Identificacin de microorganismos implicados en la eliminacin de nitrgeno en sistemas de tratamiento de aguas residuales mediante tcnicas de biologa molecular

Mnica Figueroa*, Jorge Alonso-Gutirrez, Jos Luis Campos, Ramn Mndez, Anuska Mosquera-Corral

Departamento de Ingeniera Qumica, Escuela Tcnica Superior de Ingeniera. Universidad de Santiago de Compostela, C/ Lope Gmez de Marzoa s/n, E-15782 Santiago de Compostela; Espaa.

RESUMEN
En el presente trabajo se ha evaluado la utilizacin de dos tcnicas de biologa molecular para la identificacin de microorganismos presentes en la biomasa granular de un reactor biolgico para el tratamiento de aguas residuales en el que se llevaba a cabo la eliminacin conjunta de materia orgnica y la nitrificacin en condiciones aerobias. Se estudi la aplicacin de una tcnica basada en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificacin del gen ribosomal 16S y una tcnica basada en la microscopa. La tcnica de electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), aplicada tras la PCR, proporcion un perfil caracterstico de la muestra tomada del reactor. Un anlisis posterior de secuenciacin posibilit la identificacin gentica de algunos de los microorganismos presentes resultando cinco identificados como bacterias hetertrofas (Thiothrix, Thauera, Cloroflexi, Comamonas y Zoogloea) y uno como bacterias oxidantes de amonio (Nitrosomonas). Con la tcnica de hibridacin in situ con sondas fluorescentes (FISH) y posterior visualizacin al microscopio se ha podido determinar de forma aproximada la abundancia de dichos microorganismos en la muestra as como su distribucin en el conjunto de la comunidad de microorganismos presentes. Los resultados obtenidos permitieron identificar a las bacterias pertenecientes al gnero Nitrosomonas como las oxidantes de amonio dominantes en el reactor representando un 8% del total de la biomasa. Junto a ellas tambin se identificaron las bacterias hetertrofas, se prest especial atencin a los organismos filamentosos (Thiothrix y Cloroflexi) y floculantes (Thauera, Zoogloea y Comamonas) presentes con un porcentaje alrededor del 45% del total de la biomasa en la muestra ya que ambos tipos de bacterias son con mucha probabilidad las responsables del mantenimiento de la estructura granular de la biomasa.

Palabras clave: Bacterias oxidantes de amonio, bacterias filamentosas, DGGE, FISH, grnulos aerobios, PCR, secuenciacin, 16S.

(*) Autor de contacto: E-mail: monica.figueroa@usc.es Telfono: +34 981 563100 Ext. 16739 Fax: +34 981 528050

INTRODUCCIN
El inters por la identificacin de las diferentes poblaciones bacterianas presentes en sistemas biolgicos de tratamiento de aguas residuales ha ido en aumento durante las dos ltimas dcadas, ya que permite una mejor comprensin de los procesos involucrados en la depuracin (Nielsen et al., 2009) as como de las caractersticas fsicas de la biomasa que le confieren buenas o malas propiedades de sedimentabilidad. El desarrollo de nuevas tcnicas, de sencilla y rpida aplicacin, permite que la identificacin de los microorganismos pueda ser incluida como una de las tareas de monitorizacin llevadas a cabo de forma habitual en las plantas de tratamiento de aguas residuales. Las tcnicas convencionales de microbiologa, basadas en el aislamiento de cultivos puros y en la clasificacin morfolgica, metablica o bioqumica han proporcionado una informacin extensa sobre las capacidades metablicas de los microorganismos, principalmente bacterias. Sin embargo, la inmensa mayora de las bacterias (en torno a un 95%) permanecen sin cultivar, muchas de las cuales poseen un lento crecimiento o viven gracias a relaciones sintrficas complejas y/o la necesidad de cofactores especficos desconocidos que impiden su crecimiento y aislamiento en cultivo puro. El uso de tcnicas de biologa molecular es cultivo-independiente y por tanto se presenta como la mejor alternativa para el estudio de comunidades microbianas (Sanz y Kchling, 2007). Estas tcnicas se basan en el estudio de marcadores moleculares como el gen que codifica el ARN de la subunidad pequea de los ribosoma (ARNr 16S). Los cambios acumulados en la secuencia de esta molcula actan a modo de cronmetro evolutivo presentando regiones conservadas y otras variables que nos permiten diferenciar unas especies de otras sin necesidad de cultivarlas. Algunas de estas tcnicas moleculares necesitan un paso previo de amplificacin del ADN extrado de la muestra objeto de estudio, que se denomina PCR (del ingls Reaccin en Cadena de la Polimerasa). Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de la ADN polimerasa, proveniente de organismos hipertermfilos como Thermus aquaticus (Taq Pol), para replicar hebras de ADN a altas temperaturas. Un aparato denominado termociclador genera ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas de modo que en cada ciclo de temperatura las hebras de ADN se separan, la polimerasa se une al ADN, se produce la replicacin y una nueva hebra de ADN se ha formado tras el descenso de temperatura. Este ciclo se repite aumentando de modo

