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Control de la produccin de sulfuro en aguas residuales mediante la adicin de nitrato: cintica y reversibilidad

Control de la produccin de sulfuro en aguas residuales mediante la adicin de nitrato: cintica y reversibilidad.

Juan Garca-de-Lomas, Alfonso Corzo, Emilio Garca-Robledo y Desire Villahermosa Depto. Biologa (rea Ecologa). Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales. Pol. Rio San Pedro s/n. 11510-Puerto Real (Cdiz). e-mails: juan.garciadelomas@uca.es; alfonso.corzo@uca.es

Foto J. Garca-de-Lomas Imagen de microelectrodos (pH y de referencia) midiendo microgradientes verticales en biopelculas crecidas sobre una probeta de acero inoxidable colocada en una depuradora de aguas residuales. Durante las mediciones, la biopelcula se incub en una cmara de flujo (de color transparente, rodeando la probeta). Tambin se observa el micromanipulador que sujeta y desplaza el microelectrodo durante las medidas y el picoampermetro, al fondo.

Control de la produccin de sulfuro en aguas residuales mediante la adicin de nitrato: cintica y reversibilidad

Resumen

El sulfuro es un problema en los ambientes de aguas residuales generado como consecuencia de la actividad de bacterias sulfatorreductoras (BSR) y que suele acarrear problemas de corrosin, malos olores y toxicidad. El nitrato se ha usado desde hace tiempo para reducir la produccin de sulfuro, si bien la cintica del proceso no ha sido estudiada en detalle. En este trabajo se estudi la respuesta de biopelculas crecidas en una EDAR a la adicin de diferentes concentraciones de nitrato que pudieran ser usadas de manera viable a nivel industrial (0,05, 0,25, 0,5, 1 y 3,65 mM NO3-), analizando su efecto sobre la eliminacin de sulfuro. Se determinaron las tasas de eliminacin de sulfuro y la velocidad de disminucin de la tasa neta de sulfatorreduccin en funcin de la concentracin de nitrato aadida. Se analiz la duracin y la reversibilidad del proceso una vez cesada la exposicin al nitrato. Los resultados obtenidos demostraron que el nitrato redujo significativamente la concentracin de sulfuro integrada en la biopelcula (CSI) y la tasa neta de sulfatorreduccin (TNS), existiendo una clara dependencia del proceso con la concentracin de nitrato aadida. El proceso sigui una cintica de tipo MichaelisMenten, con Dmax = 98% y 95% para CSI y TNS, respectivamente y Ksd = 21 y 17 M NO3- para CSI y TNS, respectivamente. Esta eliminacin fue un proceso reversible, recuperndose valores prximos a los iniciales en pocas horas. No obstante, la velocidad de eliminacin de sulfuro y de su recuperacin cesada la exposicin al nitrato mostraron cierta dependencia tanto con CSI como con la concentracin de nitrato, lo que sugiere una cintica de doble sustrato. La ausencia de oxidacin qumica del sulfuro en presencia de nitrato demuestra que el nitrato favorece la oxidacin biolgica de sulfuro, via estimulacin de bacterias nitratorreductoras,

sulfurooxidadoras ya presentes en las biopelculas. El estudio de la estequiometra del proceso sugiere que la oxidacin de sulfuro no es completa, y que los productos son nitrito y azufre elemental. Estos resultados podran contribuir a un uso ms eficiente del nitrato en instalaciones de aguas residuales donde la acumulacin de sulfuro puede constituir un problema.

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1. INTRODUCCIN.

El sulfuro es un problema comn en los ambientes de aguas residuales generado como consecuencia de la actividad de bacterias sulfatorreductoras (BSR) y suele acarrear problemas de corrosin, malos olores y toxicidad (Postgate, 1984). Entre las estrategias de control utilizadas para prevenir, inhibir o eliminar el sulfuro, el nitrato ha sido utilizado con xito en aguas residuales (e.g., Bentzen et al., 1995; Einarsen et al., 2000). El mecanismo implicado en el proceso puede ser la inhibicin de la actividad de las bacterias sulfatorreductoras (Nemati et al., 2001b), o la estimulacin de la oxidacin biolgica del sulfuro mediada por bacterias nitratorreductoras, sulfurooxidadoras (BNRSO) (Garca-de-Lomas et al., 2007).

Los primeros estudios relacionados con la eliminacin del sulfuro mediante la adicin de nitrato documentaron una inhibicin transitoria que no ha sido estudiada en detalle con posterioridad. Allen (1949) encontr que la adicin de 1 g L-1 de nitrato sobre lodos residuales inhibi la produccin de sulfuro durante al menos 29 das. Esta inhibicin se atribuy al incremento del potencial redox causado por la presencia de nitrato. Poduska y Anderson (1981) demostraron que la adicin de nitrato controlaba eficazmente la produccin de sulfuro en sistemas de lagunaje, en la medida en que se aadiera suficiente nitrato inicialmente como para incrementar el potencial redox de la laguna por encima de 300 mV. Jenneman et al. (1986a) encontraron que la adicin de 59 mM de nitrato ces la produccin biognica de sulfuro en fangos de aguas residuales durante al menos 6 meses, observndose un incremento de los xidos de nitrgeno. Jenneman et al. (1986a) encontraron resultados similares en sedimentos lacustres y salmueras procedentes de pozos de petrleo y demostraron que cantidades menores de nitrato (620 mM NO3-) aadidas sobre lodos residuales ms concentrados implicaban inhibiciones de la produccin de sulfuro de menor duracin, lo que sugiere una respuesta dependiente de la concentracin de nitrato aadida. Las concentraciones de nitrato utilizadas por Allen (1949) (16 mM) o por Jenneman et al. (1986a) (entre 6-59 mM) pueden resultar tiles en lugares con elevados tiempos hidrulicos de retencin (THR) como lagunas estancadas, pero son excesivamente altas como para que sean utilizadas de forma ms o menos continuada en agua residuales, debido a los costes

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econmicos. De este modo, interesa ensayar menores concentraciones de nitrato que resulten igualmente efectivas pero que puedan ser utilizadas en sistemas con menor tiempo de residencia. Sin embargo, los estudios anteriormente citados no detallan si la inhibicin causada por la adicin de nitrato compromete la eficiencia de la depuracin. Adems, la sulfatorreduccin constituye una ruta importante de consumo de materia orgnica por lo que directamente participa en la depuracin de aguas residuales, de modo que su inhibicin completa podra no ser deseable.

En

ambientes

de

aguas

residuales,

incluyendo

colectores

con

elevada

superficie:volumen (S:V) y aqullos donde se produce una frecuente deposicin de slidos, las biopelculas pueden ser responsables de acumulaciones problemticas de sulfuro (Pomeroy, 1990; Hvitved-Jacobsen, 2002; Okabe et al., 2005). Por otro lado, las biopelculas presentan una elevada densidad de clulas microbianas (Griebe y Flemming, 2000) que les dota de una intensa actividad metablica y, por tanto, son comunidades idneas para estudiar con detalle en el laboratorio los cambios en su metabolismo neto en respuesta a diferentes condiciones.

