CONSENSO CONSENSUS

I Consenso Nacional para Padronizao dos Laudos de FAN HEp-2

The first Brazilian Consensus for Standardization of ANA in HEp-2 Cells

Recebido em 29/10/01 Aceito para publicao em 09/11/01

unitermos
FAN Imunofluorescncia Doenas auto-imunes

resumo

Alessandra Dellavance1 Alexandre G. Jnior2 Alice F.U. Cintra3 Antnio C. Ximenes4 Barbara Nuccitelli5 Carlos A. von Mhlen6 Carlos D. Bichara7 Cristiane Yano8 Darlene G. Carvalho9 Elosa S.D.O. Bonf10 Fabiana N.C. Guimares8 Hugo M. Mundim11 Irmtraut A.H. Pfrimer8 Jozelia Rego4 Luiz E.C. Andrade12 Mauro M. Mesquita8 Mittermayer B. Santiago13 Nilzio A. Silva4 Paulo J. Miranda14 Paulo Leser15 Paulo Luiz C. Francescantonio16 Renata Jarach5 Roger A. Levy17 Suzane P.F. Neves18 Wilson M. Cruvinel8 Wilton S. Santos19

Rio de Janeiro, v. 38, n. 3, p. 207-216, 2002

A anlise da presena de auto-anticorpos feita por imunofluorescncia indireta em clulas HEp-2 constitui-se em um mtodo de triagem escolhido na maioria dos laboratrios clnicos. A ausncia de uma nomenclatura definida para a descrio dos laudos tem trazido problemas na utilizao clnica do teste, pelas dificuldades no controle de qualidade e na padronizao dos resultados, que, por sua vez, embora similares, recebiam denominaes diferentes. O I Consenso Brasileiro para Padronizao dos Laudos de FAN HEp-2 reuniu em agosto de 2000, em Goinia, diversos especialistas de todo o Brasil. Esses emitiram pareceres em consenso para os distintos padres: nucleares, nucleolares, citoplasmticos e aparelho mittico. Foram feitas recomendaes sobre os critrios para a leitura de uma lmina, bem como para relao entre a diluio de triagem e o sistema ptico utilizado.
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abstract
The technique of immunofluorescence using HEp-2 cells as substrate is the screening method of choice for the presence of autoantibodies in many clinical laboratories. The lack of a specific terminology for reporting results brings problems in quality control, clinical utility of the test, and standardization attempts. The first Brazilian Consensus for Standardization of ANA in HEp-2 Cells took place in Goinia in August 2000. Several laboratory specialists with experience in the methodology showed up. They established guidelines for the description of ANA patterns in the Portuguese language, encompassing distinct descriptions for nuclear, nucleolar, cytoplasmic and mitotic apparatus patterns of fluorescence. Recommendations were also established regarding screening titers, final dilution titer, and on morphological criteria for reading the slides.
ANA

key words y

Immunofluorescence Autoimmune diseases

1. Laboratrio Fleury e USP, SP. 2. Centro Imuno Reumatolgico de So Paulo, SP. 3. Biorad Diagnsticos, RJ. 4. Universidade Federal de Gois, GO. 5. Laboratrio Clnico Padro, GO. 6. Pontifcia Universidade Catlica, RS. 7. Laboratrio Amaral Costa, PA. 8. Universidade Catlica de Gois, GO. 9. Laboratrio Pardini, MG. 10. USP, SP. 11. Laboratrio Exame, DF. 12. EPM/Unifesp, SP. 13. EBMSP, BA. 14. Universidade Federal de Pernambuco, PE. 15. Laboratrio Fleury, SP. 16. Laboratrio Padro e UCG, GO. 17. UERJ e Laboratrio Labs, RJ. 18. UFMG, MG. 19. Hospital de Base, DF.