exponencial el nmero de copias de ADN. La especificidad de la reaccin viene determinada por los primers o cebadores, que son cadenas de unos 20 nucletidos (AC-G-T) que marcarn el inicio y fin de la regin a amplificar. El ADN extrado de la muestra es una mezcla de ADNs procedentes de las diferentes especies de bacterias existentes en ella. Por lo tanto, el producto de la PCR ser del mismo modo una mezcla con millones de copias de cada una de las diferentes secuencias originales. La tcnica DGGE (del ingls Electroforesis en Gel de Gradiente Desnaturalizante) se basa en la diferencia de movilidad que presentan los fragmentos de ADN pertenecientes a diferentes especies en funcin de su secuencia nucleotdica. Al someter el conjunto de ADNs amplificado por PCR (mismo tamao pero distinta secuencia de ADN) a un campo elctrico sobre un gel creado con un gradiente de desnaturalizacin, aquellos fragmentos de ADN pertenecientes a las diferentes especies van a quedar retenidos en distintas posiciones del gel en funcin de su secuencia de cidos nucleicos y se generar un patrn de bandas que indica directamente la biodiversidad de la muestra. El nmero de bandas se corresponde con el nmero de especies, de forma que si se contina con el anlisis individualizado (secuenciacin y anlisis filogentico) de cada banda se consigue una descripcin bastante exhaustiva de la composicin de la comunidad microbiana (Muyzer et al., 1993). La tcnica FISH (del ingls: Hibridacin Fluorescente In Situ) puede ser usada para identificar in situ, de forma rpida y selectiva especies de microorganismos presentes en muestras ambientales (Amann et al., 1995). Esta tcnica tambin se basa en el empleo de cadenas sintticas de nucletidos, en este caso denominadas sondas, que se unen a regiones especficas del ARNr 16S perteneciente al grupo de bacterias que se quiere detectar. Las sondas tienen la particularidad de estar ligadas a cromforos fluorescentes, de modo que la fluorescencia emitida por las bacterias marcadas con la sonda empleada se puede observar al microscopio de epifluorescencia. Diferentes sondas (homlogas a diferentes regiones del 16S y unidas a cromforos con longitudes de onda de excitacin y emisin diferentes) pueden ser utilizadas de forma simultnea en una misma muestra para detectar diferentes especies y grupos bacterianos. El empleo de esta tcnica permite, a diferencia del uso de la DGGE, la cuantificacin, grosso modo, del porcentaje que representa la poblacin detectada en la muestra total analizada. En funcin de los resultados de operacin del sistema biolgico analizado puede inferirse cules seran los microorganismos presentes, y pueden utilizarse directamente las sondas para detectar los grupos esperados. Por ejemplo, en un sistema en que 3

ocurre la nitrificacin suelen estar presentes las bacterias del gnero Nitrosomonas como bacterias oxidantes de amonio. Aunque este es el procedimiento ms rpido, en los ltimos aos ha surgido como alternativa el uso dirigido o el diseo de nuevas sondas en funcin de los resultados del anlisis metagenmico (PCR-DGGE), que es lo que algunos autores han denominado como anlisis del ciclo completo del 16S (Juretschko et al., 2002). El uso del procedimiento completo permite detectar nuevas especies para las que previamente no haba sondas descritas como ocurri con las bacterias responsables del proceso Anammox (Strous et al., 1999). La especificidad tanto de los cebadores de la PCR como de las sondas de FISH puede ajustarse a niveles filogenticos diferentes. Hoy en da existe un gran nmero de cebadores y sondas para aplicar a escala de reino, filo, gnero o especie, lo que permite la deteccin (identificacin y cuantificacin) de algunos microorganismos presentes en las muestras ambientales (Loy et al., 2007, Nielsen et al., 2009). El objetivo final de la utilizacin de estas tcnicas de anlisis es por una parte establecer una relacin entre las poblaciones bacterianas presentes en los sistemas biolgicos y los procesos que en ellos se llevan a cabo (Wagner et al., 2002) y por otra controlar las propiedades fsicas de la biomasa formada evitando la proliferacin de microorganismos filamentosos generadores de fenmenos de flotacin (bulking) o generacin de espumas. En las ltimas dcadas, con el propsito de desarrollar sistemas que mejoren los tratamientos convencionales de lodos activos para la eliminacin biolgica de materia orgnica y nitrgeno, se han utilizado reactores operados de forma secuencial (SBR) y en condiciones aerobias en los que se ha conseguido que la biomasa crezca en forma de grnulos. Estos sistemas son ms compactos y permiten obtener elevadas concentraciones de biomasa con buena capacidad de sedimentacin y alta actividad (Campos et al., 2009). La puesta en marcha y escalado de sistemas de lodos granulares puede ser mucho ms eficaz si se conocen aquellas especies responsables de la formacin de las estructuras granulares para lo que las tcnicas de biologa molecular se presentan como una potente herramienta. Las distintas poblaciones microbianas se distribuyen de forma estratificada en estos grnulos aerobios en funcin de sus necesidades de oxgeno y nutrientes (Figura 1). En un mismo grnulo se pueden llevar a cabo simultneamente varios procesos de modo que los microorganismos encargados de la oxidacin de la materia orgnica estarn localizados en la superficie de los mismos al igual que las bacterias nitrificantes, y en el 4