En este estudio, se escogieron biopelculas de aguas residuales para estudiar el efecto del nitrato sobre la generacin de sulfuro. Se utilizaron microelectrodos selectivos de H2S, pH y O2 para caracterizar los microgradientes fsico-qumicos en el interior de las biopelculas con una elevada resolucin espacial, lo que permite entender mejor los procesos microbianos dentro de las biopelculas (e.g., Ito et al., 2002a, b; Okabe et al., 2005). Estudios previos realizados en biopelculas de aguas residuales mostraron que, tras la adicin de nitrato, la capa de mxima produccin de sulfuro se desplaza hacia el interior de la biopelcula (Ito et al., 2002a, b; Okabe et al., 2003), pero no hay datos sobre la duracin de este proceso ni de los efectos que diferentes concentraciones de nitrato pueden tener en el microambiente fsico-qumico de la biopelcula.

El objetivo de este trabajo es evaluar qu efecto tienen diferentes concentraciones de nitrato (0,05-3,65 mM NO3-) sobre la produccin de sulfuro en biopelculas crecidas en una depuradora de aguas residuales urbanas de cara a su aplicacin industrial. Por otro lado, se estudia la cintica del proceso para ver si existe una repuesta dependiente de la

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concentracin de nitrato aadida. En tercer lugar, se analiza la duracin de la inhibicin de la produccin de sulfuro en funcin de la concentracin de nitrato aadida y, por ltimo, se estudia la reversibilidad del proceso, una vez que cesa la exposicin ante el nitrato. Los resultados obtenidos podran tener una aplicacin directa en el uso eficiente del nitrato en instalaciones de aguas residuales donde la acumulacin de sulfuro puede constituir un problema.

2. MATERIAL Y MTODOS.

2.1. Muestras de biopelculas y sistema experimental.

El efecto del nitrato sobre la generacin de sulfuro se analiz en biopelculas crecidas in situ en la EDAR-Guadalete (Jerez de La Frontera, Cdiz) sobre probetas de acero inoxidable (AISI-316, 15 x 10 cm2). Para la medicin de los microperfiles verticales de O2, H2S y pH, las probetas con las biopelculas se transportaron en fro al laboratorio (30-45 min) en una atmsfera saturada en vapor de agua. Una vez en el laboratorio, las probetas se colocaron en una cmara de flujo construida en metacrilato (volumen = 287,5 mL). Las incubaciones se hicieron con agua residual tomada del efluente primario de la EDAR. El agua se recogi en la poca seca durante das laborables y siempre entre las 11.00-11.30 h, tratando de asegurar cierta homogeneidad en su composicin. Este agua fue esterilizada a su llegada al laboratorio. Para los experimentos, la temperatura se ajust a 20 1C y el pH se ajust a 7,5 utilizando 2 M HCl 2 M NaOH. Durante las medidas con microelectrodos, el agua se bombe con flujo constante de 0,05 cm s-1 (THR = 0,12 h), mediante una bomba peristltica (Watson Marlow). El agua no se recircul para asegurar un aporte de nutrientes y materia orgnica continuos para la biopelcula tratando as de representar mejor las condiciones propias de la EDAR. No se us un mayor THR por dos motivos: por un lado, aproximar las condiciones de trabajo en el laboratorio a las existentes en la EDAR; por otro, un elevado THR conllevara una reduccin importante de la velocidad del fluido sobre la biopelcula que a su vez incrementara notablemente el espesor de la

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capa lmite difusiva y que redundara finalmente en un menor intercambio difusivo entre el agua y la biopelcula (Jrgensen y Revsbech, 1985; Khl et al., 1996). Se estim el balance de masas para diferentes variables del agua residual (ver ms abajo) entre el agua de entrada a la cmara de flujo (in) y el efluente de salida (out). Aunque se pretenda trabajar en condiciones anaerobias, la presencia de una lmina de agua delgada (ca. 1 cm) sobre la biopelcula en la cmara de flujo y las condiciones estriles del agua residual (la comunidad heterotrfica del agua residual agota rpidamente el oxgeno) propiciaron la existencia de condiciones microaeroflicas durante los experimentos. Las mediciones se realizaron en oscuridad para prevenir la fotooxidacin del sulfuro y evitar el desarrollo de actividad fotosinttica.

Se utiliz una biopelcula diferente para cada concentracin de nitrato ensayada (0, 0,05, 0,25, 0,5, 1 y 3,65 mM NO3-, obtenidas a partir de NaNO3). Para cada una de estas concentraciones, el experimento se dividi en tres etapas: La etapa 1 (E1) abarc desde que el agua residual estril comenz a bombearse a la cmara de flujo hasta que se alcanzaron condiciones de estado estacionario (duracin aproximada: 2 h) (Satoh et al., 2006). Durante la etapa 2 (E2), se bombe agua residual estril con una de las cinco concentraciones de nitrato (o bien sin nitrato durante el experimento control) y se realizaron mediciones peridicas de microperfiles de H2S, pH, O2 hasta que se observ una nueva estabilizacin de los mismos. Finalmente y a fin de estudiar la reversibilidad del proceso, durante la etapa 3 (E3), se aadi nuevamente agua residual estril sin nitrato aadido hasta que otra vez se estabilizaron los microperfiles. El agua residual estril utilizada en cada etapa procedi de matraces sellados (V = 10 L) diferentes, para minimizar la posible contaminacin microbiana entre etapas. Entre cada etapa, la cmara de flujo se vaci momentneamente (< 5 min) para acelerar la sustitucin de condiciones.

2.2. Variables analizadas en la biopelcula.

Se determinaron microperfiles de H2S y pH cada 10-15 minutos durante las etapas E1 y E3, y cada 5 minutos durante etapa E2 (vase ms abajo). Los perfiles de oxgeno se determinaron nicamente al final de cada etapa (n = 3). Una vez medidos estos perfiles,

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se vaci momentneamente la cmara de flujo y se tomaron muestras de biopelculas y se determin el contenido en agua y materia orgnica. En primer lugar, la muestra recogida se pes y se sec a 60C hasta peso constante, calculando el contenido en agua por diferencia. Una parte de las muestras secadas se reservaron para analizar el contenido total de C, N y S utilizando un analizador elemental Leco CHNS 932. El resto se calcin a 550C durante 2 h y la diferencia de peso se utiliz para estimar el contenido en materia orgnica. El peso libre de materia orgnica (Plmo) se utiliz para analizar el contenido en Cinorg. El correspondiente contenido en Corg se calcul por diferencia. El espesor de la biopelcula se determin con un nonio y a partir de las medidas realizadas con microelectrodos.

2.3. Medidas con microelectrodos y clculo de flujos.

Se utilizaron microelectrodos de O2 (Revsbech, 1989), H2S y pH (Revsbech y Jrgensen, 1986) siguiendo las instrucciones del fabricante (Unisense). Los microelectrodos se montaron en un micromanipulador manual unido a un micromanipulador electrnico controlado desde un PC, utilizando el software Profix de Unisense. La calibracin se hizo tal y como se ha descrito en trabajos previos (e.g, Jeroschewski et al., 1996; Corzo et al., 2005; Garca-de-Lomas et al., 2005). Para la calibracin del electrodo de oxgeno se tom como 0 de oxgeno agua residual estril burbujeada con N2 durante 5 minutos, mientras que el 100% de saturacin se tom en agua residual estril previamente burbujeada con aire durante otros 5 min. Las concentraciones fueron posteriormente convertidas a M siguiendo la ecuacin de Garca y Gordon (1992). El electrodo de pH se calibr utilizando disoluciones tamponadas de pH conocido (4 y 7), mientras que para el electrodo de sulfuro se utilizaron varias disoluciones tamponadas con fosfato y a las que se aadi volmenes crecientes de una disolucin madre de sulfuro obtenida a partir de Na2S9H2O. Todas las calibraciones y medidas se realizaron a la misma temperatura (20 1C). Para el clculo de la concentracin de sulfuro total ([S2-tot]) se utiliz la ec. 4, que se deriva de la simplificacin de la ec. 1.

