Sunteți pe pagina 1din 12

PURIFICAREA CELULELOR I A PRILOR COMPONENTE Studiile referitoare la componentele celulare necesit izolarea celulelor din contextul lor tisular,

precum i separarea componentelor subcelulare dup criterii bine stabilite. De exemplu, elementele figurate ale sngelui (hematii, leucocite) posed densiti diferite datorit faptului c eritrocitele sunt anucleate; separarea acestor dou tipuri celulare se face foarte simplu prin centrifugare de densitate la echilibru. Studiul anatomiei celulare i mai ales a componentelor subcelulare alturi de studiul biochimic al celulei presupune desfacerea celulelor n elementele componente urmat de separarea sau caracterizarea acestora CITOMETRIA DE FLUX (flow cytometry) Reprezint o metod de separare i caracterizare a populaiilor celulare dintr-o suspensie pe baza proprietilor optice (dispersia luminii sau fluorescena indus). Este un instrument de lucru adresat n special tehnicilor imunologice care presupun separarea unor subseturi celulare derivate mai ales din snge. Citometria de flux mai este denumit i sortare celular activat prin fluorescen (FACS fluorescence activated cell sorting). Ca i aplicaii clinice subliniem implicarea acestei metode n clasificarea leucemiilor sau limfoamelor precum i n prognosticul infectrii HIV. Un flow-citometru poate identifica diferitele tipuri de celule prin msurarea cantitii de lumin dispersat sau a cantitii de fluorescen emis, n timpul n care aceste celule n soluie traverseaz un spaiu iradiat cu un fascicul laser. Astfel, dintr-un amestec celular se pot separa celule cu caracteristici asemntoare (fig. 5-34 Lodish) FRACIONAREA CELULAR Definiie Este o tehnic bazat pe caracteristicile structurilor subcelulare (form, dimensiune, densitate) care reuete s le diferenieze astfel permind separarea lor. Celulele pot fi dezmembrate prin: - oc osmotic - ultrasonicare - filtrare prin site mici Dac celula este dezmembrat ntr-o manier delicat, fiecare din organitele sale poate fi izolat. Procesul de dezmembrare celular se numete omogenizare iar procesul ulterior de izolare a organitelor se numete fracionare. Izolarea organitelor necesit tehnici de chimie fizic mergnd de la strecurare prin site simple, la sedimentarea gravitaional sau precipitare diferenial sau la ultracentrifugare sau marcare fluorescent a fragmentelor n gradiente de densitate generate pe computer. Scop Izolarea componentelor celulare sau subcelulare, a complexelor macromoleculare acizilor nucleici sau enzimelor n scopul definirii rolului lor individual n celule. Individualizarea componentelor celulare permite meninerea lor ntr-o stare de funcionare, n condiii prestabilite, fr a necesita prezena unei celule sau a unui grup de

