UNSA/FACULTAD DE MEDICINA/Dpto. Cs.

FISIOLOGICAS/SECCION BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR/BIOQUIMICA

TALLER 1

Caso Clnico: Reporte de un caso de Hemoglobina S/Talasemia beta

La Hemoglobina S (Hb S) / Talasemia beta es una condicin en la que coexisten una alteracin estructural de la cadena beta (Hb S) y otra anomala cuantitativa de la misma (talasemia beta). El cuadro clnico es variable, pudiendo presentar hallazgos asociados a talasemia (esplenomegalia e ictericia) y drepanocitosis (crisis dolorosas) cuya severidad depender de las cantidades porcentuales de Hb S, Hb A y Hb F que se tenga. Se presenta un caso de la Hemoglobina S/ Talasemia, enfermedad que es bastante frecuente en Africa y en los pases mediterrneos pero inusual en el Per.

Caso clnico
En el mes de julio del ao 2003, se hospitaliz en el Departamento de Pediatra del Hospital Nacional Cayetano Heredia (Lima-Per), una paciente mujer de seis aos de edad, natural y procedente de Lima, sin antecedente de viajes fuera del lugar de procedencia. La paciente ingres con un tiempo de enfermedad de seis das, que se inici con dolor de garganta, razn por la cual acude a un centro de salud, donde le indican amoxicilina 50 mg/kg/da, la cual tom por 2 das, observando leve mejora. Cuatro das antes del ingreso, se aade fiebre (38C, axilar), que cede con Ibuprofeno. Tres das antes del ingreso, se agrega palidez marcada, ictericia progresiva de escleras y mucosas y reaparece pico febril (39C, axilar). Dos das antes del ingreso, presenta adems nauseas y vmitos de tipo bilioso. Examen fsico: Hemodinmicamente estable, afebril. Despierta, conectada con el medio. Presentaba marcada ictericia de piel y escleras. Adems, en abdomen se evidenci hepatomegalia, esplenomegalia. Exmenes auxiliares: Hemoglobina 8,6g/dl (VN 11 15); Hematocrito de 23%, Hemoglobina corpuscular media 24.3pg/clula (VN 26-33); Reticulocitos 5,5% (VN 0,5 2,5). El frotis de sangre perifrica mostraba hemates microcticos e hipocrmicos. Tambin se observaban clulas diana y clulas falciformes. Adems se evidenciaba anisocitosis y poiquilocitosis. ______________________________________________________________________________ Este Reporte se ha modificado con fines didcticos.

La hemoglobina presente en su sangre fue separada por electroforesis a pH 8,6 en acetato de celulosa y un nmero anormal de hemoglobinas fueron encontradas. Las hemoglobinas fueron ensayadas para globinas y . La Hemoglobina 1 posee ambas cadenas de globina y , la Hemoglobina 2 contiene solamente la hemoglobina . La relacin de globina y , en la paciente fue de 1.7: 1,0 (Normal 1,0-1,03). Muestras de globina de Hb 1 y de Hb A, fueron digeridos con tripsina y sus pptidos trpticos fueron separados por electroforesis bi-dimensional y cromatografa en papel. La globina de Hb 1 tambin fue tratada por bromuro de ciangeno (CNBr). Un numero de pptidos fueron generados, el largo de los cuales fue aproximadamente de 50% ms largos que su equivalente en Hb A. BASES CLINICO - MOLECULARES Las hemoglobinopatas son un grupo heterogneo de enfermedades heredadas autosmicamente que se producen por alteraciones cuantitativas o cualitativas de las cadenas de hemoglobina. Se estima que anualmente nacen en todo el mundo 200 millones de personas portadoras de esta alteracin (heterocigotos) y 300 mil personas que padecen la enfermedad (homocigotos). Clnicamente, las ms importantes de todas las hemoglobinopatas son la talasemia y la anemia de clulas falciformes. El trmino "talasemia" proviene del vocablo griego: "thalassa": Mar y "aima": Sangre y hace referencia a la elevada frecuencia con que se observa esta enfermedad entre los habitantes de la cuenca martima que rodea el Mar Mediterrneo. Bajo el nombre de talasemia, se incluye un grupo muy heterogneo de alteraciones congnitas cuya caracterstica comn es un defecto en la sntesis de una o varias cadenas de globina. Cada tipo de talasemia recibe el nombre de la cadena que deja de sintetizarse: alfa talasemia (falta la cadena alfa) y beta talasemia (falta la cadena beta). En el caso de alfa talasemia, se pueden tener 4 situaciones clnicas: hidropesa fetal (si ocurre delecin que afecta a los cuatro genes de globina), enfermedad por hemoglobina H (delecin de tres genes), rasgo alfa talasmico (delecin de dos genes) y alfa talasemia silente (delecin de un gen). En lo referente a beta talasemia, existe un dficit de sntesis por mutacin puntual en las cadenas beta. El trastorno en la produccin de la cadena beta de globina ocasiona el descenso o ausencia de Hb A (2 alfa 2 beta) con aumento de Hb A2 (2 alfa 2 delta) y Hb F (2 alfa 2 gamma). Se tienen 3 situaciones clnicas: beta talasemia menor (con presencia de un gen normal en los heterocigotos), beta talasemia mayor o Anemia de Cooley (son homocigotos para los genes de beta talasemia) y beta talasemia intermedia (que incluye variantes leves del estado homocigoto y algunas formas graves de los heterocigotos) En las talasemias el frotis de sangre perifrica muestra usualmente microcitosis e hipocroma. Por otro lado, la anemia drepanoctica, hemoglobinopata S o enfermedad por clulas falciformes es una patologa causada por mutacin puntual que hace que el cido glutmico sea sustitudo por valina en la sexta posicin de la cadena beta globina.

