Fundamentos de la tcnica de cromatografa HPLC

Dr. M. Alberto Quezada A.

Universidad Nacional de Trujillo

1. DEFINICIN Y CONCEPTOS BSICOS

ORGENES Los orgenes de la cromatografa se remontan a 1901, con los trabajos del botnico ruso Mikhail Semyonovich Tswett ( ). Sus estudios estaban enfocados a la separacin de diferentes compuestos de las plantas (clorofila y carotenoides). Us una columna rellena de carbonato clcico, y una mezcla de ter de petrleo y etanol como eluyente. El mtodo fue descrito el 30 de Diciembre de 1901 en el XI Congreso of naturalistas y mdicos en San Petersburgo. La primera descripcin impresa se produce en 1903, en los Proceedings of the Warsaw Society of Naturalists, biology section. Primera descripcin expresa del trmino cromatografa: en 1906 publicados en Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft.

1. DEFINICIN Y CONCEPTOS BSICOS

DEFINICIN DE CROMATOGRAFA LQUIDA Es el mtodo fsico de separacin en el cual los componentes de una mezcla se distribuyen entre una fase estacionaria (slida lquida-adsorbida) de gran rea superficial, y una fase mvil (lquida) que pasa a travs o a lo largo de la fase estacionaria. La separacin se produce en funcin de la afinidad del analito entre ambas fases
PROCESOS IMPLICADOS: ADSORCIN (retencin superficial en sitios activos) ABSORCIN (retencin por toda la masa) PROCESOS QUMICOS PROCESOS FSICOS PROCESOS QUMICOS

CLASIFICACIN
3 CRITERIOS 1- Segn el estado fsico de la fase mvil: FASE MVIL lquido gas Cromatografa de LQUIDOS Cromatografa de GASES

2-Segn la causa por la que se separan los componentes de la muestra. Solubilidad Tamao Carga Hidrofobicidad Interacciones por afinidad biolgica Interacciones inespecficas 3-Segn el modo operativo para el desarrollo de la cromatografa (relacionado con la fase estacionaria): FASE ESTACIONARIA Sobre superficie plana En columna

TIPOS DE CROMATOGRAFA
Fase mvil Fase estac. Clase Tipo Solubilidad Nombre Fase normal Fase inversa Tamao Exclusin Ejemplo EN PAPEL
HPLC

Lquida Lquida Reparto

FILTRACIN EN GEL

Slida

Interaccin

Electrosttica Hidrofbica

Intercambio inico Interaccin Hidrofbica Afinidad

INTERCAMBIO INICO EN CAPA FINA (TLC) HIDROFBICA AFINIDAD

Afinidad

Inespecfica

Adsorcin

HIDROXIAPATITO

DEFINICIN Y CONCEPTOS BSICOS

TIPOS DE CROMATOGRAFIA LQUIDA 3 tipos: 1) capa fina, 2) en papel, 3)en columna. En todos los casos, la muestra se debe disolver en un lquido que es transportado por el disolvente dentro o a travs del sistema cromatogrfico.

1. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC) La muestra se siembra sobre una delgada capa de partculas cromatogrficas fijadas sobre una superficie de soporte (vidrio, alumninio, ) La parte inferior se sumerge en un disolvente, y se crea un flujo de difusin del mismo por capilaridad a travs de la partcula seca.

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CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC)

CLASE: Interaccin PROPIEDAD: Hidrofbica NOMBRE: Interaccin Hidrofbica SOPORTE plancha de metal o vidrio

F. ESTACIONARIA (SLIDA) slido pulverizado sobre plancha de metal o vidrio. El ms usado es el gel de slica. F. MVIL (LQUIDA) Disolvente orgnico
-Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-OH HHH-Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-OH -Si-OH

Molec. Hidroflica LENTA Retenida por f.estacionaria

Molec. Hidrofbica Disuelta en f. mvil

RPIDA

2.- CROMATOGRAFIA EN PAPEL 2.La muestra se coloca sobre un papel hmedo el cual h Se introduce en un disolvente que crea el flujo de Separacin Separaci Soporte.-La celulosa del papel de filtro Soporte.Fase Estacionaria.-(lquida) es el agua adsorbida Estacionaria. (l sobre la celulosa Fase mvil .- (lquida) disolvente orgnico m .- (l org