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[H2S] = [S2-tot] (1 + K1/[H3O+] + K1K2/[H3O+]2) (1) Donde [H2S] es la concentracin de sulfuro medida por el microelectrodo, K1 es la primera constante de disociacin del sistema de equilibrio del sulfuro y [H3O+] la concentracin de protones obtenida a partir de los valores de pH medidos en perfiles paralelos al mismo tiempo que los valores de [H2S]. Para valores de pH < 9, esta ecuacin se simplifica a:

[H2S] = [S2-tot] (1 + K1/[H3O+])

(2)

K1 se calcul previamente de acuerdo con Millero et al. (1988) (ec. 3), considerando una conductividad media de 1,81 mS cm-1, que correspondi a una salinidad de 0,7 utilizando un ajuste experimental realizado previamente (ec. 4), obtenindose as un pK1 = 6,9616.

pK1 = -98,08 + 5765,4/T + 15,04555 x LN(T) 0,127 x S0,5 + 0,0135 x S

(3)

Donde T es la temperatura (en grados Kelvin), LN es el logaritmo neperiano y S es la salinidad: S = -0.21447 + (0.51708 x conductividad (mS cm-1)); R = 0,992 (4)

Basndonos en los perfiles de sulfuro medidos con microelectrodos, se pueden calcular los flujos difusivos de esta sustancia en el interior de la biopelcula mediante la primera Ley de Fick (Crank, 1983) (ec. 5), asumiendo una porosidad prxima a la unidad y constante con la profundidad (Khl y Jrgensen, 1992).

J = - Ds x (dC/dz)

(5)

Donde Ds es el coeficiente de difusin efectiva del H2S en el interior de la biopelcula (Ds = 1,39 10-5 cm2 s-1) (Ito et al., 2002b; Khl y Jrgensen, 1992; Nelson et al., 1986) y dC/dz es el gradiente de concentracin determinado como el gradiente ms pronunciado del perfil de sulfuro obtenidos con el microelectrodo en el interior de la

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biopelcula. Estos flujos dan una estimacin de la tasa neta de sulfatorreduccin (TNS), de acuerdo con Khl y Jrgensen (1992) e Ito et al. (2002b). TNS se expres en mol S2-tot m-2 s-1.

Durante los experimentos se utiliz agua residual esterilizada de acuerdo a lo descrito anteriormente. El sistema experimental se prepar para una fcil toma de muestras en el agua de entrada a la cmara de flujo (in) y en su efluente de salida (out) (Fig. 1).

Figura 1. Diagrama del sistema experimental.

2.4. Cuantificacin de la eficacia y reversibilidad del nitrato en la disminucin de sulfuro.

Para evaluar la eficacia del nitrato para eliminar el sulfuro en las biopelculas, as como la reversibilidad del proceso una vez que cesa la exposicin al nitrato, se procedi de acuerdo al esquema de trabajo resumido en la figura 4.3. En primer lugar, se calcul, para cada perfil de S2-tot, la concentracin de S2-tot integrada en profundidad (CSI, en mmolS2-tot m-2), considerando el primer milmetro del interior de la biopelcula en todos los casos (ec. 6). Seguidamente, se estimaron los valores promedio de CSI y TNS para

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cada etapa (E1, E2 y E3), tomando para ello los 4 5 datos obtenidos en la fase estacionaria (a partir de los 4 5 ltimos perfiles) de cada una de ellas. CSI = Zi x S2-tot,i

(6)

donde Zi es el espesor al que corresponde cada medida puntual de sulfuro total, es decir, 0,1 mm.

A partir de estos clculos se pudo estimar el porcentaje de disminucin, D (comparando los promedios obtenidos entre E1 y E2), y de recuperacin, R (entre E2 y E3, respecto a E1) tanto de CSI como de TNS (Fig. 2, izquierda) (ecs. 7-10).

DCSI = (CSIE1 - CSIE2) x 100 / CSIE1 DTNS = (TNSE1 - TNSE2) x 100 / TNSE1 RCSI = (CSIE3 - CSIE2) x 100 / CSIE1 RTNS = (TNSE3 - TNSE2) x 100 / TNSE1

(7) (8) (9) (10)

2.5. Cintica de la eliminacin de sulfuro. Dado que la dependencia de DCSI y DTNS respecto a [NO3-] sigui una cintica de Michaelis-Menten, se estimaron los parmetros Dmax (o porcentaje de disminucin mximo que se consigue cuando la enzima est saturada por una infinita concentracin de sustrato) y la constante de Michaelis, Ks, que equivale a la [NO3-] a la cual D es la mitad de Dmax. Para ello se utiliz un mtodo iterativo mediante el programa Kaleida Graph versin 4.3, para Windows.

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Figura 2. Esquema-resumen de los pasos seguidos en el estudio de la eficacia del nitrato sobre la eliminacin de sulfuro y la reversibilidad del proceso.

Figura 2-cont. Esquema-resumen de los pasos seguidos en el estudio de la eficacia del nitrato sobre la eliminacin de sulfuro y la reversibilidad del proceso (ver texto).

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2.6. Velocidad de oxidacin de sulfuro.

A partir de las series temporales anteriores se calcul la velocidad de disminucin de CSI (Fig. 2, derecha), estimndola como el valor de la pendiente de la recta de regresin lineal de CSI respecto al tiempo durante E2. Esta velocidad de disminucin de CSI tras la adicin de nitrato podra considerarse equivalente a la tasa de oxidacin de H2S (Vox,CSI, en mmol m-2 h-1). La velocidad de reaccin depende de varios factores ambientales (temperatura, pH, biomasa activa de microorganismos, concentracin de reactivos, etc.). Asumiendo que salvo las concentraciones de H2S (o CSI) (que a su vez es funcin de la biomasa activa de microorganismos) y NO3-, todas las dems variables relevantes permanecieron constantes durante la realizacin de los experimentos, podemos simplificar que Vox-CSI = f (CSI, NO3-), as como la velocidad de recuperacin de la produccin de sulfuro, una vez cesada la exposicin: Vr-CSI = f (CSI, NO3-). De este modo se asumi que la oxidacin de H2S mediada por nitrato es una reaccin bisustrato, que requiere la presencia de un donador de electrones (H2S) y un aceptor terminal de electrones (NO3-) (ec. 11) y cuya velocidad viene dada por la ec. 12. (Hvitved-Jacobsen, 2002). H2S + NO3- So + NO2-

(11)

Vox = Vox,max(CSI-NO3) x CSI x NO3- /(Ks-ox-CSI + CSI) x (Ks-ox-NO3 + NO3-) respectivamente.

(12)

donde Ks-ox-CSI y Ks-ox-NO3 son las constantes de semisaturacin de CSI y NO3-,

2.7. Variables de la fase acuosa.

Se tomaron muestras del agua de entrada a la cmara de flujo (in) y del agua de salida de (out) al final de cada etapa, determinndose el sulfuro disuelto (H2Saq), sulfato, sulfito, amonio, nitrito, nitrato, DQO (como estimacin de la cantidad de materia orgnica, Pomeroy, 1990; Nielsen et al., 1998), pH y Eh, siguiendo mtodos estandarizados (APHA-AWWA-WPFC, 1992). El NH4+ se determin utilizando el mtodo de azul de indofenol (Koroleff, 1969). En este caso, como las muestras de agua

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presentaban un bajo contenido en slidos disueltos, los anlisis se realizaron sobre muestras de agua sin filtrar.

