[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

incana]

13 de julio de 2001

ESTABLECIMIENTO DE YEMAS VALERIANA (Valeriana officinalis) y POLYLEPIS (Polylepis incana)

Apunte Kathy, Ortega Henry Escuela Politcnica del Ejrcito ESPE Departamento de Ciencias de la Vida. Carrera de Ingeniera en Biotecnologa. Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales. Sangolqu Ecuador. RESUMEN
La valeriana (Valeriana officinalis) es una hierba permanente, cuya parte area se renueva anualmente, su rizoma consta con brotes laterales delgados y largos, del que salen numerosas raicillas; sus flores son pequeas y numerosas, tiene propiedades medicinales por lo que se usa para trastornos nerviosos, trastornos digestivos, etc. Debido a la heladas que afectan a la valeriana se ha optado en estos tiempos por su multiplicacin in vitro. Polylepis incana es una especie de planta en el Rosaceae de la familia; se encuentra en los pramos en Ecuador , Per , y posiblemente Colombia, esta especie est amenazado por la prdida de hbitat, por lo que se ha buscado multiplicarla de forma in vitro para su conservacin. La callogeness a partir de yemas axilares y apicales es una tcnica de las ms importantes en el cultivo de tejidos in vitro. En el presente trabajo se realizara el establecimiento de yemas axilares y apicales de Valeriana (Valeriana officinalis) y Polylepis incana las cuales se utilizaron como explante y se analizo su respuesta en el medio de cultivo Murashige-Skoog (MS); en el caso de y Polylepis incana el medio fue enriquecido con: 2mg/L de (BAP) y 0.5mg/L de (AIA), 30g/L de azcar y 6,5 g L-1 de agar. ; para valeriana el medio solo se enriqueci con 30 g L-1 de azcar. Luego de un periodo de incubacin de dos semanas, se observ y evalo los resultados, en las que existieron, en el caso de valeriana un 33% de brotes, y en el caso de Polylepis no se obtuvo brote alguno.

Palabras Claves: Yema, Polylepis, BAP, AIA, valeriana INTRODUCCIN Valeriana officinalis es una renueva anualmente. Su hierba parte permanente, cuya parte area se subterrnea es un rizoma vertical de 1 - 2 cm de grueso. Su parte area se compone de un tallo

cilndrico, hueco, acanalado, de 70 170 cm de alto, ramificado en su parte superior, y sus flores de son en color 1 pequeas ramilletes numerosas,

terminales,

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

blanco o ligeramente rosado. Se utiliza como sedante nervioso, en malestares tales como dolor de cabeza, ansiedad, insomnio, colon irritable, clicos gastrointestinales, asma y trastornos asociados a la menopausia (MHT, 2000) Los

incana]

13 de julio de 2001 apicales (o

meristemos

primarios) del tallo y de la raz conducen al desarrollo el cuerpo primario (races, tallos y hojas) de la planta y se forman durante la embriognesis (Afanador, 2005). Segn Salazar (2009) los segmentos

Polylepys incana es un rbol de mediano porte, de unos 4-6 hasta 10 m. de altura, con follaje denso y el fuste de 40 o en ms cm de y su dimetro, revirado 2006). Se utiliza Polylepis como medicina natural debido a sus propiedades; paliativo de en las la amigdalitis, garganta y inflamaciones irregular como nudoso helicoide,

ms adecuados de explantes son las hojas y yemas en la induccin de respuestas morfogenticas in vitro en semileosas. La mayora de los brotes axilares o laterales pueden producir ramas axilares adicionales perpetuamente, por medio del subcultivo de cada uno de sus brotes en medios de cultivo adecuados. Por consiguiente, el cultivo de yemas es un mtodo conveniente al, 1993). y rpido de multiplicacin clonal (Roca M. W. et

corteza externa es rojiza (Arica,

resfros (Arica, 2006). La multiplicacin in vitro a travs de yemas, es una estrategia que permite la multiplicacin masiva de plantas, las cuales adems de ser genticamente uniformes e idnticas a la planta madre, tienen la ventaja de ser plantas libres de patgenos (Salazar, 2009).