H2O

H2O H2O HHH-

H2O

H2O H2O

H2O H2O H2O

H2O H2O

Las molculas polares son retenidas (por el Agua)

Las molculas apolares son eludas con el disolvente

CROMATOGRAFA EN SUPERFICIE PLANA

F. ESTACIONARIA (polar) CMARA CROMATOGRFICA

MUESTRA

FLUJO propiciado por CAPILARIDAD

FRENTE de avance del solvente

FASE MVIL (apolar)

hidrofbica

Rf=

distancia avanzada por la molcula distancia avanzada por el frente

hidroflica

Rf es caracterstico para cada soluto para una composicin dada de fase mvil y un determinado tipo de superficie

3. CROMATOGRAFA EN COLUMNA La muestra pasa a travs de una columna que contiene las partculas cromatogrficas, llamadas FASE ESTACIONARIA. El disolvente o mezcla de disolventes (FASE MVIL) fluye de manera contnua a travs de dicha columna. En un momento determinado, se realiza una inyeccin de la disolucin que contiene la mezcla de sustancias que se quieren separar dentro del torrente de la fase mvil, la cual la transporta por el interior de la columna. Los diferentes componentes de la mezcla se separan en base a la diferente velocidad a la cual atraviesan la fase estacionaria. Fuerza motriz de la fase mvil: gravedad o un sistema de vaco. Para columnas abiertas de vidrio con fases estacionarias de partculas mayores de 50 micras. Columnas de plstico en forma de cilindro (cartuchos) = EXTRACCIN EN FASE SLIDA.
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CROMATOGRAFA EN COLUMNA
EMPAQUETADO COLUMNA APLICACIN MUESTRA ELUCIN Y RECOGIDA DE FRACCIONES RESERVORIO f. mvil

LECHO CROMATOGRFICO f. estacionaria COLUMNA MUESTRA

FLUJO gravedad

DIFUSIN
llave

SEPARACIN

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
PERFIL DE ELUCIN FRACCIONES Molc. distribuida en f.mvil

Molc. distribuida en f.estacionaria

ANLISIS DEL CONTENIDO DE LAS FRACCIONES

Espectrofotomtrico Abs 280nm Protenas Otras Abs - Colorantes

respuesta del detector 1

fraccin

DEFINICIN Y CONCEPTOS BSICOS

CROMATOGRAFA EN COLUMNA-HPLC Si las partculas son menores de 10 micras, existe una gran resistencia al paso del flujo a su travs, por lo que se requieren altas presiones, que demandan columnas y que puedan tolerar dichas presiones y bombas que puedan impeler la fase mvil. Cuando se emplean presiones elevadas = HPLC.

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DEFINICIN Y CONCEPTOS BSICOS

CROMATOGRAFA HPLC As, el nombre HPLC se refera originalmente al hecho de necesitar altas presiones para generar el flujo necesario dentro de la columna empaquetada. Los primeros cromatgrafos contaban con bombas que generaban presiones mximas de 500psi (35 bar). This was called High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). A principios de los 70 se produjo un gran salto tecnolgico, con aparatos que soportaban presiones de hasta 6,000psi (400 bar), y con nuevos detectores y rellenos de columna, por lo que al final de los 70 se cambi el significado del acrstico.

H = High P = Performance L = Liquid C= Chromatography

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DEFINICIN Y CONCEPTOS BSICOS

3. CROMATOGRAFA EN COLUMNA-HPLC Hoy da, HPLC es una de las tcnicas ms poderosas en la Qumica para: SEPARAR IDENTIFICAR, y CUANTIFICAR los componentes de una mezcla, en cantidades de hasta PARTES POR TRILLN (ppt)

Ind.Farmacutica

Cosmticos

Ind.Alimentaria

APLICACIONES

Aplicaciones medioambientales

Industria Qumica

Anlisis Forenses
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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO DE HPLC.