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Introduo
As primeiras descries sobre auto-anticorpos ocorreram em doenas reumticas auto-imunes, como o fator reumatide na artrite reumatide e o fenmeno LE no lpus eritematoso sistmico (LES). A clula LE foi descrita por Hargraves em 1948, tendo sido utilizada por muitos anos como marcador sorolgico para o diagnstico de LES (4). Sendo uma tcnica trabalhosa, demorada e de difcil interpretao, foi substituda nas ltimas dcadas por outros mtodos para a pesquisa e identificao de autoanticorpos. A tcnica de imunofluorescncia indireta foi adaptada para a pesquisa de auto-anticorpos em 1957, por Fries. Desde ento diversos substratos antignicos foram utilizados, como, por exemplo, corte de fgado ou rim de rato, imprint de fgado de camundongo, leuccitos humanos e diversas linhagens celulares. Estes substratos foram substitudos largamente por clulas HEp-2 (1). Estas clulas imortalizadas originam-se de carcinoma larngeo humano e crescem em monocamadas sobre lminas de vidro. As vantagens do uso de clulas HEp-2 so: Primeira: possuem antgenos humanos no-encontrados em tecidos de roedores, e os antgenos semelhantes esto em maior concentrao. Segunda: apresentam todas as fases de diviso celular, interfase/prfase, metfase, anfase e telfase, cada uma delas sendo a expresso fenotpica da atuao de uma srie de genes, que codificam uma mirade de protenas que surgem, reagem, atuam e desaparecem, de acordo com as fases do ciclo de vida celular, e que funcionam como auto-antgenos que possibilitam a identificao de inmeros auto-anticorpos. Terceira: possuem uma relao ncleo/citoplasma em favor do ncleo, caracterstica neoplsica, que facilita o reconhecimento de vrios rearranjos fluorescentes. Quarta: possuem vrios nuclolos, permitindo avaliar sua forma de apresentao nos padres nucleolares. Por ltimo, tm um citoplasma rico em fibrilas e organelas, fundamentais no reconhecimento dos padres citoplasmticos. Se em 1957 eram reconhecidos apenas quatro padres de FAN, atualmente as clulas HEp-2 permitem o reconhecimento de mais de 30 diferentes padres nucleares, nucleolares, da membrana nuclear, do aparelho mittico e citoplasmticos, que so dados por diferentes autoanticorpos. A vantagem do mtodo a sua grande sensibilidade, que permite a triagem de uma gama imensa de anticorpos, fornece uma idia da concentrao dos mes-

mos e uma informao qualitativa importante que pode ser usada como um passo inicial para uma identificao especfica (5). A identificao de anticorpos antinucleares exerce um papel importante na clnica mdica e na imunologia clnica (6). A deteco de anticorpos antinucleares para diagnstico de doenas sistmicas, intermedirias ou rgoespecficas tem aumentado progressivamente desde que a tcnica de imunofluorescncia foi utilizada como triagem de auto-anticorpos. Alguns padres de fluorescncia so relativamente inespecficos, podendo ser evocados por vrios autoanticorpos distintos (pontilhado grosso associado a antgenos Sm e U1RNP). Outros padres de fluorescncia, entretanto, so ocasionados por uma gama restrita de auto-anticorpos (PCNA), e outros, ainda, exclusivamente por um nico auto-anticorpo (centromrico). Nestas circunstncias, o padro de fluorescncia per se pode ser suficiente para a definio da especificidade do autoanticorpo. Na maior parte das vezes, entretanto, o padro de fluorescncia no pode identificar qual o autoanticorpo presente, mas sua definio de vital importncia, pois pode sugerir ao clnico ou patologista clnico qual o prximo passo na investigao de sua especificidade. Os ensaios para identificao dos autoanticorpos (imunodifuso dupla, contra-imunoeletroforese, hemaglutinao passiva, Elisa, imunoprecipitao, imunodot e Western-blot) so especficos para cada teste. Assim, o FAN-HEp-2 apresenta-se como importante mtodo de triagem, pois possibilita o conhecimento do(s) anticorpo(s) provavelmente envolvido(s), restringindo assim os pedidos laboratoriais e colaborando com a viabilidade econmica do processo. Apesar de o FAN testado em clulas HEp-2 ser um mtodo sensvel, com capacidade de rastrear uma grande variedade de auto-anticorpos conhecidos e desconhecidos e oferecer indicaes sobre a provvel identidade do antgeno, apresenta como limitao variaes na interpretao dos padres de imunofluorescncia. A nomenclatura utilizada para definio dos padres de fluorescncia em nosso pas foi forjada informalmente, muitas vezes sendo adaptada a partir de nomenclatura estrangeira, seja do idioma ingls, francs ou espanhol. O resultado inevitvel desse processo foi o aparecimento de uma variedade de nomes de padres, muitos dos quais destinados a descrever o mesmo aspecto morfolgico. Assim, por exemplo, temos os termos salpicado, pontilhado, moteado, granular e filamentoso, que tm sido usados por