celule. Aceste sisteme de studiu, acelulare, sunt utilizate n toate sistemele experimentale de investigare a rolului organitelor celulare. Omogenizarea Primul pas n vederea fracionrii este izolarea celulelor i obinerea unui eantion pur. Celulele izolate (cele din snge sau din culturi de celule) pot fi separate pe baza formei sau a unor markeri de suprafa (ncrcare electric, antigene sau enzime de suprafa). Celulele din context tisular trebuie separate de celulele vecine, eliberate din jonciuni prin activitate mecanic sau enzimatic. Dezagregarea jonciunilor de tip desmosomal sau jonciunilor strnse se poate realiza cu chelatori (eliminatori) de Ca, Mg alturi de fore mecanice. Tehnicile de omogenizare cuprind: - tehnici bazate pe alterarea osmotic a mediului n care sunt celulele - tehnici bazate pe fore mecanice mojarare, blender, compresiune/expansiune, ultrasonicare Aceste tehnici determin ruperea majoritii membranelor celulare cu formarea ulterioar de microvezicule nchise. Dac tehnica este bine executat, organite ca mitocondriile, nucleul, complexul Golgi sau lizozomii rmn intacte. Disrupia reticolului endoplasmatic rugos determin formarea unor microvezicule cu coninut variabil, numite microsomi. Suspensia celular este redus la un omogenat (sau extract) care conine diferite compartimente veziculare cu coninut variabil, ncrcare i densitate diferite. Fracionarea Reprezint tehnica de separare a elementelor dintr-un omogenat. Dup omogenizarea celulelor, diferitele componente pot fi separate. Pentru unele materiale (snge integral, celule n suspensie) aceasta se poate realiza prin sedimentare gravitaional. n aceast tehnic, separarea are loc prin diferenele naturale de form i dimensiune (densitate) dintre celule. Hematiile sunt mai dense dect leucocitele, astfel nct separarea determin depunerea unui strat de hematii la fundul eprubetei de sedimentare, urmat superior de un strat de leucocite Centrifugarea reprezint cea mai folosit tehnic de fracionare a componentelor celulare utiliznd fora centrifug. Tehnicile care folosesc recipiente de centrifugare de volum mai mare i incinte frigorifice sunt tehnici preparative; tehnicile care folosesc viteze de centrifugare mari n recipiente mici sunt tehnici analitice. O centrifug de peste 20.000RPM este o ultracentrifug. Organitele pot fi separate ntr-o centrifug prin variate metode. Particulele se comport diferit sub aciunea forei centrifuge: particulele n suspensie pot fi separate fie prin sedimentare de vitez fie prin sedimentare de echilibru. Sedimentarea de vitez se mai numete i centrifugare zonal i are avantajul unei centrifugri la vitez redus pentru o perioad scurt de timp dar confer separri incomplete. Sedimentarea de echilibru se mai numete izopicnic sau de echilibru la densitate i necesit viteze mari de centrifugare pentru perioade mai lungi de timp, avnd avantajul unei separri complete. Sedimentarea gravitaional Reprezint o metod de separare grosier a componentelor unui omogenat. Separarea are loc n funcie de criteriile dimensiune i densitate. Componentele mai mari se mic cel mai repede sub aciunea forei centrifuge i se vor depune primele la nivelul fundului eprubetei de centrifugare. La viteze relativ mici, componentele mari ca nucleii sau

fragmentele celulare formeaz un depozit (pelet). O vitez superioar de centrifugare determin formarea unui pelet din mitocondrii. Ultimele componente care sedimenteaz la viteze foarte mari sunt elementele reticulului endoplasmatic i ribozomii. Peletul poate fi extras dup fiecare treapt de centrifugare. Deoarece separarea nu este de mare finee, peletul extras poate fi resuspendat i recentrifugat de cteva ori pentru a obine un eantin pur Sedimentarea de vitez Este o metod de rafinare a sedimentrii gravitaionale. Se bazeaz pe criteriile dimensiune i form a particulelor de separat. Particulele din soluia centrifugat sunt accelerate i ating o vitez final; aceast vitez final este determinat n parte de dimensiuni, greutate, densitate i forma particulelor ca i de viscozitatea mediului n care se desfoar procedura i de fora centrifug generat. Viteza final este denumit viteza de sedimentare a particulei i poate fi utilizat pentru msurarea dimensiunii, greutii sau densitii particulei. Practic, separarea are loc prin centrifugarea unui omogenat dispus ca un strat la suprafaa unei soluii saline din tubul de centrifugare. Deoarece un preparat mai dens (omogenatul) are tendina de a se amesteca n soluia de sedimentare, aceast soluie este amplasat ntr-o soluie de sucroz care este astfel preparat nct concentraia acesteia descrete de la fundul spre gtul tubului de centrifugare. Se creeaz un gradient de densitate care rafineaz sedimentarea de vitez i permite separarea diferitelor componente ale omogenatului sub form de benzi. Aceste benzi se menin datorit gradientului de densitate. Din aceste benzi de sedimentare se pot extrage individual componentele celulare. Rata de sedimentare (poziia final a fiecrui component) depinde de forma i dimensiunile particulelor i este caracterizat de un coeficient de sedimentare (s). Centrifugele moderne care ating viteze de rotaie de 80.000 rpm (rotaii pe minut) dezvolt fore de 500.000G, fore care pot determina separarea unor molecule minuscule, cum ar fi ARNt sau enzimele. Addenda Coeficientul de difuziune Cnd o particul atinge viteza final, este afectat de difuziune, de obicei n direcia opus deplasrii sale determinat de fora centrifug. Este o micare de tip brownian i poate fi statutat matematic ca o constant coeficientul de difuziune reprezentnd gradul de mprtiere a moleculei n timp. Este exprimat n uniti Fick. 1 Fick = 10 -7 cm2/sec. Exist o relaie direct ntre coeficientul de difuziune a unei particule i diametrul su. Ambele sunt raportate la coeficientul de sedimentare al particulei. Coeficientul de sedimentare este determinat de formula S = 1/ 2r x dr/dt unde - este viteza angular a rotorului exprimat n radiani/sec i este egal cu 0,10472 x RPM - r = distana dintre particul i centru de rotaie (mm) - dr/dt = rata deplasrii particulelor (cm/sec) Valoarea coeficientului de sedimentare pentru o particul poate fi determinat prin msurarea timpului de deplasare (vitez i distan) a unei particule ntr-un mediu de

