UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL COMPILADORES: Principal: M. en C. Laura Elena Santana Contreras Colaboradores: M. en C. Ma. Zulema Poncio Acosta Revisado por: Academia de Biologia 2011

Ciudad Jurez, Chihuahua Universidad Autnoma de Ciudad Jurez 2011 p. 45

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

INTRODUCCIN Los microorganismos (bacteria, virus, hongos, protozoarios y algunas algas) pueden encontrarse virtualmente en cualquier parte del medio ambiente, estn presentes en aire, agua, suelo, alimentos etc. Estos organismos son extremadamente importantes en la salud humana y en el ambiente. Las prcticas de laboratorio en este manual ayudaran al estudiante a conocer y manejar adecuadamente algunas de las tcnicas que se utilizan en la realizacin del anlisis microbiolgico de diversas muestras del medio ambiente y conocer los principales grupos de microorganismos objeto de estudio de la Microbiologa Ambiental. El estudiante llevara una bitcora personal en la registrara los siguientes datos: hora en que se llevo a cabo la practica, resultados, clculos, conclusiones, observaciones, entre otros, este registro se realizara durante todo el transcurso de su practica, estas anotaciones le sern de utilidad para realizar el reporte final de laboratorio. Los conocimientos que el estudiante adquiera en este laboratorio se consideran necesarios para la correcta interpretacin y conocimiento de procesos ambientales por un titulado en el rea ambiental y comprenda la importancia de los microorganismos en la biosfera y su papel en el mantenimiento del equilibrio de los ecosistemas.

Contenido
INTRODUCCIN CONTENIDO OBJETIVO GENERAL INDICACIONES DE SEGURIDAD PRCTICA 1. MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE. PRCTICA 2. COLUMNA DE WINOGRADSKY. PRCTICA 3. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO POR DILUCION SERIADA. PRCTICA 4. TINCIONES Y MORFOLOGA MICROSCPICA DE COLONIAS DE SUELO PRCTICA 5. PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS DE SUELO PRCTICA 6. DETERMINACIN DE ORGANISMOS COLIFORMES EN AGUA POR EL MTODO DEL NMERO MS PROBABLE. PRCTICA 7. DETERMINACIN DE ORGANISMOS COLIFORMES EN AGUA POR EL MTODO DE FILTRO DE MEMBRANA PRCTICA 8. ELABORACIN DE VINAGRE. PRCTICA 9. RECUENTO DE ORGANISMOS COLIFORMES EN PLACA EN MUESTRAS DE QUESO. 26 22 14 3 4 5 5 6 11

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OBJETIVO GENERAL El objetivo de este manual es complementar las sesiones tericas de la asignatura de Microbiologa Ambiental impartida en el rea terminal Ambiental del Programa de Qumica. Durante las sesiones de laboratorio, el estudiante desarrollar habilidades y aptitudes en el aislamiento e identificacin de algunos microorganismos y conocer las tcnicas para su aislamiento en matrices como aire, suelo, agua y alimentos, INDICACIONES DE SEGURIDAD Cualquier alumno que sufra alguna alteracin de sus defensas o presente heridas debe comunicarlo al maestro antes de comenzar las prcticas. Slo se permite el acceso al laboratorio a los alumnos que estn realizando las prcticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se est trabajando en el laboratorio. La bata no debe utilizarse fuera del laboratorio. Se prohbe beber, comer o masticar chicle en el laboratorio. Evite llevarse a la boca algn objeto o tocarse los ojos, nariz y boca. No debe depositarse en ningn momento en las mesas de trabajo libros, ropa u objetos personales. Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, as como de los microscopios que haya usado. Utilizar los mecheros Bunsen con precaucin, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobar que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio. Est prohibido pipetear con la boca. Ante un vertido accidental de material microbiolgico debe informarse inmediatamente al maestro. Utilizar guantes apropiados para el manejo de el autoclave o material recin esterilizado. La eliminacin de residuos biolgicos infecciosos, material desechable y material reciclable se realizar utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto. Se debe lavar las manos con jabn antisptico ante cualquier sospecha de contaminacin y antes de marcharse del laboratorio.

En caso de accidente se cuenta con un botiqun para atencin de emergencias y tomar las medidas necesarias para evitar un percance mayor.

PRCTICA 1 MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE 1. Introduccin Los microorganismos (bacteria, virus, hongos, protozoarios, y algunas algas) se pueden encontrar virtualmente en todo el medio ambiente. Se encuentran en el aire, agua, suelo, alimentos, petrleo, en la materia orgnica en descomposicin y en las superficies del cuerpo. Estos organismos son extremadamente importantes para la salud humana y el medio ambiente adems en los avances en inmunologa, virologa, gentica y biologa molecular. En microbiologa, la esterilizacin se define como la destruccin o remocin de cualquier forma de vida. Un objeto que est libre de cualquier organismo viviente, se dice que est estril. La esterilizacin es uno de los mecanismos utilizados para el control de los microorganismos, existen otros mtodos de control que slo matan o inhiben una parte de la poblacin microbiana como son: desinfeccin, pasteurizacin, quimioterapia y asepsis. Estos mtodos permiten prevenir la contaminacin de los materiales de laboratorio y de cultivos puros, evitan las infecciones y facilitan el tratamiento de enfermedades. La esterilizacin es muy importante en los laboratorios de microbiologa porque la mayora de los experimentos son realizados con cultivos puros o axnicos (cultivos que solamente tienen un tipo de microorganismo) o con cultivos mixtos o consorcios (cultivos constituidos por ms de un tipo de microorganismo) por lo que es necesario primero esterilizar los materiales y medios de cultivo. Los mtodos de esterilizacin, principalmente los que destruyen a los organismos, fueron diseados para eliminar an a los organismos ms resistentes, las endosporas. Bacterianas de los gneros de Bacillus y Clostridium, por lo que stas son utilizadas como indicadores biolgicos de esterilizacin durante el proceso. Existen varios mtodos de esterilizacin para la gran variedad de materiales, medios de cultivo y sustancias que pueden ser esterilizados. Los mtodos ms empleados en los laboratorios son los que utilizan calor. La velocidad con la cual los microorganismos mueren cuando son expuestos a temperatura elevadas es funcin de la naturaleza del medio en el cual ocurre el calentamiento (pH, concentracin de sales y tipo de nutrientes), la longitud del tiempo de exposicin y la temperatura de calentamiento. Por otro lado, el crecimiento microbiano slo es posible si las condiciones fsicas (temperatura de incubacin, y la cantidad de oxgeno presente) y qumicas (constituyentes del medio de cultivo, pH, etc.) son apropiadas. Se utilizan varios tipos de medios de cultivo, los cuales pueden clasificarse de la siguiente forma:
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1.

2. 3. 4.

En base a su composicin qumica pueden ser: sintticos o definidos (cuando se conoce la composicin qumica cualitativa y cuantitativa exacta de todos los componentes) y complejos (cuando no se conoce la composicin qumica cualitativa y cuantitativa exacta de alguno de los componentes). En base a la presencia de factores de crecimiento pueden ser: enriquecidos (si contienen) y mnimos (si no contienen). Por su funcin pueden ser: selectivos (para el desarrollo de un grupo o tipo de microorganismos) y diferenciales (para distinguir tipos de microorganismos) Por su consistencia pueden ser lquidos (llamados caldos) con los nutrientes disueltos en agua; slidos, a los cuales se les adiciona un agente solidificante como el agar a una concentracin de 1.5% p/v (otro agente solidificante es la slica gel); y semislidos, a los cuales se les adiciona agar en una menor concentracin.