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diferentes observadores para designar o que se v na literatura anglo-saxnica como speckled, dificultando sobremaneira a interpretao do resultado para o clnico.

Metodologia
A idia de organizar um consenso sobre laudos de FANHEp-2 surgiu em 1993 durante uma apresentao do professor Paulo Leser no Congresso Anual de Patologia Clnica. A execuo dessa proposta, porm, s foi possvel com a criao do Laboratrio de Auto-Imunidade do Departamento de Cincias Biomdicas da Universidade Catlica de Gois e a aquisio de um microscpio de fluorescncia com cmara digital, mediante projeto de pesquisa financiado pela Secretaria de Cincia e Tecnologia do Estado de Gois e pela Universidade Catlica de Gois. Foi adquirido um microscpio DMLB, marca Leica, trinocular, com revlver sxtuplo e com objetivas N planacromticas de correo infinita, alm destas propriedades: condensador universal NA1.30 para contraste de fase, campo escuro e campo claro, iluminao transmitida para campo claro de 100 watts, acoplada com sistema de fluorescncia, lmpada de vapor de mercrio de alta presso, 100 watts e filtros FIPC para acridine orange e RG N2.1 para ficoeritrina e BG 38 para isotiocianato de fluorcena. Ao microscpio foi acoplada microcmara digital DC200, marca Leica, para pesquisa e anlise de imagens com resoluo de 2,64 megapixel, CCD 2/3 de polegada e integrao de 18 imagens por segundo. A composio do grupo participante foi baseada em trs critrios: a) indicaes feitas pela Sociedade Brasileira de Reumatologia, pela Sociedade Brasileira de Patologia Clnica, pela Sociedade Brasileira de Anlises Clnicas e pelo Conselho Federal de Biomedicina; b) reconhecida experincia acadmica e profissional; c) capacidade de multiplicao dos resultados com a participao de especialistas de diversos centros nacionais, como Goinia, Braslia, Belo Horizonte, Salvador, Recife, So Paulo, Rio de Janeiro, Porto Alegre e Belm. Sintonizado com esse problema, um grupo de estudiosos de auto-anticorpos afeitos leitura de testes de imunofluorescncia indireta reuniu-se nos dias 18 e 19 do ms de agosto de 2000, em Goinia. O I Consenso Nacional para Padronizao dos Laudos de FAN HEp-2 foi organizado pela Universidade Catlica de Gois, tendo recebido vrios patrocnios. O Laboratrio de Auto-Imunidade (LAI/CBB/UCG), em conjunto com a Escola de Computao da UCG, produziu