Pueden existir efectos de estrs debido a estmulos hormonales y otros estmulos en el medio nutritivo que pueden causar una acelerada maduracin del explante. Por esta razn es importante el uso de citoquininas, que pueden jugar un rol importante en la citocinesis, crecimiento y desarrollo de 2 las

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

plantas ( Aloni et al, 2006). Se ha demostrado experimentalmente que las la interacciones formacin rpida entre de las Citoquininas y Auxinas promueven yemas florales y el nmero de yemas producidas (Peeters et al, 1991), La capacidad por Se de el formacin suele genotipo ha y de el

incana]

13 de julio de 2001 a la Escuela

perteneciente

Politcnica del Ejrcito. Material Biolgico Se utilizaron yemas axilares y y

apicales de plantas de (Valeriana officinalis)

valeriana Polylepis

incana, las cuales fueron adquiridas en la Reserva POLYLEPIS LODGE, en el Carchi; las plantas fueron transportadas a los laboratorios de cultivos de tejidos vegetales de la Escuela Politcnica del Ejercito en fundas ziploc con agua destilada. Preparacin siembra Se desinfect el piso con kalipto y las cmaras de flujo laminar con alcohol al 90%, para luego de la desinfeccin colocar todo el material que iba a ser necesario para la siembra como mecheros, vasos de precipitacin, botellas de agua estril, aspersores con savln, pinzas, bistur, papel toalla estril, ligas y plstico adherente. Despus se prendieron las lmparas UV por 15 minutos y posteriormente se encendi el flujo de aire por 15 minutos antes de trabajar en las cmaras. de la sala de

yemas afectada ambiente.

tambin

verse

demostrado adicin

experimentalmente que la

de nitrato de plata al medio de cultivo aumenta el porcentaje de brotes a partir de yemas axilares (Afanador, 2005).

El objetivo de esta prctica fue el establecer y desarrollar plntulas a partir de yemas axilares y apicales de valeriana (Valeriana officinalis) y Polylepis (Polylepis incana), adems de evaluar la supervivencia de los explantes, la contaminacin y el crecimiento de brotes. MATERIALES Y METODOS El trabajo se de en desarroll la en el de Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales Ingeniera Facultad Biotecnologa

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

Polylepis: Desinfeccin Se seleccionaron las mejores yemas apicales de la planta y se procedi a cortar alrededor de 3 cm. Se lav los explantes con agua corriente. Se prepar 3g/500mL de una solucin de detergente con 5 gotas de tween 20, yemas por un se sumergi las perodo de 10

incana]

13 de julio de 2001

y el bistur para sacar un papel toalla estril, con el bistur se realizaron cortes de las yemas apicales, el corte fue alrededor de 2 cm, se retir el tejido necrosado. Se sembr 2 yemas apicales en diferentes frascos, en medio MS suplementado con 2mg/L de (BAP) y 0.5mg/L de (AIA), 30g/L de azcar y 6,5 g L-1 de agar . Por ltimo, se sellaron los frascos con dos capas del plstico adherente, se asegur con una liga y se rotul cada frasco para su posterior por 1 10,0068 lumnica. Para valeriana se realizaron los incubacin luxes de a 25C de temperatura, 65% de humedad y intensidad

minutos, se realiz tres lavados con agua destilada para eliminar los residuos de detergente. Se sumergi los explantes

minuto en una solucin con alcohol al 70% y se mantuvo con constante agitacin. Posteriormente se sumergieron los explantes en una solucin de Hipoclorito de sodio al 20% ms 5 gotas de tween 20 por 10 minutos con agitacin constante. Luego se llev a la cmara para la siembra donde se realizaron tres lavados con agua estril. Antes de la siembra se sumergio a cada explante en una solucin de 500ml de agua destilada con 0,5 g de cistena. Siembra del explante Se realizaron tres lavados en la cmara de flujo, se flame las pinzas

mismos pasos que con Polylepis pero el detergente que se prepar fue de 3g/L con el que se desinfectaron los explantes durante 10 minutos. Luego se hicieron tres lavados explantes en con en una agua estril, de para posteriormente se sumergieron los solucin Thicarlo al 0,5% durante 10 minutos constante agitacin, despus de este paso realizar tres lavados con agua estril y sumergir enseguida a las muestras en una solucin de 500 ml, que contena alcohol al 70% durante 1 minuto. 4