Antes de utilizar los materiales de laboratorio y los medios de cultivo preparados a partir de ingredientes o de preparados comerciales, deben ser envasados, esterilizados y protegidos adecuadamente para conservar la esterilidad durante su uso y almacenamiento, lo cual va a asegurarnos que se trabajar exclusivamente con los microorganismos deseados. 2. Objetivos. Aprender a preparar adecuadamente el material de laboratorio para su esterilizacin y almacenamiento. Aprender a preparar, envasar y esterilizar medios de cultivo. Investigar los tipos de microorganismos que puedan estar presentes en el aire, cuerpo y superficies. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. 10 tubos de 16 x 150 mm con solucin salina 0.85% Vasos de precipitado de 250 y 500 ml Matraces de 250 y 500 mL Probetas 10, 100 y 500 mL 10 cajas Petri de vidrio estriles Cotonetes estriles Autoclave Balanza Analtica Gradilla Agar Nutritivo y Agar nutritivo con 5% sucrosa Agar Czapeck y Agar para hongos y levaduras Agar sangre Agua destilada esteril Yogurt natural
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Papel para esterilizar (Kraft) Cinta indicadora de esterilizacin Indicador de esterilizacin de esporas Bote de aluminio para esterilizar pipetas Mechero Esptula Succionador para pipetas Microscopio, Portaobjetos y cubreobjetos 4. Procedimiento Preparacin de material de vidrio para esterilizar. a) Tubos de ensaye de 16 x 150. 1. Colocar en 10 tubos 9 mL con solucin salina 0.85%, tapar cada tubo con un tapn de algodn ayudado de unas pinzas (pueden ser de diseccin de punta roma). 2. Colocar los tubos en una gradilla y cubrirlos con papel Kraft. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 minutos. Preparacin de medios de cultivo. 1. Pesar los gramos necesarios de acuerdo a las instrucciones del fabricante para preparar 500 mL de medio Agar Nutritivo, Agar nutritivo con 5% sucrosa, Agar Czapeck y Agar para hongos y levaduras Adicionar el agua destilada y calentar a ebullicin para disolver con agitacin.. Medir y ajustar el pH si es necesario. 2. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min. 3. Distribuir 20 mL de medio a cada caja de Petri , dejar solidificar y someter a prueba de esterilizacin a 37 C 4. Procedimiento 1. Remover la tapa de la caja petri que contiene el agar nutritivo, el agar hongos y levaduras y Czapeck. Djelo por espacio de 1 hora abierto, una vez concluido el tiempo tpelo, invirtalo y mrquelo. Incbelo a temperatura ambiente de 3 a 4 das. Una vez transcurrido el tiempo efecte el registro de sus observaciones de las colonias formadas. 2. Humedecer un cotonete con agua estril y frtelo en la piel, estrelo en la caja petri con agar nutritivo. Tpelo, invirtalo y mrquelo. Incbelo a 37 C por 48 a
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72 hrs. Una vez transcurrido el tiempo efecte el registro de sus observaciones de las colonias formadas.. 3. Humedecer un cotonete con agua estril y frtelo dentro de su boca, estrelo en la caja petri con agar nutritivo con 5% sucrosa. Tpelo, invirtalo y mrquelo. Incbelo a 37 C por 48 a 72 hrs. Una vez transcurrido el tiempo efecte el registro de sus observaciones de las colonias formadas. 4. Se introduce la torunda en la boca, evitando el contacto con la lengua y otras zonas de la boca, y se frota contra la mucosa de la faringe. a).- Frotar con un hisopo estril sobre un segmento de la placa agar sangre, hacindolo girar a la vez para descargar toda la muestra. Extender el inculo inicial con el asa bacteriolgica. b).- Con el asa flameada y fra extender el inculo sobre otro segmento. Flamear el asa y repetir dos veces el paso 2, sin llegar a tocar el inculo inicial. c).- Clavar el asa dos o tres veces en el agar, al principio de la siembra, para obtener cultivo bajo la superficie. Incubar las placas 18 h a 35-37C. Una vez transcurrido el tiempo efecte el registro de sus observaciones de las colonias formadas y de la presencia de hemlisis. 5.- Colocar una gota de agua estril en un portaobjetos. Flamear el asa de siembra hasta que adopte un color rojo. a).- Tomar una muestra del lquido del yogurt intentando no tocar con el asa la parte slida de la materia del yogurt (contiene demasiada grasa y puede dificultar la observacin. b).-Hacer un frotis de la muestra en la gota de agua (extenderlo completamente). Fjela con calor en el mechero hasta que el agua se evapore. c).- Cubrir el portaobjetos con azul de metileno, deje actuar por un minuto. Una vez transcurrido el tiempo lavar cuidadosamente la preparacin con agua para eliminar el exceso de colorante. Deje un par de gotas y cubra con el portaobjetos intentando no dejar burbujas de aire. Observar en el microscopio en el mayor aumento posible y registre sus observaciones.. 5. Discusin y Conclusiones. 1. Mencione con que esporas bacterianas se realiza el control biolgico para el mtodo de esterilizacin de: a) calor hmedo b) calor seco c) xido de etileno 2.- Las bacterias del yogurt son auttrofas o hetertrofas? Explique porqu. 3.- Que tipo de hemlisis presentaron las colonias en la placa agar sangre y explique a que se debe la reaccin hemoltica observada en el medio?

6. Bibliografa. Claus. G. W. 1988. Understanding Microbes. A Laboratory Textbook for Microbiology. Ed. W. H. Freeman and Company, Nex York . U.S.A. Difco Manual. Dehydrated culture Media and Reagentes for Microbiology. Difco laboratories Detroit Micghigan.Tenth Edition Merck. Manual de Medios de Cultivo.

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PRCTICA 2 COLUMNA DE WINOGRADSKY 1. Introduccin. La biosfera de nuestro planeta contiene un gran nmero de ecosistemas en los cuales los microorganismos participan en forma muy importante, inclusive, existen ecosistemas, los cuales estn ocupados exclusivamente por microorganismos (ejemplo: tapetes microbianos). La hidroecsfera comprende a todos los ambientes acuticos, los cuales ocupan la mayor parte de la biosfera donde se llevan a cabo las transformaciones mediadas por microorganismos. Entre los sistemas acuticos ms importantes se encuentran los ocanos, estuarios, lagos, charcas, manantiales y ros subterrneos o superficiales. El tipo de estudio de la estructura de la comunidad microbiana acutica o de su actividad depende del objetivo de la investigacin que se pretenda realizar. Los estudios microbiolgicos tradicionales han sido la identificacin taxonmica de la diversidad microbiana en la naturaleza, mientras que el campo de la ecologa microbiana se busca identificar la funcin, bioqumica e interacciones de los microorganismos en la naturaleza como con la sociedad humana. La columna de Winogradsky, denominada as en honor del microbilogo ruso Sergei Winogradsky, es un modelo de ecosistema que se utiliza para el estudio de los microorganismos acuticos y de los sedimentos. En la columna se desarrollan poblaciones bacterianas fotosintticas que utilizan el sulfuro de hidrgeno como donador de electrones en su metabolismo fotoautrotrfico. Este modelo de ecosistema imita la situacin de una columna anxica de agua que recibe luz. Debido a lo anterior se produce una zonacin semejante a los sedimentos naturales, pero en escala milimtrica. 2. Objetivos. El alumno enriquecer algunas de las poblaciones bacterianas presentes en los ambientes acutico y de sedimentos. El alumno realizar el experimento de la columna de Winogradsky para observar el desarrollo de las diferentes poblaciones hetertrofas y fotoauttrofas por medio de las caractersticas presentadas en cada zona de la columna. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. 2 Probetas de 500 mL de vidrio 2 hojas de papel filtro Sulfato de calcio Carbonato de calcio Muestra de sedimento Arena (color claro) Agua destilada
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Agua de charco 2 Plato desechable Restos de hojas, plantas, ramas, etc. Esptula Papel parafilm Papel aluminio Balanza analtica o granataria Focos de 60 watts

4. Procedimiento. Realizar el experimento en dos columnas, una de las cuales servir como testigo. 1. Utilizando una esptula tomar una muestra de sedimento y pesar 300 g. 2. Cortar trozos pequeos de papel filtro. 3. Mezclar la muestra de sedimento con 1 g de sulfato de calcio, y 1 g de carbonato de calcio, restos de hojas, plantas, ramas, etc. y con las trozos de papel filtro. 4. Agregar la mezcla al fondo de la probeta de vidrio 5. Agregar arena hasta un volumen de 450 mL. 6. Adicionar agua del lugar de donde proviene la muestra (de preferencia) hasta casi al borde. 7. Cubrir con papel parafilm la parte superior de la columna e incubar en presencia de la luz. 8. Exponer la columna a luz continua de un foco de 60 watts a una distancia entre 30 y 40 cm. 9. Realizar el mismo procedimiento desde el punto 1 al 7 con una segunda probeta de 500 mL, columna que se envolver en papel aluminio para incubarla bajo condiciones de oscuridad. 10. Haga observaciones de su columna diariamente durante 1 semana y cada tercer da durante las siguientes tres semanas. Registre los cambios macroscpicos que se presenten. 11. Mantenga el volumen de agua adicionando agua destilada en caso de observar evaporacin. Al final del experimento observar al microscopio muestras de la columna de agua como del sedimento.
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5. Discusin y Conclusiones. Informe. Reporte las observaciones peridicas de la apariencia de la columna, haciendo hincapi en los cambios macroscpicos, tales como la aparicin de organismos fotosintticos, o cualquier otro cambio observado. Tambin reporte las observaciones al microscopio, describiendo las caractersticas de los organismos encontrados en el agua y sedimento de la columna. Cuestionario. 1. Porqu se adiciona el sulfato de calcio a la muestra de sedimento? 2. Cul es la funcin de los restos de hojas, plantas, ramas. etc. en la columna? 3. Porqu razn la columna testigo se mantiene en la oscuridad durante el transcurso del experimento?

1. Bibliografa. Atlas, R. M., Bartha, R. 2002. Ecologa Microbiana y Microbiologa Ambiental. PEARSON EDUCACIN, S. A., Madrid, Espaa. Colom, J. S., Kubinski, A. M. 1986. MICROBIOLOGY. West Publishing Company. E. U. A. Laboratory Excercises in

Davis, B. D., Dulbecco, R. 1978. Tratado de Microbiologa. 2da. Edicin. Ed. Salvat Editores. Espaa.