A partir de las concentraciones obtenidas de las distintas variables en la entrada de la cmara de flujo (in) y a la salida de la misma (out), se calcul el balance de masas como la diferencia: [variable] = [variable]out - [variable]in. Teniendo en cuenta que al final de cada etapa se retir una superficie de biopelcula de 35 cm2 destinada al anlisis elemental de C, N y S, los anlisis realizados en la fase acuosa se normalizaron con respecto a la superficie de biopelcula presente en cada etapa. A partir de H2Saq obtenido en cada etapa, se estimaron eficiencias de disminucin y de recuperacin de H2Saq (DH2S,aq y RH2S,aq, respectivamente, en %), de forma anloga a lo realizado anteriormente con CSI y TNS (ecs. 13 y 14).

DH2S,aq = (H2Saq,E1 - H2Saq,E2) x 100 / H2Saq,E1 RH2S,aq = (H2Saq,E3 - H2Saq,E2) x 100 / H2Saq,E1

(13) (14)

2.8. Cuantificacin de la oxidacin qumica del sulfuro con nitrato.

Teniendo en cuenta que los experimentos tienen como objetivo cuantificar la eliminacin biolgica de sulfuro tras la adicin de nitrato, se evalu la posibilidad de que el nitrato participara en la oxidacin qumica del sulfuro. Para ello, se incub una disolucin de agua destilada tamponada con fosfato (0,1 M) en un recipiente de vidrio oscurecido de 500 mL, evitando as la fotooxidacin del H2S y la difusin de oxgeno que ocurre a travs de las paredes de recipientes plsticos (JM Gonzlez, com. pers). Esta disolucin se burbuje con N2 durante 10 minutos para eliminar todo el oxgeno disuelto y entonces se aadi sulfuro hasta una concentracin final de entre 0,3-0,5 mM H2S, preparado a partir de Na2S9H2O. Una vez aadido el sulfuro, se midi la concentracin de H2S mediante un microelectrodo de H2S, tomando un dato cada minuto. A los 30 minutos se aadi nitrato hasta una concentracin final de 2,5 mM NO3-, a partir de una disolucin madre que tambin fue previamente burbujeada con N2 para el mismo fin y se observ la evolucin del H2S durante 10 horas. El experimento se

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realiz con dos pH distintos, ajustados a partir de soluciones de HCl 1M y NaOH 1M: (a) un pH = 3,5, que mantiene el equilibrio H2S-HS--S2- totalmente desplazado hacia el H2S (que es lo que realmente mide el microelectrodo); y (b) un pH = 7,5, similar al utilizado en los experimentos. El pH se midi al principio y al final del experimento.

3. RESULTADOS.

3.1. Caracterizacin general de las biopelculas.

Las biopelculas utilizadas cubran las probetas de acero inoxidable de una manera homognea, presentando espesores de 2-2,5 mm. Las biopelculas mostraron un color gris oscuro superficial en el momento de su recogida in situ, con una capa de color negro en contacto directo con la superficie del metal. Estas caractersticas se mantuvieron durante los experimentos en el laboratorio. Los valores de agua y materia orgnica en las diferentes biopelculas utilizadas fueron del orden de 80-85% de agua y 57-72% de materia orgnica (referido a peso seco) (Tabla 1).

Tabla 1. Contenido en agua y materia orgnica (referido a peso seco) de las diferentes biopelculas utilizadas para cada concentracin de nitrato. Los valores medios se han obtenido a partir de una muestra por cada etapa (n = 3), excepto para la biopelcula correspondiente a la concentracin de 0,25 mM, que se obtuvo como media de las dos primeras etapas. Biopelcula Conc. de nitrato utilizada (mM) 0 0,05 0,25 0,5 1 3,65 % Agua (media SD) 80,1 2,2 80,5 4,2 82,9 4,3 83,1 0,4 82,6 1,7 84,6 3,3 % Materia orgnica (media SD) 61,0 4,3 57,5 1,1 65,6 10,9 58,2 2,3 66,6 1,2 71,8 3,0

El anlisis elemental de Corg y Cinorg realizado al final de cada etapa estuvo en concordancia con los elevados valores de materia orgnica anteriormente obtenidos y revel que la mayor parte del contenido de C corresponda a su fraccin orgnica,

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representando un porcentaje medio respecto al Ctot (Ctot = Corg + Cinorg) de 83,7 8,7%, n = 36. El contenido total de nitrgeno (Ntot) y azufre (Stot) present valores medios (respecto al peso de la muestra) de 3,1 1,1%, n = 36 y 0,6 0,2, n = 36, respectivamente (datos no mostrados). No se apreciaron diferencias significativas en los contenidos de Corg, Ntot y Stot entre las distintas concentraciones de nitrato ensayadas, ni entre las distintas etapas (datos no mostrados).

3.2. Microperfiles de O2, pH y H2S. Los microperfiles de O2 revelaron la existencia de condiciones microaeroflicas en las biopelculas. El oxgeno se agot en las primeras 0-200 m superficiales de las biopelculas, creando por debajo condiciones idneas para la sulfatorreduccin. Por este motivo, los perfiles de H2S se reservaron para el clculo de los parmetros CSI y TNS, en el primer milmetro por debajo de su superficie. Los experimentos realizados con diferentes concentraciones de nitrato revelaron una gran variabilidad en las cantidad de sulfuro producida, con concentraciones mximas desde 50-700 M S2-tot (en las biopelculas utilizadas para el ensayo control y para aqullas incubadas con 0,05 mM y 0,25 mM NO3-), hasta mximos de 3000-10000 M S2-tot en las biopelculas incubadas con 0,5 y 3,65 mM NO3- (Figs. 3 y 4). Los valores mximos de sulfuro se dieron cerca de la superficie de la probeta, lo que normalmente llevaba asociado un ligero descenso del pH (Fig. 3). No obstante, el pH se mantuvo en valores prximos a la neutralidad (77,5) en casi todos los perfiles y biopelculas analizadas, a excepcin de las incubaciones realizadas con 3,65 mM NO3-, en las que la adicin de nitrato provoc un incremento del pH en el interior de la biopelcula de hasta 8,5 (Fig. 3). Las concentraciones de S2-tot se modificaron drsticamente con la adicin de nitrato. Como puede observarse en los ejemplos de la figura 4, el nitrato provoc la casi completa eliminacin del sulfuro en el interior de las biopelculas (Figs. 3e, h), hecho que no fue observado en las biopelculas incubadas sin nitrato (control) (Fig. 3b). En las biopelculas que haban estado expuestas a nitrato, la posterior incubacin sin nitrato durante E3, mostr una recuperacin de las concentraciones de S2-tot en el interior de las biopelculas, superndose en algunos casos los valores iniciales (Figs. 3f, i).

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Figura 3. Ejemplos de microperfiles de O2 (crculos blancos), S2-tot (crculos negros) y pH (crculos grises) medidos en las biopelculas incubadas con 0, 1 y 3,65 mM NO3-. Se presentan separadamente los obtenidos durante las 3 etapas de cada incubacin. Cada perfil representa la media de los ltimos 3 perfiles de cada etapa (condiciones de estado estacionario). Las barras de error corresponden a la desviacin estndar. La lnea disontnua horizontal que aparece en todos los perfiles indica la superficie de la biopelcula. Ntese que las escalas de O2 y S2-tot no son las mismas entre las distintas concentraciones de nitrato.

