UNIVERSIDAD POLITCNICA DE VALENCIA

ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRNOMOS

DIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS NOCARDIOFORMES PRODUCTORES DE ESPUMAS BIOLGICAS AISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DE LA COMUNIDAD VALENCIANA

TRABAJO FINAL DE CARRERA

INGENIERO AGRNOMO

PRESENTADO POR: ALBERT SOLER HERNNDEZ DIRIGIDO POR: GONZALO CUESTA AMAT JOSE LUIS ALONSO MOLINA
VALENCIA, JULIO DE 2008

ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRNOMOS

Anexo 4 Autorizacin del director/a, codirector/a o tutor/a

Datos del trabajo de fin de carrera Autor: Albert Soler Hernndez DNI: 22584259-F

Ttulo: DIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS NOCARDIOFORMES PRODUCTORES DE ESPUMAS BIOLGICAS AISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DE LA COMUNIDAD VALENCIANA rea o reas de conocimiento a las que corresponde el trabajo: Microbiologa y Medio Ambiente Titulacin: Ingeniero Agrnomo A cumplimentar por el director/a, codirector/a o tutor/a del trabajo Nombre y apellidos: Gonzalo Cuesta Amat Departamento: Biotecnologa En calidad de: X director/a codirector/a tutor/a

Autorizo la presentacin del trabajo de fin de carrera cuyos datos figuran en el apartado anterior y certifico que se adecua plenamente a los requisitos formales, metodolgicos y de contenido exigidos a un trabajo de fin de carrera, de acuerdo con la normativa aplicable en la ETSIA.

(Firma)*

Gonzalo Cuesta Amat

Jose Luis Alonso Molina

Valencia,

21 de

Julio

de 2008

En el caso de codireccin, han de firmar necesariamente los que sean profesores de esta Escuela; si existe tutor o tutora, tiene que ser ste quien firme esta autorizacin.

DIRECCIN DE LA ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRNOMOS

ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRNOMOS

Anexo 5 Ficha resumen del Trabajo Fin de Carrera

Datos personales Nombre y apellidos: Albert Soler Hernndez Datos del trabajo de fin de carrera Ttulo del TFC: DIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS NOCARDIOFORMES PRODUCTORES DE ESPUMAS BIOLGICAS AISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES DE LA COMUNIDAD VALENCIANA Fecha de lectura: Septiembre 2008

Lugar de realizacin: ETSIA, Departamento de Biotecnologa Titulacin: Ingeniero Agrnomo Especialidad: Recursos Naturales y Medio Ambiente Director/a: Gonzalo Cuesta Amat Codirector/a: Jose Luis Alonso Molina

Resumen
La formacin de espumas de origen biolgico en la superficie de los reactores y de los clarificadores secundarios en las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDARs) es uno de los problemas de separacin de slidos ms importantes. Entre las bacterias responsables de estas espumas se encuentran los actinomicetos nocardioformes que contienen cidos miclicos (mycolata) que pertenecen al phylum Actinobacteria. Este grupo de microorganismos contiene especies filamentosas que causan problemas de formacin de espumas biolgicas (foaming) en plantas de tratamiento de aguas residuales con sistemas de fangos activos. Estas espumas interfieren en el proceso de depuracin de depuracin de aguas residuales, ya que retienen hasta el 40% de los slidos en suspensin. La presencia de especies patgenas en este grupo de microorganismos implica un riesgo para la salud pblica y, por lo tanto, la necesidad de detectar estas especies. En el presente trabajo se han investigado varias EDARs de la Comunidad Valenciana para identificar a nivel de especie las bacterias causantes de estas espumas biolgicas. Para ello se han utilizado cuatro tcnicas: caracterizacin morfolgica, caracterizacin quimiotaxonmica, caracterizacin genotpica y caracterizacin fenotpica. En la caracterizacin morfolgica se realiz un estudio micro y macroscpico de los asilados. Para caracterizar quimiotaxonmicamente los asilados se llevaron a cabo tres marcadores quimiotaxonmicos: extraccin de cidos miclicos, extraccin de los ismeros del cido diaminopimlico y extraccin de los azcares predominantes de la pared celular. En la caracterizacin genotpica se llev a cabo la extraccin del DNA de los aislados seleccionados y la amplificacin por PCR del 16S rDNA. Los productos de PCR se purificaron y se enviaron a secuenciar. Las secuencias se analizaron mediante los programas BLAST, CHROMAS y PHYDIT. Posteriormente se realizaron rboles filogenticos y matrices de similaridad. En la caracterizacin fenotpica se realizaron una serie de pruebas para completar los resultados obtenidos. Las pruebas se basaron en tests de tolerancia a diferentes temperaturas, tests de degradacin y tests en donde se haca crecer a los aislados con diferentes fuentes de carbono y/o nitrgeno. De los 25 aislados seleccionados el 48% pertenece al gnero Gordonia, el 36% al gnero Tsukamurella, el 8% al gnero Dietzia, el 4% al gnero Rhodococcus y el ltimo 4% al gnero Mycobacterium. Todas ellas presentaban cidos miclicos, forma meso-DAP y arabinosa y galactosa como azcares predominantes. Con ello demostramos que en las EDARs de la Comunidad Valenciana existe una amplia diversidad de especies formadoras de espumas biolgicas.

Palabras clave
Fangos activos, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium

Resum
La formaci de bromeres d'origen biolgic en la superfcie dels reactors i dels clarificadors secundaris en les estacions Depuradores d'Aiges Residuals (EDARs) s un dels problemes de separaci de slids ms importants. Entre els bacteris responsables d'estes bromeres es troben els actinomicets nocardioformes que contenen cids miclics (mycolata) que pertanyen al phylum Actinobacteria. Este grup de microorganismes cont espcies filamentoses que causen problemes de formaci de bromeres biolgiques (foaming) en plantes de tractament d'aiges residuals amb sistemes de fangs actius. Estes bromeres interferixen en el procs de depuraci de depuraci d'aiges residuals, ja que retenen fins al 40% dels slids en suspensi. La presncia d'espcies patgenes en este grup de microorganismes implica un risc per a la salut pblica i, per tant, la necessitat de detectar estes espcies. En el present treball s'han investigat diverses EDARs de la Comunitat Valenciana per a identificar a nivell d'espcie els bacteris causants d'estes bromeres biolgiques. Per a aix s'han utilitzat quatre tcniques: caracteritzaci morfolgica, caracteritzaci quimiotaxonmica, caracteritzaci genotpica i caracteritzaci fenotpica. En la caracteritzaci morfolgica es va realitzar un estudi micro i macroscpic dels allats. Per a caracteritzar quimiotaxonmicament els allats es van dur a terme tres marcadors quimiotaxonmics: extracci d'cids miclics, extracci dels ismers de l'cid diaminopimlic i extracci dels sucres predominants de la paret cellular. En la caracteritzaci genotpica es va dur a terme l'extracci del ADN dels allats seleccionats i l'amplificaci per PCR del 16S rDNA. Els productes de PCR es van purificar i es van enviar a seqenciar. Les seqncies es van analitzar per mitj dels programes BLAST, CHROMAS i PHYDIT. Posteriorment es van realitzar arbres filogentics i matrius de similaritat. En la caracteritzaci fenotpica es van realitzar una srie de proves per a completar els resultats obtinguts. Les proves es van basar en tests de tolerncia a diferents temperatures, tests de degradaci i tests on es feia crixer als allats amb diferents fonts de carboni i/o nitrogen. Dels 25 allats seleccionats el 48% pertany al gnere Gordonia, el 36% al gnere Tsukamurella, el 8% al gnere Dietzia, el 4% al gnere Rhodococcus i l'ltim 4% al gnere Mycobacterium. Tots ells presentaven cids miclics, forma meso-DAP i arabinosa i galactosa com a sucres predominants. Amb aix demostrem que en les EDARs de la Comunitat Valenciana hi ha una mplia diversitat d'espcies formadores de bromeres biolgiques.

Paraules clau
Fangs actius, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium

Abstract
The formation of thick viscous scums layers in activated sludge tanks and secondary clarifiers of wastewater treatment plants is one of the most important problems of solid separation. The most significant filamentous bacteria of foaming are nocardioform actinomycetes (mycolata), which belong to phylum Actinobacteria. That group of microorganisms has filamentous species that causes foaming in wastewater treatment plants. These foams interfere in that process because retain until 40% of suspension solids. The presence of pathogen species in that group is a danger to public health. In this study had been study a lot of wastewater treatment plants of the Comunidad Valenciana to identificate the species that causes foaming. We have been use four procedures: morphologic, chemotaxonomy, genotypic and phenotypic characterization. In the morphologic characterization we did a micro and macro study of the isolates. In the chemotaxonomy characterization we did micolic acids extraction, DAP extraction and Whole-cell sugar. In the genotypic characterization we did the DNA extraction and PCR amplification of the 16s rDNA. The sequences were analysed trough BLAST, CHROMAS and PHYDIT programs. Later we did the philogenetic trees and the similarity values. In the phenotypic characterization we did a lot of tests to complete the results (tolerance tests and degradation tests). 48% of isolates belongs to the Gordona genus, 36% belongs to the Tsukamurella genus, 8% belongs to the Dietzia genus, 4% to the Rhodococcus genus and the last 4% belongs to the Mycobacterium genus. All of these had micolic acids, meso-Dap form and galactose and arabinose. In conclusion, the results obtained show a great diversity of foaming filamentous bacteria in the EDARs of the Comunidad Valenciana with the activated sludge process.

Key words
Activated sludge, foaming, mycolata, BLAST, PCR, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Mycobacterium

NDICE
INTRODUCCIN 1.- Depuracin de aguas residuales 1.1.- Sistema de fangos activos 1.2.- El flculo 2.- Problemas en sistemas de fangos activos 2.1.- Aumento del volumen de los slidos sedimentables o Bulking 2.2.- Formacin de espumas biolgicas o Foaming 2.2.1.- Microorganismos productores de espumas 2.2.2.- Principales factores que influyen en la produccin de espumas 2.2.3.- Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos productores de espumas 2.2.4.- Control del foaming 3.- Actinomicetos 3.1.- Taxonoma 3.2.- Clasificacin actual 3.3.- Suborden Corynebacterineae 3.3.1.- Familia Corynebacterineae 3.3.2.- Familia Dietziaceae 3.3.3.- Familia Gordoniaceae 3.3.3.1.- Gnero Gordonia 3.3.3.2.- Gnero Millisia 3.3.3.3.- Gnero Skermania 3.3.4.- Familia Mycobacteriaceae 3.3.5.- Familia Nocardiaceae 3.3.5.1.- Gnero Nocardia 3.3.5.2.- Gnero Rhodococcus 3.3.6.- Familia Segniliparaceae 3.3.7.- Familia Tsukamurellaceae 3.3.8.- Familia Williamsiaceae 3.4.- Ecologa y distribucin en la naturaleza 6 7 8 8 9 10 10 10 10 11 12 12 12 13 14 14 15 15 16 16 1 1 1 2 2 2 3 4 5

3.4.1.- Suelo 3.4.2.- Medios marinos y aguas dulces 3.4.3.- Aguas residuales 4.- Deteccin e identificacin de nocardioformes en fangos activos 4.1.- Aislamiento y recuento 4.2.- Identificacin y caracterizacin 4.2.1.- Mtodos clsicos 4.2.1.1.- Caracteres morfolgicos 4.2.1.2.- Quimiotaxonoma 4.2.2.- Mtodos genotpicos 4.2.2.1- Anlisis de las secuencias del 16S rRNA 4.2.2.2.- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) 4.2.3.- Mtodos fenotpicos OBJETIVOS MATERIAL Y MTODOS 1.- Cepas bacterianas de referencia 2.- Caracterizacin de muestras de fangos activos 2.1.- Toma de muestras 2.2.- Caracterizacin morfolgica 2.3.- Caracterizacin quimiotaxonmica 2.3.1.- Extraccin y anlisis de cidos miclicos 2.3.1.1.- Materiales 2.3.1.2.- Metodologa 2.3.2.- Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP) 2.3.2.1.- Materiales 2.3.2.2.- Metodologa 2.3.3.- Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular 2.3.3.1.- Materiales 2.3.3.2.- Metodologa 2.4.- Caracterizacin genotpica

16 17 17 18 18 19 19 19 20 21 21 22 23 24 25 25 26 26 27 28 28 28 29 29 29 30 31 31 31 32

II

2.4.1.- Extraccin de DNA. Protocolo del CTAB. 2.4.2.- Electroforesis en gel de agarosa 2.4.3.- Amplificacin por PCR 2.4.4.- Purificacin del DNA 2.4.5.- Obtencin y anlisis de las secuencias del 16S rDNA 2.4.6.- rboles filogenticos 2.4.7.- Matrices de similaridad 2.5.- Caracterizacin fenotpica 2.5.1.- Tests fenotpicos 2.5.1.1.- Degradacin 2.5.1.1.1.- Esculina 2.5.1.1.2.- L- Tirosina 2.5.1.2.- Fuente de carbono (1%) 2.5.1.2.1.- -L-Ramnosa 2.5.1.2.2.- D-Galactosa 2.5.1.2.3.- D-Ribosa 2.5.1.2.4.- meso-Inositol 2.5.1.3.- Fuente de carbono (0,1%) 2.5.1.3.1.- cido Benzoico (sal de Na) 2.5.1.3.2.- cido ctrico 2.5.1.4.- Fuente de carbono y nitrgeno (0,1%) 2.5.1.4.1.- L-Prolina 2.5.1.5.- Test de tolerancia 2.5.1.5.1.- Crecimiento a diferentes temperaturas RESULTADOS Y DISCUSIN 1.- Caracterizacin de muestras de fangos activos 1.1.- Caracterizacin morfolgica 1.2.- Caracterizacin quimiotaxonmica 1.3.- Caracterizacin genotpica 1.3.1.- rboles filogenticos y matrices de similaridad 1.3.1.1.- Gnero Dietzia

32 33 34 34 35 35 36 36 36 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 39 39 39 39 39 40 40 40 43 47 49 49

III

1.3.1.2.- Gnero Rhodococcus 1.3.1.3.- Gnero Tsukamurella 1.3.1.4.- Gnero Gordonia 1.4.- Caracterizacin fenotpica CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS ANEXO 1: Medios de cultivo ANEXO 2: Reactivos para biologa molecular ANEXO 3: Abreviaturas empleadas

52 55 58 62 68 69 75 75 77 78

IV

NDICE DE TABLAS
Tabla 1: Clasificacin jerrquica del suborden Corynebacterineae basada en las secuencias de DNA y RNA ribosmico 16S. (Stackebrandt et al., 1997, Kmpfer et al., 1999, Stach et al., 2004, Butler et al., 2005, Soddell et al., 2006) 9 Tabla 2: Tipos de pared celular segn sus constituyentes mayoritarios (Lechevalier y Lechevalier, 1980) 20

Tabla 3: Tipos de pared celular y tipos glucdicos de los actinomicetos aerobios con mesoDAP (Lechevalier y Lechevalier, 1980) 20 Tabla 4: Microorganismos de referencia utilizados Tabla 5: Aislados obtenidos de las muestras de EDARS Tabla 6: Ciclos de la reaccin de amplificacin de la PCR para actinomicetos Tabla 7: Descripcin macroscpica y microscpica de los aislados Tabla 8: Resultados pruebas quimiotaxonmicas de los aislados 25 27 34 40 44

Tabla 9: Posible identificacin obtenida mediante BLAST de la secuencias del 16S rDNA 48 Tabla 10: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Dietzia Tabla 11: Matriz de similaridad del gen 16S r DNA del gnero Rhodococcus Tabla 12: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Tsukamurella Tabla 13: Matriz de similaridad del gen 16S rDNA del gnero Gordonia 51 54 57 60

Tabla 14: Identificacin obtenida mediante matrices de similaridad de la secuencia del 16S rDNA Tabla 15: Resultados test fenotpicos Tabla 15 (continuacin): Resultados test fenotpicos 62 64 65

NDICE DE FIGURAS

Figura 1: Esquema del proceso de fangos activos

Figura 2: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata (Sutcliffe,1998) 21 Figura 3: Dietzia maris (P26) 41 Figura 4: Gordonia amarae (P152) Figura 5: Gordonia malaquae (P175) Figura 6: Rhodococcus ruber (P135) Figura 7: Tsukamurella pseudospumae (N1) Figura 8: Tsukamurella spumae (P166) 41 41 42 42 42

Figura 9: Cromatoplaca de cidos miclicos de los aislados P46p, P48b, P108, P152, P132. Tsukamurella spumae (DSM 44113) (1), Gordonia amarae (CECT 5704) (2), Nocardia asteroides (CECT 3051) (3), Rhodococcus rhodochrous (CECT 5749) (4) y Streptomyces albus (CECT 3077) (5) 45 Figura 10: Cromatoplaca de cidos miclicos de los aislados N1, N4, N5, N9-1, L2. Tsukamurella spumae (DSM 44113) (1), Gordonia amarae (CECT 5704) (2), Nocardia asteroides (CECT 3051) (3), Rhodococcus rhodochrous (CECT 5749) (4) y Streptomyces albus (CECT 3077) (5) 45 Figura 11: Cromatoplaca de ismeros del DAP. En los extremos se observan los patrones de las formas L-DAP y meso-DAP 46 Figura 12: Cromatoplaca de los azcares predominantes. En los extremos se observan los patrones de Arabinosa y Galactosa 46 Figura 13: Comprobacin extraccin DNA. 1: P26; 2: P72; 3:P108; 4: P132; 5: P166; 6: N1; 7: N4; 8: N9-1 47 Figura 14: Gel de PCR con los productos de amplificacin del 16S rDNA.1 y 16: Marcador de peso molecular; 2: Blanco sin DNA; 3: P26; 4: P39; 5: P46p; 6:P48b; 7: P54; 8: P72; 9: P108; 10: P135; 11: P141; 12: P145; 13: N5; 14: N16-9; 15: N17-4 47 Figura 15: rbol filogentico gnero Dietzia 50 Figura 16: rbol filogentico gnero Rhodococcus Figura 17: rbol filogentico gnero Tsukamurella Figura 18: rbol filogentico gnero Gordonia Figura 19: Test Tirosina Figura 20: Test Esculina 53 56 59 66 66

VI

INTRODUCCIN

1.- Depuracin de aguas residuales

1.1.- Sistema de fangos activos
El sistema de fangos activos es un proceso que se lleva utilizando durante los ltimos 60 aos para la depuracin de aguas residuales. Este proceso surgi a partir de la observacin de que cualquier agua residual ya sea domstica o industrial, aireada durante un cierto periodo de tiempo, reduce su contenido en materia orgnica, al mismo tiempo que se forma un fluido con flculos de bacterias. Esto flculos se encuentran formados por una poblacin muy heterognea de microorganismos. (Soddell y Seviour, 1990; Bitton, 1999). Los fangos activos constituyen una mezcla de microorganismos, en su mayora bacterias hetertrofas, que transforman la materia orgnica biodegradable hasta formas ms simples y estables. Consiste en un tratamiento aerbico que oxida la materia orgnica hasta CO2, NH3 y H2O y forma nueva biomasa celular. La biomasa celular obtenida forma flculos que sedimentan en el tanque de clarificacin o sedimentacin. Este procedimiento se utiliza a escala mundial como tratamiento biolgico secundario para el tratamiento de aguas residuales domsticas (Bitton, 1999). Parte de los fangos recogidos en el sedimentador secundario se recirculan al reactor y son los que contienen los microorganismos que llevan a cabo la depuracin biolgica. (Metcalf y Hed, 2000). (Ver figura 1).