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PRCTICA 3 AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO POR DILUCION SERIADA 1. Introduccin En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando comunidades de diversos gneros y especies, por lo que es casi imposible encontrar un hbitat con un solo gnero de microorganismos. Por lo que para los estudios en que se requiera el conocimiento de un solo organismo de esa comunidad (estudio autoecolgico), es necesario el aislamiento del mismo. Obviamente se debe tener en mente que muchas reacciones fisiolgicas, bioqumicas y hasta algunas morfolgicas, requieren de la presencia del resto de los integrantes de la comunidad para que se expresen (estudios sinecolgicos). Se han empleado una serie de mtodos para la propagacin de los microorganismos a partir de clulas individuales. El cultivo en caja de Petri es un sistema sencillo y rpido para el aislamiento de los microorganismos de una mezcla, permitiendo que a partir de una clula o un conglomerado de clulas del mismo gnero y especie, se forme una colonia (clona), que sea visible a simple vista. Los mtodos ms usados son: a) mtodo de la estra cruzada y b) el mtodo del vaciado en placa. El mtodo de la estra cruzada, es un mtodo cualitativo que permite trabajar un gran nmero de muestras en corto tiempo y consiste en tomar una muestra con un asa previamente esterilizada y colocarla sobre una superficie del medio de cultivo slido que se encuentra en una caja de Petri, Posteriormente se trazan una serie de estras pegadas al borde de la caja, esterilizando el asa al final de cada serie. El mtodo de vaciado en placa, es un mtodo cuantitativo, ya que adems de aislar a los microorganismos, en un cultivo puro (formado por un solo gnero y especie), nos permite contar el nmero de organismos presentes en esa muestra. Esto es posible ya que a partir de una muestra perfectamente medida se realizan una serie de diluciones, lo que nos da la oportunidad de conocer la cantidad exacta de muestra en cada tubo de dilucin, si despus de sembrar la muestra en nuestro medio conocemos el nmero de colonias que crecieron, podemos multiplicar este por la inversa de la dilucin y por la inversa de la alcuota que sembramos, dndonos como resultado el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por unidad de volumen o masa de la muestra original. Para el trabajo con ambos procedimientos se requiere procesar las muestras bajo condiciones de esterilidad con objeto de no incorporar microorganismos de otra fuente extraa a la que estamos analizando. 2. Objetivos.

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 El alumno adquirir las habilidades para el aislamiento de microorganismos utilizando ambos procedimientos. El alumno conocer la utilidad de estas tcnicas en el estudio de los microorganismos El alumno se habituar a trabajar con los microorganismos bajo sistemas controlados de esterilidad. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. Suelo 5 pipetas de 1 mL estriles Frasco de dilucin de 90 mL con agua destilada estril 5 tubos de 16 x 150 mm con 9 mL de agua destilada estril 6 tubos de 16 x 150 mm c/tapn de rosca con agar nutritivo, inclinados Agua destilada Capsulas de porcelana Pinzas (de diseccin por ejemplo) Mechero Horno o incubadora Balanza granataria Esptulas Asa bacteriolgica Varilla acodada Alcohol Tween 80 Metanol Succionador para pipetas Cajas Petri con agar nutritivo con ciclohexamida Cajas Petri con medio de cultivo para hongos y levaduras (Saboraud) Cajas Petri con medio Czapeck 4. Procedimiento Mtodo de las diluciones 1. Pesar 10 g de suelo y colocarlos en condiciones de esterilidad en una botella de dilucin conteniendo 90 mL de agua destilada estril, .agregar 1 gota de Tween 80. Agite perfectamente y deje reposar algunos minutos. 2. Por medio de una pipeta de vidrio o micropipeta (automtica), tomar 1 mL del sobrenadante de la botella de dilucin, teniendo cuidado de no arrastrar sedimento y vaciar en condiciones de esterilidad a un tubo de ensaye con 9 mL de agua destilada estril. Agitar perfectamente para homogenizar la muestra (figura 1). 3. A partir del tubo anterior, tomar 1 mL y vaciarlo a otro tubo de ensaye con 9 mL de agua destilada estril, agitar perfectamente.
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4. Repita el punto tres, tomando siempre1 mL del ltimo tubo inoculado y vacelo a un tubo nuevo con 9 mL de agua destilada estri (figura 1). 5. Al terminar la serie de tubos, tomar de los tres ltimos tubos 0.1 mL y colocarlo en el centro de tres cajas de Petri perfectamente marcadas para su identificacin. 6. Tomar una varilla acodada esterilizarla flameando con alcohol, y una vez fra, distribuir la muestra sobre toda la superficie de la caja, girando sta y moviendo la varilla en un sentido. 7. Colocar las cajas en una canastilla e incubarlas a 35 37 C durante 24 h.

Figura 1.- Procedimiento para preparacin de diluciones seriadas.

Mtodo de estra cruzada. 1. A partir del frasco de dilucin en que se realiz la primera dilucin del experimento anterior, tomar una asada y colocarla en una porcin de la caja, trazando una serie de estras que cubran aproximadamente 1 cm a partir de la orilla de la caja. 2. Flamear el asa, dejar enfriar y trazar una nueva serie de estras a partir de un extremo de las anteriores. 3. Repetir el paso anterior durante dos series de estras. 4. Trazar la ltima serie de estras abriendo esta hacia el centro de la caja. (Anotar diagrama explicado por el maestro).
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5. Incubar a 35 37C durante 24- 48 h. 6. Repetir los pasos anteriores para las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7 Transcurrido el tiempo de incubacin para las cajas utilizadas en ambos mtodos, haga sus observaciones de morfologa colonial auxilindose de la figura que el maestro mostrar a los alumnos . Determine las UFC/g de suelo seco de la muestra original de la siguiente forma: 1. Pesar una capsula de porcelana, registre el peso. 2. Pesar aproximadamente 10 g de suelo en la capsula de porcelana, registre el peso. 3. Colquelos en el horno a 105 C por 48 hrs. Una vez concluido el tiempo de secado enfrelo, pselo y registre el peso.

Calcular el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de suelo seco UFC/g = 1/dilucin X Nmero de colonias X 1/alcuota Peso del suelo seco Determinacin del peso del suelo seco Peso del suelo seco = (peso del suelo en capsula de porcelana) (% humedad / 100) + 1) Determinacin del % de humedad del suelo % Humedad= ( suelo en capsula ) - (suelo seco en capsula) X 100 ( suelo seco en capsula - peso de la capsula)

Clculo de UFC/g de suelo Dilucin Nmero de colonias Alcuota UFC/g *

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5. Discusin y Conclusiones. 1. En un cuadro presente la morfologa colonial de tres colonias que haya seleccionado con apoyo del maestro. 2. Desde el punto de vista prctico, qu ventajas y desventajas encontr al utilizar los dos mtodos de aislamiento? 3. Qu caractersticas generales tienen las colonias bacterianas que las distinguen de los hongos? 4. Porqu reportamos los resultados como UFC/mL g en la determinacin cuantitativa de microorganismos en lugar de usar el trmino clulas/mL g. Morfologa colonial Condiciones de cultivo Medio de cultivo Temp. De incubacin Tiempo de incubacin Caractersticas Tamao Color Forma Borde Elevacin Luz reflejada Luz transmitida Superficie Aspecto Consistencia Pigmento difusible 6. Bibliografa. Alexander, S. K., Strete, D. 2001. Microbiology. A Photographic Atlas for the Laboratory. Ed. Benjamin Cummings. Claus. G. W. 1988. Understanding Microbes. A Laboratory Textbook for Microbiology. Ed. W. H. Freeman and Company, Nex York . U.S.A. Merck. Manual de Medios de Cultivo.
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Colonia 1