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Las series temporales de microperfiles de S2-tot muestran que la disminucin de S2-tot que se dej notar transcurridas normalmente entre 2-3 horas desde el momento de la adicin (Fig. 4).

Figura 4. Evolucin del sulfuro total (S2-tot) en el interior de la biopelcula durante las distintas etapas del experimento y con las distintas concentraciones de nitrato aadida, obtenido a partir de microperfiles de H2S realizados a lo largo de las 3 etapas: incubacin previa (E1); adicin de nitrato (flecha negra) (E2); incubacin sin nitrato (flecha gris) (E3).

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3.3. Porcentajes de disminucin y recuperacin de CSI y TNS en la biopelcula.

Las figuras 5 y 6 representan los valores medios de CSI y TNS (respectivamente) correspondientes al estado estacionario de las diferentes etapas de cada incubacin. En cualquier caso, se observ una relacin estadsticamente significativa entre CSI y TNS (R2 = 0,5163, P < 0,01, n = 271). Ambos parmetros mostraron una alta variabilidad entre las biopelculas utilizadas para las respectivas incubaciones con nitrato, con valores medios de CSI en E1 = 0,03-3,9 mmol S2-tot m-2 y TNS = 0,04-5,699 mmol m-2 h1

, respectivamente. La adicin de nitrato a cualquier concentracin provoc una

disminucin significativa (P 0,02) de ambos parmetros (Figs. 5 y 6), con porcentajes de disminucin (DCSI) crecientes con la dosis de nitrato, alcanzndose valores del 97% a partir de 0,5 mM NO3- (Fig. 8). En el ensayo control no se apreciaron en general cambios significativos de CSI o TNS entre etapas (salvo entre E1 y E3). Asimismo, los resultados pusieron de manifiesto la recuperacin de ambos parmetros una vez que ces la exposicin al nitrato (E3 respecto a E2), demostrando as la reversibilidad del proceso y la ausencia de inhibicin permanente de la produccin de sulfuro en las biopelculas tras la exposicin a nitrato. Esta recuperacin fue tambin bastante rpida (2-10 horas).

La dependencia de los datos de DCSI y DTNS frente a la concentracin de nitrato aadida se ajust a una michaeliana (Fig. 7). El clculo de los parmetros cinticos del ajuste mostr valores de Dmax = 98% y 95% para CSI y TNS, respectivamente y Ksd = 21 y 17 M NO3- para CSI y TNS, respectivamente. Por su parte, los porcentajes de recuperacin de ambas variables (RCSI y RTNS) tambin mostraron una tendencia creciente con la concentracin, ajustndose en menor medida a una cintica de tipo Michaelis-Menten (Rmax = 197% y 123% para CSI y TNS, respectivamente y Ksr = 0,53 y 0,75 mM NO3- para CSI y TNS, respectivamente).

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Figura 5. Concentracin de sulfuro integrada en profundidad (CSI) a lo largo del primer milmetro en el interior de la biopelcula, obtenida a partir de microperfiles de H2S medidos en cada una de las etapas (E1, E2 y E3) y con las diferentes concentraciones de nitrato ensayadas. Cada barra representa la media ( desviacin estndar) de n = 5 perfiles tomados al final de cada etapa, cuando los perfiles de sulfuro se estaban en estado estacionario. Los datos correspondientes a la E3 de la incubacin con 0,25 mM NO3- no se midieron debido a la rotura del microelectrodo.

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Figura 6. Tasa neta de sulfatorreduccin (TNS) en el interior de la biopelcula, obtenida a partir de microperfiles de H2S en cada una de las etapas (E1, E2 y E3) y con las diferentes concentraciones de nitrato ensayadas. Cada barra representa la media ( desviacin estndar) de n = 5 perfiles tomados al final de cada etapa, cuando los perfiles de sulfuro se mostraban estables (estado estacionario). Los datos correspondientes a la E3 de la incubacin con 0,25 mM NO3- no se midieron debido a la rotura del microelectrodo.

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Figura 7. Porcentajes de disminucin de CSI y TNS (DCSI, DTNS) (a, b) y de recuperacin de ambos parmetros (RCSI, RTNS) (c, d) respecto a la concentracin de nitrato aadida. Se incluye la curva de ajuste a una ecuacin de Michaelis-Menten (lnea gris) obtenida mediante mtodo iterativo, a partir de la cual se calcularon los parmetros cinticos Dmax, Ks,d, Rmax, Ks,r.

3.4. Velocidades de disminucin y recuperacin de CSI en la biopelcula.

Las pendientes calculadas a partir del ajuste lineal de CSI respecto al tiempo sirvieron para estimar las velocidades de eliminacin y de recuperacin de sulfuro (datos no mostrados), obtenindose los parmetros Vox,CSI y Vr,CSI. Se observ una variabilidad muy marcada tanto en Vox,CSI como Vr,CSI, con intervalos de variacin entre 0,049-1,095 y 0,014-4,68 mmol S2-tot m-2 h-1, respectivamente (Tabla 2). En primer lugar se estudi la dependencia de Vox,CSI respecto a CSI y [NO3-] por separado. El ajuste a una cintica michaeliana revel valores de Ks bastante bajos (Ks-oxCSI

= 0,86 mmol m-2 y Ks-ox-NO3 = 0,024 mM), que sugieren una alta afinidad de la

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comunidad microbiana por ambos sustratos (Fig. 8a y b). Respecto a Vr,CSI, tambin se apreci cierta correlacin con CSI y [NO3-], aunque se aproxim ms a una relacin lineal, que fue significativa slo entre Vr,CSI y [NO3-] (R2 = 0,9401, P = 0,006) (Fig. 8c,d).

Tabla 2. Valores de Vox,CSI y Vr,CSI obtenidos a partir de las pendientes (valores absolutos) de CSI vs tiempo durante E2 y durante E3. Cada concentracin de nitrato corresponde a una biopelcula distinta. nm: no medido. [NO3-] (mM) 0 0,05 0,25 0,5 1 3,65

(mmol S2-tot m-2)

CSIE1
0,03 0,25 0,09 3,03 0,65 3,88

(mmol S2-tot m-2 h-1)

Vox,CSI
0,008 0,049 0,049 1,095 0,624 0,659

(mmol S2-tot m-2 h-1)

Vr,CSI

0,012 0,014 Nm 0,781 0,223 4,676

Figura 8. Relacin de Vox,CSI y Vr,CSI con respecto a la concentracin de sulfuro integrada en el estado estacionario de E1 (CSIE1) y con respecto a la concentracin de nitrato aadida. En las grficas a y b se ha realizado un ajuste a una ecuacin de MichaelisMenten, mientras que en c y d se realiz un ajuste lineal.

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El ajuste de Vox,CSI a una cintica de doble sustrato se muestra en la figura 9. En esta grfica se representan las curvas de Vox,CSI frente a CSI, para los distintos valores fijos de [NO3-] utilizados en las incubaciones, de acuerdo al modelo terico (lneas de colores). Aunque los datos experimentales (Vox,exp, que aparecen como crculos negros en la fig. 9) son escasos, parecen presentar una correlacin moderadamente fuerte con los valores del modelo (R2 = 0,80).