Figura 1: Esquema del proceso de fangos activos

1.2.- El flculo

INTRODUCCIN

El flculo est formado por la unin de microorganismos, partculas orgnicas e inorgnicas, teniendo un tamao que oscila entre 1 y 1000 m. Para que el proceso de depuracin sea llevado con xito es necesaria la formacin de un flculo adecuado de microorganismos en el tanque de aireacin. Con ello se permite la separacin de los slidos en suspensin en el tanque de sedimentacin producindose un sobrenadante fluido y claro. A su vez, parte de estos slidos que contienen los flculos son recirculados al tanque de aireacin para as aumentar el nivel de actividad microbiana (Soddell y Seviour, 1990). Las bacterias filamentosas juegan un papel importante ya que gracias a ellas el flculo adquiere consistencia con lo que se pueden formar flculos de mayor tamao y ms compactos que resisten mucho mejor las turbulencias del sistema de agitacin. Tambin ayudan a capturar y mantener atrapadas pequeas partculas durante la sedimentacin (Kerley y Forster, 1995). Si no existieran bacterias filamentosas o stas estuvieran en una proporcin muy baja se formaran flculos llamados flculos en punta de alfiler, los cuales son de pequeo tamao y de consistencia muy dbil con lo que el sistema de aireacin los disgregara, adems la sedimentacin no se producira correctamente con lo que se originara un sobrenadante turbio con muchos slidos en suspensin. En cambio, si hubiera un crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos se producira un aumento de volumen de los slidos sedimentados por compactacin defectuosa denominado bulking (Bitton, 1999). Si por el contrario se produce un crecimiento excesivo de actinomicetos nocardioformes que contienen cidos miclicos (mycolata) se produce la formacin de espumas biolgicas, fenmeno conocido como foaming (Seviour y Blackall, 1998).

2.- Problemas en sistemas de fangos activos

2.1.- Aumento del volumen de los slidos sedimentables o Bulking
Este fenmeno se produce por el crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos no mycolata en el lquido de mezcla. Su presencia provoca que los flculos biolgicos del reactor sean voluminosos y poco consistentes. Estos flculos no sedimentan bien y suelen ser

INTRODUCCIN arrastrados en grandes cantidades en el efluente de los tanques de sedimentacin con el consiguiente problema que comporta (Chi Nam Seong et al., 1999).

2.2.- Formacin de espumas biolgicas o Foaming

Se produce cuando hay un crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos que contienen cidos miclicos y a Microthrix parvicella (Goodfellow et al., 1996). Aunque pueden existir otros tipos de espumas producidas por tensioactivos de lenta degradacin (Jenkins et al., 1993) las espumas producidas por mycolata son espesas, viscosas y muy estables. De todos los microorganismos que pueden producir el foaming los mycolata son los ms problemticos ya que las espumas que originan son de gran consistencia y su eliminacin es difcil sin que se altere la calidad del efluente. La primera vez que se describi la formacin de estas espumas fue en el ao 1969. En el mismo se realiz un estudio en donde se describe el llamado misterio de Milwaukee, por ser sta la localidad en donde se observaron por primera vez estas espumas que contenan gran cantidad de actinomicetos ramificados Gram-positivos. Estas bacterias fueron posteriormente identificadas como pertenecientes al gnero Nocardia, concretamente N. amarae y N. rhodochrous (Lechevalier y Lechevalier, 1974), y por ello a estas espumas se les empez a conocer como Nocardia foams (Jenkins et al., 1993). Posteriormente esta especie fue transferida al gnero Gordonia como G. amarae (Klate, 1994). Sin embargo actualmente este trmino hace referencia al problema de espumas producidas por mycolata, ya que otros microorganismos tambin pueden causar este problema, entre ellos Rhodococcus, y Tsukamurella (Nam et al., 2003). La aparicin de espumas causa una serie de problemas (Seviour y Blackall, 1998): Las espumas pueden llegar a tener ms de un metro de espesor y, por tanto, desbordarse en las pasarelas y reas circundantes donde se originan peligrosas zonas resbaladizas. Se pierden gran cantidad de slidos sedimentables, ya que las espumas pueden retener ms del 40% de los slidos en suspensin. Son las responsables de la disminucin de oxgeno transferido a la superficie de los tanques aireados mecnicamente.

INTRODUCCIN Los sistemas de eliminacin de espumas pueden verse bloqueados y stas pueden entrar en algunos casos en el tanque de sedimentacin, reduciendo as la calidad del efluente. La espuma puede congelarse en climas fros o pudrirse en climas clidos. La espuma puede introducirse en los digestores anaerobios y ocasionar tambin problemas de foaming. Los aerosoles de los organismos formadores de espumas constituyen un peligro potencial para la salud (Goodfellow et al., 1998). Algunos organismos hallados en las espumas son patgenos oportunistas, tales como Nocardia asteroides y Rhodococcus equi (Prescott, 1991). 2.2.1.- Microorganismos productores de espumas Antes de los 80s, los nicos microorganismos reconocidos como formadores de espumas eran los actinomicetos nocardioformes aunque actualmente se conocen otros tipos de microorganismos filamentosos productores de espumas como Microthrix parvicella (Blackall et al., 1994; Blackall et al., 1996). Los mycolata son la causa ms importante de foaming en Australia, Sudfrica, Los Pases Bajos o Francia. En EE.UU., Nocardia (Gordonia) es la bacteria filamentosa cuya presencia es ms comn en fangos activos y la mayora de espumas biolgicas estn producidas por este gnero, sin embargo, estudios recientes en otros pases indican que la situacin es ms compleja (Jenkins et al., 2003). En Espaa, este problema esta poco estudiado ya que no existen estudios detallados que muestren la diversidad de los productores de espumas. Los microorganismos dominantes identificados por microscopa en espumas de fangos activos son: Gordonia amarae (GALO): perteneciente a la familia Gordoniaceae y dentro de sta, al gnero Gordonia. Fue transferida desde el gnero Nocardia a este gnero (Klate, 1994) por sus propiedades qumicas, microbiolgicas y secuencia del 16S rRNA. Desde su primera descripcin como N. amarae (Lechevalier y Lechevalier, 1974) esta especie ha sido aislada en gran cantidad de plantas depuradoras con sistemas de fangos activos y es uno de los mycolata ms frecuentes implicados en problemas de espumas biolgicas. Nocardia sp. (NALO / GALO): perteneciente a la familia Nocardiaceae y dentro de sta, al gnero Nocardia. Debido a que durante 20 aos el principal productor de espumas biolgicas era conocido como N. amarae y debido a su similitud morfolgica todava existe la tendencia de llamar a estas bacterias NALO (Nocardia amarae-Like Organism). Su abundancia provoca

INTRODUCCIN disgregacin flocular y presentan una cubierta crea que forma una suspensin en medio lquido, ya que atrapan burbujas de aire, que causa la aparicin de espumas densas en el sobrenadante clarificado. Su abundancia est asociada a bajas cargas msicas, alta edad del fango y altas temperaturas. Skermania piniformis (PTLO): perteneciente a la familia Gordoniaceae y dentro de sta, al gnero Skermania. Es la nica especie con morfologa lo suficientemente caracterstica como para identificarla correctamente. Originariamente se llamaba PTLO (Pine Tree Like Organism) porque sus ramificaciones se asemejan a las hojas de un pino (Eales et al., 2003 y Ramrez et al., 2005). Rhodococcus: perteneciente a la familia Nocardiaceae. Cocos Gram-positivos que producen espumas no filamentosas en diversas plantas de fangos activados australianas. Microthrix parvicella: es muy frecuente en plantas de Europa, Australia y Sudfrica, pero menos frecuente de EE.UU. Su ubicacin taxonmica no est clara todava aunque su secuencia de 16S rDNA indica un parentesco con los actinomicetos (Blackall et al., 1994). Aunque los principales actinomicetos formadores de espumas como Gordonia amarae y S. piniformis no son conocidos como patgenos otros, como N. asteroides, R. equi y T. paurometabolum, pueden causar enfermedades, particularmente en pacientes que usan medicacin inmunodepresiva o infectados por el virus VIH (Castelli et al., 1994). Las micobacterias, tambin detectadas en fangos activos aunque no causantes de espumas, pueden representar un serio peligro potencial para la salud (Dailloux et al., 1999). Adems, el personal de la planta se encuentra expuesto a los aerosoles producidos por los nocardioformes que son potencialmente patgenos y cuya ruta de infeccin es probablemente la inhalacin (Goodfellow, 1992). 2.2.2.- Principales factores que influyen en la produccin de espumas La formacin de una espuma biolgica estable y viscosa en los tanques de aireacin en las plantas de tratamiento de aguas residuales implica el enriquecimiento selectivo de los organismos en el licor de mezcla mediante un proceso de flotacin (Seviour y Blackall, 1998) y resulta de la combinacin de elementos relacionados con la flotacin de los microorganismos y mecanismos para estabilizar la espuma producida.

INTRODUCCIN Para que se originen estas espumas biolgicas es necesaria la presencia conjunta de burbujas de aire, partculas hidrofbicas. Estos componentes estn presentes en la mayora de plantas de fangos activos con problemas de espumas. Las burbujas de aire son producidas por el sistema de aireacin y retenidas por la matriz de bacterias filamentosas. Las partculas hidrofbicas ms importantes en espumas biolgicas son los cidos miclicos contenidos en la pared celular de los mycolata. 2.2.3.- Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos productores de espumas Requisitos nutricionales: diversos estudios taxonmicos han demostrado que los

mycolata son capaces de utilizar un amplio rango de sustratos que va desde los azcares simples hasta componentes orgnicos complejos, lpidos complejos, esteroides, fenoles (Klatte et al., 1994). Los gneros Rhodococcus y Gordonia, son extremadamente verstiles en su capacidad para degradar sustratos complejos derivados de hidrocarburos (Kmpfer et al., 1995). Requisitos de oxgeno: los mycolata son aerobios estrictos y por ello no crecen si el oxgeno no se encuentra presente (Goodfellow, 1992). Esto no significa necesariamente que algunos mycolata no sean capaces de metabolizar bajo condiciones anaerobias, como ciertas especies de Rhodococcus que pueden metabolizar anaerbicamente clorofenoles (Uotila et al., 1992). Temperatura: en climas clidos es ms probable la aparicin de mycolata formadores de espumas (Eikelboom, 1994). Los mycolata crecen en un amplio rango de temperaturas. Algunos, principalmente Rhodococcus, crecen a temperaturas de 5 C, mientras que la temperatura mnima de crecimiento para G. amarae es de 15 C o superiores. La temperatura ptima de estos microorganismos es de 25 C, mientras que las temperaturas mximas de crecimiento son, al igual que las mnimas, muy variadas, algunos no pueden crecer con temperaturas de 30 C o superiores y, sin embargo, otros lo hacen a ms de 40 C. pH: el pH en el licor de mezcla influye de forma importante en el crecimiento de los filamentos. Se ha determinado que los niveles de pH recomendados para el desarrollo de los mycolata se encuentran entre 6 y 8, aunque dejan de crecer a pH superior a 8. Especies de

INTRODUCCIN Rhodococcus, Gordonia y Tsukamurella crecen a pH alcalinos superiores a 9 (Goodfellow et al., 1991). 2.2.4.- Control del foaming La formacin de espumas en los sistemas de fangos activos tiene lugar en muchas plantas de tratamiento, las cuales difieren unas de otras en sus parmetros operacionales. La temperatura, los mtodos de aireacin, la edad del fango, el nivel de slidos, etc. pueden determinar qu microorganismos crecen particularmente en una planta, y resulta pues difcil determinar los factores especficos que favorezcan el crecimiento de las grandes cantidades de organismos formadores de espumas. Las medidas comnmente empleadas son: Manipulacin de la edad del fango: debido a que los actinomicetos son considerados microorganismos de lento crecimiento, una reduccin en la edad del fango eliminara al organismo del sistema. Sin embargo, sta no resulta ser una medida totalmente efectiva ya que los organismos nocardioformes difieren en la velocidad de crecimiento. Aunque esta medida controle el problema en situaciones adversas, la calidad del efluente se ve afectada (Seviour y Blackall, 1998). Cloracin: la cloracin es normalmente utilizada como un mtodo de control no especfico para los problemas de bulking y tambin se emplea en el control de espumas, aunque hoy en da se cree que perjudica a los flculos que contienen los mycolata. Un uso ms efectivo de la cloracin en el control de espumas originadas por Gordonia reside en su aplicacin en spray directamente sobre la espuma en el tanque de aireacin (Jenkins et al., 1993). Uso de selectores: se basa en la manipulacin del crecimiento del filamento a travs de

una zona de seleccin previa al tanque de aireacin. En esta zona se crea un ambiente anaerbico donde los aireadores dejan de funcionar durante determinados periodos de tiempo, favorecindose as el crecimiento de bacterias formadoras de flculos a expensas de los mycolata (Seviour y Blackall, 1998). Eliminacin fsica: existen varias tcnicas de eliminacin fsica utilizadas para controlar el foaming que incluyen desde la eliminacin mecnica de la capa superficial del licor de mezcla (Pagilla et al., 1996). 7

INTRODUCCIN

3.- Actinomicetos
Los actinomicetos forman un grupo de microorganismos morfolgicamente muy heterogneo, pertenecientes al dominio Bacteria, formado por bacterias generalmente aerobias, Gram-positivas, con alto contenido en G+C. Muchos de ellos forman filamentos ramificados o hifas y esporas asexuales. Su diversidad morfolgica es considerable, desde formas bacilares hasta formas filamentosas ramificadas. Dos de las propiedades ms significativas de los actinomicetos son su capacidad para desarrollarse sobre sustratos muy diversos que no pueden ser usados por otros microorganismos, como la quitina y celulosa y su aptitud para sintetizar numerosos metabolitos bioactivos. Estas propiedades ponen de manifiesto la riqueza destacable del metabolismo celular de este grupo microbiano (Goodfellow et al., 1997). El inters por los actinomicetos comenz a raz del descubrimiento de la capacidad de estos microorganismos para producir antibiticos. Aunque la bsqueda de compuestos bioactivos sigue en auge, el inters por los actinomicetos se ha diversificado y actualmente ocupa reas muy variadas. Pueden ser patgenos de plantas, de animales, de humanos, descomponer productos del caucho, crecer en el combustible de los aviones. En las estaciones depuradoras de aguas residuales causan espumas densas que llegan a obstruir las instalaciones. Por la diversidad de hbitats que pueden colonizar este grupo de microorganismos tiene un enorme inters ecolgico (June et al., 1999).