Colonia 2

Colonia 3

Colonia 1

Colonia 2

Colonia 3

PRCTICA 4 TINCIONES Y MORFOLOGA MICROSCPICA DE COLONIAS DE SUELO 1. Introduccin. Los microorganismos permiten fcilmente el paso de luz a travs de sus cuerpos, lo que los hace transparentes a la vista, a menos que contengan pigmentos que permitan su observacin en el microscopio. Es por ello que debemos teir a los microorganismos con compuestos que se fijen a sus estructuras y les confieran color, estos compuestos son los colorantes. Un colorante es un compuesto orgnico que tiene grupos cromforos y auxocromos unidos a anillos bencnicos, conformando lo que se conoce como un cromgeno. Los grupos cromforos son radicales que le confieren la propiedad de color a los anillos bencnicos. El auxocromo es un radical que imparte al compuesto la propiedad de disociacin electroltica, permitiendo con esto la fijacin del compuesto a diferentes materiales. Para la tincin de las bacterias se pueden utilizar tinciones simples, diferenciales y selectivas. Las primeras son aquellas en las cuales se utiliza un solo colorante y ste tie todo el protoplasma de la clula, observndose sta de un solo color uniforme. Las tinciones diferenciales son aquellas en las cuales se utilizan dos colorantes y generalmente un mordente (compuesto que permite fijar el colorante a un material) que permiten establecer dos grupos de bacterias, uno que acepta el primer colorante y otro que acepta el segundo colorante, lo que le da un valor en la clasificacin celular (ejemplo: Tincin de Gram y Tincin de Ziehl Neelsen). Las tinciones selectivas utilizan tambin dos colorantes, pero uno de ellos tiene afinidad por ciertas estructuras de la clula, lo que permite su observacin (ejemplo Tincin de esporas, de flagelos, de cpsula, de DNA, etc). Cuando teimos una bacteria requerimos hacer un frotis, es decir requerimos colocar una pequesima muestra de una colonia bacteriana o una pequea gota de un cultivo lquido, sobre un portaobjetos, extenderla, dejarla secar y fijarla. En este punto podemos teir a nuestra bacteria y hacer la observacin al microscopio para conocer la morfologa que pueden tener los diferentes organismos. Debido al tamao de las bacterias, todas las observaciones se realizan al microscopio con el objetivo de inmersin. 2. Objetivos. El alumno aplicar sus conocimientos adquiridos en cursos anteriores para elaborar frotis que permitan una observacin correcta de algunos de los microorganismos del suelo aislados en las prcticas 1 y 2.
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 El alumno practicar una tincin simple y una tincin diferencial. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. Tubos con medio inclinado conteniendo tres cepas de la prctica nmero 2 tubos con caldo nutritivo inoculados con 3 de las diferentes cepas encontradas en la misma prctica. 1 Equipo de la tcnica de Gram. (cristal violeta. lugol, solucin alcohol-acetona y safranina). Verde de malaquita Microscopio Puentes de coloracin Aceite de inmersin 4. Procedimiento. Preparacin del frotis. 1. Con el asa previamente esterilizada, tomar una pequea muestra del crecimiento bacteriano que se ha desarrollado sobre la superficie del agar en los tubos inclinados, o una asada del crecimiento bacteriano del caldo nutritivo. 2. Colocarla sobre una pequea gota de agua o solucin salina (estriles) que se ha colocado en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado. Con ayuda del asa distribuya hasta ocupar una superficie de 1 cm2. 3. Dejar secar al aire y posteriormente fijar a la flama del mechero, pasando rpidamente la laminilla sobre la flama y midiendo la temperatura con el dorso de la mano. Repetir este procedimiento 3 veces. Tincin simple. 2. Tomar una laminilla de cada cepa y colocarla sobre un puente de coloracin. 3. Cubrir el frotis con una cantidad generosa de verde de malaquita 4. Dejar actuar un minuto, lavar con agua corriente, sacudir y dejar secar al aire. 5. Observar con objetivo de inmersin, siguiendo las instrucciones del profesor. Tincin diferencial (Tincin de Gram). 1. Tomar una laminilla fijada de cada una de las cepas y colocarla cobre el puente de coloracin. 2. Cubrir el frotis con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto. Al trmino de ste, escurra la muestra y lave con agua de la llave.
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3. Cubra con la solucin de lugol y deje actuar durante un minuto. Al trmino de ste escurra el exceso. 4. Inclinando su portaobjetos, agregar el alcohol acetona y dejar escurrir hasta que no se observa desprendimiento de colorante. Generalmente el tiempo es de 15 segundos, pero este puede variar dependiendo del groso del frotis. 5. Lavar con agua de la llave y aplicar la safranina, dejndola actuar 10- 15 seg. 6. Lavar con agua de la llave, escurrir bien y dejar secar al aire. 7. Observar con objetivo de inmersin. 5. Discusin y Conclusiones. Informe. 1. Haga un esquema de sus observaciones al microscopio, de los frotis teidos con una coloracin simple, indicando al pie de cada uno tipo de organismos. 2. Haga un esquema de sus observaciones al microscopio de los frotis teidos por la tcnica de Gram, indicando al pie de cada uno tipo de organismo, agrupacin que presente y tipo de Gram. 3. Discuta sus resultados y obtenga las conclusiones correspondientes. Cuestionario. 1. Describa la razn de las diferentes agrupaciones que presentan las bacterias. 2. Qu teora existe para explicar la diferente reaccin que presentan los microorganismos en la tcnica de Gram? 3. Describa tres tcnicas de coloracin diferenciales que se apliquen en microorganismos. 6. Bibliografa. Alexander, S. K., Strete, D. 2001. Microbiology. A Photographic Atlas for the Laboratory. Ed. Benjamin Cummings. Davis, B. D., Dulbecco, R. 1978. Tratado de Microbiologa. 2da. Edicin. Ed. Salvat Editores. Espaa.
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PRCTICA 5 PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS DE SUELO 1. Introduccin. Las tinciones simples, diferenciales y estructurales, an cuando se combinen con observacin de las caractersticas de la colonia y cultivo de las misma, no son suficientes para la identificacin de una bacteria aislada. Los resultados de las tinciones y de los cultivos deben combinarse con resultados de pruebas bioqumicas. Las pruebas bioqumicas evalan las propiedades metablicas de un microorganismo aislado, las cuales son nicas para cada especie. La combinacin de pruebas bioqumicas puede utilizarse para determinar el patrn bioqumico del microorganismo aislado. Esto hace posible la identificacin del mismo utilizando un esquema de identificacin. La identificacin de un microorganismo es especialmente importante en el rea clnica debido a que, al conocer la identidad del patgeno se puede determinar la susceptibilidad a algn antibitico, lo cual es esencial para determinar un tratamiento mdico efectivo. Existen tres mtodos de identificacin: a) mtodo convencional; b) sistemas multiprueba y c) mtodos automatizados. 2. Objetivos. El alumno aplicar los conocimientos adquiridos en cursos anteriores para la identificacin de microorganismos aislados en las prcticas 1 y 2 mediante pruebas bioqumicas. El alumno utilizar el mtodo convencional de pruebas bioqumicas desde la inoculacin hasta la identificacin, utilizando esquemas de identificacin. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. Tubos (segn el nmero de colonias a identificar) con medios de cultivo con los siguientes medios de cultivo para pruebas bioqumicas: TSI LIA KIA CITRATO UREA SIM VOGES PROSKAUER
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MIO FENIL ALANINA Solucin acuosa de cloruro frrico al 10% Solucin alcohlica al 5% de naftol Solucin de Hidrxido de potasio al 40% Reactivo de Kovacs Solucin de rojo de fenol Reactivo para prueba de oxidasa Perxido de hidrgeno Asa circular Asa recta Gradilla Mechero Bunsen 1 trozo de papel filtro Cultivo de bacterias (fresco, es decir de entre 18 y 24 horas de incubacin) Portaobjetos Incubadora a 37 C. 4. Procedimiento. 1. Colocar en una gradilla un juego de pruebas bioqumicas por cada colonia que se desee identificar, iniciando la serie con el tubo conteniendo el medio de citrato. 2. Tomar parte de una colonia aislada con el asa circular del microorganismo que se desee identificar y estriar en el pico de flauta del tubo conteniendo el medio de cultivo de citrato (no puncionar). 3. Tomar una porcin de la misma colonia con una asa recta y puncionar el medio de cultivo hasta una profundidad mxima de y posteriormente estriar el pico de flauta en las pruebas de TSI, LIA, KIA (Kligler), Fenil alanina y Urea. 4. Tomar una porcin de la misma colonia con una asa recta y puncionar el medio de cultivo hasta una profundidad mxima de en las pruebas de SIM Y MIO. 5. Tomar una porcin de la misma colonia con una asa recta o circular e inocular el caldo de cultivo de la prueba de Voges Proskauer. 6. Incubar a 35 C durante 24 hr. 7. Tomar una porcin de la misma colonia y extenderla sobre un portaobjetos. Agregar unas gotas de perxido de hidrgeno y observar. 8. Con un hisopo estril tomar una porcin de la misma colonia y extenderla sobre un trozo de papel filtro previamente humedecido con el reactivo para la prueba de la oxidasa y observar. 9. Despus de lo incubacin realizar las siguientes pruebas:
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a) Adicionar al tubo con medio SIM 5 gotas del reactivo de Kovacs para determinar la produccin de indol. Observar y registrar si hubo cambios o no. b) Del caldo de cultivo Voges Proskauer tomar la mitad en un tubo de ensaye para la determinacin correspondiente, y el resto volver a incubar a 35 C por 24 hr ms. En la porcin separada (aprox. 1.5 mL) agregar 3 gotas del reactivo de la solucin de naftol al 5% y 1 gota de solucin de KOH al 40%. Espere de 10 a 15 minutos para permitir el desarrollo del color. Registre las observaciones. c) Adicionar al tubo con medio de fenil alanina 4 5 gotas de solucin de cloruro frrico. Observar y registrar observaciones.

c) Pasado el tiempo de la segunda incubacin de la porcin de caldo VP, agregar 3 gotas del indicador rojo de metilo. Agitar suavemente para permitir que se disperse el indicador y se lleve a cabo el desarrollo del color. Observar y registrar observaciones.

