6 (Domnio III)

73

teraes das toxinas com canais de sdio voltagem-depentente est apresentado na Tabela 4.81 J para o entendimento do mecanismo de ao dos anestsicos locais, postulou-se inicialmente que estes compostos poderiam agir de forma semelhante a bloqueadores de origem natural (neurotoxinas), ou seja, na parte extracelular do canal. Porm, j nos anos 70, Narahashi e colaboradores mostraram que anestsicos locais carregados causavam bloqueio de canais de sdio quando infiltrados pelo lado citoplasmtico da membrana de axnios de lagosta.20,21 Embora aminas ionizveis representem a grande maioria das molculas com atividade anestsica, h excees importantes (como o ster benzocana) e o entendimento de que tanto as formas neutra quanto a protonada dos AL devem ser consideradas na sua ao sobre o canal de sdio uma premissa recente. Os achados de Narahashi e colaboradores20,21 desviaram a ateno dos pesquisadores da importncia de ambas as formas dos AL, embora no explicassem como a benzocana, uma molcula neutra em pH fisiolgico, produz bloqueio tnico e dose-independente durante repetidas despolarizaes.22 Ao longo dos anos, vrios trabalhos relevantes apareceram na literatura tentando descrever os mecanismos moleculares envolvidos com o efeito farmacolgico dos AL.24,25,80,88-91 As primeiras descries da interao AL-canal de sdio s apareceram na dcada de 90, atravs de tcnicas de mutao stio-especfica. Ragsdale e colaboradores24,25 demonstraram a existncia de um stio hidrofbico para o anestsico local Etidocana no interior da -hlice S6 do domnio IV da subunidade da protena canal de sdio de crebro.91 Segundo Ragsdale e colaboradores a -hlice S6 (domnio IV), prxima ao lmen interno do canal, constituiria o stio de ao dos anestsicos

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tabela 4. Stios de ao identificados para neurotoxinas nos canais de sdio voltagem dependentes Toxina Stio 1 Tetrodotoxina Saxitoxina Domnio I (S5-S6) II (S5-S6) III (S5-S6) IV (S5-S6) -conotoxina I (S5-S6) II (S5-S6) III (S5-S6) IV (S5-S6) Stio 2 Veratridina Batrachotoxina Grayanotoxina Stio 3 Toxinas de escorpio Toxinas de anmona do mar Stio 4 Toxinas de escopio IV (S6) I (S5-S6) IV (S5-S6) E1613 F1579, N1584, Y1586, I1760, I1764 I (S6) Aminocido D384, E387, Y385 E942, E945 K1422, D1426 D 1426 D400, Y401, W402, E403 A728, A730, E758 W1239, D1241 W1531, D1532 I433, N434, L437

Toxinas de aranhas IV (S3-S4) E1616, V1620, L1624 I (S5-S6) II (S1-S2) II (S3-S4) III (S5-S6) Stio 5 Stio 6 Stio para toxina excitatria Stio para toxina depressora Brevetoxina Ciguatoxina -conotoxinas I (S6) IV (S5) ? ? ? G845

Toxinas excitatrias I (S5-S6) de escorpio III (S5-S6) IV (S5-S6) Toxinas depressoras I (S5-S6) de escorpio III (S5-S6) IV (S5-S6) ? ?

locais com dois resduos aromticos de aminocidos, F1764 (situada no meio da -hlice transmembranar, correspondente regio de estreitamento do canal de K+ revelada pelos estudos de Raios-X78) e Y1771 (prxima face interna da membrana) seriam fundamentais para a interao com o AL.24 O possvel modo de interao (hidrofbico, ction-eltron ou aromtico-aromtico) foi demonstrado posteriormente ser a interao dependente do estado do canal,92 indicando que o stio de ao uma estrutura dinmica. Alm dessa regio, os resduos de aminocidos L1465, N1466, I1469 na hlice S6 do domnio III e o resduo de I409 na hlice S6 do domnio I parecem fazer parte do stio de ligao dos anestsicos locais.80 Um estudo utilizando mutaes de aminocidos do canal de sdio de msculo esqueltico de rato por cistena encontrou que vrios aminocidos podem determinar a ligao da lidocana, dentre eles: I424, I425 e G428 na hlice S6 do domnio I e I782 e V786 da hlice S6 do domnio II, baseado na observao de que as mutaes por cistena destes resduos alteram a sensibilidade do canal quando em presena de lidocana.93