viscozitate cunoscut. Cel mai simplu este s calculm distana de deplasare a particulelor pentru o centrifug cu o for cunoscut. Sedimentarea la echilibru Este o tehnic de separare a componentelor dintr-un omogenat pe baza densitii de flotare. n acest caz, nu mai conteaz parametrii dimensiune i form. Dac o prob conine mai multe particule diferite, cu diferite densiti i dimensiuni, ele vor fi separate pe baza acestor parametri. Particulele mai mari vor ajunge la baza tubului de centrifugare mai repede dect cele mai mici. Dac fora centrifug este crescut progresiv, timpul de separare poate scdea. Gradientul de concentraie din tubul de centrifugare (gradient de sucroz sau clorur de cesiu) este mult mai accentuat dect pentru sedimentarea de vitez. Prin centrifugare, componentele celulare se deplaseaz spre fundul tubului de centrifugare i se opresc i floteaz n momentul n care ajung ntr-un strat unde densitatea este echivalent cu densitatea proprie. La finalul centrifugrii se formeaz benzi din care cea mai apropiat de fundul centrifugii este compus din elemente cu densitatea de flotare cea mai mare. Metoda este util pentru separarea unor componente asemntoare care incorporeaz sau nu (experimental) izotopi grei.

INVESTIGAREA COMPONENTELOR CELULARE Toate componentele celulare pot fi investigate prin metode specifice n scopul de a le defini structura i/sau funcia. Fiind cele mai importante componente ale celulei, proteinele au suscitat interesul pentru dezvoltarea unor tehnici moderne de identificare, separare i caracterizare. Proteinele sunt macromolecule biologice formate din lanuri de aminoacizi. Identificarea i caracterizarea proteinelor se bazeaz pe metode de laborator dar i pe metode teoretice care pornesc de la secvena de nucleotide care codific pentru o anumit secven de aminoacizi. Astfel, simularea computerizat a proprietilor ipotetice ale unor peptide poate facilita obinerea ulterioar de date experimentale 1. PURIFICAREA PROTEINELOR Purificarea proteinelor provenite din multiple surse biologice reprezint o problem major a biochimiei proteinelor. Metodele de purificare cuprind: - cromatografia - electroforeza - centrifugarea diferenial i n gradient de densitate - precipitare cu sulfat de amoniu - separare de faz macromolecular, utiliznd polietilen-glicol 2. STRUCTURA CHIMIC A PROTEINELOR Este analizat prin analiza aminoacizilor care le compun. Proteinele sunt hidrolizate n aminoacizii constitueni prin nclzirea la 110C n HCl 6M timp de 24 ore. Separarea ulterioar a aminoacizilor se face prin cromatografie de schimb ionic. Spectrometria de mas este o metod redutabil de determinare a secvenei de aminoacizi la nivelul peptidelor sau a oligozaharidelor la nivelul glicoproteinelor 2.1. METODE DE DIFRACIE Difracia cu raze X Este o metod utilizat pentru determinarea structurii tridimensionale a proteinelor. Prima protein cristalizat a fost albumina, prima enzim ureaza iar prima structur descifrat a fost cea a mioglobinei. Determinarea structurii tridimensionale a unei proteine presupune cristalizarea din soluie apoas prin ajustarea pH-ului n apropierea punctului izoelectric unde solubilitatea este minim. Dup cristalizare, monocristalul obinut este iradiat cu un fascicul de raze X monocromatic, obinndu-se ct mai multe raze reflectate posibil. Razele reflectate definesc parametrii cristalului. Reflexiile (denumite reflexii Bragg) sunt direct dependente de planurile cristaline i de proprietile substanei cristalizate. Reconstrucia computerizat a acestor reflexii permite aprecierea densitii electronice i deci a poziiei spaiale a atomilor unei proteine (cu excepia atomilor de hidrogen) n cadrul celulei elementare a cristalului. Difracia cu neutroni, poate fi utilizat pentru determinarea structurii proteinelor dar este o metod costisitoare i se utilizeaz numai n cazul n care este necesar precizarea poziiei atomilor de hidrogen. Cristalografia cu electroni poate fi utilizat pentru determinarea structurii proteinelor membranare n iruri cristaline bidimensionale.