La clnica de la drepanocitosis incluye palidez de mucosas, fatiga y disminucin de tolerancia al ejercicio. Suele haber ictericia e incremento de bilirrubina en sangre. Se presentan tambin las crisis vasooclusivas, dolor abdominal, lceras en las piernas, necrosis de la cabeza del fmur, sndrome del trax agudo (fiebre, dolor torxico e infiltrados pulmonares), dficit visual, convulsiones, dficit neurolgico grave e incluso coma. Dichas manifestaciones clnicas se presentan frecuentemente cuando el paciente est sometido a episodios de deshidratacin, infeccin, desoxigenacin o fro. Los individuos heterocigotos para la Hb S (Hb A/S) (rasgo falciforme) usualmente son asintomticos y presentan sintomatologa cuando se exponen a situaciones de estrs hipxico. La Hb S/ Talasemia beta es un estado de doble heterocigoto en la cual se produce una alteracin en la sntesis de globina y por otro lado ocurre una alteracin estructural en la hemoglobina. De las hemoglobinopatas "doble heterocigoto" la ms frecuente es la Hb S / C (132/100000) seguida de la Hb S / Talasemia beta (60/100000) en poblacin negra norteamericana. En Per, se cuenta con informacin de un trabajo realizado en Lima por Castillo y colaboradores (1998) quienes estudiaron 5206 muestras de sangre, encontrando que un 7.2% eran hemoglobinas anormales, con 16 tipos de variantes, de los cuales el 3.2% corresponda a Hemoglobina S; 2.1% tenan Talasemia y 0.4% presentaban Hemoglobina S/ Talasemia. Por otro lado, Roa y colaboradores analizaron 234 muestras de sangre de recin nacidos de tres ciudades andinas (Huancayo, Puno y Cerro de Pasco), ubicadas entre 3500 y 4400 metros sobre el nivel del mar, en dicha evaluacin, no se detect ninguna variante anormal de hemoglobina. En dos estudios realizados en Huaral y en Lima, se encontr una frecuencia de 3% y 10% respectivamente de Hemoglobina S en personas de raza negra, presentando la tercera parte de ellos anemia de tipo leve. Dentro de este contexto, es importante precisar que normalmente la Hb F (no mutante) aumenta de manera compensatoria cuando hay disminucin de la Hb A; la cuanta de este incremento es responsable en gran parte de aminorar las manifestaciones clnicas de los pacientes con Hb SS (y de los Hb A/S en situaciones de situaciones de estrs). En cuanto al tratamiento de la Hemoglobina S/Talasemia beta, las alternativas de manejo incluyen el uso de transfusiones (utilizando quelantes de fierro, por el riesgo de hemocromatosis) y cido flico. Tambin es importante una hidratacin adecuada, as como el uso de sintomticos y antibiticos (en el caso de infeccin concomitante). As mismo, la esplenectoma y el transplante alognico de mdula sea constituyen posibilidades teraputicas. La prevencin y el diagnstico prenatal de las hemoglobinopatas deben considerarse alternativas eficaces a seguir en las estrategias de manejo de esta enfermedad. La prevencin debe procurarse en primer lugar mediante el consejo gentico de los portadores heterocigotos. El anlisis del ADN tiene un valor primordial en el diagnstico prenatal. El ADN obtenido por biopsia de vellosidades placentarias o por amniocentesis, permite detectar