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Sistema de almacenamiento de la fase mvil

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

RESERVORIOS DE LA FASE MVIL REQUISITOS: Tanto los frascos como su conexin a la bomba deben estar hechos de materiales que no contaminen la fase mvil: tefln, vidrio o acero inoxidable. Deben estar cerrados al exterior para evitar cualquier contaminacin. Si se usa una botella de disolvente, se debe tapar la boca con papel de aluminio. El cierre no debe estar cerrado hermeticamente, pues puede originar un vaco que impide que circule la fase mvil. La agitacin no es necesaria, pero ayuda a mantener la fase mvil homognea (especialmente si se trabaja en monobomba) Es conveniente la desgasificacin, a travs de una corriente de helio o por ultrasonidos.

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

RESERVORIOS DE LA FASE MVIL DESGASIFICACIN por ULTRASONIDOS Al mezclar los disolventes para formar la fase mvil, el exceso de gas escapa en forma de burbujas (el aire es menos soluble en mezclas de disolventes que en disolventes puros). Al colocar el reservorio en un bao de US, las ondas sonoras provocan la coalescencia de pequeas burbujas que escapan ms fcilmente. til para fases mviles premezcladas, no para sistemas de desgasificacin online. Se usa conjuntamente con la DESGASIFICACIN A VACO.

Desgasificador por filtracin a vaco Bao de US 25

COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

RESERVORIOS DE LA FASE MVIL DESGASIFICACIN por HELIO Se puede usar una corriente de helio, que eliminar el aire disuelto en el lquido. Como el helio es virtualmente insoluble en los disolventes habituales de HPLC no se produce reemplazo del aire por helio. Es un mtodo muy efectivo: reduce el aire disuelto en los disolventes habituales a valores por debajo de los niveles de saturacin en la mezcla de disolventes. Muy adecuado para desgasificacin on-line. Pequeo inconveniente: cambio en la composicin de la fase mvil por evaporacin de los compuestos ms voltiles. Se evita con flujos de helio no demasiado vigorosos.
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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

RESERVORIOS DE LA FASE MVIL DESGASIFICACIN ON LINE CON MEMBRANAS El mtodo quiz ms conveniente La fase mvil se pasa a travs de fibras huecas formadas por membranas semipermeables. Se mantiene un vaco parcial en el exterior de la membrana. Puesto que el aire puede difundirse a travs de la membrana, pero las molculas de disolvente en fase vapor no lo pueden hacer, se elimina el aire. Este mdulo de coloca justo antes de la bomba, por lo que no da tiempo al aire para redisolverse en la fase mvil.

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

RESERVORIOS DE LA FASE MVIL Es importante evitar la presencia de slidos en suspensin, pues pueden daar la bomba, el inyector y colmatar la columna. Para ello, se suelen filtrar antes de usarlas. Tambin se suelen conectar al final del tubing un filtro de partculas, de tamao de poro generalmente de 5-10 micras (ms pequeos se colmatan rapidamente). Adems, sirven para hacer que el tubo de plastico permanezca en el fondo del reservorio, por lo que estos filtros se conocen como sinker frits. Si se colmatan (fcil en medios acuosos donde crecen bacterias) se deben sonicar en un bao de metanol.

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

BOMBA DEL CROMATGRAFO DE HPLC.

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

BOMBA

Su misin consiste en mantener un flujo constante de fase mvil a travs del sistema con independencia de la presin causada por la resistencia de la fase estacionaria. La mayora de la bombas comerciales se basan en un diseo de pistones recprocos. Una leva accionada por un motor mueve el pistn adelante y atrs dentro de la cabeza de la bomba. Una junta flexible alrededor de la periferia del pistn impide que la fase mvil vuelva atrs. Las vlvulas de control en la cabeza de la bomba se abren y se cierran en funcin de pequeos cambios en la presin para mantener un flujo unidireccional constante de fase mvil.