Reconstrucia uni-particular a moleculelor individuale de proteine cu orientri diferite pornind de la date de microscopie electronic este utilizat pentru reconstrucia structurilor proteice non-cristaline (n special proteine tubulare i de origine muscular). Rezonana Magnetic Nuclear (RMN) este util pentru determinarea structurii proteinelor mici, n soluie. Avantajul fa de cristalografia cu raze X const n faptul c proteinele nu trebuie cristalizate. Dezavantajul const n rezoluia inferioar celei rezultate din difracia cu raze X. 2.2. DICROISMUL CIRCULAR este utilizat pentru estimarea structurii secundare a proteinelor prin compararea spectrului de dicroism circular al unei proteine cu spectrele alfa-helixului, pliurilor sau buclelor. Tehnica se bazeaz pe interaciunea chiral dintre lumina polarizat circular i moleculele optic active. 2.3. MICROSCOPIA ELECTRONIC permite observarea complexelor proteice macromoleculare numai dac sunt marcate cu atomi de metale grele. Proteinele nemarcate pot fi observate prin crioelectronomicroscopie. 2.4. CROMATOGRAFIA Metodele cromatografice reprezint sisteme experimentale nrudite, utile n analizarea unei mari varieti de substane chimice. Cromatografia reprezint o metod analitic important. Dintre domeniile de aplicare citm: controlul de calitate, purificarea produselor, cercetarea fundamental. Definiie Termenul de cromatografie a fost utilizat iniial de Tsvet (1872-1919), un botanist rus, ca rezultat al combinrii a doi termeni din limba greac (khromatos culoare i graphos scris). El a folosit termenul pentru a descrie studiile de migrare a unui pigment vegetal separat pe o coloan de cret. Tsvet a descris astfel cromatografia ca o metod prin care componentele unui amestec sunt separate pe o coloan de absorbie ntr-un mediu fluid. IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) definete cromatografia ca : o metod utilizat n principal pentru separarea componentelor unei probe, prob n care componentele sunt distribuite ntre dou faze din care una este staionar iar cealalt este mobil. Faza staionar poate fi solid sau un lichid dispus pe un suport solid sau un gel. Faza staionar poate fi compactat ntr-o coloan, pulverizat ntr-un strat sau dispus ca un film; n aceste definiii, patul cromatografic este un termen generic denominnd diferitele forme de utilizare a fazei staionare. Faza mobil poate fi gazoas sau lichid. Istoric 1941 Martin i Synge inventeaz cromatografia de partiie (lichid-lichid) pe coloan i planar (pe hrtie). Primesc Premiul Nobel n 1952. 1950 depunerea silicagelului n strat subire duce la apariia TLC (thin-layer cromatography) cromatografia n strat subire 1959 James i Martin introduc GLC (gas-liquid chromatography) cromatografia gazlichid 1959 Porah i Flodin cromatografia cu excludere dimensional permite separarea uoar a macromoleculelor dup dimensiuni 1970 HPLC high precision liquid chromatography metod de mare finee. Clasificare