fcilmente la alteracin que dio origen a la hemoglobinopata. Caractersticas e identificacin de la hemogloina S En 1949, Pauling y colaboradores examinaron las propiedades fisicoqumicas de la hemoglobina de individuos normales y de pacientes con el rasgo falciforme o con anemia falciforme y realizaron pruebas electroforticas. En el punto isolelectrico, la carga neta de la protena es cero y no existe movilidad. Estos puntos isoelctricos para la hemoglobina normal y la hemoglobina falciforme cuando estn oxigenadas son de 6,87 y de 7,09, respectivamente. Esta diferencia sugiri que exista una variacin entre el nmero o clase de grupos ionizables en las dos hemoglobinas Un cambio en la unidad de pH de una disolucin de hemoglobina se asocia con otro de alrededor de 13 cargas. La diferencia entre la unidades es de 0,23 y corresponde aproximadamente a unas tres cargas por molcula de hemoglobina. Como resultado de la electroforesis se determin que los pacientes con anemia falciforme tienen hemoglobina S pero no hemoglobina A y los pacientes con rasgos falciformes tiene ambas clases de hemoglobina en cantidades aproximadamente iguales. De esta manera se revel que exista una alteracin en la protena debido a un cambio allico en un solo gen relacionado a su sntesis, convirtindose en la primera demostracin de una enfermedad molecular monogenica. La etapa siguiente de estudio consisti en separar las protenas por hidrlisis con proteasas. Despus, se separaron por electroforesis, pero exista mucho solapamiento, luego se realiz una separacin cromatogrfica y las huellas dactilares resultantes fueron altamente reveladoras. Se vio que se trataba de un pptido de 8 aminocidos, se secuencio el pptido y se determin que la diferencia entre la hemoglobina S y A se deba a un aminocido en la posicin 6, es decir que la hemoglobina S contiene valina en lugar de glutamato. La secuencia de los aminocidos de la cadena de la hemoglobina A, es la siguiente:

ARLGAERPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGACEAW R

VYDLGLR LRQRKMLRRERVRAQPCCKPTAYEDEVSFLDAHSRYH

TVHELSARECACV

INTERROGANTES 1. En la cadena beta de la hemoglobina A, cul es el aminocido N terminal? Y cul es el aminocido C terminal?

2. Cul es el numero de pptidos que se obtiene al tratar la cadena Beta de la Hb A con a) Tripsina, b) Pepsina, c) Bromuro de Ciangeno? 3. a)___________ b)____________ c) ______________

Cromatografia

Electroforesis

Origen

Cromatografia

Electroforesis

Origen

Separacin bidimensional de los pptidos obtenidos luego de la digestin triptica de la cadena de la Hb A de un normal (panel superior) y de Hb 1 del paciente (panel inferior)

4. A qu corresponde la Hb 1. A que corresponde la Hb 2?. Cul es la composicin de las cadenas de la Hb A, de la Hb A2?

5. Qu interpretacin le merece el resultado de tratar la cadena beta de la Hb de la paciente con bromuro de ciangeno?

6. Qu alteracin estructural tiene la cadena beta de la Hb de la paciente?

7. Haga una estimativa del PM aproximado de la cadena beta de hemoglobina.

8. Qu es la hemoglobina CS?

9. Cmo explicara la alteracin detectada en la estructura de la hemoglobina de la paciente, las manifestaciones clnicas y laboratoriales observadas?

10. Se puede hacer diagnostico de una talasemia en un recin nacido? Cmo se hara?

11. Indique las diferencias ms importantes desde el punto de vista clnico y molecular entre la anemia falciforme y la enfermedad que portara la paciente estudiada.

12. Si piensa en una talasemia, de que tipo seria?.

13. Qu se puede concluir de la separacin electrofortica y corrido cromatogrfico de la Hb de la paciente, al compararla con un normal?

14. Qu nos puede decir del PI de la Hb S. Qu importancia tiene en la medicina su determinacin.