Desta forma, so fortes as evidncias de que o stio de ligao dos AL envolve mltiplos segmentos S6 dos domnios do canal de sdio voltagem-dependente. Este fato implica que os segmentos S6 estariam prximos no espao, contribuindo assim para a interao com uma molcula pequena como a dos anestsicos locais.88 No entanto, estes pontos de contato no so estticos e podem depender de ambos, do estado do canal e do tipo de anestsico local testado. Por outro lado, se a ligao do anestsico ocorresse somente nas hlices S6, isto , alterasse diretamente estruturas relacionadas ao poro do canal, no seria possvel justificar que modificaes na partcula de inativao alterassem a ao do anestsico local, como demonstrado por Bennett e colaboradores.94 Kuroda e colaboradores, empregando 1H-RMN, encontraram resultados que indicariam a interao dos AL com a partcula de inativao, isto , a ala entre o domnio III (-hlice S6) e IV (-hlice S1) que mantm o canal fechado durante o perodo refratrio (perodo em que um novo potencial de ao no pode ocorrer em uma fibra excitvel devido ao fato de a membrana estar despolarizada pelo potencial de ao anterior) e perodo de repouso (perodo quando no se tem sinais nervosos transmitidos, tendo um valor de potencial de membrana de cerca de -90 mV). Segundo esses autores, a presena do anestsico nesta regio prolonga o estado inativado do canal de sdio, tornando impossvel a transmisso do impulso nervoso.66 Concomitantemente, estudos de mutaes stio-especficas95-100 revelaram que a ala que liga as -hlices S4 e S5 do domnio IV seria tambm importante para o processo de inativao do canal.77,97, 99,100 A pequena ala intracelular que conecta os segmentos S4 e S5, tanto no domnio III99 quanto no domnio IV,77,98 tem sido sugerida como boa candidata a este papel regulador. McPhee e colaboradores mostraram que os resduos F1651, L1660 e N1662 da ala S4-S5 do domnio IV estabelecem interaes com os resduos IFM da partcula de inativao do canal de sdio, tanto inativado quanto fechado.97 Estudos de mutao stio-especfica mostraram que a substituio de resduos hidrofbicos anteriores a P1473 da ala S4-S5 do domnio IV levaram a canais no funcionais, indicando que esta ala intracelular tem um papel importante na inativao de canais de sdio de msculo esqueltico de rato99,100 e de msculo cardaco humano.98 Yang e colaboradores101,102 demonstraram a existncia de interaes espaciais entre resduos no polares desta ala citoplasmtica e resduos do canal, em resposta despolarizao, resultados que levaram Filatov e colaboradores100 a sugerir que estas interaes facilitariam a formao de um stio de existncia transitria, para ligao da partcula de inativao, estabilizando o canal no estado inativado. Como os determinantes estruturais da inativao rpida do canal so os resduos hidrofbicos (IFM) da partcula de inativao, a existncia de um receptor para a partcula de inativao poderia explicar a estabilizao do canal no estado no-condutor. Este receptor seria formado pelos resduos da parte final (intracelular) da hlice S6 do domnio IV e tambm pelas alas S4-S5 dos domnios III e IV, segundo recente reviso de Nau e Wang,88 o que cria a hiptese de um outro possvel stio de ao dos anestsicos locais, uma vez que os anestsicos tm uma interao preferencial com a forma inativa do canal de sdio.26 A ligao do anestsico a este receptor estabilizaria a interao receptor-partcula, e poderia ser a responsvel pelo mecanismo de inativao dos canais induzido por AL. Nosso grupo recentemente apresentou a hiptese de que a ala citoplasmtica S4-S5 do domnio IV (que faz parte da partcula de inativao) seja um stio de ao de lidocana e benzocana.9 A estrutura tridimensional desta ala citoplasmtica S4-S5 do domnio IV foi determinada por 1H-RMN em micelas de dodecilsulfato de sdio103 e em trifluoretanol.9 A interao com dois anestsicos locais (lidocana e benzocana) foi estudada por 1H-RMN,9 indicando que a interao se d com resduos hidrofbicos da ala. Esta regio importante

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Anestsicos locais: interao com membranas biolgicas e com o canal de sdio