5. Discusin y Conclusiones. Informe. 1. Haga una tabla con los resultados obtenidos en las pruebas bioqumicas que llev a cabo en cada uno de los microorganismos que seleccion para la identificacin.

PRUEBA BIOQUMICA TSI LIA KIA FENIL ALANINA UREA SIM

CARACTERSTI CAS COLONIA 1

CARACTERSTI CAS COLONIA 2

CARACTERSTIC AS COLONIA 3

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MIO VOGES PROSKAUER CITRATO INDOL ROJO METILO CATALASA OXIDASA DE

NOTA: Especificar de donde proviene el cultivo de bacterias que utiliz para llevar a cabo sus pruebas bioqumicas (suelo, agua, etc) y anotar si hubo produccin de gas y/o cido sulfhdrico. Puede modificar la tabla agregando o quitando filas y columnas segn se adapte a su reporte. 2. Utilizando esquemas de identificacin, determine que microorganismo presenta las reacciones descritas para cada una de las colonias que seleccion para su identificacin. Cuestionario. 1. Describa la razn de utilizar una sola colonia en una serie de pruebas bioqumicas. 2. Haga una tabla comparativa de cmo se observa la reaccin negativa y la positiva para cada una de las pruebas bioqumicas que llev a cabo. 3. Cul es la razn por la que el citrato fue la primer tubo en inocularse? 6. Bibliografa. Alexander, S. K., Strete, D. 2001. Microbiology. A Photographic Atlas for the Laboratory. Ed. Benjamin Cummings. Davis, B. D., Dulbecco, R. 1978. Tratado de Microbiologa. 2da. Edicin. Ed. Salvat Editores. Espaa. Mac Faddin, J.F. 1984. Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Editorial Mdica Panamericana, S.A.
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PRCTICA 6 DETERMINACIN DE ORGANISMOS COLIFORMES EN AGUA POR EL MTODO DEL NMERO MS PROBABLE 1. Introduccin Reconociendo que la necesidad de consumo de agua potable es esencial, el control de su calidad bacteriolgica, desde el punto de vista sanitario, constituye un hecho de vital importancia, debido a que un nmero importante de enfermedades son transmitidas a travs del agua que ha sido contaminada con materia fecal. Lo que en casos extremos puede originar brotes epidmicos. An el agua que se observa clara puede estar contaminada con microorganismos enteropatgenos que normalmente habitan en el intestino del hombre y de otros animales de sangre caliente. Estos enteropatgenos incluyen principalmente a las bacterias de los gneros Salmonella, Shigella y Vibrio, protozoarios como Entamoeba hystoltica o virus como el de la hepatitis o el de la poliomielitis. Todos ellos pueden ingresar al agua cuando sta entra en contacto con la materia fecal. De esta manera, parecera que la bsqueda de estos microorganismos constituira la medida ms acertada para decidir si el agua es apta o no para el consumo humano. Sin embargo, no es prctico determinar directamente a los microorganismos enteropatgenos debido a que su deteccin es tardada, laboriosa y a veces poco confiable. Por otro lado, los enteropatgenos en cuestin, aparecen solo ocasionalmente en cantidades suficientes para ser detectados, an en las heces de individuos enfermos, por lo que se corre el riesgo de consumir un agua contaminada solo por el hecho de no haber hallado ningn enteropatgeno reconocido en las muestras analizadas. De este modo es necesario enfocar el problema desde otro punto de vista. Si los organismos enteropatgenos residen en el intestino, bastar con demostrar que el agua est contaminada con materia fecal para determinar que la fuente de abastecimiento puede ser transportadora de enfermedades intestinales. Con esta base, sin demostrar necesariamente la presencia directa de organismos enteropatgenos, se puede hacer un anlisis microbiolgico para poner de manifiesto algunos microorganismos que constituyen un indicador de contaminacin fecal. Las cualidades ideales de un microorganismo indicador de este tipo de contaminacin son: Presencia constante en materia fecal Exclusividad en la materia fecal Abundancia en la materia fecal Incapacidad de reproduccin en el agua Supervivencia semejante a la de los organismos enteropatgenos
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 Facilidad para demostrarse en el laboratorio En la bacteriologa del agua, los organismos del grupo coliforme se definen como: bacterias aerobias o facultativamente anaerobios, Gram negativas, no esporuladas que fermentan la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 hr de incubacin a 35 C. Esta ltima propiedad, dado que no es comn entre las bacterias, es el punto clave que se utiliza para la identificacin de ste grupo microbiano. En este grupo se incluye a la Escherichia coli considerada como el principal indicador de contaminacin fecal, as como a la Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter. Cuya fuente no se limita a un origen fecal y que comnmente son encontrados en muestras de suelo, plantas y granos. Algunas normas oficiales para agua y alimentos slo enumeran a los coliformes fecales, es decir, aquellos organismos coliformes que son capaces de producir gas a partir de la fermentacin de la lactosa, cuando se incuban durante 24 a 48 horas a una temperatura de 44.5 0.2 C. Existen dos pruebas oficiales para la determinacin de coliformes en muestras de agua: Norma Mexicana de Anlisis NMX-AA-042-1987. Calidad del Agua. Determinacin del Nmero ms Probable (NMP) de Coliformes Totales, Coliformes Fecales (termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva. Este mtodo microbiolgico contempla tres fases: a) Prueba presuntiva b) Prueba confirmativa c) Prueba completa En las aguas altamente contaminadas o que de hecho se sabe que han estado en contacto con materia fecal, solamente se efecta la prueba presuntiva; no obstante, el anlisis debe llevarse a cabo hasta la fase confirmativa cuando se trata de agua destinada a beberse o usarse en albercas para natacin. La prueba completa queda solo indicada para resolver problemas especficos (epidemiolgicos, para diagnosticar el origen de la contaminacin, etc.) En las tres fases del mtodo se emplean medios de cultivo a base de lactosa para observar la produccin de cido y de gas. En la fase confirmativa se emplean medios selectivos con inhibidores de otros grupos microbianos ajenos a los coliformes. Adems, en la fase completa se pueden emplear medios y pruebas para la identificacin de los microorganismos coliformes detectados. El nmero de organismos coliformes en agua se calcula estadsticamente utilizando como referencia la tabla que se anexa al final de esta prctica. Los resultados son reportados como Nmero Ms Probable de Organismos Coliformes
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(Totales Fecales)/100 mL de agua. El mtodo no es exacto, slo da la probable densidad de los organismos coliformes totales o fecales en la muestra. Norma Mexicana de Anlisis NMX-AA-102-1987. Calidad del Agua. Deteccin y Enumeracin de Organismos Coliformes Termotolerantes y Escherichia coli presuntiva. Mtodo de Filtracin de Membrana. Este mtodo es recomendado en los casos en los que se sabe que el grado de contaminacin por organismos coliformes debe ser bajo o nulo (aguas purificadas, aguas destiladas, aguas desionizadas, aguas inyectables, etc.), por lo que se requieren grandes volmenes de muestra para confirmar de manera segura la ausencia de ellos. En este caso, la muestra (que debe ser de por lo menos de 100 mL) se hace pasar por una membrana (un filtro especial comnmente hecho a base de nitrato de celulosa o de acetato de celulosa) con una abertura de poro de 0.45 m. Los microorganismos son retenidos en la membrana la cual se coloca en los medios de cultivo adecuados y se incuba a las temperaturas y tiempos especificados. Se cuentan las colonias fermentadoras de lactosa desarrolladas en la membrana y se calcula el nmero de coliformes en la muestra original. Este mtodo es ms rpido que el Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP), pero tiene la desventaja que no puede ser usado en muestras de agua con alto contenido de partculas en suspensin porque se obstruyen los poros de la membrana. Recientemente se ha desarrollado un mtodo simple y rpido para la deteccin de coliformes fecales que puede combinarse con la determinacin por el Mtodo del Nmero Ms Probable. El mtodo utiliza un medio de cultivo que contiene como sustrato los reactivos o-nitrofenil -D galactopiransido (ONPG) y 4-metilumbelifenil D glucurnido (MUG). La muestra de agua se incuba en el medio de cultivo conteniendo los reactivos (colilert) durante 24 h. Los coliformes presentes producen la enzima -galactosidasa, la cual acta sobre el ONPG desarrollando un color amarillo. Escherichia coli adems posee una enzima constitutiva, la -glucuronidasa que acta sobre el MUG, y forma un compuesto fluorescente de color azul que se puede poner de manifiesto haciendo incidir radiacin ultravioleta sobre el sistema. 2. Objetivos. El alumno determinar la presencia de los organismos coliformes en agua por el Mtodo del Nmero Ms Probable. 3. Equipos, Reactivos y Materiales.
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1 pipeta serolgica de 10 ml estril (por muestra, blanco o control) 2 pipeta serolgica de 1 ml estril (por muestra, blanco o control) 1 pinzas (de diseccin) estriles Frasco de dilucin estril aforado a 100 mL (conteniendo 0.3 mL de solucin de tiosulfato de sodio al 3%) Asa bacteriolgica Horno de incubacin a 37 C Horno de incubacin a 44.5 C Autoclave 9 tubos de ensaye 16 x 150 mm (por muestra, blanco o control) 9 campanas Durham (por muestra, blanco o control Gradilla Mechero Caldo lactosado concentracin doble Caldo lactosado concentracin sencilla Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa (VBBL) Cajas Petri con medio de agar Eosina Azul de Metileno (EMB) (segn resultados de la prctica) 100 mL de agua potable (colectada en un frasco estril (que contenga 0.3 mL de solucin de tiosulfato de sodio al 3%) 100 mL de agua contaminada con materia fecal 100 mL de agua estril Agua destilada Succionador para pipetas 4. Procedimiento Mtodo Nmero Ms Probable. a) Prueba Presuntiva 3. Inocular con 10 mL de la muestra tres tubos con caldo lactosado de doble concentracin. 4. Inocular con 1mL de la muestra tres tubos con caldo lactosado de concentracin sencilla. 5. Inocular con 0.1 mL de la muestra tres tubos con caldo lactosado de concentracin sencilla. 6. Incubar todos los tubos a 37 C durante 48 h. 7. Transcurrido el tiempo de incubacin, observar si hubo produccin de cido y/o gas. La produccin de gas se detecta por su acumulacin en la campana de Durham. La ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba, an cuando haya produccin de cido o se observe un crecimiento evidente.
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b) Prueba Confirmativa. 1. A partir de uno de los tubos positivos de la prueba presuntiva, inocular con dos asadas un tubo con caldo VBBL y con otras dos asadas otro tubo con caldo EC. Anote a que tubo y a que alcuota corresponde la resiembra. 2. Realizar la misma operacin anterior con cada uno de los tubos positivos provenientes de la prueba. 3. Incubar los tubos con caldo VBBL a 37 C durante 48 h (Coliformes Totales). 4. Incubar los tubos con caldo EC a 44.5 0.2 C durante 48 h (Coliformes Termotolerantes o Fecales). 5. Al trmino del tiempo de incubacin, observar la produccin de gas en los tubos. Registre el nmero de tubos positivos en la siguiente tabla:

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES Alcuota (mL) 10 1 0.1 Tubos positivos PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES FECALES Alcuota (mL) 10 1 0.1 Tubos positivos

NOTA: El nmero de tubos positivos para cada una de las alcuotas en la prueba confirmativa confirma lo que se conoce como el nmero caracterstico, y que ser el que se interpole, para efectos de esta prctica, en la tabla 1, y as calcular del Nmero Ms Probable. Por ejemplo, si en la prueba confirmativa usted obtiene los siguientes resultados: PRUEBA CONFIRMATIVA 10 1 2 1

Alcuota (mL) Tubos positivos

0.1 0

30

Significa que su nmero caracterstico ser 2 1 0. Al interpolar en la tabla 1 este nmero caracterstico le dar un total de 15. Entonces usted reportar 15 NMP de organismos coliformes (totales o fecales, segn sea el caso)/100 mL.

TABLA 1 Determinacin de microorganismos por el mtodo del Nmero Ms Probable cuando se utilizan alcuotas de 10 , 1.0 y 0.1 mL por triplicado. 10 mL 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 mL 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.1 mL 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 NMP/100 10 mL mL 3 2 3 2 6 2 9 2 3 2 6.1 2 9.2 2 12 2 6.2 2 9.3 2 12 2 16 2 9.4 2 13 2 16 2 19 2 3.6 3 7.2 3 11 3 15 3 7.3 3 11 3 15 3 19 3 11 3 15 3 20 3 24 3 16 3 20 3 24 3 29 1 mL 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 0.1 mL 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 NMP/100 mL 9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 -

c) Prueba Completa.
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1. Resembrar en una placa de agar EMB por estra cruzada, cada uno de los tubos de VBBL que haya dado positivo en la prueba. 2. Incubar todas las placas a 37 C durante 24 48 h. 3. Al trmino del tiempo de incubacin observar la aparicin de colonias con centro oscuro y/o brillo metlico en las placas de EMB. Siempre que sea posible, el anlisis bacteriolgico debe iniciarse inmediatamente despus del muestreo, y preferentemente, antes de una hora. Cuando las condiciones no lo permiten y sea necesario retardar el anlisis de las muestras, stas debern guardarse a una temperatura igual o menor a los 10 C, hasta que sean examinadas. Se recomienda que el tiempo de almacenamiento no exceda de las 30 h para muestras de agua potable y de 6 horas para otros tipos de agua. 5. Discusin y Conclusiones. 8. Mencionar los inhibidores selectivos que contienen los medios de cultivo VBBL y EMB. 9. Qu entiende por microorganismos indicadores? 10. Cul es la diferencia entre un coliforme total y un coliforme fecal? 11. Mencione algunos microorganismos que pudieran ser tiles como indicadores de otras formas de contaminacin, diferente a la fecal (en diferentes ambientes). 12. En qu casos se utiliza al Clostridium perfringens como microorganismo indicador de contaminacin fecal? INFORME 1. Reporte los resultados del Mtodo del Nmero Ms Probable en las siguientes tablas: NMP ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES/100 mL

EQUIPO

NMERO CARACTERSTICO

EQUIPO

NMERO CARACTERSTICO

NMP ORGANISMOS COLIFORMES

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FECALES/100 mL

2. Discuta sus resultados de acuerdo con los valores sealados como lmites permisibles en la NOM-127-SSA1-1994. 3. Reporte la presencia de Escherichia coli en el mtodo de anlisis utilizado

6. Bibliografa. Fernndez Escartin. E. 1981. Microbiologa Sanitaria. Agua y Alimentos Vol 1. EDUG. Guadalajara, Mxico. Norma Mexicana de Anlisis NMX-AA-042-1987. Calidad del Agua. Determinacin del Nmero ms Probable (NMP) de Coliformes Totales, Coliformes Fecales (termotolerantes) y Escherichia coli presuntiva. Norma Mexicana de Anlisis NMX-AA-102-1987. Calidad del Agua. Deteccin y Enumeracin de Organismos Coliformes Termotolerantes y Escherichia coli presuntiva. Mtodo de Filtracin de Membrana. Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud Ambiental. Agua para Uso y Consumo Humano. Lmites permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacin. Pelczar, M.J., E.C.S. Chan, N.R. Krieg. 1993. Microbiology. Concepts and Applications. McGraw-Hill. Inc. New York. Pepper I.L., C.P. Gerba, J.W. Brendecke. 1995. Environmentel Microbiology: A Laboratory Manual. Ec. Academic Press. E.U.A. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 20th Edition. Tortora, G.J., B.R. Funke, C.L. Case. 1995. Microbiology. 5a. Ed. Ed. The Benjamn/Cummings Publishing Companu, Inc. E.U.A.

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PRCTICA 7 DETERMINACIN DE ORGANISMOS COLIFORMES EN AGUA POR EL MTODO DE FILTRO DE MEMBRANA