previamente um CD em que constava uma rvore de deciso proposta pelo grupo de Goinia, juntamente com imagens digitalizadas de FAN-HEp-2. O clique na clula do organograma da rvore permitia a visualizao do grupo de imagens correspondentes, utilizando-se a estratgia de captura de vrios campos, como se o observador estivesse correndo a lmina no microscpio. Em cada campo visualizado havia sempre clulas em um dos estgios da diviso celular. O programa permitia a abertura de uma janela que possibilitava a emisso do laudo pelo observador, que poderia ser salvo em disquete e remetido ou transmitido por e-mail ao LAI. Foi feita uma estatstica dos padres emitidos pelos diferentes profissionais, a qual foi utilizada nas discusses da plenria dos dias 18 e 19 de agosto.
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Durante dois dias foram analisadas dezenas de imagens digitalizadas de FAN, sobre as quais houve acirrado debate, discutindo-se a nomenclatura e possveis significados prticos. Ao final, chegou-se a uma nomenclatura uniforme para os principais padres de fluorescncia nuclear, nucleolar, aparelho mittico e citoplasmtico. Conscientes de que a diversidade de aparelhos de microscopia e a heterogeneidade no grau de experincia com leitura de imunofluorescncia indireta acarretam grande variao na capacidade de reconhecer os padres de fluorescncia, os participantes do consenso definiram os critrios de leitura de uma lmina, as diluies empregadas e os padres mnimos a serem identificados e relatados. A seguir apresentamos as recomendaes do I Consenso Nacional para Padronizao dos Laudos de FAN HEp-2 , que devem ser seguidas juntamente com as rvores de deciso (Figura 1). Os critrios a ser seguidos so: as diluies de triagem so 1/40 e 1/160, na dependncia da lmpada do microscpio (20W, 50W, 100W); os critrios morfolgicos a ser observados durante a leitura da lmina: a) aspecto da matriz nuclear; b) aspecto do nuclolo; c) observao de todos os estgios de diviso celular; d) aspecto do fuso mittico; e) aspecto do citoplasma. A combinao desses critrios resultou nas seguintes rvores de decises: 1. padres nucleares; 2. padres nucleolares; 3. padres relacionados ao aparelho mittico; 4. padres citoplasmticos.

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Padres nucleares
Os padres nucleares foram divididos em trs grandes categorias: membrana nuclear, homogneo e pontilhado.
Padro tipo membrana nuclear

nal, o nmero de pontos maior ou igual a dez ou menor do que dez pontos por ncleo). Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no-fluorescentes (Figura 5). A informao adicional a respeito do padro pontilhado pode ser fornecida na dependncia do equipamento tico utilizado, bem como da experincia do observador nos diagnsticos a seguir. Pontilhado grosso Nucleoplasma com grnulos de aspecto grosseiro. Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no-fluorescentes (Figura 6). Pontilhado grosso reticulado Nucleoplasma com grnulos de aspecto grosseiro que se organizam em retculos associados a antgenos da matriz celular. Nuclolo, clula em diviso e citoplasma nofluorescentes. Pontilhado fino Nucleoplasma com granulao fina. Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no-fluorescentes (Figura 7). No subgrupo dos pontilhados com mitose fluorescente temos os laudos a seguir. Pontilhado centromrico (laudo obrigatrio) Nucleoplasma da clula apresenta-se em interfase, pontilhado com um nmero constante de 46 pontos. Nuclolo normalmente no-fluorescente, clula em diviso pontilhada e citoplasma no-fluorescente (Figura 8). No subgrupo da mitose fluorescente temos como laudo opcional o que se segue. Pontilhado fino denso Nucleoplasma da clula em interfase apresenta-se como um pontilhado fino denso, de aspecto quase homogneo, e nuclolo no-fluorescente. A clula em diviso tambm apresenta decorao em pontilhado fino denso, quase homogneo, dos cromossomos, na placa metafsica, com citoplasma no-fluorescente (Figura 9).

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Esta denominao foi adotada para diferenci-la do antigo padro perifrico utilizado quando do uso de imprint de fgado de rato, onde o DNA de dupla hlice se encontrava ancorado s protenas da membrana nuclear, dando seu aspecto caracterstico e que no encontra o mesmo significado quando do uso de clulas HEp-2. O perodo em que ocorre o ancoramento nestas clulas muito curto e praticamente no encontrado na rotina laboratorial. O padro composto por uma fluorescncia em toda a membrana nuclear (podendo ser emitida com informao adicional, em aspecto contnuo ou pontilhado). No observamos fluorescncia em nuclolos; a clula em diviso, em todos os estgios, e o citoplasma apresentam-se no-fluorescentes (Figura 2).
Padro homogneo

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Apresenta o nucleoplasma fluorescente. No possvel distinguir a rea de nuclolo. A clula em diviso, em todos os estgios, fluorescente, com decorao homognea dos cromossomos. Citoplasma normalmente nofluorescente (Figura 3).
Padro pontilhado