interior del grnulo, donde el oxgeno no penetra, se encontraran las bacterias desnitrificantes (Lemaire et al., 2008). En la nitrificacin, que sucede en condiciones aerobias, el amonio se oxida secuencialmente a nitrito y nitrato mediante la intervencin de dos grupos distintos de bacterias auttrofas: las bacterias oxidantes de amonio (AOB) - principalmente de los gneros Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus y Nitrosovibrio - que realizan la oxidacin de amonio a nitrito, y las bacterias oxidantes de nitrito (NOB) principalmente pertenecientes a los gneros Nitrobacter y Nitrospira - que llevan a cabo la oxidacin del nitrito a nitrato. Mientras que la nitrificacin es llevada a cabo por unos grupos especializados y bien definidos de bacterias quimiolittrofas, la desnitrificacin es llevada a cabo por diferentes gneros de bacterias hetertrofas y tambin por especies auttrofas. La desnitrificacin es un proceso biolgico de reduccin del nitrato presente en las aguas residuales a nitrgeno molecular en condiciones anxicas por la accin generalmente de bacterias pertenecientes a distintos grupos filogenticos, entre ellos: Proteobacteria, Aquaspirillum, Zoogloea, Rhodocyclus, Dechloromonas, Rhodobacter, Firmicutes y Bacteroidetes, cubriendo ms de 50 gneros diferentes (Hagman et al., 2008, Thomsen et al., 2007, Wagner et al., 2002). Las bacterias hetertrofas, que tambin son las responsables de la oxidacin de la materia orgnica, son extremadamente abundantes en los sistemas convencionales de tratamiento de aguas y presentan una gran diversidad gentica (Nielsen et al., 2009). En el presente trabajo se han identificado las principales bacterias hetertrofas y nitrificantes presentes en la muestra por medio de la tcnica DGGE. A continuacin el uso de la tcnica FISH permiti determinar las poblaciones de bacterias que llevan a cabo el proceso de nitrificacin as como estimar los porcentajes en que se encontraban presentes las bacterias nitrificantes y hetertrofas no filamentosas en la muestra.

MATERIALES Y MTODOS
Sistema experimental Se utiliz un reactor del tipo SBR (reactor secuencial discontinuo) con biomasa granular aerobia en el que se llev a cabo la eliminacin de materia orgnica y nitrgeno de forma simultnea.

El reactor SBR dispona de un volumen til de 1,5 L, con una relacin altura- dimetro de 5,5 (Figura 1). El suministro de aire se realiz a travs de un difusor colocado en la parte inferior del reactor, promoviendo la formacin de pequeas burbujas para garantizar la mezcla completa y mantener una concentracin de oxgeno siempre por encima de 6 mg O2/L. La temperatura y el pH no se controlaron mantenindose sus valores entre 15 y 25 C y 7,5 y 8,5, respectivamente. El SBR se oper en ciclos de 3 h divididos en las siguientes fases de operacin: alimentacin (3 min), aireacin (171 min), decantacin (2 min) y vaciado del efluente (4 min). El volumen de intercambio se fij en el 50% y el tiempo de retencin hidrulico (TRH) en 0,25 das.

Figura 1. Imgenes del reactor SBR, de los grnulos aerobios y esquema representativo de su estructura.

Composicin de la alimentacin El reactor se aliment con un agua residual industrial efluente de un digestor anaerobio en el que se trataban los efluentes generados de la coccin de tnidos de una industria conservera. Se realiz la dilucin del efluente durante la fase de arranque para alcanzar una velocidad de carga orgnica de 1,7 kg DQO/(m3 d) y una velocidad de carga nitrogenada de 0,25 kg N-NH4+/(m3 d). Los datos relativos a la operacin del reactor pueden consultarse en Figueroa et al. (2008).

Extraccin de ADN, PCR y DGGE Se tom una muestra de biomasa directamente del reactor y se someti a ultrasonidos durante 1 min y al 65% de amplitud del equipo (UP200s, Dr. Hielscher). El ADN se extrajo con el kit MoBio Power Soil kit (Carlsbad, USA) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN extrado se suspendi en 50 L de agua y se conserv a 4 C. Se emple la combinacin de cebadores universales F341-GC y R907 (Yu y Morrison, 2004), con la cola de GC en el extremo 5 del cebador F341. La reaccin se llev a cabo en un volumen de 50 L conteniendo 1,25 U de polimerasa (TaKaRa ExTaq Hot Start Version; TaKaRa Bio Inc., Japan), 1X ExTaq Buffer (2 mM de MgCl2), 200 M de desoxinucletidos trifosfato (dNTPs), 0,5 M de cada cebador y 100 ng de ADN. Las condiciones de la reaccin PCR fueron las siguientes: 9 min de desnaturalizacin a 95 C seguido de 35 ciclos de 60 s a 94 C, 60 s a 55 C y 90 s a 72 C, finalmente, una etapa de extensin de 10 min a 72 C. Los productos de la PCR se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa al 1% (peso/volumen) para comprobar su longitud y la especificidad de la reaccin.