1. Introduccin. La importancia del anlisis bacteriolgico del agua se explica en la introduccin de la prctica # 1. Este mtodo de anlisis se recomienda para muestras de agua en los que se sabe o se espera que el grado de contaminacin por organismos coliformes debe ser bajo o nulo (aguas purificadas, aguas destiladas, aguas desionizadas, aguas inyectables, etc.), por lo que se requieren grandes volmenes de muestra para confirmar de manera segura la ausencia de ellos. En este caso, la muestra (que debe ser de por lo menos de 100 mL) se hace pasar por una membrana (un filtro especial comnmente hecho a base de nitrato de celulosa o de acetato de celulosa) con una abertura de poro de 0.45 m. Los microorganismos son retenidos en la membrana la cual se coloca en los medios de cultivo adecuados y se incuba a las temperaturas y tiempos especificados. Se cuentan las colonias fermentadoras de lactosa desarrolladas en la membrana y se calcula el nmero de coliformes en la muestra original. Este mtodo es ms rpido que el Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP), pero tiene la desventaja que no puede ser usado en muestras de agua con alto contenido de partculas en suspensin porque se obstruyen los poros de la membrana. 2. Objetivos. El alumno determinar la presencia de los organismos coliformes (totales y fecales) en agua por el Mtodo del Filtro de Membrana. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. Incubadora con temp. 44.5 C 0.2 C. Incubadora con temp. 35 C 0.5 C. Autoclave (requerimientos 121 C y 15 psi.) Balanza analtica (precisin 0.0001) Bomba para vaco. Parrilla agitadora/calentadora. Equipos de Filtracin (embudo, portafiltro y pinzas) Matraz Kitasato ( 500 mL como mnimo) Frascos para muestreo 250-500 mL. Pipetas graduadas de 10 mL.
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Matraces Erlenmeyer o para preparar (tapa de rosca preferentemente) Cajas Petri de vidrio o de plstico desechables (estriles) de 47 mm de dimetro Filtros de membrana estriles de 47 mm de dimetro y 0.45 m de poro Almohadillas absorbentes estriles Embudo magntico de filtracin Pinzas para filtro Pizeta de plstico esterilizable Mechero Bunsen Barras magnticas Pipetor Papel indicador para autoclave Pipeta volumtrica de 1 mL Medio m-Endo deshidratado. Medio m-FC deshidratado. Alcohol etlico 95%. Hidrxido de sodio grado reactivo cido roslico deshidratado grado reactivo. Tiosulfato de sodio grado reactivo. Agua con las siguientes destilada o desionizada 4. Procedimiento. 4.1 Preparacin de reactivos y medios de cultivo. Caldo m-Endo (Coliformes Totales) a) Pesar 4.8 g de medio m-Endo deshidratado y disolverlo en una 100 mL de solucin de alcohol al 2% (disolver 2 mL de alcohol etlico al 95% en 100 mL de agua destilada). b) Poner aproximadamente 20 mL de la solucin de alcohol en un matraz Erlenmeyer de 250 500 mL con tapa de rosca, vaciar el medio de cultivo pesado y agregar el resto de la solucin de alcohol. c) Poner el matraz ligeramente tapado en una parrilla de calentamiento y en agitacin con una barra magntica, calentando hasta ebullicin, retirarlo rpidamente para que no se derrame. No esterilizar. d) Dejar enfriar y ajustar el pH entre 7.1 y 7.3 con NaOH 1N. e) El medio puede ser utilizado hasta por 7 das permaneciendo en refrigeracin de 2-10 C Caldo m-FC (Colifomes Fecales) a) En un matraz Erlenmeyer con tapa de rosca agregar en 100 mL de agua destilada 3.7 g de medio m-FC deshidratado. b) Agregar 1.0 g de cido roslico deshidratado a un matraz volumtrico conteniendo solucin 0.2N de NaOH hasta completar un volumen de 100 mL para producir una solucin al 1% de cido roslico. Esta solucin se conserva hasta 15 das en refrigeracin.
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c) Agregar 1 mL de la solucin al 1% de cido roslico al caldo m-FC deshidratado. d) Calentar el medio hasta de ebullicin y en agitacin con una barrita magntica, remover rpidamente para que no se derrame. e) Dejar enfriar y medir que el pH final sea de 7.4 . f) El medio puede ser utilizado hasta por 7 das permaneciendo en refrigeracin de 2-10 C

Hidrxido de sodio 0.2 N a) Pesar 0.8 g de hidrxido de sodio y disolverlo por agitacin en un vaso de precipitado con aproximadamente 30 mL de agua destilada. Aforar en un matraz volumtrico de 100 mL. Hidrxido de sodio 1.0 N. a) Pesar 4 g de hidrxido de sodio y disolverlo por agitacin en un vaso de precipitado con aproximadamente 50 mL de agua destilada. Aforar en un matraz volumtrico de 100 mL.

NOTA: Todo el material requerido para el anlisis (frascos, pipetas, tubos de ensaye, etc.) debe ser sometido a esterilizacin a 121C y 15 lb/pulg2 (psi) por 15 minutos, o de lo contrario adquirirlos esterilizados de fbrica. A los frascos de muestreo de 250 mL antes de someterlos a la esterilizacin se les agrega 1 mL de una solucin al 3 % de tiosulfato de sodio (Na2S2O3). 4.2 Sembrado de las muestras. a) Limpiar el rea de trabajo con una solucin desinfectante y encender un mechero para crear una atmsfera estril. b) Sumergir las puntas de la pinza para filtro en alcohol, llevarlas al mechero encendido para flamearlas y as esterilizarlas. Colocar una almohadilla absorbente en las cajas Petri utilizando las pinzas estriles. En caso de adquirir cajas Petri con almohadilla hacer caso omiso de la indicacin anterior. c) Con una pipeta estril agregar a cada caja 2 ml de medio m-Endo para coliformes totales y en otra caja 2 mL del medio m-FC para coliformes fecales. d) En la boca del matraz Kitasato colocar la base del soporte del embudo de filtracin (portafiltro) . Conectar el matraz a la bomba de vaco.

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e) Con la punta de las pinzas estriles tomar un filtro de membrana y colocarlo en el centro de la base del soporte del embudo de filtracin, despus solo colocar el embudo, en el caso de ser magntico; si es de vidrio, unirlo con pinzas especiales para este sistema. f) Iniciar la filtracin 100 mL de muestra (verter cuidadosamente la muestra al embudo). g) Remover el filtro con las pinzas flameadas y transferir el filtro inmediatamente a la caja Petri que se prepar con anterioridad, centrar el filtro y evitar que queden atrapadas burbujas de aire bajo el mismo ocasionando una mala impregnacin del medio de cultivo en su superficie. h) Tapar e invertir la caja Petri (para prevenir que la condensacin se deposite en la superficie del filtro durante el periodo de incubacin) e incubar a la temperatura apropiada. Coliformes Totales 35 C + 0.5, por un lapso de 18 a 24 horas Coliformes Fecales 44.5 C + 0.2, por un lapso de 18 a 24 horas (bao mara) Nota: Despus del procedimiento de filtracin, enjuagar las paredes del embudo de filtracin con un volumen mnimo de 50 mL de agua esterilizada y flamear la base del filtro antes de pasar otra muestra por el embudo. 4.3 Resultados. El crecimiento bacteriano se observa de la siguiente manera: Coliformes totales. Colonias guinda oscuro, rojas o con brillo verde metlico. Coliformes fecales. Colonias azules. En algunos casos verdes o grises (organismos estresados). El conteo se hace tomando en cuenta cualquier colonia que presente las caractersticas antes mencionadas. Un buen resultado es aquel que presenta desde 0 hasta 60 unidades

formadoras de colonias (UFC) por cada 100 mL. En el caso de observar un nmero mayor a 60 indica que la muestra requiere dilucin para su anlisis. El resultado se expresa en UFC/100 mL 5. Discusin y Conclusiones. Informe.

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Describa el procedimiento de sembrado con ilustraciones desde la toma de la muestra hasta la observacin de los resultados, anotando los cambios que se llevaron a cabo durante todo el proceso, en comparacin con lo estipulado en el escrito de su prctica, y explicando las razones de dichos cambios. Cuestionario. 1. Cul es el medio de cultivo utilizado para la determinacin de coliformes totales y porqu? 2. Cul es el medio de cultivo utilizado para la determinacin de coliformes fecales y porqu? 3. Segn la NOM-127-SSA1-1994, que decisin debe tomarse para las muestras analizadas? 4. Los resultados obtenidos, pueden expresarse tal como se obtuvieron en su prctica? Argumente sus resultados. 5. Haga un cuadro comparativo entre la tcnica de filtro de membrana y la de nmero ms probable en donde se observen ventajas y desventajas. Investigue. 6. Bibliografa. Norma Mexicana de Anlisis NMX-AA-102-1987. Calidad del Agua. Deteccin y Enumeracin de Organismos Coliformes Termotolerantes y Escherichia coli presuntiva. Mtodo de Filtracin de Membrana. Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud Ambiental. Agua para Uso y Consumo Humano. Lmites permisibles de Calidad y Tratamientos a que debe Someterse el Agua para su Potabilizacin. Pelczar, M.J., E.C.S. Chan, N.R. Krieg. 1993. Microbiology. Concepts and Applications. McGraw-Hill. Inc. New York. Pepper I.L., C.P. Gerba, J.W. Brendecke. 1995. Environmentel Microbiology: A Laboratory Manual. Ec. Academic Press. E.U.A. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 20th Edition. Tortora, G.J., B.R. Funke, C.L. Case. 1995. Microbiology. 5a. Ed. Ed. The Benjamn/Cummings Publishing Companu, Inc. E.U.A.