Figura 9. Relacin entre la velocidad de oxidacin y la concentracin de sulfuro integrada (CSI), para distintas concentraciones fijas de nitrato, estimadas para una cintica de doble sustrato, utilizando como parmetros Ks,CSI = 0,85 mmol m-2; Ks,NO3 = 0,02 mM y Vmax = 1 mmol m-2 h-1. Los datos experimentales (Vox,exp) aparecen como crculos negros.

3.5. Balance de masas en la fase acuosa. Eficiencias de eliminacin de sulfuro.

El anlisis de nutrientes realizado en muestras tomadas a la entrada y la salida de la cmara de flujo permiti realizar un balance de masas y estimar el metabolismo neto de la biopelcula. El balance especfico de H2Saq demostr que la biopelcula actu como un productor neto de sulfuro en ausencia de nitrato aadido (E1 y E3), con balances netos positivos de 0,5-6 M H2Saq cm-2 (Fig. 10a). Durante E2, se observ una clara disminucin de este balance, con valores prximos a cero, dado lugar a eficiencias medias de eliminacin (DH2S,aq) y recuperacin de sulfuro disuelto (RH2S,aq) de 94,7% y 50%, respectivamente.

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Figura 10. Balance de masas especfico (referido a la superficie de biopelcula presente en cada etapa - cm-2) de las diferentes propiedades de la fase acuosa a travs de la cmara de flujo (salida entrada) durante las distintas etapas. Cada barra representa el balance medio SD de n = 2 muestras para las diferentes concentraciones de nitrato ensayadas. variable = ([variable]out - [variable]in) cm-2. Todas las unidades vienen dadas en M cm-2 salvo para el potencial redox, mV (cm2 biopelcula)-1 y la DQO, mg O2 L-1 cm-2.

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Por otro lado, el sulfato no experiment variaciones significativas entre la entrada y salida, ni tampoco respecto a las diferentes concentraciones de nitrato aadida en las distintas etapas, si bien en promedio se detect un leve consumo neto durante la adicin de nitrato (Fig. 10b). El balance de DQO no sufri cambios significativos en ninguna de las etapas o concentraciones probadas (Fig. 10c). El balance especfico de potencial redox mostr valores negativos incluso durante la adicin de nitrato de hasta -5 mV cm2

, lo que demuestra el papel reductor de la biopelcula, registrndose un descenso

significativo (P = 0,005) en E3 (Fig. 10d). En cuanto a los compuestos de nitrgeno, se observ un consumo neto (P = 0,0582) de nitrato durante E2 (NO3- entre 0 y -1 M cm2

, Fig. 10e), asociado a un incremento neto de nitrito de menor magnitud (NO3- entre 0

y 0,2 M cm-2), especialmente patente durante la adicin de las concentraciones mayores de nitrato (1 y 3,65 mM) (Fig. 10f). El amonio experiment un descenso significativo (P = 0,0252) durante la adicin de nitrato (E2) a cualquier concentracin (Fig. 10g).

3.6. Cuantificacin de la oxidacin qumica del sulfuro con nitrato.

El experimento realizado para evaluar la posibilidad de oxidacin qumica del sulfuro con nitrato demostr que el nitrato no provoc oxidacin de sulfuro, a ninguno de los pH probados (Fig. 11), a lo largo de 10 h. Se observ una mayor constancia en los valores de H2S medidos a pH = 3,5, al que el equilibrio de disociacin del sulfuro se encuentra completamente desplazado hacia el H2S, que es la sustancia que realmente detecta el microelectrodo. A pH = 7,5, similar al utilizado durante los experimentos y habitual en el agua residual de la EDAR-Guadalete, el H2S muestra una disminucin muy tenue despus de varias horas, por lo que demuestra la estabilidad de las medidas realizadas en perfiles en los que los tiempos de medida a cada profundidad de la biopelcula no superan un segundo.

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Figura 11. Evolucin de la concentracin de H2S en medio tamponado (0,1 M fosfato; 20C) tras la adicin de nitrato a una concentracin final de 2,5 mM NO3-, a dos valores de pH distintos (3,5 y 7,5). La flecha negra indica el momento de la adicin de nitrato.

4. DISCUSIN.

4.1. Caractersticas de las biopelculas.

Las biopelculas procesadas estaban constituidas por comunidades netamente productoras de sulfuro. La presencia de condiciones microaeroflicas en el experimento se debi a la estrecha lmina de agua en contacto con la biopelcula, lo que motiv a su vez que apenas se observara sulfuro en la superficie de la biopelcula (Khl y Jrgensen, 1992; Jrgensen et al., 1983). Por este motivo, no fue viable la estimacin precisa de las tasas de exportacin de sulfuro al agua sobrenadante. En cualquier caso, se evit cualquier fuente de oxigenacin adicional en los experimentos, ya que el oxgeno resulta termodinmicamente ms favorable que el nitrato como aceptor terminal de electrones (Madigan et al., 1997). A pesar de las condiciones microaeroflicas en la superficie de la biopelcula, los microgradientes de oxgeno revelaron un agotamiento del mismo en las primeras 0-200 micras dentro de la biopelcula, permitiendo una intensa actividad sulfatorreductora muy cerca de su superficie, y la existencia de condiciones adecuadas para estudiar el efecto del nitrato sobre la eliminacin de sulfuro. Por otro lado, el color gris oscuro que mostraron las biopelculas tanto in situ como durante los experimentos es indicativo de condiciones anaerobias y precipitacin de sulfuros metlicos (Nielsen et al., 2005).

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A pesar de haber sido recogidas en el mismo punto de la EDAR-Guadalete, las biopelculas mostraron tasas de sulfatorreduccin y concentraciones de sulfuro en su interior altamente variables, incluso a pesar de presentar un espesor similar. Esto pudo estar motivado por diferencias en el nmero y actividad de las bacterias sulfatorreductoras, asociados a posibles cambios en las condiciones operativas de la planta durante el transcurso de los experimentos (aproximadamente un mes).

El contenido de agua y materia orgnica medido en las biopelculas sugiere que se trabaj con comunidades maduras. Los valores de agua (80%) fueron sensiblemente inferiores a aqullos documentados en biopelculas jvenes ( 90%). Este hecho responde seguramente a un enriquecimiento de material inorgnico que se va adheriendo progresivamente a los abundantes exopolisacridos que, junto con las clulas microbianas, constituyen las biopelculas (Schaule et al., 2000).

4.2. Efecto del nitrato sobre la concentracin de sulfuro y la tasa neta de sulfatorreduccin.

Los resultados de DCSI y DTNS revelaron una elevada efectividad del nitrato para disminuir las concentraciones de sulfuro en biopelculas de aguas residuales. La eficiencia del proceso, estimada como porcentaje de disminucin DCSI y DTNS se correlacion con la concentracin de nitrato aadida, alcanzndose parmetros cinticos de Dmax muy similares (98% y 95% para CSI y TNS, respectivamente). Por su parte, los valores obtenidos de Ks (21 y 17 y M NO3-, para CSI y TNS, respectivamente) demuestran una alta afinidad por el nitrato por parte de la comunidad microbiana de las biopelculas. Esto indica que el uso de mayores concentraciones de nitrato no redundara en una mayor eficiencia del proceso pero s en un incremento innecesario de los costes del tratamiento.