Figura 2. Esquema del procedimiento de aplicacin de la tcnica DGGE.

Aproximadamente 800 ng de producto de la PCR se cargaron en el gel de poliacrilamida al 6% (peso/volumen) formado con un gradiente desnaturalizante de formamida/urea que variaba desde el 40 al 75%. Se utiliz el equipo INGENY phorU (Ingeny, The Netherlands), operado a 60 C y 100 V durante 16 h. Posteriormente, el gel se ti con tampn TAE 1X conteniendo SybrGold (Molecular Probes, USA). Las bandas ms intensas se cortaron con un bistur estril, se suspendieron en 50 L de agua milliQ 7

esterilizada durante toda la noche y se reamplificaron utilizando los primers F341 y R907.

Tcnica FISH de identificacin de poblaciones bacterianas Se sigui el procedimiento descrito por Amann et al. (1995), en el que se distinguen cuatro pasos: la fijacin de la biomasa, la inmovilizacin sobre el portaobjetos, la hibridacin y el anlisis microscpico (Figura 3).

Figura 3. Esquema del procedimiento de la tcnica FISH.

En el presente estudio, la fijacin de la muestra se llev a cabo con para-formaldehdo en una concentracin del 4% (peso/volumen) y la hibridacin se llev a cabo a una temperatura constante de 46 C durante un periodo de 90 min, ajustando el porcentaje de formamida a los valores indicados en la Tabla 1. En cada pocillo de los portaobjetos se realiz la hibridacin empleando sondas con fluorocromos diferentes: fluorescena-5-isotiocianato (FITC) y cianina (Cy3). Finalmente se realiz una tincin con DAPI (diclorohidrato de 4,6-diamidino-2fenilindol), un colorante universal que se une al ADN y permite visualizar todas las clulas de la muestra. La tincin se realiz a temperatura ambiente y aplicando una concentracin de 1 g/mL durante 5 minutos. Para la observacin de las muestras se emple un microscopio de epifluorescencia (Axioskop 2 plus, Zeiss) equipado con los filtros correspondientes para visualizar cada fluorocromo empleado, dado que cada uno de ellos presenta un espectro de excitacin y emisin caracterstico y nico. Una cmara acoplada al microscopio (Coolsnap, Roper Scientfific Photometrics) permiti obtener 8

fotografas digitales con cada filtro utilizado. Finalmente, se realiz la superposicin de las imgenes (Figura 3), de forma que se pueden observar las hibridaciones positivas de una sonda frente al resto y hacer una estimacin de la abundancia de las poblaciones.
Tabla 1. Secuencias, organismos objetivo y porcentaje de formamida (%FA) utilizados
Sonda EUB338I ALF1b BET42a* GAM42a* NEU653* NSO190 G123T* Secuencia (53) GCT GCC TCC CGT AGG AGT CGT TCG YTC TGA GCC AG GCC TTC CCA CTT CGT TT GCC TTC CCA CAT CGT TT CCC CTC TGC TGC ACT CTA CGA TCC CCT GCT TTT CTC C CCT TCC GAT CTC TAT GCA % FA 20 20 35 35 40 55 40 Organismo objetivo Dominio Bacteria Alphaproteobacteria Betaproteobacteria Gammaproteobacteria Nitrosomonas spp. halofilicas y halotolerantes - Proteobacteria oxidantes de amonio Thiothrix eikelboomii, T. nivea, T. unzii, T. fructosivorans, T. defluvii, Eikelboom tipo 021N grupo I, II, III filo Chloroflexi Rhodocyclaceae Thauera spp. mzt1t Miembros del gnero Zoogloea, no Z. resiniphila Ref. [1] [2] [2] [2] [3] [4] [5]

CFX1223 Rhoc1425 MZ1 ZRA23 Cte

CCA TTG TAG CGT GTG TGT MG ACTACCTACTTCTGGTGA TCT GCC GTA CTC TAG CCT T CTG CCG TAC TCT AGT TAT TTC CAT CCC CCT CTG CCG

35 40 45 35 20

[6] [7] [8] [9] [10]

Comamonas spp., Acidovorax spp., Hydrogenophaga spp., Aquaspirillum spp. *Sondas usadas con una concentracin equimolar de competidor sin fluorocromo

[1] Amann et al., 1990; [2] Manz et al., 1992; [3] Wagner et al., 1995; [4] Mobarry et al., 1996; [5] Kanagawa et al., 2000; [6] Bjornsson et al., 2002; [7] Figuerola y Erijman, 2007 ; [8] Lajoie et al., 2000; [9] Rossell-Mora et al., 1995; [10] Schleifer et al., 1992.