3.1.- Taxonoma
La taxonoma de los actinomicetos ha evolucionado considerablemente durante las ltimas dcadas al mismo tiempo que se ha incrementado el nmero de gneros. Los actinomicetos nocardioformes aparecen descritos por H. A. Lechevalier en la Seccin 26 de la 1 edicin del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Williams et al., 1989). En esta edicin se describen once gneros de nocardioformes de los cuales slo Nocardia y Rhodococcus contienen cidos miclicos. En la 9 edicin del Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994) los actinomicetos nocardioformes estn incluidos en el Grupo 22, el cul est dividido en 4 subgrupos. El subgrupo 1 rene los actinomicetos que contienen cidos miclicos (mycolata).

INTRODUCCIN

3.2.- Clasificacin actual

Desde hace algn tiempo se ha observado que las secciones del Volumen 4 del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology de 1989 no son homogneas y que no coinciden con los datos de la secuencia del 16S rRNA. Con el fin de corregir este problema se realiz una propuesta para una nueva clasificacin jerrquica basada en el estudio filogentico de las secuencias del 16S rRNA. En 1997 se propone la clase Actinobacteria (Stackebrandt et al., 1997) compuesta por los actinomicetos y sus parientes filogenticos con un alto contenido en G+C. Contiene cinco subclases de las cuales la ms extensa es Actinobacteridae, compuesta a su vez por dos rdenes; Actinomycetales y Bifidobacteriales. Los gneros incluidos en este trabajo estn en el orden de Actinomycetales, que se divide en 10 subrdenes. El suborden Corynebacterineae engloba a 8 familias, de las que parte estudiaremos en el presente trabajo, conteniendo todos ellos cidos miclicos (tabla 1). Tabla 1: Clasificacin jerrquica del suborden Corynebacterineae basada en las secuencias de DNA y RNA ribosmico 16S. (Stackebrandt et al., 1997, Kmpfer et al., 1999, Stach et al., 2004, Butler et al., 2005, Soddell et al., 2006) Suborden Familia Gnero Corynebacteriaceae Corynebacterium Dietziaceae Dietzia Gordonia Gordoniaceae Millisia Skermania Corynebacterineae Mycobacteriaceae Mycobacterium Nocardiaceae Nocardia Rhodococcus Segniliparaceae Segniliparus Tsukamurellaceae Tsukamurella Williamsiaceae Williamsia

La segunda edicin del Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (Boone et al., 2001) recoge la clasificacin actual, en la que la clase Actinobacteria se eleva al rango de Phylum. Dentro del phylum se reconoce una nica clase, Actinobacteria, que mantiene la estructura jerrquica propuesta por Stackebrandt et al., (1997).

INTRODUCCIN

3.3.- Suborden Corynebacterineae

Este suborden se compone de 8 familias: Corynebacteriaceae, Dietziaceae, Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Segniliparaceae, Tsukamurellaceae y Williamsiaceae (Euzby, J. P.). 3.3.1.- Familia Corynebacterineae Es la familia tipo del suborden Corynebacterineae. Contiene un nico gnero, Corynebacterium (Stackebrandt et al., 1997). Corynebacterium est incluido en el grupo 20 del Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994). El gnero Corynebacterium contiene bacilos rectos o levemente curvados, aerobios y anaerobios facultativos, catalasa positivos, a menudo de extremos afilados. Se suelen observar formas en maza. Las corinobacterias poseen un quimiotipo de pared celular tipo IV (cido mesodiaminopimlico, arabinosa y galactosa). Contienen cidos miclicos de 22-36 tomos de carbono (Collins y Cummins, 1986). 3.3.2.- Familia Dietziaceae Solamente posee un nico gnero, Dietzia. Este gnero apareci como resultado de la reclasificacin de Rhodococcus maris a Dietzia maris basndose en la secuencia del 16S rRNA (Rainey et al., 1995). El gnero Dietzia est constituido por cocobacilos, Gram-positivos, catalasa positivos, aerobios y no formadores de esporas. La pared celular contiene cido mesodiaminopimlico y los azcares que predominan son la galactosa y la arabinosa (quimiotipo de pared celular IV). Contiene cidos miclicos de 34-38 tomos de carbono. Su contenido en G+C expresado en mol% es del 73% (Rainey et al., 1995). Actualmente se conocen seis especies vlidas descritas de este gnero (Euzby, J. P.). 3.3.3.- Familia Gordoniaceae En la publicacin de Stackebrandt et al. (1997) esta familia contena un nico gnero, Gordonia, ubicado en el Grupo 22 correspondiente a los actinomicetos nocardioformes del

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INTRODUCCIN Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994). En la edicin del Bergeys Taxonomic Outline de 2002 esta familia incluye el gnero Skermania y el gnero Millisia. 3.3.3.1.- Gnero Gordonia Originariamente, este gnero fue propuesto por Tsukamura en 1971 para algunos actinomicetos dbilmente cido-alcohol resistente aislados del suelo y de esputos de pacientes con enfermedades pulmonares. Las tres especies originales G. bronchialis, G. rubropertincta y G. terrae fueron trasferidas en 1977 por Goodfellow y Alderson al gnero Rhodococcus desapareciendo como tal el gnero Gordonia. Posteriormente, el descubrimiento de que en el gnero Rhodococcus existan dos grupos filogenticamente distintos segn el anlisis de la secuencia del 16S rRNA condujo a Stackebrandt et al. (1988) a recuperar el gnero Gordonia. Actualmente existen 25 especies de Gordonia vlidamente descritas y al menos dos en proceso de clasificacin (Euzby, J. P.). Gordonia amarae fue transferida desde el gnero Nocardia a este gnero en base a sus propiedades qumicas, microbiolgicas y secuencia del 16S rRNA (Klate et al., 1994, Goodfelllow et al., 1994). Desde su primera descripcin como N. amarae (Lechevalier y Lechevalier, 1974) esta especie ha sido aislada en gran cantidad de plantas depuradoras con sistemas de fangos activos y es uno de los mycolata ms frecuentemente implicados en problemas de espumas biolgicas (Iwahori et al., 2001). El gnero incluye pequeos bacilos y formas cocceas, pueden formar hifas con ramificaciones en ngulo recto, son aerobios, Gram-positivos o Gram-variable, catalasa positivos y normalmente parcialmente cido-alcohol resistentes. Forman colonias marronceas, rosas, naranjas o rojas cuyas clulas se encuentran en algunos casos formando agregados. La pared celular contiene cido meso-diaminopimlico (DAP) y los azcares mayoritarios son galactosa y arabinosa (quimiotipo de pared celular IV). Poseen cidos miclicos de 48-66 tomos de carbono (Arenskter et al., 2004). El gnero Gordonia ha sido considerado como patgeno oportunista aislado de esputos de pacientes con afecciones pulmonares como G. sputi y G. bronchialis (Tsukamura, 1982). La etimologa del gnero fue corregida por Stackebrandt en 1997 quedando como Gordonia y no Gordona (Stackebrandt et al., 1997).

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INTRODUCCIN 3.3.3.2.- Gnero Millisia Este gnero fue propuesto por Soddell et al. en 2006 y fue aislado de espumas procedentes de plantas de fangos activados. Actualmente la nica especie de este gnero es, Millisia brevis. Est constituido por bacilos con ramificaciones en ngulo recto, aerobios, Grampositivos o Gram-variables, cido-alcohol resistentes, catalasa positivos y con grnulos de polifosfato. Forman colonias rosceo-asalmonadas, irregulares y con escasos filamentos. La pared celular contiene cido meso-diaminopimlico (DAP) y los azcares mayoritarios son galactosa y arabinosa (quimiotipo de pared celular IV). Poseen cidos miclicos de 44-52 tomos de carbono. Su contenido en G+C expresado en mol% es del 64,7% 3.3.3.3.- Gnero Skermania Nocardia pinensis fue propuesta como una de las principales especies de actinomicetos que ocasionan espumas en las superficies de los tanques de aireacin de las plantas de tratamiento de aguas residuales de Australia (Blackall et al., 1989). La secuencia completa del 16S rDNA y la estructura de los cidos miclicos representativos de los mycolata ha sido determinante para clarificar la posicin taxonmica de esta especie, ya que pone de manifiesto el error al clasificarla en el gnero Nocardia, a pesar de estar relacionada filogenticamente con las distintas familias que integran la clase Actinobacteria. En base al estudio realizado por Chun et al. (1997), Nocardia pinensis fue reclasificada como un gnero nuevo dentro de la familia Nocardiaceae, renombrndose como Skermania piniformis, la nica especie del gnero. El gnero Skermania lo componen bacterias filamentosas Gram-positivas, no cidoalcohol resistentes con un metabolismo oxidativo y catalasa, oxidasa y ureasa positivos. Los componentes mayoritarios de la pared celular son el cido meso-DAP, arabinosa y galactosa. El nmero de tomos de carbono de sus cidos miclicos oscila entre 58 y 64, y su DNA tiene un porcentaje muy alto en G+C (Chun et al., 1997). 3.3.4.- Familia Mycobacteriaceae Contiene solamente el gnero Mycobacterium del cual se han contabilizado 95 especies en la edicin del Bergeys Taxonomic Outline de 2002. Mycobacterium est compuesto por bacilos ligeramente curvos o rectos, que a veces se ramifican o forman filamentos que se 12

INTRODUCCIN fragmentan con facilidad en bacilos y cuerpos cocoides. Son aerobios y catalasa positivos. El quimiotipo de pared celular es IV y el contenido en G+C expresado en mol% es del 62-70%. Sus paredes celulares son muy ricas en lpidos y contienen ceras con cidos miclicos de 60 a 90 tomos de carbono. La presencia de cidos miclicos y de otros lpidos por fuera de la capa de peptidoglicano hace que las micobacterias sean fuertemente cido-alcohol-resistentes (Sneath et al., 1986). Las micobacterias suelen crecer muy lentamente y han de ser incubadas desde 2 hasta 40 das tras su inoculacin en un medio complejo solidificado para formar colonias visibles. El primer escaln de la taxonoma de las micobacterias es la velocidad de crecimiento. As, se dividen en micobacterias de lento crecimiento y de rpido crecimiento. Las micobacterias patgenas suelen ser de lento crecimiento, como M. tuberculosis y M. leprae, mientras que las de rpido crecimiento se consideran ambientales y son frecuentemente aisladas del suelo, como M. moriokaense (Hartmans y de Bont, 1992). Se ha demostrado que las micobacterias pueden multiplicarse en agua pura aunque la materia orgnica favorece su crecimiento (Dailloux et al., 2000). En sistemas de tratamiento de aguas potables han sido aisladas diversas especies de micobacterias no tuberculosas (Le Dantec et al., 2002, Torvinen et al., 2004) Aunque las micobacterias se pueden observar en fangos activos, no se consideran responsables de formacin de espumas biolgicas. 3.3.5.- Familia Nocardiaceae Contiene dos gneros, Nocardia y Rhodococcus (Stackebrandt et al., 1997, Chun et al., 1997) descritos en la seccin 17 (nocardioformes) y seccin 26 (actinomicetos nocardioformes) de la primera edicin del Manual Bergeys. El trmino nocardioforme, introducido por Prauser en 1967, hace referencia a los actinomicetos que forman un micelio fugaz que se fragmenta en elementos bacilares o cocoides. sta no es una definicin satisfactoria ya que se conocen cepas individuales de nocardioformes que no presentan esta caracterstica. Este trmino intent unir de una manera informal un nmero de organismos con caractersticas similares sin que esto signifique que sean organismos estrechamente relacionados.

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INTRODUCCIN 3.3.5.1.- Gnero Nocardia La primera Nocardia fue aislada en 1888 por el veterinario y bacterilogo francs Edmond Nocard y fue caracterizada un ao despus por Trevisan, el cual le dio el nombre de Nocardia farcinica. Desde la transferencia de N. amarae al gnero Gordonia como G. amarae (Goodfellow et al., 1994) y de N. pinensis al gnero Skermania como S. piniformis (Chun et al., 1997) el gnero Nocardia ha quedado como un taxn homogneo. El gnero Nocardia contiene 71 especies vlidamente descritas (Euzby, J. P.). Se ha demostrado que una de estas especies, N. farcinica, es una de las responsables de formacin de espumas en plantas de fangos activos (Stratton et al., 1996). Son aerobios, catalasa positivos, parcialmente cido-alcohol resistentes, Gram-positivas o Gram-variables. Forman un micelio areo, aunque nicamente visible al microscopio, que se eleva por encima del agar, donde ocasionalmente se pueden encontrar conidios. Las hifas del micelio del sustrato adquieren unas dimensiones de 0.5-1,2 m de dimetro y la principal caracterstica morfolgica de este gnero es la tendencia a fragmentarse con facilidad en bacilos y elementos cocoides. Las hifas forman ramificaciones caractersticas en ngulo recto. Las colonias tienen un aspecto aterciopelado o calcreo y pueden ser marrones, rosas, rojas, naranjas, prpuras, grises o blancas y, adems, pueden producir pigmentos solubles de color marrn o amarillo. Los componentes mayoritarios de la pared celular son el cido meso-DAP, arabinosa y galactosa. Contienen cidos miclicos de 44-60 tomos de carbono y su contenido en G+C expresado en mol% es del 64-72%. 3.3.5.2.- Gnero Rhodococcus El gnero Rhodococcus abarca actinomicetos aerobios, Gram-positivos, catalasa positivos y parcialmente cido-alcohol resistentes en alguno de sus estados de crecimiento. Son coco-bacilos que pueden formar micelio de sustrato que da lugar a la aparicin de extensas hifas, mientras que tan slo en algunas especies es caracterstico un micelio areo visible al microscopio. Las colonias de Rhodococcus pueden ser aterciopeladas, rugosas o mucosas, de color rojo, naranja, amarillo o crema. Los componentes mayoritarios del peptidoglicano de la pared celular son el cido meso-DAP, arabinosa y galactosa. Contiene cidos miclicos de 32-66 tomos de carbono y su contenido en G+C expresado en mol% es del 73%.

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INTRODUCCIN El hbitat de Rhodococcus es muy amplio y frecuentemente es aislado de suelos, medios acuticos y excrementos de animales herbvoros. Existen 29 especies de Rhodococcus vlidamente descritas (Euzby, J. P.). Algunas especies como R. equi son patgenos para hombres y animales. Otras especies tienen inters medioambiental ya que son capaces de degradar herbicidas y otros compuestos (Finnerty, 1992, Briglia et al., 1996). 3.3.6.- Familia Segniliparaceae Esta familia est integrada por un nico gnero, Segniliparus y actualmente contiene nicamente do especies validadas, Segniliparus rotundus y Segniliparus rugosus. Estas bacterias estn caracterizadas por tener forma bacilar. Producen colonias no pigmentadas (de blancas a beiges), lisas o arrugadas. Su contenido en G+C se encuentra comprendido entre un 68 y un 72 mol%. La pared celular contiene cido meso-DAP y cidos miclicos (Butler et al., 2005). 3.3.7.- Familia Tsukamurellaceae Aparece en el Grupo 22 correspondiente a los actinomicetos nocardioformes del Bergeys Manual of Determinative Bacteriology de 1994. Est integrada por un nico gnero, Tsukamurella, el cul fue introducido en 1988 para acomodar dos organismos previamente clasificados como Corynebacterium paurometabolum y Rhodococcus auranticus y reducirlos a una sola especie T. paurometabola mediante el anlisis de la secuencia del 16S rRNA (Collins et al., 1988). Actualmente el gnero contiene 8 especies vlidamente descritas (Euzby, J. P.). El gnero incluye actinomicetos aerobios, Gram-positivos, catalasa positivos, dbilmente cido-alcohol resistentes y de forma bacilar, que pueden observarse solos, en parejas o en masa. Tambin pueden aparecer elementos cocobacilares. Forman colonias convexas que son secas pero ligeramente emulsificables y cuyos colores van desde el blanco o crema hasta el naranja. El componente mayoritario del peptidoglucano es el cido meso-DAP, galactosa y arabinosa. La envoltura celular posee cidos miclicos de 62-78 tomos de carbono y su contenido en G+C expresado en mol% es del 68%. Han sido aisladas mayoritariamente del suelo y de esputos humanos. La especie T. spumae ha sido aislada en espumas de fangos activos (Nam et al., 2003) al igual que la especie T. pseudospumae (Nam et al., 2004). 15

INTRODUCCIN 3.3.8.- Familia Williamsiaceae Esta nueva familia se describi en 1999 con un gnero nuevo, Williamsia, aislado de las paredes de una guardera en Finlandia. Est formada por un nico gnero y dos especies Williamsia muralis y W. maris (Stach et al., 2004).Los componentes mayoritarios de la pared celular son el cido meso-DAP, arabinosa, galactosa, manosa y ribosa. El nmero de tomos de carbono de sus cidos miclicos oscila entre 50 y 56. La secuencia del 16S rDNA indica que representa un taxn dentro del suborden Corynebacterineae. Aunque las propiedades morfolgicas y quimiotaxonmicas son parecidas a las del gnero Gordonia, pueden ser diferenciadas por la secuencia del 16S rRNA y la longitud de las cadenas de cidos miclicos (Kmpfer et al., 1999). Este taxn es reconocido como familia en la edicin del Bergeys Taxonomic Outline (2002).