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

Posteriormente se introdujo al

incana]

13 de julio de 2001

mientras que los frascos 3 y 5 lo presentaron en poca cantidad. En el caso de los frascos 2, 6, (en forma significativa) 7, 8 y 9 (en forma moderada) estos factores presentaron derivaron en la contaminacin por hongos. Todos oxidacin de los explantes en los frascos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11 y
Explan te Brot e Bacter ia ++ + ++ + ++ ++ ++ Hongo Oxidaci n ++ + ++ +++ + + + ++ +++ ++ Muert o + + + + + + + + + -

material vegetal en una solucin de 500ml de cloro al 1,5% ms 5 gotas de tween 20. Dentro de la cmara se realizaron los mismos pasos que para Polylepis excepto que no se sumerge en cistena.

RESULTADOS Los explantes cultivados de se dos

Blanc o
+++ +++ ++ ++ -

Verde
++ + ++ -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

observaron

despus

semanas. Los resultados obtenidos de cada uno de los frascos se detallan en la Tabla 1 y Tabla 2.
Tabla 1. Evaluacin del desarrollo de las yemas apicales de Polylepis en la formacin de brotes y callos, adems de la evaluacin de la viabilidad de los explantes. Criterio de evaluacin: (-) Ausencia, (+) Poco, (++) Moderado, (+++) Mucho.

12 y en la muerte de los explantes en los frascos 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 y 11. En la figura 1 se muestra los

Se tom como criterios de anlisis la formacin de brote as como la presencia explante. Como se muestra en la tabla 1 todos los frascos fue presentaron pero causada la por contaminacin contaminacin de contaminacin del

diferentes tipos de contaminacin, por bacterias y hongos. En caso de los hongos vara el color del hongo. En los frascos 2, 6, 8 y 9 se observ hongos de color blanco, y en los frascos 7, 8 y 9 un hongo de color verde.

diferentes agentes, los frascos 1, 4, 8, 11 y 12 presentan contaminacin por bacterias de forma moderada 5

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

incana]
+ + +

13 de julio de 2001
+ ++ -

11 12

En el caso de Valeriana, como se muestra en la tabla 2, los contaminacin

Figura 1. Muestra la contaminacin de hongos de color verde (1B), bacterias (1A) y contaminacin de hongos de color blanco (1C).

frascos los por

1, 2, 3, 8, 11 y 12 mostraron poca por bacterias; frascos 5, 7 y 10 contaminacin bacterias y no mostraron una moderada se observ

En

la

figura

se de

muestra hongos

la y

contaminacin por hongos. En el caso de Valeriana, se obtuvo un total de 4 explantes (33%) que presentaron brote. Sin embargo, dos de ellos presentaron contaminacin por hongos y los dos restantes se vieron afectados por efecto de la oxidacin obtuvieron por se lo que viables. no En se la brotes

oxidacin y muerte causada por la contaminacin bacterias en los frascos de Polylepis.

Figura 2: Oxidacin producida por contaminacin.

figura

muestran

algunos

explantes procedentes de valeriana

Tabla 2. Evaluacin del desarrollo de las yemas axilares de Valeriana en la formacin de brotes y callos, adems de la evaluacin de la viabilidad de los explantes. Criterio de evaluacin: (-) Ausencia, (+) Poco, (++) Moderado, (+++) Mucho.
Explant e 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Brote Bact eria + + + ++ ++ + ++ Hongo Blanc o + Verde + Oxid aci n + + + +++ + + +++ + + +++ Mue rto + + +

donde se mostraron brotes.