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PRCTICA 8 ELABORACIN DE VINAGRE 1. Introduccin. El vinagre es un excelente ejemplo de la produccin microbiolgica de un compuesto, el cual es el resultado del proceso de fermentacin y una subsecuente oxidacin. El primer paso en la produccin de vinagre se lleva a cabo por una levadura que fermenta el azcar, el cual utiliza como sustrato, produciendo alcohol como un producto de ese proceso. La produccin casera de vinagre utiliza las levaduras que se encuentran de forma natural en la piel de uvas o manzanas. Comercialmente, se utiliza la S. cerevisiae como cultivo para iniciar el proceso de fermentacin. En ambos casos ocurre este proceso. Seguido del proceso de fermentacin, el etanol producido por las levaduras es metabolizado aerbicamente por las bacterias del cido actico, tales como el Acetobacter aceti u otras especies. Estos organismos oxidativos son capaces de utilizar el alcohol como fuente de carbono y energa, produciendo el cido actico como un producto de desecho. 2. Objetivos. El alumno llevar a cabo los dos tipos de preparacin de vinagre (casera y comercial) para comparar ambos procesos. El alumno observar los resultados de los dos procesos llevados a cabo en las diferentes preparaciones que se le indiquen y los tiempos en los cuales ocurren. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. 4 matraces Erlenmeyer perfectamente limpios de 250 mL 250 mL de jugo de manzana 1 manzana (sin lavar) Pasas (sin lavar) Cultivo fresco de Saccharomyces cerevisiae 1 sobre de lavadura para hacer pan Cultivo fresco de Acetobacter Asa de inoculacin Papel aluminio Cuchillo 4. Procedimiento. Primer perodo. 1. Adicionar aproximadamente 50 mL de jugo de manzana a cada uno de los matraces Erlenmeyer de 250 mL.
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2. Adicionar a un primer matraz conteniendo jugo de manzana, trozos de piel de manzana y 3 pasas (ambas sin lavar). 3. Adicionar a otro matraz conteniendo jugo de manzana, trozos de piel de manzana y 3 pasas (todo bien lavado). 4. Rehidratar la levadura para hacer pan siguiendo las instrucciones del fabricante y despus del tiempo que establecen las mismas, adicionar 1 mL a otro matraz conteniendo el jugo de manzana. 5. Tomar 2 asadas del cultivo fresco de S. cerevisiae y agregarlas al otro matraz conteniendo jugo de manzana cuidando de homogenizar muy bien la levadura. 6. Cubrir todos los matraces con papel aluminio e incubar a temperatura ambiente. Revisar peridicamente los matraces para observar crecimiento del microorganismo, olor y produccin de gas. NO AGITAR LOS MATRACES. Segundo Perodo. 1. Cuando el olor del etanol se haga predominante en el matraces, lleve a cabo la tincin de Gram para observar tanto levaduras como bacterias.

2. Aadir una asada ( 1 mL) del cultivo de Acetobacter a los matraces que solo fueron inoculados con la S. cerevisiae ( no adicionar a aquellos matraces que se les agreg piel de manzana y pasas). 3. Volver a incubar a temperatura ambiente. 4. Dejar que los matraces que contienen la piel de manzana y las pasas progresen naturalmente. Los organismos oxidativos deben estar presentes en el matraz, ya que ellos, al igual que las levaduras, forman parte de la flora normal de esas frutas. Tercer Perodo. 1. Examinar los matraces para observar la produccin de una pelcula, la cual indicar el crecimiento del microorganismos aerbico Acetobacter. NO ROMPER LA PELCULA AGITANDO EL MATRAZ.

2. Cuando la pelcula est bien formada y el olor de vinagre se haga presente, haga la tincin de Gram. Compare los resultados de sus observaciones con respecto a las primeras que realiz (sustrato fermentado).

5. Discusin y Conclusiones.
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Informe. 1. Haga un esquema de sus observaciones al microscopio de los frotis teidos por la tcnica de Gram, indicando al pie de cada uno tipo de organismo, agrupacin que presente y tipo de Gram. 2. Discuta sus resultados y obtenga las conclusiones correspondientes. 3. Describa como observ el desarrollo de cada uno de los pasos involucrados en esta prctica, tomando en cuenta cada uno de los cuatro matraces que se prepararon.

6. Cuestionario. 1. Cules son los dos grupos de microorganismos responsables de la produccin del vinagre? 2. Escriba las reacciones qumicas que se llevan a cabo en ambos procesos. 3. Porqu el vinagre debe pasteurizarse? 4. Bsicamente qu factores se controlaron en esta prctica para la produccin del vinagre?

6. Bibliografa. Alexander, S. K., Strete, D. 2001. Microbiology. A Photographic Atlas for the Laboratory. Ed. Benjamin Cummings. Colom, J. S., Kubinski, A. M. 1986. MICROBIOLOGY. West Publishing Company. E. U. A. Laboratory Excercises in

Davis, B. D., Dulbecco, R. 1978. Tratado de Microbiologa. 2da. Edicin. Ed. Salvat Editores. Espaa.

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PRCTICA 9 RECUENTO DE ORGANISMOS COLIFORMES EN PLACA EN MUESTRAS DE QUESO 1. Introduccin. Los organismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra. A fin de simplificar su manejo en el laboratorio, se ha establecido una definicin sobre la base de las caractersticas ms constantes que exhibe la especie tipo del grupo, Escherichia coli. Esta simplificacin sin embargo, da lugar a que se incluyan en el grupo, bacterias de origen no estrictamente intestinal como el Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae y Citrobacter, porque comparten las caractersticas que la definicin impone, por lo que no necesariamente guardan una relacin directa con la contaminacin de origen fecal y en consecuencia, tampoco con la presencia de patgenos entricos. El uso de los coliformes como indicador sanitario significativo, debe restringirse al agua, hielo potable, a los alimentos sometidos a procesos trmicos y a la evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higienizacin del equipo. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos o slidos con caractersticas selectivas y/o diferenciales. Este mtodo permite determinar el nmero de microorganismos coliformes presentes en una muestra utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35 C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la produccin de gas y cidos orgnicos, los cuales viran el indicador de pH que contiene el medio y precipita las sales biliares. 2. Objetivos. El alumno conocer el mtodo microbiolgico para la determinacin del nmero de microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por medio de la tcnica de recuento en placa. El alumno interpretar la presencia de organismos coliformes totales en alimentos. 3. Equipos, Reactivos y Materiales. 2 frascos con 90 mL de solucin amortiguadora de fosfatos (solucin de trabajo diluyente) 8 tubos con 9 mL de solucin amortiguadora de fosfatos c/u (solucin de trabajo diluyente) 2 morteros con pistilo 2 esptulas 10 pipetas de 1mL estriles
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2 pipetas de 10 mL estriles Balanza granataria Dispositivo con luz ultravioleta Incubadora a 35 C 2 C 250 mL de agar rojo violeta bilis 10 cajas Petri estriles Un trozo de queso a granel (de preferencia de una tienda de abarrotes) Un trozo de queso empaquetado de fbrica

a. Preparacin de soluciones. La solucin amortiguadora de fosfatos se prepara segn instrucciones en la NOM113-SSA1-1994. 4. Procedimiento. i. Exponer los morteros y esptulas (previamente limpios) a la luz ultravioleta por un perodo de 30 minutos. Moverlos aproximadamente cada 10 min para asegurar que todas las superficies queden expuestas a la luz UV. Transcurridos los 30 min, cortar un trozo de cada muestra de queso y molerlos en mortero (cada trozo por separado). Pesar en la balanza granataria un frasco con 90 mL de solucin amortiguadora de fosfatos (solucin de trabajo), y agregar muestra de queso molido hasta completar 10 g ms de peso correspondientes a la muestra. Agitar vigorosamente por un tiempo suficiente para homogenizar muy bien la dilucin. Este procedimiento se lleva a cabo por cada muestra de queso. Llevar a cabo las diluciones tal como se indic en su prctica # 5 Transferir 1 mL de cada dilucin a cajas de Petri estriles. Agregar de 12 a 15 mL de medio agar rojo violeta bilis, el cual se debe mantener de 45 a 48 C en bao de agua. Mezclar correctamente el medio con la muestra (movimientos de adelante hacia atrs, de izquierda a derecha en sentido de las manecillas del reloj, as como en contra). Dejar solidifica sobre una superficie plana, horizontal y fra. Agregar 4 mL del mismo medio extendindolo para cubrir completamente la superficie.
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ii. iii.

iv. (10-1 a 10-5). v. vi. vii.

viii.

ix. x. horas. xi.

Dejar solidificar. Incubar las cajas en posicin invertida a 35 2 C durante 24 2 Contar el nmero de colonias en cada placa y multiplicar por el inverso de la dilucin. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa. Reportar: Cuenta de organismos coliformes en placa de agar rojo violeta bilis incubadas a 35 2 C durante 24 2 horas por gramo o mL de muestra. Utilice la frmula: UFC/g = 1/dilucin X Nmero de colonias X 1/alcuota NOTA: El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 min.

xii.

5. Discusin y Conclusiones. Informe. 1. Haga las ilustraciones y discuta los resultados que obtuvo estableciendo las conclusiones correspondientes. 6. Cuestionario. 1. En el caso de no contar con dispositivo con luz UV, que tratamientos sugiere Ud. para los materiales utilizados en el corte y molienda de la muestra. 2. Qu hara Ud. para poder demostrar la presencia o ausencia de coliformes fecales en esta muestra?

6. Bibliografa. Amador, L. R., Fernndez, R. E., Rodrguez M. R. 2004. Manual de Laboratorio de Microbiologa Sanitaria. Instituto Politcnico Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas . Departamento de Microbiologa.
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NOM-113-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

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