3.4.- Ecologa y distribucin en la naturaleza

Los actinomicetos son microorganismos muy extendidos que se encuentran sobre todos los sustratos naturales corrientes. Aunque las primeras cepas de actinomicetos fueron aisladas de fuentes humanas y animales por Cohn en 1875 y Nocard en 1888, respectivamente, el mayor reservorio de actinomicetos es el suelo, y a partir de aqu estos pueden invadir numerosos biotopos. Otra ubicacin importante es el medio acutico: medios marinos, aguas dulces y aguas residuales. (Williams et al., 1989). 3.4.1.- Suelo Los actinomicetos estn presentes en todo tipo de suelos tanto en las capas ms superficiales como en horizontes profundos disminuyendo su concentracin con la profundidad. Suelen ser el segundo grupo de microorganismos ms abundantes en el suelo, despus de las bacterias no actinomicetos. Los actinomicetos comienzan su actividad cuando las bacterias y los hongos no pueden descomponer las molculas ms complejas que quedan en el suelo. Utilizan como fuente de carbono compuestos simples y muy complejos tales como cidos orgnicos, azcares, polisacridos, lpidos, protenas e hidrocarburos alifticos. Muchos pueden degradar protenas, lpidos, almidn y quitina.

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INTRODUCCIN Estos microorganismos participan en muchos procesos del suelo, tales como la descomposicin de los compuestos ms resistentes procedentes de plantas y animales, formacin de humus, fermentacin del compost, causantes de fitopatologas, infecciones en animales y humanos y simbiosis con plantas. 3.4.2.- Medios marinos y aguas dulces Hay mucha controversia acerca de la poblacin de actinomicetos en medios marinos ya que mientras unos afirman que las cepas de estos microorganismos slo seran formas terrcolas adaptadas al medio marino, otros aseveran que son una flora propia de medio acutico. Los actinomicetos estn bien representados en este medio de donde se pueden aislar fcilmente cepas de Micromonospora, Actinoplanes y Streptosporangium. Estos estn presentes restos vegetales (Stach et al., 2003). 3.4.3.- Aguas residuales Los actinomicetos que contienen cidos miclicos son los mximos responsables de la aparicin del foaming en el proceso de depuracin por fangos activados. Estos microorganismos generalmente proliferan en los tanques de aireacin pero tambin se pueden encontrar en el sedimentador. Como ya hemos visto anteriormente, varios gneros de este grupo han sido observados en la espuma, tales como Nocardia, Gordonia y Rhodococcus, aunque tambin se han detectado otros organismos filamentosos como son Microthrix parvicella, Streptomyces spp. y Micromonospora (de los Reyes et al., 1997). Sin embargo, estudios realizados demuestran que, a pesar de que problema del foaming no est causado por un solo gnero, hay que hacer una mencin especial al gnero Gordonia ya que se han encontrado gran cantidad de especies en las espumas de las depuradoras (Goodfellow et al., 1996). Hay que destacar que las especies ms comnmente encontradas en los fangos activos son Gordonia amarae y Skermania pinensis, sobretodo en plantas depuradoras de Australia y Estados Unidos. En Europa, el gnero predominante es el Rhodococcus, sin embargo, Microthrix parvicella es la especie que ms predomina ltimamente en Francia (Bitton, 1999). 17 en sedimentos fluviales o lacustres donde juegan un papel importante en la descomposicin de los

INTRODUCCIN Otras ventajas de este tipo de bacterias sobre otras que puedan crecer en las aguas residuales son su alta resistencia a la desecacin y a la radiacin ultravioleta adems de su capacidad para almacenar polifosfatos y poli--hidroxibutrico (Lemmer y Baumann, 1988b). Su deteccin resulta interesante en cuanto a que ciertos actinomicetos aislados de las espumas de fangos activados son patgenos oportunistas de humanos y animales, tales como Nocardia asteroides (nocardiosis humana), Rhodococcus equi (bronconeumona en caballos) y Gordonia bronchialis (afecciones pulmonares). El gnero Tsukamurella y, ms concretamente la especie T. paurometabola, es un claro ejemplo de patgeno oportunista de humanos. Est asociada principalmente a desechos clnicos y se ha encontrado en fangos activos, de ah su importancia, ya que puede representar un peligro para la salud pblica debido a la difusin de patgenos mediante aerosoles (Goodfellow et al., 1998). La especie Nocardia farcinica tambin es un patgeno oportunista de humanos ya que puede provocar neumona y infecciones cutneas en personas inmunodepresivas. Adems es conocida su alta resistencia a la mayora de antibiticos. El problema asociado a esta especie es que la mayora de las veces su identificacin por tcnicas convencionales es errnea (Stratton et al., 1996).

4.- Deteccin e identificacin de nocardioformes en fangos activos

4.1.- Aislamiento y recuento
Para aislar nocardioformes se utiliza la tcnica de dilucin y siembra en medios selectivos suplementados con antibiticos, como el cido nalidxico que inhibe la flora acompaante Gram-negativa (Goodfellow et al., 1996). Adems es necesario resaltar que la morfologa de algunos organismos formadores de espumas puede variar en cultivo puro debido a las influencias en su ritmo de crecimiento y estado fisiolgico y hay que tener en cuenta tambin que los nocardioformes no crecen a temperaturas superiores a los 30C. Sin embargo, recientes avances en biologa molecular estn permitiendo el desarrollo de pruebas ms rpidas y exactas en la identificacin in situ aunque el aislamiento por mtodos clsicos es necesario como primer peldao en este tipo de investigaciones.

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INTRODUCCIN Uno de los inconvenientes de sta tcnica es que la gran cantidad de microbiota acompaante enmascara el crecimiento de los nocardioformes ms lentos como Skermania piniformis. Debido a esta limitacin con ste mtodo slo pueden ser aislados los nocardioformes ms abundantes y de crecimiento ms rpido, siendo inadecuado este mtodo para nocardioformes de crecimiento lento. Las cepas de Gordonia difcilmente son detectadas por ste mtodo ya que tardan alrededor de dos semanas en crecer.

4.2.- Identificacin y caracterizacin

4.2.1.- Mtodos clsicos Para identificar los diversos grupos de actinomicetos se ha utilizan tradicionalmente criterios fisiolgicos, morfolgicos y quimiotaxonmicos. Los criterios fisiolgicos se limitan al tipo de metabolismo oxidativo o fermentativo. Los caracteres morfolgicos y quimiotaxonmicos son los ms importantes. Estos ltimos se han utilizado tanto para distinguir grupos supragenricos como para distinguir especies (Williams et al., 1989). 4.2.1.1.- Caracteres morfolgicos Los caracteres morfolgicos son todava muy utilizados para caracterizar el gnero. Los principales tratan sobre el modo de septacin de las hifas, la estabilidad o fugacidad, importancia y disposicin de las hifas del micelio del sustrato o del micelio areo, la presencia de esporangios o de las diversas formas de los conidios, la presencia de esporas, su nmero, su movilidad, su disposicin en las hifas y su forma. La observacin microscpica de estos caracteres debe realizarse alterando lo menos posible las estructuras morfolgicas de las cepas examinadas. Esto es posible empleando objetivos a gran distancia focal que permiten el estudio de las colonias desarrolladas sobre medios slidos translcidos. Pero, aunque a veces sea posible clasificar una cepa en base a criterios morfolgicos completamente evidentes, estos no son suficientes para establecer una determinacin correcta y es indispensable considerar otros caracteres (Lechevalier et al., 1980).

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INTRODUCCIN 4.2.1.2.- Quimiotaxonoma El estudio de los constituyentes mayoritarios de la pared celular de los actinomicetos ha mostrado que estos microorganismos se pueden dividir en ocho tipos, de los cuales los ms importantes son los cuatro primeros. (Tabla 2) Tabla 2: Tipos de pared celular segn sus constituyentes mayoritarios (Lechevalier y Lechevalier, 1980) Tipo de Constituyentes mayoritarios Ejemplo de gneros Pared I L-DAP, glicina Streptomyces II III IV V VI VII VIII Meso-DAP, glicina Meso-DAP Meso-DAP, arabinosa, galactosa Lisina, ornitina Acido asprtico y galactosa DAB, glicina Ornitina Micromonospora Actinomadura Nocardia, Gordonia, Saccharopolyspora Actinomyces Oerskovia Agromyces Cellulomonas

Los actinomicetos con paredes celulares del tipo I poseen principalmente cido diaminopimlico de la forma L, mientras que la forma meso de este mismo cido es caracterstica de los tipos II, III y IV. Por otra parte, la presencia o ausencia de cuatro azcares arabinosa, galactosa, xilosa y madurosa en los hidrolizados cidos de clulas enteras permite clasificar los actinomicetos de los tipos II, III o IV que contienen meso-diaminopimlico. Sobre esta misma base, es posible repartir en dos grupos los actinomicetos con pared celular tipo III segn la presencia o ausencia de madurosa. (Tabla 3) Tabla 3: Tipos de pared celular y tipos glucdicos de los actinomicetos aerobios con meso-DAP (Lechevalier y Lechevalier, 1980) Constituyentes Tipo Constituyentes Tipo de pared distintivos glucdico glucdicos mayoritarios celular caractersticos II Glicina D Xilosa, arabinosa B Madurosa III Ninguno C Ninguno o ramnosa IV Arabinosa, galactosa A Arabinosa, galactosa

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INTRODUCCIN Los cidos miclicos tienen un inters particular en la definicin de los gneros incluidos en el suborden Corynebacterineae (Stackebrandt et al. 1997). Estos son nicos y constituyentes caractersticos de la pared celular de los gneros Nocardia, Gordonia, Rhodococcus, Dietzia, Tsukamurella, Corynebacterium y Mycobacterium, Skermania y Williamsia. Los nicos actinomicetos que contienen cidos miclicos pertenecen al suborden Corynebacterineae al que corresponden todos los microorganismos estudiados en el presente trabajo.

Figura 2: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata (Sutcliffe,1998) El modelo propuesto por Minnikin para la estructura de la cubierta celular los mycolata est descrito en el trabajo de Sutcliffe (1998). En este modelo, los cidos miclicos pueden llegar al 30% del peso de la pared celular. 4.2.2.- Mtodos genotpicos 4.2.2.1- Anlisis de las secuencias del 16S rRNA En la actualidad est demostrado que ciertas macromolculas son cronmetros evolutivos, es decir, medidas del cambio evolutivo. As pues, la distancia evolutiva entre dos organismos puede determinarse por las diferencias en la secuencia de aminocidos o nucletidos de macromolculas homlogas aisladas de cada uno de ellos.

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INTRODUCCIN Para determinar las verdaderas relaciones evolutivas entre organismos, es esencial elegir las molculas adecuadas para los estudios de secuenciacin. Esto es importante por varios motivos. Primero, la molcula debe estar universalmente distribuida en el grupo elegido para ser estudiado. Segundo, deben ser funcionalmente homlogos en cada organismo; las comparaciones filogenticas deben realizarse con molculas de idntica funcin. Tercero, resulta crucial poder alinear apropiadamente las dos molculas a fin de identificar regiones tanto con homologa como con variacin de secuencia. Finalmente, la secuencia de la molcula elegida debera cambiar con una velocidad proporcional a la distancia filogentica que se va a determinar. Y, de hecho, cuanto mayor sea la distancia filogentica a determinar, menos ser la velocidad de cambio de la molcula; demasiado cambio tiende a enturbiar el registro evolutivo. Se han evaluado muchas molculas como cronmetros evolutivos, y entre ellas, los genes que codifican los RNAs ribosmicos, componentes clave del sistema de traduccin, son los que han proporcionado la informacin gentica ms significativa sobre los microorganismos. La mayor parte de la atencin se ha centrado en las secuencias del rRNA 5S y 16S aislados respectivamente de las subunidades 50S y 30S de los ribosomas procariotas. Los rRNA son prcticamente ideales para los estudios de evolucin y parentesco microbianos, puesto que son imprescindibles para un orgnulo esencial que se encuentra en todos los microorganismos. Su papel funcional es el mismo en todos los ribosomas. Adems, su estructura se modifica muy lentamente en el tiempo, debido probablemente a la funcin esencial y constante que desempean. Debido a que el rRNA contiene secuencias variables y estables, es posible comparar tanto microorganismos estrechamente relacionados como de parentesco muy lejano. Esto constituye una importante ventaja, ya que los microorganismos de parentesco lejano slo pueden estudiarse utilizando secuencias que sufren pocas modificaciones con el tiempo. (Madigan et al., 2003; Prescott et al., 2002) 4.2.2.2.- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es un proceso de amplificacin enzimtica in vitro del DNA, iniciada por unos fragmentos cortos de DNA llamados iniciadores o cebadores (primers). Este proceso se lleva a cabo cclicamente. Cada ciclo est dividido temporalmente en tres fases trmicas: desnaturalizacin de la doble cadena de DNA, acoplamiento o unin de los iniciadores y polimerizacin mediante la adicin de dNTPs por la enzima Taq polimerasa. Los productos de la PCR, se detectan por electroforesis en gel de agarosa y se visualizan bajo luz ultravioleta. 22

INTRODUCCIN Muchos problemas derivados de la identificacin de microorganismos mediante las tcnicas tradicionales pueden obviarse mediante la PCR, lo que ha hecho que esta tcnica suponga una alternativa muy eficaz en microbiologa. Adems, la versatilidad de esta tcnica ha permitido su aplicacin a otros campos de inters econmico, como la identificacin gentica, la medicina forense o el control de calidad en las industrias. Para poder disear los iniciadores es necesario conocer la secuencia del fragmento o gen de DNA o RNA que se va amplificar. En muchos casos conocer la secuencia completa del organismo que nos interesa es un proceso caro y difcil, por lo que se recurre a informacin generada por otros investigadores y almacenada en los numerosos bancos de datos para esta finalidad (Madigan et al., 2003; Prescott et al., 2002). 4.2.3.- Mtodos fenotpicos Actualmente, para clasificar correctamente un microorganismo se utiliza la taxonoma polifsica, es decir, utilizar gran cantidad de informacin. Esta informacin se divide en informacin genotpica e informacin fenotpica. La informacin genotpica comprende todo lo relacionado con el DNA, el RNA y las protenas. La informacin fenotpica comprende todo lo que son marcadores quimiotaxonmicos as como la morfologa y fisiologa del microorganismo. ste tipo de taxonoma intenta asimilar muchos niveles de informacin, desde moleculares a ecolgicos para as poder clasificar e identificar de una manera ms correcta a los microorganismos. El estudio del 16S solamente abarca una pequea porcin del genoma de la bacteria, con lo que estaramos despreciando un alto contenido de informacin. Como datos de apoyo se utilizan los marcadores quimiotaxonmicos y las pruebas fenotpicas son las que nos dan una visin ms global del genoma (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 2 Ed., 2001).

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OBJETIVOS OBJETIVOS La depuracin de aguas residuales por el sistema de fangos activos es un proceso biotecnolgico donde intervienen multitud de parmetros operacionales, todos ellos interrelacionados. Tradicionalmente se han controlado los parmetros fsico-qumicos como si de un sistema inerte se tratara aunque actualmente se conoce el papel crucial que realizan los microorganismos. Segn se ha explicado en la introduccin, el crecimiento indeseado de actinomicetos productores de cidos miclicos (mycolata) puede interferir seriamente en el funcionamiento correcto del sistema de fangos activados. En muchas plantas de tratamiento europeas, australianas y americanas se han estudiado con detalle estos microorganismos; sin embargo en las plantas de tratamiento espaolas se est empezando a estudiar desde hace escasos aos. Por ello es importante conocer la diversidad de especies que nos encontramos en las plantas de tratamiento potencialmente productoras de espumas. Por lo tanto, en el presente trabajo nos planteamos utilizar la taxonoma polifsica para estudiar la biodiversidad de los microorganismos productores de espumas. Los objetivos parciales son: 1.- Caracterizacin morfolgica de los aislados obtenidos de muestras de espumas biolgicas provenientes de plantas depuradoras. Seleccin de los aislados ms representativos. 2.- Caracterizacin quimiotaxonmica de las cepas mediante la extraccin y anlisis de cidos miclicos, la determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP) y la extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular. 3.- Caracterizacin fenotpica de las cepas mediante la realizacin de una serie de tests fenotpicos. 4.- Identificacin a nivel de especie mediante anlisis de la secuencia del 16S rRNA por medio de la realizacin de rboles filogenticos para establecer las relaciones evolutivas entre los aislados y anlisis de las matrices de similaridad de nucletidos.