El proceso de eliminacin del sulfuro en las biopelculas estudiadas ha demostrado ser un proceso reversible, recuperndose valores de CSI o de TNS durante E3 parecidos a los de E1. El nitrato, por tanto, no inhibi de forma permanente la produccin de sulfuro

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en biopelculas de aguas residuales, contrariamente a lo que apuntaban estudios ms antiguos que utilizaban concentraciones muy altas de nitrato (Allen, 1949; Jenneman et al., 1986a), o bien en ensayos de laboratorio con salmueras y bacterias aisladas de pozos de petrleo (Reinsel et al., 1996, Nemati et al., 2001c). Aunque no se determin la biomasa de clulas en las biopelculas, es improbable que este resultado responda al aumento significativo del nmero de clulas, ya que los valores de Corg y Ntot a lo largo de las incubaciones y sus respectivas etapas no mostraron variaciones significativas entre las distintas etapas. Tampoco se observ un incremento significativo de estos parmetros en la incubacin control. Esto estara en concordancia con McComas et al. (2001), quienes no apreciaron incrementos significativos de la biomasa celular en cultivos mixtos de bacterias desnitrificantes procedentes de pozos de petrleo durante las primeras 200 h de incubacin, por lo que incubaciones de menor duracin como las realizadas en este estudio (8-20 h) no deberan haber tenido una gran influencia en el nmero de clulas.

Es interesante resaltar que la velocidad de eliminacin de sulfuro (estimada a partir de Vox,CSI) fue en general bastante rpida (entre 0,05 y 1,09 mmol m-2 h-1). Se encontr una dependencia moderadamente fuerte de Vox,CSI con CSI y [NO3-], tanto por separado, (ajustndose de manera aproximada a michaeliana) como conjuntamente utilizando una cintica de doble sustrato. Aunque los datos experimentales son escasos, este resultado sugiere que el tiempo que tarda el nitrato en eliminar el sulfuro depende tanto del nitrato aadido como de la biomasa activa de los microorganismos responsables del proceso (bacterias nitratorreductoras, sulfurooxidadoras, BNR-SO, como se ver ms adelante). Sin embargo, esta velocidad tambin podra depender del tiempo de adaptacin requerido por BNR-SO a las nuevas condiciones creadas por la adicin de nitrato, as como del tiempo que tardan las BSR en sintetizar enzimas nitritorreductasas para evitar su inhibin por nitrito (Greene et al., 2003; Haveman et al., 2004, 2005). Por su parte, la velocidad de recuperacin de la produccin de sulfuro (estimado como Vr,CSI) tambin mostr cierta dependencia de CSI y [NO3-]. No obstante, los datos de Vox,CSI y Vr,CSI deben ser tomados con cautela, ya que la variabilidad encontrada en la concentracin de sulfuro entre las distintas biopelculas, que a su vez se incubaron con diferentes concentraciones de nitrato, no permite sacar conclusiones slidas a este respecto,

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requirindose un mayor nmero de ensayos. En cualquier caso, dada la afinidad que las biopelculas de aguas residuales ensayadas han demostrado por el nitrato, se recomienda realizar ensayos adicionales en un intervalo de concentraciones bajas de nitrato (entre 01 mM NO3-) que, por otro lado, sera beneficioso para disminuir los costes del tratamiento.

El balance de masas realizado en el agua sobrenadante a su paso por la biopelcula confirma la efectividad del nitrato para eliminar sulfuro y permite vislumbrar la influencia de actividad metablica de la biopelcula sobre las caractersticas del agua, a pesar del corto tiempo hidrulico de retencin utilizado. La biopelcula present una intensa actividad reductora, como demostr el descenso especfico de potencial redox, tanto en presencia como en ausencia de nitrato aadido. Por otro lado, la eliminacin del sulfuro provoc una desnitrificacin del nitrato hacia nitrito, que se hizo especialmente evidente con las concentraciones de nitrato ms elevadas (1 y 3,65 mM NO3-). Sin embargo, no parece que la produccin de nitrito inhibiera la sulfatorreduccin, como han sugerido varios trabajos con bacterias aisladas de pozos de petrleo (Reinsel et al., 1996, Nemati et al., 2001c; Greene et al., 2003), ya que no se produjeron cambios significativos en el balance de sulfato entre etapas. Por otro lado, si se hubiera producido una inhibicin (transitoria o total) de las bacterias sulfatorreductoras no se hubiera observado la rpida recuperacin de CSI y TNS.

4.3. Naturaleza del proceso estudiado.

Las bajas concentraciones de sulfuro en la parte ms superficial de la biopelcula parecen responder a un proceso mediado por actividad microbiana. Por un lado, el uso del oxgeno como aceptor terminal de electrones en las cadenas respiratorias resulta termodinmicamente favorable frente a otras sustancias para la degradacin de la materia orgnica y, en su presencia, es utilizado preferentemente sobre otros aceptores. Este uso da lugar a un rpido agotamiento de oxgeno en las primeras micras de las biopelculas, tal y como se comprob durante los microperfiles de oxgeno. Por otro lado, la oxidacin biolgica del H2S es mucho ms eficiente que el proceso puramente qumico. La vida media del H2S durante una oxidacin puramente qumica con oxgeno

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en agua a temperatura ambiente suele durar entre 30 minutos y varias horas (Millero, 1986; Millero y Hershey, 1989; Eary y Schramke, 1990). Incluso aunque la reaccin qumica fuera acelerada con catalizadores, la vida media del H2S no baja del orden de minutos (Chen y Morris, 1972).

En el interior de la biopelcula (y en ausencia de adicin de nitrato) se detectaron elevadas concentraciones de H2S y tasas netas de sulfatorreduccin. La adicin de nitrato en concentraciones de 0,05-3,65 mM disminuy en un corto intervalo de tiempo tanto CSI como TNS. Sin embargo, caba asegurarse -al igual que se ha comentado para el oxgeno-, que el nitrato no estuviera provocando la oxidacin qumica del H2S. Por este motivo se realizaron los ensayos de incubaciones de H2S con NO3- durante varias horas. Las incubaciones realizadas revelaron que la oxidacin qumica de H2S con nitrato debe ser muy lenta (como ocurre con el oxgeno). Considerando por tanto que la disminucin de H2S obtenida con las distintas concentraciones de NO3- ensayadas ocurri en el plazo de 1,5-3 h, la oxidacin de H2S con NO3- estaba claramente mediada por microorganismos. En particular, se sugiere la actividad de BNR-SO, ya que el oxgeno resulta inhibitorio para la actividad nitrato-reductasa desasimilatoria (Kuenen et al., 1982). Nuestros datos estaran en concordancia con los anlisis de la comunidad microbiana realizada en biopelculas crecidas en la EDAR sobre aceros similares (Garca-de-Lomas et al., 2007). En particular, estos autores encontraron que el nitrato estimulaba a Thiomicrospira denitrificans, una Epsilon-Proteobacteria (recientemente reclasificada como Sulfurimonas denitrificans por Takai et al., 2006) capaz de oxidar anaerbicamente H2S con NO3-.