RESULTADOS
La identificacin de las diferentes poblaciones bacterianas se ha realizado en una muestra recogida del reactor en el momento en que se encontraba en una fase de operacin en estado estacionario en cuanto a los parmetros medidos en fase lquida como slida. Dado que la evolucin de las poblaciones microbianas en el interior de los agregados es relativamente lenta en estas condiciones se consider que las poblaciones a identificar podran ser representativas de la operacin del reactor en ese periodo. En el momento de toma de la muestra (da 148 de operacin), en el reactor se aplicaba una velocidad de carga orgnica de 1,56 kg DQO/(m3 d) y se consegua una eficacia de eliminacin del 93%. La velocidad de carga nitrogenada aplicada era de 0,18 kg NNH4+/(m3 d). En esta fase de operacin, el valor de la concentracin de amonio a la 9

entrada era de 53 mg N-NH4+/L, una fraccin era oxidada a nitrito (25 mg N-NO2-/L) y la otra era desnitrificada o invertida en el metabolismo celular. No se detect oxidacin de nitrito a nitrato. A la vista de los resultados operacionales, es de esperar que la biomasa del sistema est constituida, entre otros, por organismos hetertrofos que lleven a cabo la oxidacin de la materia orgnica, por bacterias oxidantes de amonio que lleven a cabo la oxidacin de amonio a nitrito, y por bacterias desnitrificantes, que lleven a cabo la reduccin del nitrito a nitrgeno gas.

Anlisis DGGE
Aplicando la tcnica DGGE a la muestra de biomasa se detectaron 6 bandas claras de diferente intensidad localizadas en distintas posiciones del gel (Figura 4). Esto es indicativo de la existencia de unas pocas especies bacterianas que dominan la estructura del grnulo en el reactor. Estas bandas ms intensas del gel se cortaron y disolvieron en agua, para extraer el ADN presente en cada porcin. Se obtuvieron secuencias parciales del gen 16S ARNr de una longitud que variaba entre 500 y 550 nucletidos (Figura 4). Al realizar la comparacin de las bandas extradas con las depositadas en el GenBank se obtuvieron cinco secuencias de bacterias hetertrofas y una de auttrofa perteneciente a una bacteria oxidante de amonio.
Anlisis de las secuencias de ADN obtenidas de la DGGE. Mejor resultado (N de acceso) Organismo ms cercano (% similitud) Nitrosomonas europaea ATCC Nitrosomonas europaea 19718 (AL954747) (100%) Clon bacteriano no cultivado IC-32 Thiothrix caldifontana (AB255060) (99%) Clon bacteriano no cultivado de Thauera sp. Proteobacteria QEEB3BF07 (100%) (CU917875) Clon bacteriano no cultivado NB-09 Chloroflexi (AB117713) (87%) Clon bacteriano no cultivado de Comamonas Proteobacteria QEDN4AH06 (99%) (CU926435) Clon bacteriano no cultivado P1G05 Zoogloea sp. (FJ416442) (99%)

Banda DGGE B1 B2 B3 B4 B5 B6

Figura 4. Gel obtenido de la tcnica DGGE y su versin esquemtica en que se indican las bandas de inters que se cortaron (B1 a B6). Tras la secuenciacin de cada una de las bandas se realiz la comparacin con las secuencias depositadas en la base de datos, y se obtuvieron los organismos indicados ms cercanos filogenticamente.

10

La mayora de las bandas se correspondan con muestras ambientales sin cultivar y pertenecan a clases y rdenes diferentes. Thauera y Zoogloea son organismos hetertrofos y Nitrosomonas es auttrofo, todos ellos de la clase Betaproteobacteria; las dos primeras pertenecientes a la familia Rhodocyclaceae, mientras que Nitrosomonas (bacterias oxidantes de amonio) pertenece a la familia Nitrosomonadaceae. Thiothrix pertenece a la familia Thiotrichaceae de las Gammaproteobacteria y Chloroflexi forma un filo propio distinto a las Proteobacteria. Ambas se corresponden con bacterias caracterizadas por su aspecto filamentoso.

Anlisis FISH
A la muestra de biomasa granular se le aplicaron sondas especficas de FISH (Tabla 1) para las clases generales y para los gneros bacterianos que fueron detectados tras la secuenciacin del ADN de las bandas del gel resultante de la tcnica DGGE. Se aplicaron las tres sondas de oligonucletidos: ALF1b, BET42a y GAM42a especficas para las clases Alfa (-), Beta (-) y Gamma (-) Proteobacteria. Estas sondas fueron usadas en combinacin con la sonda general EUB338I, universal para los microorganismos del dominio Bacteria. Se observ que la clase Betaproteobacteria era la que se encontraba en mayor proporcin, si bien tambin se detectaron poblaciones pertenecientes a las subclases Alfa- y Gammaproteobacteria. Solamente una pequea proporcin de la biomasa, aproximadamente un 2%, proporcion resultados positivos al aplicar la sonda Alfaproteobacteria, mientras que al aplicar la sonda Gammaproteobacteria se observ la presencia de bacterias con aspecto filamentoso en la muestra.