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MATERIAL Y MTODOS

1.- Cepas bacterianas de referencia

En el presente trabajo se han utilizado un total de 22 cepas de referencia suministradas por la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Esta coleccin de cepas contiene especies pertenecientes a todas las familias del suborden Corynebacterineae. Entre las cepas del gnero Gordonia se encuentra la especie G. amarae que es la especie aislada con ms frecuencia en muestras de espumas. De los gneros Nocardia y Rhodococcus se incluyen las especies patgenas N. asteroides y R. equi. En la tabla 4 se muestra la relacin de cepas de referencia utilizadas. Tabla 4: Microorganismos de referencia utilizados Cepa
Corynebacterium xerosis Dietzia maris Gordonia amarae Gordonia rubropertincta Gordonia terrae Gordonia nitida Gordonia hirsuta Gordonia hydrophobica Mycobacterium phlei Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Nocardia carnea Nocardia farcinica Nocardia nova Nocardia soli Rhodococcus coprophilus Rhodococcus equi Rhodococcus erythropolis Rhodococcus rhodnii Rhodococcus rhodochrous Skermania piniformis Tsukamurella spumae

Nmero de la coleccin
CECT 4160 CECT 4617 CECT 5704 CECT 5393 CECT 5707 CECT 7017 CECT 7018 CECT 7021 CECT 3009 CECT 3051 CECT 3052 CECT 3374 CECT 3053 CECT 3056 CECT 3375 CECT 5751 CECT 555 CECT 3013 CECT 5750 CECT 5749 CECT 3057 DSM 44113

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MATERIAL Y MTODOS Todas las cepas se incubaron en medio YEME en condiciones de aerobiosis de 5 a 10 das dependiendo de la cepa. En el caso de Skermania piniformis se utiliz el medio 180 segn recomienda la CECT. Esta especie necesita un tiempo de incubacin de 20-25 das para obtener colonias visibles. Todas las cepas se mantuvieron en crioviales con caldo nutritivo con un 20% de glicerol a 20C. Antes de proceder a su congelacin, as como despus de recuperar una cepa, se comprob la pureza del cultivo mediante tincin Gram, para comprobar que no ha habido ningn tipo de contaminacin. El estudio previo de estas cepas de referencia, tanto a nivel macroscpico como a nivel microscpico, facilit la posterior caracterizacin morfolgica de los aislados estudiados en este trabajo.

2.- Caracterizacin de muestras de fangos activos

2.1.- Toma de muestras
La toma de muestras se realiz por el propio personal de la planta. Se tomaron muestras de espumas del reactor biolgico en recipientes estriles y se enviaron al laboratorio donde se guardaron en refrigeracin a 4 C y se procesaron dentro de las 24 horas siguientes. Todas las plantas estudiadas realizan el proceso basado en el sistema de fangos activos y realizan la depuracin de aguas residuales urbanas. En el presente trabajo se ha realizado una seleccin de aislados que fueran lo ms representativos posibles seleccionando aquellos que presentaron mayor diversidad morfolgica. En la tabla 5 se presentan las plantas estudiadas en el presente trabajo. En esta tabla se muestran todas las muestras de fangos activos que fueron recibidas, as como los aislados que se obtuvieron a partir de ellas en trabajos anteriores. Se resaltan en negrita los aislados utilizados en el presente estudio.

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MATERIAL Y MTODOS Tabla 5: Aislados obtenidos de las muestras de EDARS EDAR FECHA Alcoy 2004 Algemes 2004 Algors 2004 Bemsa 2004 Benidorm 2004 Camp de Turia 2004 Carcaixent 2004 Castelln 2005 Denia 2004 Formentera 2005 Mancomunada 2004 Mora dEbre 2005 Pinedo 2004 Quart 2004 Rincn de Len 2004 Rojales 2005 Torres Torres 2004 Torrevieja 2004 Vall dUx 2005 Vinalop 2004 Viver 2005 Lloc Nou 2005 AISLADOS P54 P145, P162 P152, P153, P155, P157, P163 P102, P103, P105, P107, P108, P110 P60, P61, P63, P72, P73, P74, P80, P81, P84 P134, P135, P136,P138 P132 N16-9, N22-7, N22-11 P158, P159, P160 N4 P175 N5 P48a, P48b, P51, P52 P26, P28, P38 P39 N1, N2 P165, P166, P167, P168, P169, P177 P141 N7, N9-1, N9-3, N20-1 P42, P46, P46p N17-4, N17-8, N17-11 L2, L10, E9

2.2.- Caracterizacin morfolgica

Para cada aislado se realiz una observacin macroscpica y una observacin microscpica. Con esto se comprob que los resultados obtenidos coincidieran con el trabajo previo realizado. La observacin macroscpica se fundamenta en el aspecto de las colonias aisladas: dimensin, color, contorno regular o irregular, textura, superficie lisa o rugosa, opacidad, color reverso, consistenciaetctera. Adems, se efectu la prueba de la catalasa para comprobar que fueran catalasa positivos. Para la observacin microscpica se realiz una tincin Gram para comprobar que tuvieran una morfologa tpicamente nocardioforme.

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MATERIAL Y MTODOS La microscopa directa est basada en que determinados grupos de mycolata tienen una morfologa peculiar que se puede utilizar para identificarlos: * Morfologa GALO (Gordonia amarae- like-organism). Presenta ramificaciones en ngulo recto producida por especies de Gordonia y de Nocardia. * Morfologa PTLO (Pine-Tree-Like-Organism). Presenta ramificaciones en ngulo agudo para el caso de Skermania.

2.3.- Caracterizacin quimiotaxonmica

Para esta caracterizacin se llevaron a cabo tres pruebas fundamentales: Extraccin y anlisis de cidos miclicos, Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular.

Estos tres marcadores quimiotaxonmicos son lo que mejor definen al grupo de los mycolata. 2.3.1.- Extraccin y anlisis de cidos miclicos 2.3.1.1.- Materiales Para realizar este anlisis se prepar previamente: TBAH (hidrxido de tetrabutil amonio) al 5% mediante la dilucin, con agua destilada y cido molibdofosfrico al 5% mediante la dilucin de cido molibdofosfrico al 10% con

estril, de TBAH al 40%. etanol absoluto. La solucin adquiere un color verdoso. Es necesario mantener a 4 C. En el ensayo se emple una placa de celulosa TLC de 20x20 cm (Merck 1.05554).

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MATERIAL Y MTODOS 2.3.1.2.- Metodologa La deteccin de cidos miclicos se ha realizado siguiendo el mtodo propuesto por Hamid et al. (1993). En primer lugar se aadi, en criotubos de 2 ml., 1000 L de TBAH y aproximadamente 100 mg de perlas de vidrio (< 106 ). Posteriormente, a partir de los cultivos en ISP-2 de los actinomicetos, se agreg un asa de siembra de cada muestra a cada criotubo y, tras agitar en vrtex durante 30 segundos como mnimo, se incubaron en termoblock a 100 C durante 4 horas. Tras las 4 horas de incubacin, los criotubos se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos. Seguidamente se transfiri el sobrenadante a un nuevo criotubo, al que se le aadi 1 ml de diclorometano y 25 L de yodometano (todo ello se realiz en la cmara de extraccin de gases) para, posteriormente homogeneizarlo en un tuborotador a 40 rpm durante 30 minutos. Pasados estos se centrifug a 2000 rpm durante 3 minutos y se transfiri la capa de abajo a un nuevo tubo eppendorf. Esos tubos eppendorf se depositaron en el termoblock a una temperatura constante de 55 C hasta que estuvieron completamente secos y, seguidamente, se redisolvieron con 75 L de ter de petrleo. Una vez preparadas las muestras se procedi a aplicar 5 L de cada una de ellas en una placa de celulosa. Esta placa de celulosa se coloc en una cubeta de vidrio que contena ter de petrleo y acetona (95:5) y se mantuvo all hasta que el frente estuvo aproximadamente a 1 cm del final de la placa. A continuacin se dej secar la placa y se pulveriz, en la cmara extractora de gases, con cido molibdofosfrico al 5%. Finalmente se incub en estufa a 100 C durante 5-10 minutos y se procedi a su lectura. 2.3.2.- Determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP) 2.3.2.1.- Materiales Para realizar esta prueba se tuvo que preparar anteriormente: 50 ml de sistema disolvente, aadiendo 33,3 ml de metanol, 11 ml de agua destilada y

esterilizada, 1,6 ml de HCl 6 N y 4,1 ml de piridina. La mezcla se conserv a 4 C en cmara frigorfica hasta su utilizacin. 29

MATERIAL Y MTODOS 100 ml de control, disolviendo 0,0019 g del patrn de DAP (Sigma) en 10 ml de agua

destilada y esterilizada En el ensayo se emple una placa de celulosa TLC de 20x20 cm (Merck 1.05716). 2.3.2.2.- Metodologa La deteccin de la presencia de cido diaminopimlico (DAP) y la identificacin de sus ismeros es uno de los procedimientos ms utilizados para bacterias Gram-positivas del grupo de los actinomicetos. El principal componente de la pared celular en las bacterias Gram-positivas es el peptidoglicano, que puede contener uno de los ismeros del DAP, estos son, L-DAP o mesoDAP. Estos ismeros pueden ser determinados por anlisis del hidrolizado cido de la clula total y separacin por cromatografa en capa fina (Staneck y Roberts, 1974). Para llevar a cabo dicha determinacin, en primer lugar se aadieron 500 L de HCl 6N a criotubos de 2 mL conteniendo aproximadamente 100 mg de perlas de vidrio (<106 ). A continuacin, y a partir de los cultivos en ISP-2 de los actinomicetos, se aadi un asa de siembra de cada una de las muestras a cada criotubo y, tras agitar en vrtex durante 6 minutos, se incubaron en termoblock a 100C durante 4 horas. Transcurridas las 4 horas de incubacin, los criotubos se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos y se transfiri el sobrenadante a nuevos tubos eppendorf. Estos eppendorf se incubaron en termoblock a 100C hasta el secado del sobrenadante y, una vez seco, se aadieron 500 L de agua destilada estril resuspendiendo la mezcla mediante vrtex. De nuevo, se centrifugaron las muestras durante 5 minutos a 4000 rpm y se transfiri el sobrenadante a nuevos tubos eppendorf que se llevaron a incubar a 100C hasta que el sobrenadante se sec por completo. Transcurrido el tiempo necesario para su secado, se redisolvi con 75 L de agua destilada. Una vez preparadas las muestras, se procedi a aplicar 3 L de cada una de ellas y 1 L del control en la placa de celulosa. Realizado esto, la placa se coloc en una cubeta de vidrio conteniendo 50 mL del sistema disolvente previamente preparado y se mantuvo all durante 5 horas. Al cabo de esas 5 horas, se 30

MATERIAL Y MTODOS dej secar la placa y se pulveriz, en la cmara extractora de gases, con ninidrina en acetona al 0,2%. A continuacin, se incub en estufa a 100C durante 5-10 minutos y se procedi a su lectura. 2.3.3.- Extraccin y anlisis de los azcares predominantes de la pared celular 2.3.3.1.- Materiales Para realizar esta prueba se prepar anteriormente: Reactivo de eftalato de anilina: se prepar con 3,25 g de cido eftlico, que se aadieron

a 100 ml de agua saturada en butanol y 2ml de anilina. Se mantuvo a 4 C en cmara frigorfica hasta su utilizacin. Agua saturada en butanol: se aadieron agua y n-butanol en una proporcin de 1:1. Azcar estndar en piridina al 1% (en nuestro caso arabinosa y galactosa). En el ensayo se utiliz una placa de celulosa TLC de 10x20 cm (Merck 1.05552). 2.3.3.2.- Metodologa El estudio de los constituyentes mayoritarios de la pared celular de los actinomicetos tiene una importancia taxonmica considerable. Es por ello por lo que consideramos que esta prueba es fundamental. Para llevarla a cabo se utiliz el protocolo propuesto por Hasegawa et al., 1983. En primer lugar se aadieron 0,1 ml de HCl 0,25 N a cada criotubo. Posteriormente, y a partir de los cultivos puros de cada cepa, se aadi media asa de siembra a cada criotubo y se autoclavaron durante 15 minutos a 121 C. Despus de dejar enfriar a temperatura ambiente se aadieron, a la placa de celulosa TLC, 1 L de la preparacin estndar de los azcares (arabinosa y galactosa) y 3 L de cada muestra. Hecho esto, la placa se introdujo en una cubeta de vidrio conteniendo 10 n-butanol : 6 H2O : 6 piridina: 1 tolueno y se dej desarrollar hasta que el frente estuvo a 1 cm del final de la 31

MATERIAL Y MTODOS placa. Posteriormente se dej secar fuera de la cubeta y se meti de nuevo en la cubeta durante 2 horas aproximadamente. Una vez transcurridas esas 2 horas se dej secar la placa fuera de la cubeta y se roci, en la cmara extractora de gases, con el reactivo de eftalato de anilina. A continuacin se incub en estufa a 100 C durante 4 minutos.

2.4.- Caracterizacin genotpica

Para ello, partiendo de un cultivo puro de cada una de las cepas, se procedi a la extraccin del DNA siguiendo el protocolo del CTAB (Bromuro de Cetil-trimetil-amonio). Adems tambin se utiliz un kit de extraccin de DNA (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante, que asegura un contenido ms puro aunque una menor cantidad. El DNA extrado de las muestras fue amplificado mediante PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) utilizando los iniciadores especficos 27f (5AGAGTTTGATCMTGGCTCAG, siendo M = C,A) y 1492r (5TACGGYTACCTTGTTACGACTT, siendo Y = C,T) (Lane, 1991). Finalmente, los productos obtenidos de la PCR se purificaron y secuenciaron, para posteriormente analizar la secuencia e identificar cada cepa a nivel de especie. 2.4.1.- Extraccin de DNA. Protocolo del CTAB. Los actinomicetos forman agrupaciones de hifas fuertemente unidas que es necesario disgregar para conseguir rendimientos adecuados en la extraccin de DNA. Adems, muchas especies crecen adheridas al agar debido al micelio de sustrato que producen. En primer lugar se aadi 500 L de tampn TE (Tris-ClH 10 mM, EDTA 1mM) a cada tubo eppendorf, a los que previamente se haban aadido perlas de vidrio (< 106 ). Posteriormente se lisaron las clulas aadiendo 100 L de lisozima (50 mg/mL) y se incubaron durante 1 hora a 37 C en un termoblock agitando cada 5-10 minutos en vrtex para deshacer agregados y facilitar la accin de la lisozima. A continuacin se aadieron 30 L de dodecil sulfato sdico (SDS) al 10% y 3 L de proteinasa K (20 mg/mL). Los tubos eppendorf se agitaron y se incubaron nuevamente, esta vez durante 30 minutos a 37 C.

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MATERIAL Y MTODOS Pasado este tiempo, se aadieron 100 L de NaCl 5 M y 80 L de una solucin de CTAB/NaCl (CTAB 10% en NaCl 0,7 M), se agitaron las muestras en vrtex y se incubaron a 65C durante 10 minutos. La purificacin del DNA se realiz aadiendo un volumen de 700 L de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1), agitando y centrifugando a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar los complejos formados por el CTAB. El sobrenadante se transfiri a un nuevo tubo eppendorf y se aadi un volumen de 700 L de cloroformo/alcohol-isoamlico (24:1). Se agit la mezcla y se centrifug a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar los restos de complejos con el CTAB (protenas y polisacridos). A continuacin, el sobrenadante, que contiene los cidos nuclicos, se transfiri a otro tubo eppendorf y se adicion el mismo volumen de isopropanol fro para precipitar el DNA. El DNA precipitado se centrifug a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar el isopropanol y se lav el precipitado con 500 L de etanol fro al 70%. Finalmente, se centrifug para eliminar el etanol, se sec en una secadora de vaco durante 15 minutos y se resuspendi en 50 L de tampn TE. Para eliminar los restos de RNA extrado se aadi 1 L de RNAsa (25 mg/mL). Las muestras se conservaron a 4 C durante 24 horas, tras las cuales, se realiz un gel de comprobacin de la extraccin. 2.4.2.- Electroforesis en gel de agarosa Para comprobar la adecuada extraccin del DNA se analizaron las muestras (3 L de cada una de ellas) mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% en tampn TAE 1X. Para ello se aadi 1,2 g de agarosa en 100 ml de TAE 1X, preparado a partir de la adicin de 20 ml de TAE 50X (48,9 g de Tris base, 7,44 g de Na2EDTA 2H2O y 1,42 mL de cido actico glacial a 1000 mL de agua MiliQ, ajustando el pH a 8,5) y 980 ml de agua MiliQ. Una vez solidificado el gel se procedi a cargarlo con los 3 L de cada muestra, a los que anteriormente se mezclaron un tampn de carga. Adems se debe disponer en los extremos del gel un marcador que, en nuestro caso, es de 100 pb. Una vez cargado el gel, se le somete a un voltaje de 90 V durante 45 minutos. Los fragmentos de DNA se visualizaron con un

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MATERIAL Y MTODOS transiluminador de UV tras teirlos con bromuro de etidio. Finalmente, las muestras se conservaron a -20 C hasta su utilizacin. 2.4.3.- Amplificacin por PCR La amplificacin del 16S rDNA se realiz mediante PCR, utilizando los iniciadores 27f y 1492r (Lane, 1991). La reaccin se realiz en un volumen total de 50 L conteniendo 1,5 M de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs (mezcla equimolar de los cuatro nucletidos), 0,4 M de cada iniciador, 1,25 U del enzima Taq polimerasa (Ecogen) con su correspondiente tampn y 3 L de DNA. En cada reaccin de amplificacin se incluy un control negativo en el que el DNA se reemplaz por agua estril. A continuacin, se realiz la reaccin de amplificacin que comienza con una fase inicial de desnaturalizacin (95 C durante 5 minutos), seguida de 35 ciclos compuestos por la desnaturalizacin (95 C durante 1 minuto), la unin de iniciadores (54 C durante 1 minuto) y la elongacin (72 C durante 1 minuto). Por ltimo, se produce un ciclo final de extensin (72 C durante 10 minutos) (Tabla 6). Tabla 6: Ciclos de la reaccin de amplificacin de la PCR para actinomicetos
1 ciclo 95 C 95 C 35 ciclos 55 C 72 C 1 ciclo 72 C 5 min. 1 min. 1 min. 1 min. 10 min. Desnaturalizacin Desnaturalizacin Unin de iniciadores Elongacin Extensin

El DNA amplificado por la PCR (8 L) se visualiz mediante electroforesis en gel de agarosa del modo descrito anteriormente. 2.4.4.- Purificacin del DNA El 16S rDNA obtenido tras la PCR se purific utilizando el kit de purificacin GenElute (Sigma), siguiendo las indicaciones del fabricante. A continuacin, los productos purificados (3 L) se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa del modo descrito anteriormente (punto 2.4.2.).