A dificuldade de diferenciao dos tamanhos e formas com que os grnulos se apresentam fez com que o consenso considerasse obrigatrio o laudo de padro pontilhado. O grupo dos pontilhados foi dividido em mitose fluorescente e no-fluorescente. No subgrupo da mitose no-fluorescente foram considerados obrigatrios os laudos que se seguem. Pontilhado pleomrfico O nucleoplasma apresenta-se totalmente no-fluorescente na clula em fase G1 da interfase, passando a pontilhado com grnulos, variando de grosso, fino a fino denso na medida em que a clula evolui para as fases S e G2. Nuclolo, clula a partir da metfase e citoplasma nofluorescentes. Tpico de PCNA (Figura 4). Pontilhado do tipo pontos isolados Nucleoplasma apresenta-se com pontos fluorescentes isolados (podendo ser fornecido, como informao adicio-

Padres nucleolares
O consenso recomenda que os padres nucleolares sejam relatados como padro nucleolar (laudo mnimo). Como informao adicional pode o observador relatar os laudos que se seguem.

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Nucleolar homogneo

Citoplasmtico pontilhado polar Este tambm um laudo obrigatrio, pois evidencia cisternas do aparelho de Golgi. A decorao apenas citoplasmtica em pontos agrupados de situao perinuclear, normalmente em apenas um plo nuclear. Ncleo, nuclolo e clula em diviso no-fluorescentes (Figura 16). Citoplasmtico pontilhado com pontos isolados Pontos definidos de nmero varivel por toda a extenso do citoplasma. Ncleo, nuclolo e clula em diviso no-fluorescentes (Figura 17). Citoplasmtico pontilhado fino denso Fluorescncia de finos, densos e confluentes pontos, chegando quase homogeneidade. O ncleo pode ou no apresentar uma leve decorao homognea na rea do nuclolo. A clula em diviso no-fluorescente (Figura 18). Citoplasmtico pontilhado fino Pontos definidos em grande nmero e densidade; clula em diviso e nuclolo no-fluorescentes (Figura 19). Citoplasmtico pontilhado reticulado
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Nuclolo homogneo, a clula em diviso e o citoplasma no-fluorescentes (Figura 10).

Nucleolar aglomerado

Colorao de forma indefinida nos cromossomos. O nuclolo se apresenta com grumos de intensa fluorescncia. A clula em diviso mostra-se amorfa, com colorao indefinida dos cromossomos da placa metafsica. Citoplasma e ncleo no-fluorescentes (Figura 11).
Nucleolar pontilhado

O nuclolo apresenta-se com pontos isolados que tendem a confluir. A clula em diviso exibe pontos isolados (mximo de dez) e brilhantes na placa de cromossomos em metfase. Citoplasma normalmente no-fluorescente (Figura 12).

Padres citoplasmticos
Os padres citoplasmticos so divididos em dois grandes grupos: fibrilar e pontilhado.
Citoplasmtico fibrilar

O laudo que caracteriza o grupo obrigatrio; j as trs subdivises do grupo so opcionais. Citoplasmtico fibrilar linear Fibras de estresse que constituem o citoesqueleto decoradas de forma retilnea, cruzando toda a extenso da clula e no respeitando os limites nucleares. Ncleos e nuclolos no-fluorescentes (Figura 13). Citoplasmtico fibrilar filamentar Decorao de filamentos com acentuao uni ou bipolar em relao membrana nuclear. Ncleos e nuclolos no-fluorescentes (Figura 14). Citoplasmtico fibrilar segmentar Apenas segmentos curtos das fibras de estresse se encontram fluorescentes. Ncleo e nuclolos negativos. Nas clulas em diviso, podemos observar, eventualmente, grnulos intensamente fluorescentes que correspondem forma globular das protenas do citoplasma (Figura 15).
Citoplasmtico pontilhado

Fluorescncia em retculo por todo o citoplasma. Ncleo, nuclolo e clula em diviso no-fluorescentes (Figura 20).