Presencia de bacterias oxidantes de amonio A partir de los resultados obtenidos de la tcnica DGGE ya se pudo determinar que las bacterias oxidantes de amonio presentes en la muestra eran las bacterias del gnero Nitrosomonas. Con el fin de comprobar su abundancia, se aplicaron una serie de sondas especficas para estas bacterias oxidantes de amonio, las sondas NEU653 y NSO190 (Figura 5), que permitieron observar una respuesta positiva intensa, indicando la abundancia de bacterias oxidantes de amonio de los gneros Nitrosomonas y Nitrosococus. Se estim que la poblacin de Nitrosomonas representaba un 8% del total de la biomasa presente (resultados positivos con la sonda NEU653). 11

A pesar de haber disgregado la biomasa granular mediante la aplicacin de ultrasonidos, puede distinguirse la disposicin espacial de las bacterias oxidantes de amonio en forma de agregados densos (Figura 5). Estas bacterias crecen normalmente en forma de microcolonias con fuerte adhesin entre sus miembros, por lo que son difciles de disgregar empleando ultrasonidos.

Figura 5. Imagen de FISH de la muestra y esquema de las sondas aplicadas. Las sondas aplicadas y el fluorocromo correspondiente fueron: BET42a (Cy3-rojo), NEU653 (FITC-verde) y DAPI en azul, la superposicin de las tres imgenes aparece en blanco. La barra indica 25 m.

Presencia de bacterias filamentosas Tras los resultados obtenidos de las secuencias de ADN, se aplicaron dos sondas distintas para identificar y cuantificar las bacterias filamentosas presentes en la muestra. Se observ que las bacterias filamentosas de mayor tamao (desde 75 m a 300 m de longitud) y ms abundancia en la muestra produjeron hibridaciones positivas tras la aplicacin de la sonda G123T, que abarca las bacterias del gnero Thiothrix (Figura 6). ste es un organismo hetertrofo que est asociado generalmente a problemas de flotacin en sistemas de lodos activos, y que se caracteriza sobre todo por la presencia de corpsculos de azufre en su estructura. Su aparicin en los sistemas de lodos activos suele asociarse a la presencia de sulfuros, deficiencia de nutrientes, principalmente nitrgeno, y condiciones de elevada carga orgnica vinculada a la cantidad de cidos orgnicos de bajo peso molecular. Excepto la presencia de sulfuros el resto son condiciones que fcilmente pueden ocurrir en sistemas granulares aerobios debido a los diferentes ambientes presentes en la profundidad de los grnulos y teniendo en cuenta que el acceso de los sustratos a las distintas zonas va verse ms o menos dificultado dependiendo de la profundidad. Sin embargo estas condiciones no deben en suficiente

12

extensin como para el desarrollo masivo de estas bacterias indeseadas. En el caso de los grnulos aerobios, la presencia de estas bacterias filamentosas no ocasion problemas de operacin, sino que parece servir de soporte y malla para el crecimiento de las otras bacterias puesto que no se observ el crecimiento de los mismos en la superficie de los grnulos o en suspensin. El segundo tipo de bacterias filamentosas observado en las muestras se corresponde con Chloroflexi, tambin denominadas bacterias verdes no del azufre debido a su capacidad de obtener energa a travs de la luz. Mediante la tcnica FISH se pudo constatar que la presencia de este tipo de bacterias filamentosas en las muestras del reactor SBR es muy reducida. Se observaron hibridaciones positivas con la sonda CFX1223, mostrando que las bacterias de este tipo tenan una longitud inferior a las Thiothrix, en torno a 25 m, y que en la mayora de los casos se encontraban entrelazadan con los flculos de biomasa.

Figura 6. Imagen de FISH de la muestra y esquema de las sondas aplicadas. Las sondas aplicadas y el fluorocromo correspondiente fueron: A) G123T (Cy3-rojo) y EUB338 (FITC-verde); la barra indica 25 m. B) CFX1223(Cy3-rojo) y EUB338 (FITC-verde); la barra indica 10 m. En ambos casos, la superposicin de las dos imgenes aparece en naranja.

13

La precisin con la que la tcnica FISH permite identificar las bacterias filamentosas abre un amplio campo de aplicacin de esta tcnica en los sistemas biolgicos de tratamiento, puesto que la identificacin basada nicamente en morfotipos y tcnicas de tincin (gram-positivo, gram-negativo, Neisser) usando microscopa (Jenkins et al., 2004, Nielsen et al., 2009) puede no ser completamente fiable en determinados casos debido a la similitud morfolgica de las bacterias filamentosas.