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MATERIAL Y MTODOS 2.4.5.- Obtencin y anlisis de las secuencias del 16S rDNA La secuenciacin de los productos obtenidos tras la PCR fue realizada en el Laboratorio de Secuenciacin de Sistemas Genmicos S.L. Para la realizacin de las reacciones de secuenciacin se utiliz el kit ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction (versin 3.1). Estas reacciones fueron sometidas a electroforesis capilar en un secuenciador automtico Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer. La secuencia de bases de cada fragmento, con una longitud aproximada de 600 a 700 nucletidos, se obtuvo en un archivo de texto electrnico desde el electroferograma mediante la aplicacin cientfica CHROMAS (versin 1.43). Las secuencias del 16S rDNA fueron ensambladas manualmente, utilizando el programa informtico PHYDIT, a partir de la combinacin de fragmentos separados generados con los iniciadores 27f y 1492r que amplifican el segmento 16S en sentidos opuestos. Los segmentos inicial y final (alrededor de 25 nucletidos de longitud) de cada secuencia parcial, debido a que suelen presentar una baja fiabilidad, fueron eliminados antes de ensamblar la secuencia completa. Las secuencias parcialmente alineadas se unieron para generar una secuencia completa del gen del 16S rDNA. La probable identidad de cada una de las cepas secuenciadas se determin mediante la herramienta informtica BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponible en Internet a partir del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Jones, 2006). 2.4.6.- rboles filogenticos A partir de las secuencias se obtienen los rboles filogenticos de cada gnero, para as poder caracterizar mejor cada especie encontrada. Como se ha comentado anteriormente, lo que nos aporta el BLAST (Basic Local Alignment Tool) es la posible identidad, con un alto porcentaje de validez, de cada cepa secuenciada. Para realizar dichos rboles filogenticos se utiliz el programa informtico PHYDIT y, dentro de l, la herramienta llamada CLUSTAL X. Previamente se seleccionaron las especies tipo validadas de cada gnero (Euzby, J. P.) y se seleccion la secuencia del 16S rDNA de cada especie en el banco de datos del NCBI. Posteriormente se escogi para cada gnero todas las especies validadas y, adems, las especies tipo de cada gnero del suborden 35

MATERIAL Y MTODOS Corynebacterineae. Por ltimo se escogi una especie alejada de ellas que sirviera como raiz para as poder dar validez al rbol filogentico, que en nuestro caso fue Turicella otitidis. Una vez realizado esto se procedi a generar los rboles filogenticos mediante la herramienta PHYDIT package (Chun, 1995). Primero se dedujeron los rboles usando el mtodo del algoritmo neighbour-joining. Posteriormente se evaluaron por el anlisis del bootstrap (Felsenstein, 1993) utilizando el mtodo del neighbour-joining (Saitou y Nei, 1987). Por ltimo se utiliz el programa informtico TREECONW para generar finalmente los rboles filogenticos. 2.4.7.- Matrices de similaridad Una vez realizados los rboles filogenticos se procede a confeccionar las matrices de similaridad que indican el porcentaje de similaridad entre los nucletidos estudiados que existe entre las cepas aisladas y las cepas ms representativas que componen el rbol filogentico. Las matrices de similaridad se realizan mediante el programa informtico PHYDIT, utilizando la herramienta Sim Table.

2.5.- Caracterizacin fenotpica

El objetivo de la taxonoma polifsica es obtener datos codificados en todo el genoma bacteriano. Con esto se consiguen datos de apoyo a los resultados obtenidos con la caracterizacin genotpica. Para esta caracterizacin se realizaron 12 test fenotpicos. 2.5.1.- Tests fenotpicos Se han realizado una serie de test fenotpicos, basados en la degradacin de diversos compuestos, crecimientos con diferentes fuentes de carbono y crecimientos con diferentes fuentes de carbono y nitrgeno. Adems se realizaron tests de tolerancia para comprobar los crecimientos a diferentes temperaturas.

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MATERIAL Y MTODOS 2.5.1.1.- Degradacin 2.5.1.1.1.- Esculina La hidrlisis de la esculina se determin en el medio basal de Williams. Para ello se suplement este medio con aesculina (0,1%). Todo ello se verti en placas, las cuales se inocularon con las cepas a estudiar. Posteriormente cada una de ellas fue examinada despus de 7 y 14 das. Si el medio se ennegreca indicaba un resultado positivo. 2.5.1.1.2.- L- Tirosina Este test se realiz utilizando el medio GYEA al que se le aadi L-Tirosina (0,5%). Despus de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 das, indicando un resultado positivo la presencia de halos en las placas. 2.5.1.2.- Fuente de carbono (1%) Para estas pruebas se realiz un control positivo que consisti en incubar las cepas en medio GYEA a 28 C durante 7, 14 y 21 das. 2.5.1.2.1.- -L-Ramnosa Este test se realiz utilizando el medio Stevenson al que se le aadi -L-Ramnosa (1%). Despus de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 das, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las placas de control positivo GYEA. 2.5.1.2.2.- D-Galactosa Este test se realiz utilizando el medio Stevenson al que se le aadi D-Galactosa (1%). Despus de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 das, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa

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MATERIAL Y MTODOS de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las placas de control positivo GYEA. 2.5.1.2.3.- D-Ribosa Para realizar este test se utiliz el medio Stevenson al que se le aadi D-Ribosa (1%). Despus de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 das, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las placas de control positivo GYEA. 2.5.1.2.4.- meso-Inositol Este test utiliz el medio Stevenson al que se le aadi meso-Inositol (1%). Despus de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 das, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las placas de control positivo GYEA. 2.5.1.3.- Fuente de carbono (0,1%) Para estas pruebas se realiz un control positivo que consisti en incubar las cepas en medio GYEA a 28 C durante 7, 14 y 21 das. 2.5.1.3.1.- cido Benzoico (sal de Na) Para realizar este test se utiliz el medio Stevenson al que se le aadi cido benzoico (0,1%). Despus de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 das, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las placas de control positivo GYEA.

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MATERIAL Y MTODOS 2.5.1.3.2.- cido ctrico Este test utiliz el medio Stevenson al que se le aadi cido ctrico (0,1%). Despus de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 das, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa de control positivo GEYA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las placas de control positivo GYEA. 2.5.1.4.- Fuente de carbono y nitrgeno (0,1%) Para estas pruebas se realiz un control positivo que consisti en incubar las cepas en medio GYEA a 28 C durante 7, 14 y 21 das. 2.5.1.4.1.- L-Prolina En este test se utiliz el medio Stevenson al que se le aadi L-Prolina (0,1%). Despus de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 das, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las placas de control positivo GYEA. 2.5.1.5.- Test de tolerancia 2.5.1.5.1.- Crecimiento a diferentes temperaturas En este test fenotpico se realiz la siembra de las cepas en medio GYEA y se incubaron a 10 C, 28 C (control), 37 C y a 45 C. La nomenclatura que se utiliz fue diferente, siendo 0 para describir que no hay crecimiento, + para describir que existe un crecimiento bajo, ++ para un crecimiento medio y +++ para un crecimiento alto.

39

RESULTADOS Y DISCUSIN

1.- Caracterizacin de muestras de fangos activos

1.1.- Caracterizacin morfolgica
Para realizar la caracterizacin morfolgica se realiz una observacin macroscpica directa en placa y, posteriormente, una observacin microscpica mediante tincin Gram. Adems se realiz la prueba de la catalasa. En la tabla 7 se muestran los resultados obtenidos: Tabla 7: Descripcin macroscpica y microscpica de los aislados Cepa P26 P39 P46p P48b P54 P72 P108 P132 P135 P141 P145 P152 P158 P166 P175 P177 N1 N4 N5 N9-1 N16-9 N17-4 E9 L2 L10 Descripcin Macroscpica Anaranjadas, regulares, lisas, mucosas Anaranjadas, pequeas, irregulares , mucosas Anaranjadas, mucosas, pequeas, regulares, lisas Rojo-asalmonadas, pequeas, irregulares, rugosas Rosadas, pequeas, regulares, rugosas Amarillo, pequeas, regulares, lisas, mucosas Asalmonadas, pequeas y regulares, mucosas Amarillo claro, grandes, regulares, lisas Anaranjadas, pequeas, irregulares y rugosas Anaranjadas, pequeas, regulares, lisas Anaranjadas, medianas, irregulares, rugosas Color ocre, pequeas e irregulares, rugosas Anaranjadas, pequeas, rugosa, irregulares Naranja muy vivo, medianas, irregulares, rugosas Amarillo-blanquecinas, medianas, regulares, rugosas Naranja-asalmonadas, medianas, irregulares Naranjas, medianas, irregulares, rugosas Naranjas, medianas, irregulares, rugosas Naranjas, medianas, irregulares, rugosas Naranjas, medianas, irregulares, rugosas Naranjas, medianas, irregulares, rugosas Naranjas, medianas, irregulares, rugosas Amarillas, medianas, regulares, lisas Anaranjadas, medianas, irregulares, rugosas Rosadas, pequeas, irregulares, rugosas Descripcin Microscpica Cocobacilos Cocos Cocos Bacilos Bacilos pequeos irregulares Cocos Cocos Bacilos pequeos Cocobacilos Bacilos pequeos Bacilos irregulares Bacilos ramificados en ngulo recto Cocobacilos Bacilos irregulares Cocobacilos Cocobacilos Bacilos irregulares Bacilos irregulares Bacilos irregulares Bacilos irregulares Bacilos irregulares Bacilos irregulares Cocobacilos Bacilos irregulares Bacilos

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RESULTADOS Y DISCUSIN En las figuras siguientes podemos observar alguna cepa de cada gnero:

Figura 3: Dietzia maris (P26)

Figura 4: Gordonia amarae (P152)

Figura 5: Gordonia malaquae (P175)

41

RESULTADOS Y DISCUSIN

Figura 6: Rhodococcus ruber (P135)

Figura 7: Tsukamurella pseudospumae (N1)

Figura 8: Tsukamurella spumae (P166)

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RESULTADOS Y DISCUSIN Todos los actinomicetos estudiados son catalasa positivos y Gram-positivos. Generalmente las formas mucosas suelen ser formas cocoides y las formas rugosas o sin brillo suelen ser bacilos de tamao variable en ocasiones con ramificaciones en ngulo recto bien desarrolladas, como es el caso del aislado P152.

1.2.- Caracterizacin quimiotaxonmica

Para realizar esta caracterizacin se utilizan tres marcadores quimiotaxonmicos que definen correctamente a los aislados dentro del suborden Corynebacterineae. En primer lugar se realiz la extraccin y anlisis de los cidos miclicos de la pared celular. Con ello se comprueba su pertenencia al suborden, ya que si no poseen estos cidos no se podran incluir en l. En esta prueba se obtiene un parmetro que se denomina RF, el cual nos indica la movilidad relativa de los cidos miclicos. Se define como el cociente entre la movilidad los cidos y lo que avanza el frente. La segunda prueba realizada fue la determinacin de los ismeros del cido diaminopimlico (DAP). Todas las especies pertenecientes al suborden Corynebacterineae deben tener la forma meso-DAP. Por ltimo se determinaron los azcares predominantes de la pared celular. En nuestro caso se debe obtener una tipo de pared celular IV, siendo los constituyentes distintivos mayoritarios arabinosa y galactosa. A continuacin se muestran los resultados obtenidos tras la separacin cromatogrfica en placa de celulosa (tabla 8 y figuras 9 y 10):

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RESULTADOS Y DISCUSIN Tabla 8: Resultados pruebas quimiotaxonmicas de los aislados Cepa cidos Miclicos RF cido Diaminopimlico (DAP) Azcares predominantes

P26 + 0,33 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P39 + 0,34 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P46p + 0,30 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P48b + 0,41 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P54 + 0,34 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P72 + 0,34 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P108 + 0,44 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P132 + 0,41 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P135 + 0,39 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P141 + 0,46 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P145 + 0,66 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P152 + 0,40 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P158 + 0,43 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P166 + 0,53 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P175 + 0,34 Forma MESO Arabinosa y Galactosa P177 + 0,47 Forma MESO Arabinosa y Galactosa N1 + 0,50 Forma MESO Arabinosa y Galactosa N4 + 0,48 Forma MESO Arabinosa y Galactosa N5 + 0,48 Forma MESO Arabinosa y Galactosa N9-1 + 0,48 Forma MESO Arabinosa y Galactosa N16-9 + 0,48 Forma MESO Arabinosa y Galactosa N17-4 + 0,47 Forma MESO Arabinosa y Galactosa E9 + 0,33 Forma MESO Arabinosa y Galactosa L2 + 0,49 Forma MESO Arabinosa y Galactosa L10 + 0,34 Forma MESO Arabinosa y Galactosa RF = Distancia frente inferior hasta centro mancha / Distancia frente inferior hasta frente superior

Como se puede observar en la tabla 8 y en las figuras 9 y 10, los gneros Gordonia, Nocardia y Rhodococcus tienen un RF muy parecido entre ellos, sin embargo el gnero Tsukamurella posee un RF algo mayor. Esto es debido a la diferencia de longitud en las cadenas carbonadas de los cidos miclicos, ms corta en gneros como Nocardia, Rhodococcus, Dietzia y Gordonia y ms larga en gneros como Tsukamurella y Mycobacterium. En un sistema de separacin cromatogrfica en capa fina, como el empleado en el presente trabajo, las molculas de mayor tamao avanzan ms rpidamente y por lo tanto tienen en RF mayor. Como control negativo se utiliz la cepa Streptomyces albus CECT 3077 que no posee cidos miclicos.

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RESULTADOS Y DISCUSIN

cidos miclicos

P46p P48b

P108

P152

P132

5 Tsukamurella

Figura 9: Cromatoplaca de cidos miclicos de los aislados P46p, P48b, P108, P152, P132. Rhodococcus rhodochrous (CECT 5749) (4) y Streptomyces albus (CECT 3077) (5).

spumae (DSM 44113) (1), Gordonia amarae (CECT 5704) (2), Nocardia asteroides (CECT 3051) (3),

cidos miclicos

N1

N4

N5

N9-1

L2

Figura 10:3: Dietzia mariscidos miclicos de los aislados N1, N4, N5, N9-1, L2. Tsukamurella spumae (DSM Figura Cromatoplaca de (P26) 44113) (1), Gordonia amarae (CECT 5704) (2), Nocardia asteroides (CECT 3051) (3), Rhodococcus rhodochrous (CECT 5749) (4) y Streptomyces albus (CECT 3077) (5).

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RESULTADOS Y DISCUSIN Como se observa en la tabla 8 todos los aislados tienen la forma meso-DAP. En la figura 11 se observa la cromatoplaca de alguno de los aislados. Es algo esperado ya que los gneros incluidos en el suborden Corynebacterineae siempre presentan la forma meso-DAP.

L-DAP meso-DAP

P108 P132 P135 P141 P145 P152 P158 P166 P175 P177

Figura 11: Cromatoplaca de ismeros del DAP. En los extremos se observan los patrones de las formas L-DAP y meso-DAP

En la determinacin de los azcares se toman como referencia la arabinosa y galactosa ya que estos son los predominantes en la pared celular de los mycolata. Como se observa en la tabla 9 todos los aislados contienen arabinosa y galactosa como azcares predominantes. En la figura 12 se observan los azcares de algunos de los aislados, arabinosa (color granate) y galactosa (color verdoso).