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tabela 5. Regies de interao entre anestsicos locais e canal de sdio voltagem-dependente Regio Hlice S6 (Domnios I a IV) Ala S6-S1 (Domnios III-IV) Hlice S6 (Domnio IV) Ala S4-S5 (Domnio IV) Ala S4-S5 (Domnio III) Importncia Refs. Maiores evidncias de stio de 24, 25, 80, ligao de anestsicos locais 88, 93 Regio da partcula de 66 inativao - Motivo IFM Parte do receptor da partcula 71 de inativao e stio de ligao de anestsicos locais Partes do receptor da partcula 9,88 de inativao, relacionada com a inativao do canal

para o mecanismo de ao dos anestsicos locais, pois estabiliza o fechamento do canal pela partcula de inativao, favorecendo o estado inativado do canal de sdio voltagem-dependente. Um trabalho recente, de dinmica molecular in silico, mostrou o docking do AL benzocana na hlice S6 do domnio IV.71 Neste trabalho os autores, embora tenham focado somente em resduos na regio da hlice S6 do domnio IV, reconheceram que este pode ser um possvel stio de ao da benzocana. No entanto, descrevem que uma melhor investigao em outras regies do canal deva ser realizada.71 A Tabela 5 resume as regies descritas na literatura como possveis stios de ao dos anestsicos locais em canais de sdio voltagem-dependentes. conclUses Os mecanismos de ao dos AL propostos na literatura envolvem tanto a interao com a fase lipdica membranar quanto com stio(s) na protena canal de sdio voltagem-dependente, como representado esquematicamente na Figura 5.

membranas, o que facilitaria seu acesso aos stios de ao na protenacanal e determinaria a potncia do bloqueio nervoso.13 Sabe-se ainda que a interao especfica dos AL com os canais de sdio dependente do estado conformacional destes, ocorrendo preferencialmente quando do estado inativado, provocando desta forma a no conduo de ons. Quanto maior o nmero de canais na forma inativada, mais fcil a instalao do bloqueio, tal que o aumento na freqncia de estimulao de uma fibra possibilita que mais canais se abram, se fechem e se inativem, aumentando a afinidade pelos AL. Este fenmeno denominado bloqueio dependente de freqncia ou bloqueio uso-dependente.105 De acordo com as idias do clssico trabalho de Hille,26 outras regies dos canais devem ser consideradas como potenciais stios de ao para os AL. Essas regies incluiriam os resduos hidrofbicos da ala entre os domnios III e IV da partcula de inativao,24 resduos prximos prolina da ala S5-S6 dos domnios I e IV, envolvidos com o controle da seletividade especfica dos canais,106 bem como a ala intracelular, que seria parte do receptor para a partcula de inativao.90,97-100 A teoria do receptor modulado (modulated-receptor hypothesis) pressupe a existncia de stios de ligao para AL que convertem estados de baixa e alta afinidade, durante as transies entre os estados aberto e inativado. De fato, em 1987 Starmer28 teorizou que a ligao dos anestsicos ao canal de sdio seria regulada por rearranjos do canal durante o processo de despolarizao-repolarizao, tal que o acesso da molcula anestsica ao seu(s) stio(s) de ao somente seria possvel aps a despolarizao, o que ficou conhecido como a hiptese do receptor protegido (guarded receptor hypothesis).28 Neste contexto acreditamos que, de acordo com a hiptese de Starmer,28 os AL interagem com o receptor da partcula de inativao do canal, que se forma transitoriamente durante o processo de despolarizao, estabilizando-o e mantendo o canal de sdio em seu estado no condutor. interessante considerar que a existncia transitria do receptor para a partcula de inativao que tem um papel central no processo de inativao do canal talvez explique a dificuldade de se demonstrar, experimentalmente, a existncia de stio(s) de ligao para os AL e a elucidao inequvoca do mecanismo da anestesia. AgrAdecimentos FAPESP (Proc. Fapesp. 2006/00121-9) pelo auxlio financeiro e ao CNPq pela bolsa de produtividade em pesquisa (E. Paula, Proc. 300197/95-0). reFernciAs

Figura 5. Esquema ilustrativo da interao de anestsicos locais com a fase lipdica e as possveis vias de acesso destes a(os) stio(s) de ao na protena canal de sdio

Prope-se atualmente que os AL se ligam a uma ou mais regies diferentes da protena canal de sdio, bloqueando o transporte desses ons.24,25,86 Por outro lado, a correlao direta entre hidrofobicidade e potncia anestsica revela que a partio/distribuio inespecfica de grande quantidade do AL na bicamada lipdica importante para facilitar o acesso da molcula ao(s) stio(s) de ligao no canal de sdio voltagem-dependente.13 A teoria dos lipdios sugere que o AL, por sua atividade na bicamada lipdica, produza uma alterao no empacotamento dos lipdios, causando uma modificao conformacional nos canais de sdio, o que levaria inativao temporria do mesmo. Tambm interessante notar que essa teoria prev a ligao inespecfica de grande quantidade de AL na fase lipdica, para que haja a alterao significante da fluidez e permeabilidade da membrana.104 a lipofilicidade dos AL que permite a concentrao de grandes quantidades do composto nas

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