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

MEZCLADOR Generalmente, la fase mvil est constituida por una mezcla de dos o ms disolventes (fases binarias, ternarias y cuaternarias). Cmo mezclar los componentes de la fase mvil: MANUALMENTE: Lo ms preciso cuando se trabaja con grandes cantidades de fase mvil para analizas un gran nmero de muestras siempre en las mismas condiciones. MEZCLADO ON-LINE: Cuando varan las condiciones.

Mezclado a alta presin.

CON DOS BOMBAS:

CON UNA BOMBA Y UNA VLVULA: Mezclado a baja presin.

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

Rgimen de funcionamiento de la BOMBA Existen dos procedimientos generales de trabajo en HPLC, para los cuales el papel de la(s) bomba(s) es decisivo. EN RGIMEN ISOCRTICO

La composicin de la fase mvil permanece constante a lo largo de todo el cromatograma.

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

Rgimen de funcionamiento de la BOMBA EN RGIMEN de GRADIENTE

La composicin de la fase mvil cambia a lo largo de la cromatografa. Se emplea para separar mezlas muy complejas. Se puede hacer con 2 reservorios y dos bombas. La velocidad de ambas est controlada para suministrar cantidades distintas en tiempos distintos. Posteriormente,se ezclan. ambos caudales en el mezclador para originar el gradiente(alta presin).

Se necesitan bombas ms precisas y fiables que para el rgimen isocrtrico.

Otra opcin: una sola bomba, varios reservorios , y una vlvula que crea la mezcla deseada de disolventes (baja presin).
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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

INYECTOR DE MUESTRA

Manuales Automticos

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

INYECTORES MANUALES

La presin entre la bomba y la columna depende de: La velocidad del flujo de la fase mvil (mayor flujo, mayor presin) La viscosidad de la fase mvil (mayor viscosidad, mayor presin) Resistencia de la columna Menores tamaos de partcula, mayor presin Mayor longitud de columna, mayor presin Menor dimetro de columna, mayor presin

Se necesita una vlvula especial, el INYECTOR, para introducir la muestra dentro de este sistema presurizado. Muy importante, debe introducir entre 0.1 to 100 ml de volmen de muestra con alta reproducibilidad y en condiciones de alta presin (hasta 4000 psi), con la menor alteracin posible del flujo.
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INYECTORES MANUALES Aunque el diseo externo es diferente, internamente la mayora (RHEODYNE) consiste en una vlvula rotatoria de 6 puertos. Tres surcos internos conectan los puertos externos por pares. Existen dos posiciones: Formados por un cuerpo fijo (STATOR) y una junta interna que rota (ROTOR SEAL). CARGA (LOAD): la bomba est conectada a la columna, y la muestra que se inyecta entra en el BUCLE DE CARGA (LOOP), conectado por el otro extremo al puerto de DESECHO (WASTE). Una rotacin hace una reconexin de lneas en el interior del inyector, por lo que la muestra es arrastrada por la fase mvil al interior de la columna.
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INYECTORES MANUALES INYECCIN TIPO FILLED-LOOP: Se inyecta un volmen mayor (2-3 veces) que el del loop de inyeccin. FILLED LOOP: Garantizamos que se inyecta siempre el mismo volumen= REPRODUCIBILIDAD. PARTIAL LOOP: Es menos preciso, por lo que para qu se usa?: Cuando deliberadamente queremos variar el volumen de la muestra inyectada, para determinar el efecto del dicho volumen en la separacin. Para ello, en lugar de cambiar el loop se controla el volumen de inyeccin con la jeringa. Cuando se trabaja con inyector automtico es muy fcil la programacin de volmenes variables.
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INYECCIN TIPO PARTIAL LOOP: Se inyecta un volumen menor que el del loop de inyeccin.

INYECTORES AUTOMTICOS La mayora de los equipos cuentan con Inyectores Automticos lo que aumenta la repeptitividad. La vlvula de inyeccin es similar almanual, pero el sistema cuenta con una jeringa que toma directamente las muestras de un coleccin de viales y las inyecta en la columna. Entre pinchazo y pinchazo, la jeringa se limpia automticamente. Suponen un considerable ahorro de tiempo, y son muy fiables y precisos. Como las muestras estn en los viales largo tiempo = deben ser estables, y estar bien filtradas para evitar la obturacin del sistema de inyeccin. Hay dos tipos: Inyeccin directa Inyeccin con desplazamiento

Inyeccin Directa

Inyeccin con desplazamiento

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

COLUMNA CROMATOGRFICA.