Arabinosa Galactosa

P26

P39

P46p

P48b

P54

P72

Figura 12: Cromatoplaca de los azcares predominantes. En los extremos se observan los patrones de Arabinosa y Galactosa

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RESULTADOS Y DISCUSIN

1.3.- Caracterizacin genotpica

Una vez realizada la extraccin de DNA, se comprob la cantidad y calidad del mismo antes de llevar a cabo la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2%. Despus de realizar la separacin electrofortica, se procedi a la tincin del gel con bromuro de etidio. La deteccin de los fragmentos amplificados obtenidos tras la PCR se realiz tambin mediante electroforesis en gel de agarosa.
1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 13: Comprobacin extraccin DNA. 1: P26; 2: P72; 3:P108; 4: P132; 5: P166; 6: N1; 7: N4; 8: N9-1

9 10 11 12 13 14 15 16

1500 pb

Figura 14: Gel de PCR con los productos de amplificacin del 16S rDNA.1 y 16: Marcador de peso molecular; 2: Blanco sin DNA; 3: P26; 4: P39; 5: P46p; 6:P48b; 7: P54; 8: P72; 9: P108; 10: P135; 11: P141; 12: P145; 13: N5; 14: N16-9; 15: N17-4

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RESULTADOS Y DISCUSIN Los productos de la PCR se purificaron y se enviaron a secuenciar a la empresa Sistemas Genmicos S.L. Para la realizacin de las reacciones de secuenciacin se utiliz el kit ABI PRISM Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction (versin 3.1). Estas reacciones fueron sometidas a electroforesis capilar en un secuenciador automtico Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer. Las secuencias completas, obtenidas con ayuda de los programas informticos CHROMAS y PHYDIT, se analizaron mediante el programa BLAST (NCBI) para obtener la posible identificacin a nivel de especie. De las 25 aislados seleccionadas se obtuvieron 5 gneros distintos. En la tabla 9 se muestran los resultados conseguidos. Tabla 9: Posible identificacin obtenida mediante BLAST de la secuencias del 16S rDNA CEPAS P26 P39 P46p P48b P54 P72 P108 P132 P135 P141 P145 P152 P158 P166 P175 P177 N1 N4 N5 N9-1 N16-9 N17-4 E9 L2 L10 IDENTIFICACIN Dietzia maris Gordonia alkanivorans/nitida Dietzia daquingensis Gordonia sputi Gordonia polyisoprenivorans Mycobacterium vanbaalenni/austroafricanum Gordonia terrae Gordonia malaquae Rhodococcus ruber Gordonia polyisoprenivorans Tsukamurella spumae/pseudospumae Gordonia amarae Gordonia araii/effusa Tsukamurella spumae Gordonia malaquae Gordonia polyisoprenivorans Tsukamurella spumae/pseudospumae Tsukamurella spumae/pseudospumae Tsukamurella spumae/pseudospumae Tsukamurella spumae/pseudospumae Tsukamurella tyrosinosolvens/strandjordii Tsukamurella spumae/pseudospumae Gordonia sputi/jacobaea Tsukamurella spumae/pseudospumae Gordonia alkanivorans

Con estos resultados se obtiene una identificacin a nivel de gnero al 100% y una posible identificacin a nivel de especie. Para conseguir una identificacin a nivel de especie es

48

RESULTADOS Y DISCUSIN necesario realizar los respectivos rboles filogenticos y las matrices de similaridad de nucletidos. 1.3.1.- rboles filogenticos y matrices de similaridad Los rboles filogenticos son el resultado del alineamiento de las secuencias del 16S rDNA de los aislados con las cepas de referencia previamente seleccionadas segn se ha descrito en el apartado 2.4.6. de Material y Mtodos. 1.3.1.1.- Gnero Dietzia La figura 15 muestra el rbol filogentico del gnero Dietzia basado en las secuencias del 16S rDNA obtenido mediante el mtodo del neighbour-joining. Se muestra la posicin de las cepas P26 y P46p con respecto a sus parientes filogenticos. La secuencia del 16S rDNA de Turicella otitidis (X73976) se utiliza como out-group o raz del rbol ya que no pertenece al suborden Corynebacterineae. Los nmeros de secuencia (accesion numbers) se muestran en parntesis. Los nmeros de los nudos muestran el % del valor del bootstrap, solo los valores mayores del 50% son mostrados. La escala del rbol filogentico indica 0.02 sustituciones por posicin de nucletido, esto es, nos indica los cambios que se han sucedido a travs del tiempo en una zona determinada de la secuencia. La matriz de similaridad se muestra en la tabla 10 y se elabor mediante el programa PHYDIT. Segn se observa en el rbol, la cepa P26 forma un nico cluster con Dietzia kunjamensis y la P46p lo forma con Dietzia natronolimnaea; sin embargo en la matriz de similaridad, el aislado P26 muestra mayor similitud con Dietzia maris con un porcentaje del 99,85%. Esto indica que la cepa P26, aunque filogenticamente est ms prxima a D. kunjamensis, la tasa de sustituciones nucleotdicas, segn se muestra en la escala, es menor entre P26 y D. maris que entre P26 y D. kunjamensis. Por lo tanto, y segn los criterios actuales de definicin de especie, la cepa P26 es Dietzia maris (Rosell-Mora and Amann, 2001; RosellMora, 2005). En la tabla 10, el tringulo superior nos indica los nucletidos diferentes entre las cepas y el tringulo inferior nos muestra el porcentaje de similaridad entre ellas. Para la P26 los nucletidos diferentes son 2 y el porcentaje de similaridad con D. maris es del 99,85%. Para la 49

RESULTADOS Y DISCUSIN P46p el nmero de nucletidos diferentes es 5 y el porcentaje de similaridad con D. natronolimnaea es 99,63%.
0.020

64 100

P46p Dietzia natronolimnaea 15LN1 CBS 107.95 (X92157) Dietzia psychralcaliphila ILA-1 (AB049630)

100

Dietzia maris DSM43672 (X79290)

100 100 99

P26 Dietzia kunjamensis K30-10 (AY972480)

59

100

Dietzia cinnamea IMMIB RIV-399 (AJ920289) Dietzia papilomatosis N1280 (AY643401) Tsukamurella paurometabola DSM 20162 (Z46751)

Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 (X79288) Segniliparus rotundus CIP 108378 (AY608918) Smaragdiciccus niigatensis DSM44881 (AB243007) Nocardia asteroides ATCC 19247 (X84850) Williamsia muralis DSM 44343 (Y17384) Millisia brevis DSM 44463 (AY534743)
100 54 52

Skermania piniformis DSM 43998 (Z35435) Gordonia bronchialis DSM 43247 (X79287) Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 (X52917)

Turicella otitidis DSM 8821 (X73976)

Figura 15: rbol filogentico gnero Dietzia

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RESULTADOS Y DISCUSIN

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RESULTADOS Y DISCUSIN 1.3.1.2.- Gnero Rhodococcus La figura 16 muestra el rbol filogentico del gnero Rhodococcus basado en las secuencias del 16S rDNA obtenido mediante el mtodo del neighbour-joining. Se muestra la posicin de la cepa P135 con respecto a sus parientes filogenticos. La secuencia del 16S rDNA de Turicella otitidis (X73976) se utiliz como out-group o raz del rbol ya que no pertenece al suborden Corynebacterineae. Los nmeros de secuencia (accesin numbers) se dan en parntesis. Los nmeros de los nudos muestran el % del valor del bootstrap, solo los valores mayores del 50% son los mostrados. La escala del rbol filogentico indica 0.02 sustituciones por posicin de nucletido, esto es, nos indica los cambios que se han sucedido a travs del tiempo en una zona determinada de la secuencia. La matriz de similaridad se muestra en la tabla 11 y se elabor mediante el programa PHYDIT. Segn se observa en el rbol, la cepa P135 forma un nico cluster con Rhodococcus ruber, lo que tambin nos indica la matriz de similaridad. En la tabla 11, el tringulo superior nos indica los nucletidos diferentes entre las cepas y el tringulo inferior nos muestra el porcentaje de similaridad entre ellas. Para la cepa P135 slo hay 1 nucletido diferente y el porcentaje de similaridad con R. ruber es del 99,93%.

52

RESULTADOS Y DISCUSIN
0.020 54 60 69 Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082 (Z37138) Rhodococcus imtechensis RKJ300 (AY525785) Rhodococcus koreensis DNP505 (AF124342) Rhodococcus percolatus MBS1 (X92114) Rhodococcus opacus DSM43205 (X80630) Rhodococcus jostii IFO 16295 (AB046357) 55 85 52 97 67 87 99 Rhodococcus marinonascens DSM43752 (X80617) Rhodococcus tukisamuensis Mb8 (AB067734) Rhodococcus maanshanensis M712 (AF416566) Rhodococcus globerulus DSM4954 (X80619) Rhodococcus erythropolis ATCC 4277T (X81929) Rhodococcus quingshengii djl-6 (DQ090961) Rhodococcus baikonurensis GTC 1041 (AB071951) 100 Rhodococcus fascians DSM 20669 (X79186) Rhodococcus yunnanensis YIM 70056 (AY602219) Rhodococcus kyotonensis DS472 (AB269261) 97 Rhodococcus kroppenstedtii K-07-23 (AY726605) Rhodococcus corynebacterioides DSM 20151 (AF430066) Segniliparus rotundus CIP 108378 (AY608918) Rhodococcus equi DSM20307 (X80614) Nocardia asteroides ATCC 19247 (X84850) Rhodococcus kunmingensis YIM 45607 (DQ997045) Rhodococcus triatomae IMMIB RIV-085 (AJ854055) Rhodococcus rhodnii DSM43336 (X80621) Rhodococcus coprophilus DSM43347 (X80626) 88 99 Rhodococcus zopfii DSM 44108 (T) (AF191343) Rhodococcus phenolicus DSM 44812 (AM933579) 69 100 Rhodococcus pyridinivorans PDB9 (AF173005) Rhodococcus gordoniae W4937 (AY233201) Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 (X79288) 99 99 85 56 Rhodococcus aetherivorans 10bc312 (AF447391) P135 Rhodococcus ruber DSM43338 (X80625) Williamsia muralis DSM 44343 (Y17384) Millisia brevis DSM 44463 (AY534743) Gordonia bronchialis DSM 43247 (X79287) 100 77 Skermania piniformis DSM 43998 (Z35435) Dietzia maris DSM43672 (X79290) Tsukamurella paurometabola DSM 20162 (Z46751) Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 (X52917) Corynebacterium diphtheriae NCTC 11397 (X84248) Turicella otitidis DSM 8821 (X73976)

100

Figura 16: rbol filogentico gnero Rhodococcus

53

RESULTADOS Y DISCUSIN

54

RESULTADOS Y DISCUSIN 1.3.1.3.- Gnero Tsukamurella La figura 17 muestra el rbol filogentico del gnero Tsukamurella basado en las secuencias del 16S rDNA obtenido mediante el mtodo del neighbour-joining. Se muestra la posicin de las cepas P145, P166, N1, N4, N5, N9-1, N16-9, N17-4 y L2 con respecto a sus parientes filogenticos ms cercanos. La secuencia del 16S rDNA de Turicella otitidis (X73976) se utiliz como out-group o raz del rbol ya que no pertenece al suborden Corynebacterineae. Los nmeros de secuencia (accesin numbers) se dan en parntesis. Los nmeros de los nudos muestran el % del valor del bootstrap, solo los valores mayores del 50% son los mostrados. La escala del rbol filogentico indica 0.02 sustituciones por posicin de nucletido, esto es, nos indica los cambios que se han sucedido a travs del tiempo en una zona determinada de la secuencia. La matriz de similaridad se muestra en la tabla 12 y se elabor mediante el programa PHYDIT. Segn se observa en el rbol, las cepas P145, N1, N4, N5, N9-1 y N17-4 forman un nico cluster con Tsukamurella pseudospumae; las cepas P166 y L2 forman un nico cluster con Tsukamurella spumae; y la cepa N16-9 se encuentra entre Tsukamurella strandjordii y Tsukamurella tyrosinosolvens y si nos fijamos en la matriz de similaridad, el aislado N16-9 muestra igual similitud (99,78%) con Tsukamurella strandjordii que con Tsukamurella tyrosinosolvens. Esto indica que la cepa N16-9 est filogenticamente igual de prxima a Tsukamurella strandjordii que a Tsukamurella tyrosinosolvens ya que la tasa de sustituciones nucleotdicas, segn se muestra en la escala, es igual entre N16-9 y las otras dos. Sin embargo, la cepa N16-9 es degradadora de la tirosina (ver tabla 17), caracterstica comn a T. tyrosinosolvens. Por lo tanto podemos afirmar que la cepa N16-9 es T. tyrosinosolvens. En la tabla 12, el tringulo superior nos indica los nucletidos diferentes entre las cepas y el tringulo inferior nos muestra el porcentaje de similaridad entre ellas. Para la cepa P145 no hay ningn nucletido diferente y su porcentaje de similaridad con Tsukamurella pseudospumae es del 100% al igual que para las cepas N4, N5 y N17-4. Para la cepa P166 no hay ningn nucletido diferente y su porcentaje de similaridad con Tsukamurella spumae es del 100% al igual que para la cepa L2. Para la cepa N1 y la cepa N9-1 slo hay 1 nucletido diferente y el porcentaje de similaridad con Tsukamurella pseudospumae es del 99,93%. La cepa N16-9 cuenta con 3 nucletidos diferentes y el porcentaje de similaridad con Tsukamurella tyrosinosolvens es del 99,78%. 55

RESULTADOS Y DISCUSIN

0.020

56

60

100 57

N1 Tsukamurella pseudospumae JC85 (AY333425) P145 N9-1 N17-4 85 N5 N4 57 L2 95 P166 Tsukamurella spumae N1171 (AY714239) Tsukamurella spongiae K368 (AY714239) Tsukamurella pulmonis DSM 44192 (X92981) Tsukamurella tyrosinosolvens DSM 44234 (AY238514) N16-9 100 Tsukamurella strandjordii ATTTC BAA-173 (AF283283) Tsukamurella paurometabola DSM 20162 (Z46751) Tsukamurella inchonensis DSM 44067 (X85955) Dietzia maris DSM 43672 (x79290) Segniliparus rotundus CIP 108378 (AY608918) Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 (X79288) Nocardia asteroides ATCC 19247 (X84850) Smaragdiciccus niigatensis DSM44881 (AB243007) Williamsia muralis DSM 44343 (Y17384) Millisia brevis DSM 44463 (AY534743) Skermania piniformis DSM 43998 (Z35435) Gordonia bronchialis DSM 43247 (X79287) Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 (X52917)

Turicella otitidis DSM 8821 (X73976)

Figura 17: rbol filogentico gnero Tsukamurella

56

RESULTADOS Y DISCUSIN

57

RESULTADOS Y DISCUSIN 1.3.1.4.- Gnero Gordonia La figura 18 muestra el rbol filogentico del gnero Gordonia basado en las secuencias del 16S rDNA obtenido mediante el mtodo del neighbour-joining. Se muestra la posicin de las cepas P39, P48b, P54, P108, P132, P141, P152, P158, P175, P177, E9 y L10 con respecto a sus parientes filogenticos ms cercanos. La secuencia del 16S rDNA de Turicella otitidis (X73976) se utiliza como out-group o raz del rbol ya que no pertenece al suborden Corynebacterineae. Los nmeros de secuencia (accesin numbers) se dan en parntesis. Los nmeros de los nudos muestran el % del valor del bootstrap, solo los valores mayores del 50% son los mostrados. La escala del rbol filogentico indica 0.02 sustituciones por posicin de nucletido, esto es, nos indica los cambios que se han sucedido a travs del tiempo en una zona determinada de la secuencia. La matriz de similaridad se muestra en la tabla 13 y se elabor mediante el programa PHYDIT. Segn se observa en el rbol, las cepas P39 y L10 forman un nico cluster con Gordonia alkanivorans; las cepas P175 y P132 forman un nico cluster con Gordonia malaquae; la cepa P152 forma un nico cluster con Gordonia amarae; la cepa P108 forma un nico cluster con Gordonia terrae; la cepa P158 forma un nico cluster con Gordonia effusa; las cepas P54, P141 y P177 forman un nico cluster con Gordonia polyisoprenivorans; la cepa E9 forma un nico cluster con Gordonia jacobaea; y la cepa P48 lo hace con Gordonia sputi. En la tabla 13, el tringulo superior nos indica los nucletidos diferentes entre las cepas y el tringulo inferior nos muestra el porcentaje de similaridad entre ellas. Para las cepas P39 y L10 hay 1 nucletido diferente y el porcentaje de similaridad con Gordonia alkanivorans es del 99,93%. Para las cepas P132 y P175 hay 9 y 10 nucletidos diferentes respectivamente con unos porcentajes de similaridad con Gordonia malaquae del 98,96% y 99,96% respectivamente. Para la cepa P152 hay 1 nucletido diferente y un porcentaje de similaridad con Gordonia amarae del 99,93%. Para la cepa P108 hay 14 nucletidos diferentes y un porcentaje de similaridad con Gordonia terrae del 98,97%. Para la cepa P158 tambin hay 14 nucletidos diferentes y un porcentaje de similaridad con Gordonia effusa del 98,97%. Para las cepas P54, P141 y P177 hay 20, 20 y 10 nucletidos diferentes respectivamente y los porcentajes de similaridad con Gordonia polyisoprenivorans son del 98,52%, 98,52% y 98,97% respectivamente. Para la cepa E9 hay 2 nucletidos diferentes y un porcentaje de similaridad con Gordonia

58

RESULTADOS Y DISCUSIN jacobaea del 99,86%. Para la cepa P48b no hay ningn nucletido diferente por lo que su porcentaje de similaridad con Gordonia sputi es del 100%.