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Aparelho mittico
O grupo de antgenos do aparelho mittico foi subdividido em trs subgrupos de laudo obrigatrio.
Centrolo

Ponto fluorescente isolado na clula em repouso (interfase) que se divide em dois e migra ao plo oposto do ncleo medida que a clula entra em diviso (Figura 21).
Ponte intercelular

Antgenos que formam a unio entre clula-me e clula-filha ao final da telfase. Podem ser observados com fluorescncia intensa na ponte citoplasmtica, que sofrer clivagem ao final da diviso celular (Figura 22).
Fuso mittico

O laudo que caracteriza o grupo e o subgrupo polar obrigatrio; j as quatro subdivises restantes so opcionais.

O fuso mittico poder ser observado de forma diferenciada em duas situaes: 1) na presena de anticorpos

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contra a protena NuMA 1 (antgeno associado mitose do tipo 1), encontramos intensa fluorescncia do tipo pontilhado fino denso no nucleoplasma das clulas em repouso e decorao em cone dos plos do fuso mittico nas clulas que esto em mitose. Citoplasma no-fluorescente; 2) na presena do antgeno NuMA 2, as clulas em repouso se encontram no-fluorescentes em todas as suas estruturas. H decorao intensa e grosseira dos plos mitticos das clulas em diviso, e as pontes intercelulares so positivas em telfase. Citoplasma no-fluorescente (Figuras 23 e 24).

de Patologia Clnica H. Pardini/MG; Laboratrio Amaral Costa/PA; Laboratrio Atalaia/GO; Laboratrio Fleury/SP; Laboratrio de Imuno-Reumatologia e HLA HC-UFG; Laboratrio Padro/GO; Laboratrios Cardiolab/RJ; Leica; Metanalysis Centro de Diagnsticos Mdicos/RS; Sociedada Brasileira de Anlises Clnicas Regional Gois; Sociedade Brasileira de Patologia Clnica e Medicina Laboratorial; Sociedade Brasileira de Reumatologia; Sociedade Goiana de Patologia Clnica; The Binding Site; Universidade Catlica de Gois (UCG); Wama Diagnstica. Organizao: Laboratrio de Auto-Imunidade UCG (LAI-CBB-UCG) Universidade Catlica de Gois Corpo tcnico: professora Irmtraut Araci Hoffmann Pfrimer, professor Paulo Luiz Carvalho Francescantonio, professora Fabiana Nunes de Carvalho Guimares, professor Wilson de Melo Cruvinel, Pricles Lopes Dourado (BIC/VPG-UCG); Departamento de Biomedicina CBB: professor Paulo Roberto de Melo Reis.

Entidades patrocinadoras
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Bion Diagnostics; Bio-Rad; BioSystems Reagents & Instruments; CPEI (Central de Produtos Enzimticos e Imunolgicos); Conciteg/GO; Exame Medicina Laboratorial/DF; GMK Diagnsticos/RS; Hemagen Diagnostics; Hospfar/GO; IMMCO Diagnostics; Instituto

Referncias
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Endereo para correspondncia

Paulo Luiz C. Francescantonio Laboratrio de Auto-Imunidade (LAI) e-mail: CBB@UCG.br

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Figura 1 rvore de deciso

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Figura 2 Nuclear tipo membrana nuclear

Figura 4 Nuclear pontilhado pleomrfico

Figura 3 Nuclear homogneo

Figura 5 Nuclear pontilhado do tipo pontos isolados

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Figura 6 Nuclear pontilhado grosso

Figura 9 Nuclear pontilhado fino denso

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Figura 7 Nuclear pontilhado fino

Figura 10 Nucleolar homogneo

Figura 8 Nuclear pontilhado centromrico

Figura 11 Nucleolar aglomerado

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Figura 12 Nucleolar pontilhado

Figura 15 Citoplasmtico fibrilar segmentar

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Figura 13 Citoplasmtico fibrilar linear

Figura 16 Citoplasmtico pontilhado polar

Figura 14 Citoplasmtico fibrilar filamentar

Figura 17 Citoplasmtico pontilhado com pontos isolados

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Figura 18 Citoplasmtico pontilhado fino denso Figura 22 Aparelho mittico: ponte intercelular

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Figura 19 Citoplasmtico pontilhado fino

Figura 23 Fuso mittico NuMA 1

Figura 20 Citoplasmtico pontilhado reticulado

Figura 21 Aparelho mittico: centrolo

Figura 24 Fuso mittico NuMA 2