Analticas Preparativas

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COLUMNAS Es la parte ms importante de un cromatgrafo . Su misin es contener el relleno cromatogrfico (FASE ESTACIONARIA) que va a interaccionar de manera distinta con los analitos para lograr la separacin adecuada. PROPIEDADES: Debe soportar la presin elevada. Debe retener las partculas de la fase estacionaria. Debe proporcionar un camino controlado para el flujo a travs de dichas partculas. Debe ser qumicamente inerte y no interferir en el mecanismo ntimo de separacin.

Materiales tpicos de construccin: Acero inooxidable PEEK Plsticos especiales

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COLUMNAS 1.-Volumen de Columna Determinado por Longitud (L) Dimetro interno (I. D.) Estos parmetros determinan la cantidad de fase estacionaria que se puede empaquetar dentro de la columna. En general, las columnas oscilan entre 20mm y 500mm en longitud y entre 1mm y 50mm de dimetro interno.

2.- Dimetro de partcula (Dp) de fase estacionaria A medida que aumenta la escala, el volmen de las columnas aumenta, en especial su longitud. Para asegurar una velocidad de flujo suficiente de fase mvil, el tamao de partcula debe ser lo suficientemente grande como para reducir la presin inherente que debe soportar la columna, y hacer que la bomba trabaje sin problemas. Varian entre 10m y 5m. Las nuevas columnas suelen tener 3m o incluso 1,5m

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CUADRO ORIENTATIVO del tamao de partcula segn el tipo de columna

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Causas del deterioro de las columnas. 1.- ATAQUE QUMICO A LA FASE ESTACIONARIA. 2.- ATASCO (PLUGGING) DE LOS FRITS O DE LA COLUMNA CAUSADA POR FINOS. 3.- DAOS MECNICOS 4.- ADSORCIN DE IMPUREZAS A PARTIR DE MUESTRAS SUCIAS.

Cada tipo de cromatografa (fase reversa o normal) Requiere un tipo de relleno de la precolumna.

Cada tipo de columna Cada tipo de cromatografa (fase reversa o normal) Requiere un tipo de relleno de la guradacolumna
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PRECOLUMNA Situado entre la bomba y el inyector. Para proteger al relleno de la columna de ataques qumicos por fases mviles con alto valor de pH, (pre-condicionamiento). Generalmente se empaqueta con silica normal. La muestra no pasa por la pre-columna, no tiene que estar perfectamente empaquetada. Peridicamente se debe revisar, y reponer la silice. FILTRO EN LINEA Situado entre el inyector y la columna o la salvacolumna. Misin: atrapar partculas que puedan atascar la columna o los frits. Es un cartucho de poco volmen que contiene un frit de 0.5 o de 2 micras. Si se colmata, (aumento de la presin habitual, deterioro en la separacin) se abre el sistema y se reemplaza. Son baratos.
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GUARDA COLUMNA Pequea columna situada entre el inyector y la columna analtica, o bien entre el filtro en lnea y la columna. Empaquetada con un material similar al de la columna. Su misin: Retener impurezas que podran quedar irreversiblemente adsorbidas a la columna y deteriorarla de forma seria. Es tambin un filtro para la fase mvil. Pueden prepararse en el laboratorio, o comprarlas ya pre-empacadas. Se sigue la misma filosofa que el filtro on line; es una carcasa que contiene el material adsorbente. Ojo con confundir los rellenos. Afectara a la presin del sistema
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Sistema de calefaccin de la columna

El sistema de calefaccin de la columna Es fundamental en el caso de los detectores de IR, o de Light scattering, que son sensibles a la variacin de las condiciones ambientales
Sistema de calefaccin de la columna

Tambin se recomiendan el caso De los HPLC dotados de inyector automtico y/o derivatizacin pre-columna. Calientan la columna por encima de la temperatura del laboratorio

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

DETECTORES EN HPLC

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COMPONENTES DE UN CROMATGRAFO

DETECTORES.