+ ++ ++ -

Figura 3: Explantes con brote de Valeriana.

La contaminacin por bacterias en Valeriana deriv en la oxidacin de todos los explantes (figura 4).

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

En cuanto

incana]

13 de julio de 2001 a Valeriana, se pudo

obtener un total de 4 brotes (Tabla 2) de los cuales dos fueron descartados por la presencia de contaminacin bacteriana restantes
Figura 4: Contaminacin por bacterias y oxidacin de explantes de Valeriana.

(2

12)

los ya

dos que

descartados El resto de

presentaron oxidacin en sus tejidos (6 y 9). explantes para presentaron dificultades

DISCUSIN El explante ms usado en cultivo in vitro las para plantas los procesos 2004). es de El el micropropagacin son las yemas de (Castillo, de establecimiento yemas

desarrollar brotes por la presencia de hongos (4), bacterias (1, 2, 3, 5, 7, 8, 10, 11, 12) y oxidacin (en todos), que solo en algunos casos llevaron a la muerte de la muestra (4, 7, 10). Como describe Gonzlez (2003), la principal fuente de contaminacin en el cultivo in vitro de tejidos vegetales presencia se de produce por la microorganismos

mtodo ms usado debido a que est formado por tejido meristemtico que se caracteriza por ser una estructura dinmica que se encuentra en continuo proceso de divisin celular y crecimiento (Afanador, 2005). Al observar los resultados obtenidos se pudo ver que, en el caso de Polylepis (Tabla 1) ninguna present desarrollo de brote debido a contaminacin ya sea por hongos (2, 6, 7, 8 y 9) o bacterias (1, 3, 4, 5, 8, 11 y 12) o por oxidacin (1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11 y 12); factores que llevaron en la mayora de los casos, a la muerte de los explantes (1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 12).

superficiales en el explante. Sin embargo, esta contaminacin no solo puede provenir del explante sino tambin del operador. Segn Roca (1991), el operador es una fuente primaria de contaminacin por lo que debe lavarse bien sus manos y cuidar de mantener la asepsia en todo el procedimiento de siembra con el fin de minimizar el riesgo de contaminacin.

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

Posiblemente la contaminacin

incana]

13 de julio de 2001

crecimiento y desarrollo de la yema (Afanador, 2005). En general, no se obtuvo ningn brote de Polylepis pero en el caso de Valeriana se pudo obtener 4 brotes aunque estos no resultaron viables por causa de la contaminacin y la presencia de oxidacin. Al parecer a la los no gran procesos fueron cantidad que de de se desinfeccin debido explantes efectivos

observada provena principalmente de la planta ya que la mayor parte de explantes (11 estuvieron explantes en contaminados

Polylepis y 10 en Valeriana). En cuanto el a su puede de la por las yemas in vitro, que el de de

presentaron durante explante condiciones causado

tejido

muerto,

cultivo

sufrir produccin

estrs

oxidativo

contaminados

compuestos fenlicos despus de que el tejido ha sido sometido a un estrs como el proceso de desinfeccin o por la presencia de agentes contaminantes a los cuales la planta responde con la liberacin de estos compuestos de naturaleza fenlica. Probablemente estas son las principales causas por las que los explantes tanto en Polylepis como en Valeriana presentaron tejido muerto, ya que no soportaron la desinfeccin o la contaminacin produjo que el tejido se oxide y empiece a morir el explante. Los productos liberados en un proceso oxidativo como el ocurrido en estos explantes tienen carcter fitotxico por lo que son capaces de alterar eventos morfogenticos e impedir el

obtuvieron para ambas especies. En el caso de Polylepis, el uso de cistena deba reducir el efecto de la oxidacin, sin embargo, esto no se pudo evidenciar ya que gran parte de los explantes presentaron este tipo de limitacin. su efecto Las anti posibles oxidante causas para que la cistena no tuviera pueden ser debido a que no se sumergi correctamente el explante antes de su siembra o el tiempo no fue suficiente (Vaca, 2010). Segn el Vaca (2010) in vitro y la utilizacin la la una conjunta de auxinas y citoquininas en cultivo estimula permite de proliferacin regeneracin celular

completa

planta, motivo por el que se utiliz estas fitohormonas para la obtencin de brotes. 8