0.02

P39 64 97 L10 98 Gordonia alkanivorans CIP 106363 (Y18054) Gordonia westfalica Kb2 (AJ312907) Gordonia namibiensis NAM-BN063A (AF380930) 51 64 Gordonia rubripertincta DSM43197(X80632) Gordonia amicalis IEGMAF (101418) Gordonia paraffinivorans HD321 (AF432348) Gordonia desulfuricans NCIMB 40816 (AF101416) Gordonia shandongensis SD29 (DQ420167) Gordonia sihwensis DSM 44576 (AJ416151) Gordonia hydrophobica DSM 44015 (X87340) Gordonia hirsuta DSM 44140T (X93485) 56 Gordonia malaquae IMMIB WWCC-22 (AM406674) 100 100 P175 P132 Gordonia defluvii J4 (AY650265) P152 100 Gordonia amarae DSM43392 (X80635) P108 88 Gordonia terrae DSM 5707 (X79286) Gordonia araii IFM 10211 (AB162800) 61 P158 97 Gordonia effusa IFM 10200 (AB162799) 100 P141 70 P54 P177 Gordonia polyisoprenivorans DSM 44302 (Y18310) Gordonia bronchialis DSM 43247 (X79287) Gordonia rhizosphera IFO 16247 (AB023368) 59 Gordonia otitidis IFM 10032 (AB122026) 100 Gordonia aichiensis DSM43978 (X80633) 80 E9 92 92 Gordonia jacobaea MV-1 (AF251791) P48b Gordonia sputi DSM43896 (X80634) Gordonia sinesedis DSM 44455 (AF380834) Gordonia soli CC-AB07 (AY995560) Williamsia muralis DSM 44343 (Y17384) Millisia brevis DSM 44463 (AY534743) 91 Skermania piniformis DSM 43998 (Z35435) Tsukamurella paurometabola DSM 20162 (Z46751) Nocardia asteroides ATCC 19247 (X84850) 98 Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 (X79288) 50 Smaragdicoccus niigatensis MBIC06267 (AB243007) 100 Segniliparus rotundus CIP 108378 (AY608918) Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 (X52917) Corynebacterium diphtheriae NCTC 11397 (X84248) Turicella otitidis DSM 8821 (X73976)
80

Figura 18: rbol filogentico gnero Gordonia

59

RESULTADOS Y DISCUSIN

60

RESULTADOS Y DISCUSIN

61

RESULTADOS Y DISCUSIN Tabla 14: Identificacin obtenida mediante matrices de similaridad de la secuencia del 16S rDNA CEPAS IDENTIFICACIN y PORCENTAJE DE SIMILARIDAD 99,85% P26 Dietzia maris 99,93% P39 Gordonia alkanivorans 99,63% P46p Dietzia natrolonimnaea 100% P48b Gordonia sputi 98,52% P54 Gordonia polyisoprenivorans 98,97% P108 Gordonia terrae 98,96% P132 Gordonia malaquae 99,93% P135 Rhodococcus ruber 98,52% P141 Gordonia polyisoprenivorans 100% P145 Tsukamurella pseudospumae 99,93% P152 Gordonia amarae 98,97% P158 Gordonia effusa 100% P166 Tsukamurella spumae 99,26% P175 Gordonia malaquae 98,97% P177 Gordonia polyisoprenivorans 99,93% N1 Tsukamurella pseudospumae 100% N4 Tsukamurella pseudospumae 100% N5 Tsukamurella pseudospumae 99,93% N9-1 Tsukamurella pseudospumae 99,78% N16-9 Tsukamurella tyrosinosolvens/strandjordii 100% N17-4 Tsukamurella pseudospumae 99,86% E9 Gordonia jacobaea 100% L2 Tsukamurella spumae 99,93% L10 Gordonia alkanivorans

1.4.- Caracterizacin fenotpica

Para caracterizar fenotpicamente las especies halladas se realizaron un total de 12 pruebas fenotpicas. Como control se incubaron los aislados en el medio GYEA a 28 C. Los tests se centraron principalmente en .5 partes: crecimiento a diferentes temperaturas, degradacin, crecimiento en diferentes fuentes de carbono al 1%, crecimiento en diferentes fuentes de carbono al 0,1% y crecimiento en diferentes fuentes de carbono y nitrgeno al 0,1%. (Ver tabla 15).

62

RESULTADOS Y DISCUSIN La lectura de las pruebas de crecimiento a diferentes temperaturas e hidrlisis de la esculina se realizo a los 7 y 14 das de incubacin a 28 C. Para las pruebas de degradacin, fuentes de carbono al 1%, fuentes de carbono al 01% y fuentes de carbono y nitrgeno al 01%, la lectura se realiz a los 7, 14 y 21 das. Como se puede observar, la mayora de las cepas crecen bastante bien entre una temperatura comprendida entre 28 C y 37 C. Para la temperatura de 10 C, las nicas cepas que crecieron son Gordonia alkanivorans (P39), Dietzia natrolonimnaea (P46p), Gordonia terrae (P108), Gordonia malaquae (P132), Gordonia malaquae (P175) y Gordonia alkanivorans (L10). Para la temperatura de 45 C no hay crecimiento observable en ninguna. La mayora de los aislados estudiados en este trabajo degrada la esculina. Hay que destacar que todas las especies pertenecientes al gnero Gordonia dieron positivo para esta prueba. Las cepas que degradan la tirosina pertenecen a los gneros Rhodococcus y Tsukamurella, siendo estas: Rhodococcus ruber (P135), Tsukamurella spumae (P166), Tsukamurella pseudospumae (N1), Tsukamurella pseudospumae (N4), Tsukamurella pseudospumae (N5), Tsukamurella tyrosinosolvens/strandjordii (N16-9) y Tsukamurella spumae (L2). Para las fuentes de carbono al 1% los resultados fueron siempre positivos a excepcin del gnero Dietzia en el que las cepas Dietzia maris (P26) y Dietzia natrolonimnaea (P46p) no utilizan galactosa. En las fuentes de carbono al 01% hay que destacar que para el cido benzoico todos los resultados obtenidos fueron negativos a excepcin de la cepa Gordonia alkanivorans (P39). En la nica fuente de carbono y nitrgeno al 01% el resultado para todos los gneros fue positivo. Para el cido ctrico en 17 cepas se obtuvo un resultado positivo, todas ellas pertenecientes a los gneros Tsukamurella, Gordonia y Rhodococcus; mientras que para las 7 restantes lo fue negativo, destacando al gnero Dietzia.

63

Tabla 15: Resultados test fenotpicos CEPAS TEST

0 0 0 +++ + + + + + + 0 +++ + + + + + + 0 0 ++ 0 +++ + + + + + + + 0 +++ 0 +++ + + + + + + + 0 + +++ + + + + + + + + 0 +++ + +++ + + + + + + 0 + 0 +++ + + + + + + + 0 ++ 0 +++ + + + + + + + 0 +++ + +++ + + + + 0 +++ + +++ + + + + + + + 0 +++ 0 +++ + + + + 0 -

P26

P39

P46p P48b

P54

P108 P132 P135 P141 P145 P152

1.- Crecimiento a 10 C

2.- Crecimiento a 37 C

3.- Crecimiento a 45 C

DEGRADACIN

4.- Esculina

5.- L-Tirosina

FUENTE DE CARBONO 1%

6.- L-Ramnosa

7.- D-Galactosa

8.- D-Ribosa

9.- meso-Inositol

FUENTE DE CARBONO 0' 1%

10.- cido Benzoico

11.- cido Ctrico

FUENTE DE CARBONO Y NITRGENO 0' 1%

12.- L-Prolina

CONTROL

RESULTADOS Y DISCUSIN

13.- Crecimiento a 28 C

64

Temperaturas: 0 = No hay crecimiento + = Mnimo crecimiento ++ = Crecimiento medio +++ = Mximo crecimiento

Fuentes de Carbono y/o Nitrgeno: - = Resultado negativo + = Resultado positivo

Tabla 15 (continuacin): Resultados test fenotpicos CEPAS P158 P166

+++ + 0 +++ + + + + + + + 0 +++ + + + + + + + 0 0 ++ 0 +++ + + + + + + + 0 0 +++ + + + + + + + 0 0 ++ 0 +++ + + + + + + 0 0 +++ + + + + + + + 0 0 0 +++ + + + + + + + 0 0 0 +++ + + + + + + + 0 0 0 +++ + + + + + + + + 0 0 + 0 +++ + + + + + + + 0 + +++ + + + + + + + 0 0 + 0 +++ + + + + + + + + + 0 +++ + + + + + + + 0 0 -

TEST

P175 P177

N1

N4

N5

N9-1 N16-9 N17-4

E9

L2

L10

1.- Crecimiento a 10 C

2.- Crecimiento a 37 C

3.- Crecimiento a 45 C

DEGRADACIN

4.- Esculina

5.- L-Tirosina

FUENTE DE CARBONO 1%

6.- L-Ramnosa

7.- D-Galactosa

8.- D-Ribosa

9.- meso-Inositol

FUENTE DE CARBONO 0' 1%

10.- cido Benzoico

11.- cido Ctrico

FUENTE DE CARBONO Y NITRGENO 0' 1%

12.- L-Prolina

CONTROL

13.- Crecimiento a 28 C

Temperaturas: 0 = No hay crecimiento + = Mnimo crecimiento ++ = Crecimiento medio +++ = Mximo crecimiento

RESULTADOS Y DISCUSIN

Fuentes de Carbono y/o Nitrgeno: - = Resultado negativo + = Resultado positivo

65

RESULTADOS Y DISCUSIN A continuacin se muestran dos ejemplos de las pruebas realizadas:

Figura 19: Test Tirosina

Figura 20: Test Esculina

El gnero Gordonia posee gran cantidad de especies con una capacidad degradadora interesante. No solo porque degraden la tirosina y la esculina sino porque cepas tales como Gordonia alkanivorans y Gordonia polyisoprenivorans son capaces de degradar alcanos e isoprenos respectivamente (Arensktter et al., 2004). Se han aislado cepas que no suelen encontrarse en espumas de plantas depuradoras, como por ejemplo Gordonia terrae, frecuentemente aislada de suelos y recientemente aislada de pacientes con bacteremia (Pham et al. 2003), Gordonia effusa y Gordonia sputi, aisladas de esputos de pacientes en Japn, Gordonia polyisoprenivorans, aislada del caucho de neumticos de coches (Linos et al., 1999), Gordonia alkanivorans, aislado de suelo contaminado de alquitrn (Kummer et al., 1999), Tsukamurella strandjordii y Tsukamurella tyrosinosolvens, aisladas de restos clnicos. Aunque ciertas aislados, como las pertenecientes al gnero Tsukamurella, han sido clasificadas como la misma especie y estn relacionadas filogenticamente entre ellas, se han aislado de diferentes EDARs (ver Tabla 5 de Material y Mtodos). La cepa de Mycobacterium (Mycobacterium vanbaalenni/austroafricanum P72), por no ser considerada un productor de espumas, no se ha estudiado su posicin filogentica. Sin embargo, el hecho de aislar una micobacteria de tipo ambiental en una planta depuradora indica 66

RESULTADOS Y DISCUSIN que otras micobacterias no ambientales, esto es, de tipo patgeno oportunista, pueden existir en las depuradoras con el consiguiente riesgo que conllevara para la salud humana.

67

CONCLUSIONES Los problemas de espumas en las plantas de tratamiento estudiadas son causados por una gran diversidad de microorganismos filamentosos que contienen cidos miclicos, pertenecientes al suborden Corynebacterineae. La presencia de cidos miclicos es necesaria para que el microorganismo sea un productor de espumas ya que todos los aislados se obtuvieron de espumas biolgicas de plantas depuradoras. De todos los aislados estudiados en este trabajo, el 48% pertenece al gnero Gordonia, el 36% al gnero Tsukamurella, el 8% al gnero Dietzia, el 4% al gnero Rhodococcus y el 4% al gnero Mycobacterium. De las especies del gnero Gordonia, solo una fue identificada como G. amarae, por lo que, dentro de este gnero, tambin existe gran diversidad ya que se han identificado 8 especies distintas. Por tanto G. amarae no es la principal especie productora de espumas sino que existen otras especies dentro del gnero. El trmino GALO debera abarcar ms especies. El segundo grupo ms importante es el gnero Tsukamurella, en donde se han identificado, tanto especies productoras de espumas como T. spumae y T. pseudospumae, como otras que no han sido relacionadas con espumas como T. tyrosinosolvens y T. strandjordii. El gnero Rhodococcus, aislado en otras zonas frecuentemente y reconocido como productor de espumas, es el minoritario La tcnica del anlisis del 16S rDNA, que incluye la elaboracin de rboles filogenticos y matrices de similaridad, es el mtodo ms fiable para identificar los actinomicetos nocardioformes a nivel de especie. La taxonoma polifsica es de gran ayuda para poder identificar mejor actinomicetos ya que proporciona una mayor informacin acerca del resto del genoma bacteriano.

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ANEJO 1

MEDIOS DE CULTIVO
Composicin de los medios de cultivo empleados referida a un litro de agua destilada YEME Extracto de levadura Extracto de malta Dextrosa Agar pH GYEA Glucosa Extracto de levadura Agar pH Agar de CZAPEK modificado NaNO3 K2HPO4 MgSO47H2O KCl FeSO4 Sacarosa Extracto de levadura Agar pH ISP-2 Extracto de levadura Extracto de malta Dextrosa Agar pH 4g 10 g 4g 20 g 7.0 2g 1g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 30 g 2g 18 g 7.2 10 g 10 g 18 g 7.0 4g 10 g 4g 18 g 7.2

75

ANEJO 1 MEDIO BASAL de WILLIAMS Extracto de levadura Citrato amonio-ferroso Agar pH MEDIO STEVENSON Base de levadura nitrogenada Casamino-cidos Agua destilada 67 g 0.1 g 1l 3g 0.05 g 7.5 g 7.2

Solucin 10X

+
Fosfato dipotsico 10% Medio completo: Solucin 10X + A Agar fundido Fuente de carbono tindalizada 100 ml 800 ml 100 ml 200 ml A

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ANEJO 2

Soluciones, reactivos y material de identificacin para PCR

Solucin CTAB / NaCl CTAB 10% en NaCl 0.7M Tampn TE Tris-CHI 10mM, EDTA 1mM Solucin RNAsa RNAsa A (Boehringer) NaCl 1M Tris 1M (pH 8.3) EDTA 0.5M Agua MilliQ 5 mg 15 ml 6 ml 1.5 ml 77 ml

Calentar a 100C durante 5 min para inactivar las DNAsas y enfriar. Conservar a 20C. Tampn TAE 10X Tris base Na2EDTA2H2O cido actico glacial Agua MiliQ pH Gel de Agarosa Agarosa D-1 Media EEO (Pronadisa) Agarosa D-1 Alta EEO (Pronadisa) Solucin de bromuro de etidio 10 mg/ml (IBERLABO) Pesar la agarosa (1-2%) y transferir a un matraz, aadir el tampn TAE 1X, calentar hasta que rompa a hervir, agitar y atemperar hasta 50C. Aadir 3l de bromuro de etidio por cada 50 ml de agarosa y verter en el molde. Marcadores de pesos moleculares Lambda DNA/HindIII (IBERLABO) Low Range III Tampn de carga Agua MilliQ estril 100pb DNA Ladder (IBERLABO) Marcador L-101 Tampn TE Tampn de carga 10l 20l 90l 50l 750l 200l 48,4 g 7,44 g 11,42 ml 1000 ml 8,5

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ANEJO 3

ABREVIATURAS EMPLEADAS
Mycolata Foam foaming bulking BLAST CECT CTAB DNA DAP DNTPs DSMZ EDARs EDTA G+C GALO NALO NCBI pb PCR PTLO RNA rpm rRNA SDS TAE TBAH TE L Actinomicetos nocardioformes que contienen cidos miclicos Espumas biolgicas producidas por mycolata en fangos activos Produccin de espumas biolgicas por mycolata Aumento de volumen de los slidos en suspensin producido por bacterias filamentosas Basic Local Alignment Search Tool Coleccin Espaola de Cultivos Tipo Bromuro de Cetil-Trimetil-Amonio cido desoxirribonucleico cido diaminopimlico Desoxinucletidos Trifosfato Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales cido etilendiaminotetractico Contenido en Citosina + Guanina Gordonia amarae-Like Organism Nocardia amarae-Like Organism National Center for Biotechnology Information Pares de bases Reaccin en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction) Pine Tree-Like Organism cido ribonuclico Revoluciones por minuto cido ribonuclico ribosmico Dodecil Sulfato Sdico Tris-actico-EDTA Hidrxido de Tetrabutil Amonio Tris-EDTA Microlitro

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