Bacterias hetertrofas no filamentosas Para la determinacin de la cantidad de las restantes bacterias hetertrofas se emple una sonda especfica (Rhoc1425) para los miembros de la familia Rhodocyclaceae, que engloba, entre otros, a los gneros Zoogloea y Thauera (Figura 6). Se produjeron hibridaciones positivas con la sonda Rhoc1425, que englobaba en torno a un 20% de la biomasa. Para distinguir entre los diferentes gneros presentes se aplicaron las sondas MZ1, especfica para Thauera, que proporcion resultados positivos con un 4% de la biomasa presente, y la sonda ZRA23, especfica para Zoogloea, con un 10% de hibridaciones positivas. Las bacterias pertenecientes al gnero Comamonas tambin fueron detectadas tras la aplicacin de la sonda Cte. Se observ que estas bacterias se correspondan con un 13% de la biomasa. En las muestras observadas, estos tres gneros bacterianos presentaban la particularidad de que se encontraban tanto en forma dispersa como formando pequeos clusters de 25 m de dimetro. Los gneros Thauera, Zoogloea y nmerosos gneros de la familia Comamonadaceae (por ejemplo Curvibacter) son organismos que generalmente se encuentran en sistemas de tratamiento de aguas y se caracterizan por encontrarse entre los responsables del proceso de la desnitrificacin (Thomsen et al., 2007). Los gneros Thauera y Zoogloea se asocian generalmente con la formacin de flculos en las plantas de lodos activos debido a su capacidad de segregar polmeros extracelulares. Estos organismos ya fueron detectados previamente en sistemas granulares aerobios, (Li et al., 2008), y se considera que su capacidad de segregar exopolmeros, que actan como pegamento para facilitar la adhesin de las bacterias, est relacionada con la formacin y mantenimiento de la estructura de los grnulos aerobios.

14

Figura 6. Imagen de FISH de la muestra y esquema de las sondas aplicadas. Las sondas aplicadas y el fluorocromo correspondiente fueron: A) Rhoc1425 (Cy3-rojo) y EUB338 (FITC-verde). B) MZ1 (Cy3rojo) y EUB338 (FITC-verde). C) ZRA23 (Cy3-rojo) y EUB338 (FITC-verde). D) Cte (Cy3-rojo) y EUB338 (FITC-verde). En todos los casos la barra indica 25 m y la superposicin de las dos imgenes aparece en naranja.

CONCLUSIONES El uso de tcnicas de biologa molecular para la identificacin de las poblaciones bacterianas presentes en un reactor biolgico permite disponer de informacin que puede ser correlacionada con lo que sucede en el reactor a nivel macroscpico en cuanto 15

a las actividades presentes as como con las propiedades fsica de la biomasa obtenida. En el presente caso bacterias involucradas en las actividades nitrificante (Nitrosomonas), desnitrificante (Thauera y Zoogloea) y oxidante de la materia orgnica (Comamonas) fueron identificadas. En cuanto a la estructura de la biomasa granular se corrobora la presencia de bacterias filamentosas (Thiothrix y Cloroflexi) aunque presumiblemente realizando nicamente funciones estructurales. Esta informacin ser de ayuda en el futuro en la puesta a punto de nuevos reactores o el escalado de estas tecnologas a plantas de mayor tamao. Los resultados obtenidos del anlisis de FISH y de la tcnica DGGE concuerdan con los resultados operacionales del reactor. El empleo de la tcnica DGGE ha permitido identificar las bacterias nitrificantes auttrofas y las bacterias hetertrofas responsables del proceso de depuracin que ha permitido posteriormente la aplicacin dirigida de la tcnica del FISH. Adems, con el empleo de la tcnica FISH se ha hecho una cuantificacin grosera de las bacterias filamentosas y floculantes presentes en la muestra en un alto porcentaje, proponindose como responsables de la estructura en forma de grnulo de la comunidad microbiana. Por su simplicidad la hibridacin in situ con sondas fluorescentes se presenta como una herramienta til y de uso rutinario para identificar las poblaciones presentes en sistemas biolgicos para el tratamiento de aguas residuales, ya sea en sistemas granulares aerobios como en sistemas de lodos activos puesto que es la nica herramienta que permite realizar estimaciones cuantitativas de la abundancia de una especie frente al total. Sin embargo, hay que considerar que la existencia de exopolmeros, la propia agregacin bacteriana y la fluorescencia de fondo puede dificultar en gran medida la aplicabilidad de tcnicas de anlisis de imagen para la cuantificacin, convirtindolo en un proceso subjetivo y tedioso, especialmente cuando se trabaja con biomasa agregada como en el presente caso.

AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado a travs de los proyectos del Gobierno Espaol Togransys (CTQ2008-06792-C02-01) y NOVEDAR_Consolider (CSD2007-00055).