Exist 3 moduri de clasificare a metodelor cromatografice. Prima i cea mai folosit este bazat pe mecanismele de retenie modul n care substana de analizat interacioneaz cu faza staionar. n acest mod de clasificare, cromatografia poate fi de 5 tipuri: 1. Cromatografia de absorbie Aceast tehnic este bazat pe competiia pentru substane de analizat neutre dintre faza mobil (lichid sau gaz) i faza staionar. Substanele cu grupri polare sunt reinute mai mult de ctre un adsorbent polar n timp ce substanele cu grupri nepolare interacioneaz optim cu faza staionar nepolar. n acest tip de cromatografie, substanele de analizat sunt simultan n contact att cu faza staionar ct i cu faza mobil. 2. Cromatografia de partiie Tehnica este bazat pe competiia pentru substanele neutre ntre faza mobil (lichid sau gaz) i un lichid neutru sau o faz staionar de tip lichid (numit i faz legat deoarece este reprezentat de lanuri lungi alkilice cuplate la o matrice astfel nct s se comporte ca un fluid). n cromatografia de partiie, substana de analizat (analizatul) este transferat din masa unei faze n masa celeilalte faze astfel nct moleculele analizatului sunt nconjurate de moleculele unei faze. Separarea n cromatografia de partiie este obinut prin diferenele dintre coeficienii de partiie ai analizatului ntre faza mobil i staionar. 3. Cromatografia pe schimbtori de ioni Tehnica este bazat pe interaciunea electrostatic dintre un solvit ncrcat i o faz staionar ncrcat opus. Separarea n cromatografia pe schimbtori de ioni este obinut prin afinitatea diferit a ionilor din soluie pentru gruprile ionice de sens opus din faza staionar. Acest tip de cromatografie se aplic pentru orice solvit care capt ncrcare electric n soluie. Astfel, chiar i carbohidraii (glucidele) care sunt nepolare sub pH 12 pot fi separate prin aceast metod, n soluie la un pH peste 12. 4. Cromatografia de excludere dimensional Tehnica este bazat pe principiul sitei i mai este cunoscut sub denumirea de gelcromatografie, gel-filtrare sau cromatografie de gel-permeaie. n aceast tehnic, particulele fazei staionare posed pori de diferite dimensiuni astfel nct moleculele mari sunt excluse. Solviii sunt astfel separai pe baza greutii moleculare i a dimensiunilor; moleculele mari sunt primele eluate (extrase) din sistem. 5. Cromatografia de afinitate Tehnica este bazat pe specificitatea biologic unic a interaciunilor ligand-receptor (mecanismul cheie-yal). Ligandul este cuplat covalent cu matricea care formeaz materialul de tapetare a coloanei. Separarea are loc dup ce macromoleculele devin specific dar nu ireversibil cuplate ligandul. Eluarea are loc prin modificarea compoziiei sau pHului solventului de extracie (eluent) n scopul diminurii interaciunilor cu ligandul, facilitnd disocierea i facilitarea extraciei. Aa cum se observ n imaginea de mai jos, scopul cromatografiei de afinitate este de a separa moleculele cu o specificitate aparte dintr-un amestec molecular cum este serul sanguin. De exemplu, anticorpii serici specifici pentru un determinant antigenic pot fi izolai prin aceast metod (vezi i pricepe figura) Etapa 1 este cea de pregtire a imunosorbentului. Acesta const dintr-o matrice solid la care antigenul (marcat cu albastru n figur) a fost cuplat (de obicei covalent). Matricea const de obicei din agaroz, sefadex, derivai de celuloz sau alte tipuri de polimeri.

Etapa 2. Serul este trecut peste imunosorbent. Att timp ct capacitatea de tranzitare a coloanei nu este depit, anticorpii din amestec (culoare roie) specifici pentru antigenul cuplat la matricea fix se vor cupla necovalent i vor fi reinui. Anticorpii nespecifici (verde) sau alte proteine serice (galben) vor trece nestingherite prin coloan. Etapa 3. Extracia. Un reactiv este trecut prin coloan pentru a elibera anticorpii de pe imunoadsorbent. Soluiile tampon care conin o concentraie crescut de sruri i/sau pH sczut sunt utilizate frecvent pentru a disloca interaciunile necovalente dintre anticorp i antigen. Un agent de denaturare cum ar fi ureea 8M va determina de asemenea desfacerea legturii antigen-anticorp prin modificarea situsului de cuplare a antigenului cu molecula de anticorp. O metod de extracie mai delicat este splarea coloanei cu o soluie care conine antigen specific. Acesta va intra n competiie cu imunoadsorbentul pentru situsurile de cuplare pentru antigen ale anticorpului i va prelua anticorpii n faza fluid. Etapa 4. Soluia extras va fi dializat pe soluie tampon salin pentru a nltura reactivul utilizat la extracie.