4.4. Aproximacin a la estequiometra del proceso.

Los balances de masa en el agua sobrenadante ofrecen una informacin algo limitada de la estequiometra del proceso teniendo en cuenta el corto THR utilizado. Sin embargo, junto con los datos obtenidos en el interior de la biopelcula, pueden arrojar algo de luz sobre la estequiometra del proceso. De este modo, la disminucin de TNS observada durante E2 con las distintas incubaciones con nitrato debera llevar asociada un incremento del balance de SO42-, debido a un cese de la conversin de SO42- a H2S, en

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concordancia con el incremento del balance de NO2-, que podra resultar inhibitoria para las BSR (Greene et al., Haveman et al., 2004, 2005). Sin embargo, la ausencia de cambios significativos en el balance de SO42- respecto a las otras dos etapas (a excepcin de la incubacin con 3,65 mM NO3-) sugiere que la sulfatorreduccin debi continuar en el interior de las biopelculas, muy cerca de la superficie del metal donde las medidas con microelectrodos no llegaron. Este resultado estara en concordancia con otros autores (Okabe et al., 2003; Ito et al., 2002) que hallaron que la adicin de nitrato no ces la sulfatorreduccin, sino que provoc un descenso de la zona de sulfatorreduccin hacia el fondo de la biopelcula, haciendo desaparecer el pequeo solapamiento habitual entre el oxgeno y el sulfuro. Por otro lado, la ausencia de cambios significativos en el balance de SO42- durante las incubaciones sugiere que el oxgeno, presente en bajas concentraciones en la superficie de la biopelcula, pudo participar en la reoxidacin completa del sulfuro a sulfato. Excepcionalmente, la adicin de 3,65 mM NO3- provoc un descenso significativo de [SO42-], que apunta a una oxidacin parcial de sulfuro a So, de acuerdo a una alta proporcin sulfuro/nitrato (Gadekar et al., 2006). Este So se acumulara en la biopelcula. Numerosos estudios avalan la produccin de So como producto de la oxidacin biolgica de H2S, sugirindose distintas ecuaciones posibles (e.g., Nemati et al., 2001b; Reyes-vila et al., 2004; Gadekar et al., 2006).

La acumulacin de nitrito, que se hizo especialmente evidente durante el tratamiento con 1 y 3,65 mM NO3-, sugiere por su parte que la oxidacin de sulfuro va acompaada fundamentalmente de la desnitrificacin parcial de nitrato a nitrito. Esta acumulacin de nitrito no fue tan evidente durante incubaciones con concentraciones bajas de nitrato, lo que podra responder a su posible eliminacin por parte de BSR, para prevenir la inhibicin de las enzimas encargadas de la sulfatorreduccin (Greene et al., 2003; Haveman et al., 2005). La acumulacin de nitrito observada en la incubacin con 3,65 mM NO3-, junto con la disminucin de la cantidad de sulfuro, pueden explicar el incremento del pH observado en el interior de la biopelcula (vase Fig. 4h). El descenso significativo de [NH4+] durante la adicin de nitrato en todas las concentraciones ensayadas apunta hacia una posible oxidacin anaerobia de amonio

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(Anammox) con nitrato, en la que el amonio actuara como donador de electrones y el nitrato como aceptor terminal (e.g. Strous et al., 1997). Esta ruta metablica, utilizada en reactores de lecho fluidizado fue responsable de porcentajes de retirada del 99,5% de nitrito aadido y del 84,6% del amonio presente en el agua residual (Jetten et al. 1999). En cualquier caso, la desnitrificacin observada resultara un beneficio aadido para el tratamiento de aguas residuales, lo que recomienda su investigacin con mayor profundidad. La figura 12 resume los posibles procesos implicados en la biopelcula de acuerdo a esta discusin y da una primera idea de los consorcios metablicos que podran establecerse entre BSR y BNR-SO durante la adicin de nitrato.

Figura 12. Aproximacin a los procesos metablicos implicados en la biopelcula sin adicin de nitrato (a) y durante la adicin de nitrato (b). Se sealan los posibles grupos microbianos implicados: bacterias sulfatorreductoras (BSR) y bacterias nitratorreductoras, sulfurooxidadoras (BNR-SO).

El uso de diferentes concentraciones de NO3- y la presencia de concentraciones de sulfuro altamente variables entre las diferentes biopelculas tambin podra implicar una estequiometra ligeramente diferente dependiendo de la concentracin de nitrato aadida. Recientemente, se demostr que la conversin de H2S a SO42- a So durante la

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oxidacin biolgica mediada por Thiomicrospira sp. (cepa CVO) depende del cociente entre las concentraciones iniciales de H2S y de nitrato (H2S/NO3-) (Greene et al., 2003; Gadekar et al., 2006). De este modo, valores de H2S/NO3- suficientemente altos (1-1,5) estimulan la oxidacin parcial de H2S a So, mientras que valores del cociente ms bajos (0,3-0,6) favorecen la oxidacin del So previamente producido a SO42- (Gadekar et al., 2006). Si realizamos con nuestros datos un anlisis similar (H2S/NO3-), considerando el numerador como el promedio de las concentraciones mximas de sulfuro en el interior de la biopelcula frente a la [NO3-] inicial (Tabla 3), se observa que la mayora de los valores del cociente (excepto para 0,25 mM NO3-) tienen un valor suficientemente elevado como para estimular la oxidacin de H2S a So. De este modo, los resultados parecen aproximarse a una oxidacin parcial de sulfuro a azufre elemental y una desnitrificacin del nitrato a nitrito, tal y como sugiere Gadekar et al. (2006): HS- + NO3- + H+ So + NO2- + H2O.

Tabla 3. Clculo del cociente [H2S]/[NO3-] para cada una de las concentraciones de nitrato ensayadas y las diferentes biopelculas utilizadas. [S2-tot]biopelcula (mM)* 0,68 0,15 10,93 1,72 6,83 [NO3-]inicial (mM) 0,05 0,25 0,5 1 3,65 [S2-tot]/[NO3-] 13,60 0,60 21,86 1,72 1,87

* valores mximos medios (n = 5) en la fase estacionaria de la etapa 1.

5. CONCLUSIONES.

Este estudio ha demostrado que la adicin de nitrato sobre biopelculas tomadas en una EDAR disminuy de forma efectiva tanto la concentracin de sulfuro integrada como la tasa neta de sulfatorreduccin en el interior de la biopelcula. La eficiencia del proceso, estimada como porcentaje de disminucin de CSI y TNS demostr ser dependiente de la concentracin de nitrato aadido, mostrando una gran afinidad de la comunidad por el nitrato (Dmax = 98% y 95% para CSI y TNS, respectivamente y Ksd = 21 y 17 M NO3para CSI y TNS, respectivamente). La velocidad de disminucin de CSI y TNS mostr

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una relacin moderadamente fuerte tanto con CSI (que a su vez depende de la biomasa y actividad metablica de la bioplcula), como con la concentracin de nitrato aadida. La variabilidad en CSI y TNS entre las biopelculas ensayadas sugiere realizar medidas adicionales que investiguen la dependencia de la velocidad de oxidacin del sulfuro en funcin de la concentracin de sulfuro presente y la concentracin de nitrato. La adicin de nitrato no caus una inhibicin permanente de la produccin de sulfuro, encontrndose una recuperacin de CSI y TNS una vez que ces la exposicin al nitrato. Los resultados obtenidos sugieren que el nitrato induce la oxidacin biolgica de sulfuro, teniendo en cuenta que el nitrato no oxida qumicamente al sulfuro en las concentraciones y condiciones ensayadas. La estequiometra del proceso sugiere una oxidacin incompleta de sulfuro con nitrato a nitrito y azufre elemental. Estos resultados podran contribuir a un uso ms eficiente del nitrato en instalaciones de aguas residuales donde la acumulacin de sulfuro puede constituir un problema y demuestran la utilidad de los microelectrodos para estudiar la cintica del proceso con una elevada resolucin espacial.

Agradecimientos:

A los tcnicos y operarios de la EDAR-Guadalete, por su ayuda durante la recogida de las muestras y a mi mujer Piedad, por su continuo apoyo.

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