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

CONCLUSIONES. Se establecieron 2 brotes in vitro a partir de yemas apicales de Valeriana, mas de Polylepis no se obtuvo ningn brote. Uno de los problemas ms severos en el establecimiento de yemas es la oxidacin de los explantes, y la contaminacin ya sea proveniente de la planta o del operador.

incana]

13 de julio de 2001

Para el establecimiento en lugar de utilizar las yemas, se podra usar los meristemos directamente, y tambin contaminacin. En caso de valeriana tambin se podra hacer uso de auxinas y citoquininas para que promueva la formacin de brote. BIBLIOGRAFIA evitara tanta

Para la obtencin de brotes es importante que el balance hormonal entre auxinas y citoquininas sea el adecuado ya que es un punto crtico en la divisin celular y el crecimiento del tejido meristemtico en un brote. RECOMENDACIONES:
Para

Arica, D. (2006). Documentos de google. Extrado el 12 de Julio de 2011, de Polilepis Incana: http://docs.google.com/viewer? a=v&q=cache:Zfhd5q2uEJcJ:www.c ondesan.org/memoria/foresteria/DAr ica3.pdf+polylepis+incana&hl=es& gl=ec&pid=bl&srcid=ADGEESjfIfqCt kdjZubEqjeS3B8nYj7Tu2qoH2C60b8 Q9lKFAHy7ULCg4X1F Afanador A.2005. Propagacin in vitro a partir de meristemos de cinco variedades comerciales de Dianthus caryophyllus L. (clavel). Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Carrera de Biologa. Bogot Colombia. MHT. Herbarios 2000. Medicamentos Mxico. 9

eliminar completamente la de contaminacin se

presencia fungicida

podra aadir un bactericida y un ya que como se vio en esta prctica la contaminacin en Polylepis fue 100% y en valeriana solo hubo un 25% de explantes viables, tambin uso de se podra hacer como antibiticos

tetraciclina o ampicilina lo cual nos brindara una mejor desinfeccin.

Tradicionales.

[Establecimiento de Yemas en Valeriana y Polylepis

Extrado el 12 de julio, 2011 de http://www.redsalud.gov.cl/portal/url /item/7d99ff5a580ddbd7e04001011 f016dc3.pdf

incana]

13 de julio de 2001

http://sian.inia.gob.ve/repositorio/re vistas_ci/Agronomia %20Tropical/at5902/pdf/salazar_e.p df Roca, Luis A. Mroginski. 1993.

Peeters A, Will Gerards, Gerard W. M. Barendse, and George J. Wullems. 1991 In Vitro Flower Bud Formation in Tobacco: Interaction of Hormones. Plant Physiol 97, 402408. Aloni R, E. Aloni, M. Langhans, and c. I. Ullrich. 2006. Role of Cytokinin and Auxin in Shaping Lateral Root Root Architecture: Differentiation, Regulating Vascular

Cultivo de Tejidos en la Agricultura, Fundamentos y Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Colombia. Vaca I., Landzuri A., Falconi E. Soria vitro. Ejrcito. N. (2010) Incremento Politcnica de del del nmero de brotes de babaco in Escuela Carrera Ingeniera

Agropecuaria. Sangolqu-Ecuador.

Initiation, Root Apical Dominance and Root Gravitropism. Annals of Botany 97: 883893. Gonzlez Alvarado N., Y ., Caraballoso (2003) en in la fase vitro I., de del

Bacterias

contaminantes establecimiento Cuba.

guayabo. Facultad de Agronoma.

Salazar E, Pablo Gonzlez y Carlos Hernndez. 2009 Multiplicacin in vitro De Agave cocui Trelease a travs 2011 de Yemas Axilares. de 10 Venezuela. Extrado el 12 de julio,