DE REINUT Dializa reprezint procedeul de separare a solviilor cu molecul mic sau ionilor (ex. glucoz sau Na, Cl) de macromolecule (ex. amidon) datorit ratei diferite de difuziune printr-o membran cu permeabilitate diferenial. Exemplu: celofanul este o membran perforat de pori mici care permit ionilor i moleculelor mici s o traverseze dar care exclude moleculele cu greutate molecular peste 12.000 Da. Dac umplem un rezervor de celofan cu un amestec de amidon i glucoz i l imersm ntr-un rezervor cu ap pur, moleculele glucidice vor difuza n apa din mediul nconjurtor pn la stabilirea unui echilibru adic pn cnd concentraiile sunt egale de ambele pri ale membranei. Datorit dimensiunilor mai mari, moleculele de amidon nu pot trece prin membrana de celofan. ! Greutatea molecular este suma greutilor atomilor din care este compus molecula. Unitatea de msur este Da daltonul 1/12 din greutatea unui atom de 12C. Astfel, greutatea molecular GM sau MW n englez - a apei este de 18 Da. De ce este att de important a cunoate greutatea molecular a unui compus ? S spunem c suntem responsabili pentru un studiu care se ocup de rspunsul albinelor de miere la diferite tipuri de zahr. Una din modalitile de rezolvare a acestei probleme este crearea unor soluii cu diferite concentraii de zaharuri pentru a vedea care sunt preferate de albine. Ai putea oferi albinelor s aleag ntre o soluie de sucroz 35% (zahrul de mas) i o soluie 35% glucoz (component natural al mierii). Pentru a realiza aceste amestecuri ar trebui deci 350 pri pe greutate (ex. grame) de zahar n 650 pri (g) ap, producnd 1000 g din fiecare soluie. Este ns o problem! Modul de rspuns al albinelor la prezena zaharului dizolvat n ap este dependent de numrul de molecule dintr-un volum dat de soluie. Molecula de sucroz (GM=342) este de aproximativ 2 ori mai grea dect molecula de glucoz (GM=180). Astfel, o soluie de glucoz 35% va conine aproape de 2 ori mai multe molecule dect o soluie 35% de sucroz. Pentru a corecta aceast situaie trebuie compus o soluie cu greutile de sucroz i glucoz n raport de 342:180. n acest caz ar trebui s avem aceeai concentraie de molecule n fiecare soluie, astfel, pictur cu pictur, fiecare soluie trebuie s conin acelai numr de molecule. Dac vom cntri exact 342 g sucroz vom fi cntrit 1 mol de sucroz. Astfel, un mol reprezint cantitatea de substan a crei greutate n grame este egal cu greutatea molecular a substanei. Astfel, 1 mol de glucoz cntrete 180 g. dac se dizolv 1 mol de substan n suficient ap pentru a crea 1 litru de soluie, avem o soluie 1 M (1 molar). O soluie 1M ar fi prea concentrat pentru albine. O soluie mai potrivit ar fi cu 34,2g sucroz i 18 g glucoz. Astfel de soluii ar fi deci soluii 0,1M. Considerate pictur cu pictur, aceste dou soluii conin acelai numr de molecule avnd aceeai molaritate. Dar cte molecule sunt ntr-un mol? Aproximativ 6x1023. Acesta este numrul lui Avogadro. Numrul lui Avogadro se aplic pentru molii oricrei substane sau ion. 1 mol de H2 are 1g.