16

REFERENCIAS
Amann, R., Binder, B.J., Olson, R.J., Chisholm, S.W., Devereux, R. y Stahl, D.A. (1990) Combination of 16S ribosomal-RNA-targeted oligonucleotide probes with flow-cytometry for analyzing mixed microbial-populations. Applied and Environmental Microbiology 56(6), 1919-1925. Amann, R., Ludwig, W. y Schleifer, K.H. (1995) Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiological Reviews 59(1), 143-169. Bjornsson, L., Hugenholtz, P., Tyson, G.W. y Blackall, L.L. (2002) Filamentous Chloroflexi (green non-sulfur bacteria) are abundant in wastewater treatment processes with biological nutrient removal 9. Microbiology 148(8), 2309-2318. Campos, J.L., Figueroa, M., Mosquera-Corral, A. y Mndez, R. (2009) Aerobic sludge granulation: state-of-the-art. International Journal of Environmental Engineering 1(2), 136-151. Figueroa, M., Mosquera-Corral, A., Campos, J.L. y Mendez, R. (2008) Treatment of saline wastewater in SBR aerobic granular reactors. Water Science and Technology 58(2), 479-485. Figuerola, E.L.M. y Erijman, L. (2007) Bacterial taxa abundance pattern in an industrial wastewater treatment system determined by the full rRNA cycle approach. Environmental Microbiology 9(7), 1780-1789. Hagman, M., Nielsen, J.L., Nielsen, P.H. y Jansen, J.l.C. (2008) Mixed carbon sources for nitrate reduction in activated sludge-identification of bacteria and process activity studies. Water Research 42(6-7), 1539-1546. Jenkins, D., Richard, M.G. y Daigger, G.T. (2004) Manual on the causes and control of activated sludge bulking, foaming, and other solids separation problems, IWA Publishing, London, UK. Juretschko, S., Loy, A., Lehner, A. y Wagner, M. (2002) The microbial community composition of a nitrifyingdenitrifying activated sludge from an industrial sewage treatment plant analyzed by the full-cycle rRNA approach. Systematic and Applied Microbiology 25(1), 84-99. Kanagawa, T., Kamagata, Y., Aruga, S., Kohno, T., Horn, M. y Wagner, M. (2000) Phylogenetic analysis of and oligonucleotide probe development for Eikelboom Type 021N filamentous bacteria isolated from bulking activated sludge. Applied and Environmental Microbiology 66(11), 5043-5052. Lajoie, C.A., Layton, A.C., Gregory, I.R., Sayler, G.S., Taylor, D.E. y Meyers, A.J. (2000) Zoogleal clusters and sludge dewatering potential in an industrial activated-sludge wastewater treatment plant. Water Environment Research 72, 56-64. Lemaire, R., Webb, R.I. y Yuan, Z. (2008) Micro-scale observations of the structure of aerobic microbial granules used for the treatment of nutrient-rich industrial wastewater. The ISME Journal 2(5), 528-541. Li, A.j., Yang, S.F., Li, X.y. y Gu, J.d. (2008) Microbial population dynamics during aerobic sludge granulation at different organic loading rates. Water Research 42(13), 3552-3560. Loy, A., Maixner, F., Wagner, M. y Horn, M. (2007) probeBase - an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic Acids Research 35, 800-804. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M. y Schleifer, K.H. (1992) Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of Proteobacteria - problems and solutions. Systematic and Applied Microbiology 15(4), 593-600. Mobarry, B.K., Wagner, M., Urbain, V., Rittmann, B.E. y Stahl, D.A. (1996) Phylogenetic probes for analyzing abundance and spatial organization of nitrifying bacteria. Applied and Environmental Microbiology 62(6), 21562162. Muyzer, G., Dewaal, E.C. y Uitterlinden, A.G. (1993) Profiling of complex microbial-populations by Denaturing Gradient Gel-Electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes-coding for 16S ribosomalRNA. Applied and Environmental Microbiology 59(3), 695-700. Nielsen, H., Daims, H. y Lemmer, H. (2009) FISH handbook for biological wastewater treatment, IWA Publisihing, London, UK. Rossell-Mora, R.A., Wagner, M., Amann, R. y Schleifer, K.H. (1995) The abundance of Zoogloea ramigera in sewage treatment plants. Applied and Environmental Microbiology 61(2), 702-707. Sanz, J.L. y Kchling, T. (2007) Molecular biology techniques used in wastewater treatment: An overview. Process Biochemistry 42(2), 119-133. Schleifer, K.H., Amann, R., Ludwig, W., Rothermund, C., Springer, N. y Dorn, S. (1992) Pseudomonas: Molecular Biology and Biotechnology. Galli, E., Silver, S. and Witholt, B. (eds), pp. 127-134, American Society for Microbiology, Washington. Strous, M., Fuerst, J.A., Kramer, E.H.M., Logemann, S., Muyzer, G., Pas-Schoonen, K.T., Webb, R., Kuenen, J.G. y Jetten, M.S.M. (1999) Missing lithotroph identified as new planctomycete. Nature 400(6743), 446-449. Thomsen, T.R., Kong, Y. y Nielsen, P.H. (2007) Ecophysiology of abundant denitrifying bacteria in activated sludge. FEMS Microbiology Ecology 60(3), 370-382. Wagner, M., Loy, A., Nogueira, R., Purkhold, U., Lee, N. y Daims, H. (2002) Microbial community composition and function in wastewater treatment plants. Antonie van Leeuwenhoek 81(1-4), 665-680. Wagner, M., Rath, G., Amann, R., Koops, H.P. y Schleifer, K.H. (1995) In-situ identification of ammonia-oxidizing bacteria. Systematic and Applied Microbiology 18(2), 251-264. Yu, Z.T. y Morrison, M. (2004) Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology 70(8), 4800-4806.

17