CARACTERSTICAS PTIMAS Lo ms universal posible Respuesta rpida (la muestra no permanece en el detector) TIPOS MS HABITUALES UV-visible Indice de refraccin Fluorescencia ELS (Evaporative Light Scattering) Detectores electroqumicos Detector LC-EM (Espectrometra de masas) Detectores quirales
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POLARIDAD
Fase estacionaria

Analitos

Fase mvil

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POLARIDAD

Los analitos que se quieren separar, poseen diferentes polaridades, lo que puede ser aprovechado para su separacin. En funcin de la congruencia entre la polaridad de la columna y la de los analitos, stos sern retenidos de manera diferencial, habiendo Atraccin No atraccin Rechazo REGLA GENERAL : Lo semejante atrae a lo semejante y lo distinto se repele. Se va a establecer una COMPETENCIA entre la fase mvil y la fase estacionaria por retener o rechazar a los analitos. Compuestos con polaridad semejante a la fase estacionaria sern ms retenidos

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Tipos de separaciones cromatogrficas

Basndonos en la POLARIDAD RELATIVA ENTRE LA FASE ESTACIONARIA Y LA FASE MOVIL, exiten DOS METODOLOGAS. CROMATOGRAFA EN FASE NORMAL: La fase estacionaria es polar, la fase mvil es apolar
polar apolar

CROMATOGRAFA EN FASE REVERSA: La fase estacionaria es apolar, la fase mvil es polar

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Cromatografa en fase normal

TIPOS de RELLENO de COLUMNAS. 1.- PELICULAR Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas Sobre su superficie se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina una resina de intercambio inico etc. Se utilizan sobre todo en PRE y SALVACOLUMNAS

2.- PARTCULAS POROSAS Micropartculas de silice

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Cromatografa en fase normal

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Cromatografa en fase normal

Se emplean slices modificadas qumicamente. Las ms tpicas funcionalizaciones son:
1) NC Si OH 2) H2 O Cl Si Cl Cl HO OH Si O

Si

CN

CIANOPROPIL

1) H 2N Si OH 2) H 2O

Cl Si Cl Cl

Si

HO OH Si O

NH 2

AMINOPROPIL

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MECANISMOS DE SEPARACIN

Cromatografa en fase normal Polaridad de los disolventes (fase mvil)

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POLARIDAD de los DISOLVENTES ms habituales

APOLARES

POLARES

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Cromatografa en fase reversa

Se emplean soportes modificados qumicamente, por unin de cadenas alifticas sobre la estructura inicial. Aproximadamente el 75% de todas las aplicaciones de HPLC
Reaccin de activacin qumica

1) Si OH

Cl Si Cl n Cl Si 2) H2 O n = 6, OCTIL, C8 n = 8, OCTADECIL, C 18

HO OH Si O

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Cromatografa en fase reversa

Proteccin frente a la hidrlisis: Modificacin restos alqulicos.

Se introducen grupos alquilo con gran impedimento estrico como son el iso-butilio, iso-propilo etc.

Tambin se utiliza para evitar la retencin de sustancias polares como cidos carboxlicos, fenoles etc. Que hacen que se formen colas.

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Cromatografa en fase reversa. Efecto de la polaridad del disolvente

HO

O O HO

O O HO

O O

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Cromatografa en fase reversa. Efecto de la columna

HO

O O O O O O

HO

HO

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CH3 OH MeO O

EJEMPLOS

Conditions: Chiralpak AD-H Hexane/IPA/TFA, 80:20:0.1 Flow: 1.0 mL/min

Conditions: Chiralpak AS-RH aq. H3PO4 (pH2)/ACN, 60:40 Flow: 0.7mL/min

Conditions: Chiralpak AD-H, 100x4.6mm CO2/MeOH, 80:20 Flow: 5.0 mL/min

Conditions: Chiralpak AD-H, 100x4.6mm CO2/MeOH, 90/10 Flow: 2.0 mL/min

Cromatografa quiral
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