2.5. ELECTROFOREZA Definiie Electroforeza reprezint o tehnic de separare a proteinelor bazat pe migrarea acestora n cmp electric. Aceste metode nu sunt utilizate pentru a purifica mari cantiti de proteine deoarece exist metode alternative mai simple iar metodele electroforetice afecteaz structura i funcia proteinelor. Electroforeza este util ca metod analitic. Avantajul major este acela c proteinele pot fi vizualizate i separate n acelai timp, permind estimarea rapid a numrului de proteine dintr-un amestec sau gradul de puritate al unui preparat proteic specific. Electroforeza permite, de asemenea, determinarea proprietilor fundamentale ale proteinelor cum ar fi punctul izoelectric sau greutatea molecular. Generaliti Migrarea electroforetic a unei molecule n orice tip de mediu are loc n direcia electrodului cu ncrcare electric de sens opus ncrcrii nete a moleculei. Astfel, moleculele ncrcate negativ vor migra spre electrodul pozitiv; cationii vor migra spre catod (-) iar anionii spre anod (+). Mediul de migrare trebuie s fie tamponat la un pH care determin o direcie i o rat de migrare specifice. Mobilitatea proteinelor crete cu ct pH-ul este mai ndeprtat de punctul izoelectric (pI), crescnd astfel ncrcarea net. Cu toate acestea, rezoluia de separare bazat pe diferenele de ncrcare net este mai bun dac diferena de ncrcare este redus sau se apropie de zero la pI. Electroforeza se desfoar fie pe hrtie sau pe geluri. Gelurile pot fi de agaroz sau poliacrilamid. Electroforeza pe gel de poliacrilamid Gelul de poliacrilamid acioneaz ca o sit molecular, ncetinind micarea proteinelor proporional cu raportul mas molecular / ncrcare electric. Migrarea poate fi afectat i de forma moleculelor. n concluzie, migrarea unei proteine n gel este o funcie de dimensiune i form.

Electroforez vertical pe gel de poliacrilamid (schem). Proteinele migreaz n gel la aplicarea unui cmp electric. Gelul inhib dezvoltarea curenilor de convecie datorai gradienilor mici de temperatur sau migrrile induse de alte cauze dect cmpul electric.

Identificarea proteinelor dup colorarea proteinelor din gel cu albastru Coomassie. Fiecare band din gel reprezint o protein diferit. Proteinele mai mici se deplaseaz n gel mai rapid dect cele mari. Acest exemplu ilustreaz separarea unei enzime. Prima coloan prezint migrarea proteinelor din extractul celular nepurificat. Celelalte coloane, de la stnga la dreapta reprezint proteinele migrate dup fiecare pas. Pe ultima coloan se observ migrarea celor 4 subuniti ale enzimei.

Pentru a migra proteinele n gel este nevoie de extragerea lor din context. Cele mai comune metode electroforetice de determinare a puritii i masei moleculare utilizeaz pentru extracie un detergent, numit SDS (sodium-dodecil-sulfat). Acesta se cupleaz la proteine n cantiti relativ proporionale cu greutatea molecular a proteinei, adic 1 molecul SDS la fiecare 2 reziduuri de aminoacizi. SDS determin o ncrcare negativ net, fcnd nesemnificativ ncrcarea intrinsec a proteinei i oferind tuturor proteinelor din amestec un raport mas/ncrcare similar. Astfel, electroforeza n prezena SDS ine cont aproape n exclusivitate de masa molecular, polipeptidele mici migrnd mai repede. Dup electroforez, vizualizarea proteinelor se face prin adugarea unui colorant (cel mai folosit albastru Coomassie) care se leag la proteine, fr a colora gelul. Prin aceast metod, cercettorul poate monitoriza progresiunea unui proces de purificare proteic cum ar fi fracionarea celular. Compararea poziiilor benzilor de migrare cu geluri standard face facil identificarea unor proteine cu greutate molecular necunoscut.

DE REINUT pI punctul izoelectric punctul izoelectric este pHul la care ncrcarea net total a unei molecule amfotere devine zero. Punctul izoelectric depinde de tria ionic a solventului, de speciile contraionice i de concentraia de solvii n timp ce punctul izoionic este punctul izoelectric n absena contraionilor i la concentraii sczute de solvit. Punctul izoelectric este uor de determinat ca pHul la care molecula este imobil ntr-un experiment de electroforez (focusare izoelectric). Punctul izoelectric se apropie de punctul izoionic la o trie ionic sczut, cnd legturile ionice sunt inactivate. La punctul izoelectric, moleculele amfotere se agreg i devin insolubile deoarece nu exist repulsie electrostatic ntre molecule cu aceeai ncrcare net.