Metode de determinare a activitatii enzimatice © precipiarea gradual a unuia dintre componentii mediului de reactie determina modificéri la nivelul absorbanfei sau fluorescentei si interfer in doterminirile spectofotometrice si fluorimetrice. De excmplu, adiugarca la mediul de reactie care contine un tampon pe baza de fosfati a ionilor de calciu sau magneziu, ioni care sunt activatori ai unor enzime, determina aparitia unor precipitate. Accleagi efecte pot fi produse de un produs de reactie greu solubil in apa care precipita spre finalul desfisuririi reactiei; © contaminarea unuia dintre componentii mediului de reactic, De exemplu, in cazul determinarilor efectuate cu preparate enzimatice nepurificate care contin substraturile enzimei se inregistreazi 0 vitez’ de reactic si in absenta acestuia din mediul de determinare. Daca substratul este o molecula mica el poate fi indepartat din extractul proteic prin dializ& sau ultrafiltrare; ® contaminarea veselei utilizate cu alte proteine. Multe proteine adera puternic la suprafete de sticlé. Spre exemplu, uncle enzime adsorbite pe peretii de sticla ai cuyelor spectrofotometrelor nu pot fi indepirtate prin spalare cu api distilata si interferd in utilizari ulterioare ale cuvelor. Aceasti interferenfai poate fi minimalizati prin folosirea cuvelor de plastic; © reactii necatalizate enzimatic. Solutiile de NAD(P)H sunt instabile la valori de pH sub cea neutra si conduc Ia scaderi spontane ale absorbanjei la 340 nm, in aceasta situatie valoarea adsorbantei determinati in reactia neenzimatici trebuie scdizuta din cea inregistrati in prezenfa enzimei. Reactii intre diferite componente ale mediului pot avea loc si in absenfa enzimei. De exemplu, aldehidele pot reactiona neenzimatic cu NAD * formand un produs cu absorbanti similar cu a NADH-ului. O asfel de reactie creazi probleme in determinarea activitatii aldehid dehidrogenazei la pH alcalin, dar este nesemificativa la valori de pH acide sau neutre; © prezenta in mediu a unei enzime contaminante care catalizeaza o reactie care interferd in determinarea activitatii enzimatice. Pentru a anula aceste interferene probele in care se determina activitatea sunt insotite de un martor care confine toate componentele mediului de reactie, cu exceptia uneia, care de obicei este enzima. Valoarea martorului se scade din cea determinata pentru proba. 4.2, Tipuri de metode utilizate in determinarea activitatilor enzimatice Metodele utilizate pentru a determina activitatile enzimelor trebuie si fie specifice, sensibile cantitative, simple $i rapide, Metodele sunt de doua feluri, metode directe si metode indirecte. In metodele directe se urmiresc direct si continuu modificarile produse la nivelul proprictitilor unuia dintre reactanfi sub actiunca cataliticd a enzimei. Metodele indirecte necesité tratamente ulterioare ale amestecului de reactie. Metodele indirccte pot fi continue sau discontinue, fn metodele continue enzima si substratul (sau substraturile) sunt amestecate si se urmareste, continua sau periodic, o finctie dependents de concentrajia unui produs de reactie sau a unui substrat, Exemple de astfel de functii sunt absorbanta sau presiunea unui gaz. Metodele continue permit urmirirea progresiva a curbelor de reactie si o determinare 3Diana Dinu simpli a vitezei. in metodele discontinue, reactia este stopati dup& un anumit timp cu un agent de precipitare al proteinelor si se dozeazA cantitativ un component consumat sau eliberat in cursul reacfiei Metodele directe exploateazi orice diferen{& existent intre proprictatile substraturilor si cele ale produsilor de reactie. Modificari in absorbanté, fluoresceny, pH, roiatie optic’, conductivitate, entalpic, vascozitate sau yolum al mediului de reactie, au fost utilizate pentru a determina activitatile unor enzime. Dintre acestea cele mai utilizate sunt cele spectrofotometrice gi fluorimetrice. Reactiile care implica consum sau eliberare de protoni pot fi determinate direct si continua, in medii netamponate sau tamponate slab, urmirind modificarea pH-ului cu ajutorul unui clectrod de sticla. Electrozi sensibili la diferiti ioni sau la diferite gaze pot fi utilizati pentru a monitoriza modificiri ale concentratiilor unor substante ca: ionul amoniu sau CO, Metodele indirecte necesita tratamente ulterioare ale mediului de reactie fie pentru a produce un produs masurabil, fie pentru a mari sensibilitatea procedculuj de determinare a activititii. Metodele indirecte pot fi continue sau discontinue. Metodele indirecte continue utilizeaz& una sau mai multe enzime aditionale care catalizeaz; 9 reactie prin care un produs al actiunii enzimei supuse determinarii este transformat intr-un compus care poate fi determinat direct. Astfel de determinari sunt numite metode cu reacfii cuplate sau metode cu enzime auxitiare. Mctodele indirecte discontinue necesiti stoparea reactiei enzimatice dup’ o perioadi fixi de timp si tratarea mediului de reactie pentru a separa un produs care s% poati fi analizat, sau pentru a produce modificari in proprietitile unuia dintre substraturi sau produsi de reactie, modificari care pot fi masurate. Metodele indirecte discontinue pot fi spectrofotometrice, radiomettice, titrimetrice, etc. 4.2.1, Metode fotometrice Metodele fotometrice sunt cele mai utilizate metode de determinare ale ‘lor enzimatice. Ele subt metode sensibile, rapide, reproductibile, care necesiti consum mic de reactivi $i pot fi utilizate pe un numar mare de probe. in cazal multor enzime conversia substratului la produs de reactie este insofita de modificdri la nivelul proprietitilor optice ale sistemului, modificari_ care pot fi monitorizate direct. in cazul reactiilor enzimatice care nu conduc la modificari directe ale proprietafilor optice ale sistemului, incorporarea in mediu de reactic a unui reactiv corespunzittor, face ca reactia respectiva si poata fi urmiriti fotometric. Cele mai utilizate metode fotometrice se bazeazi pe modificarea absorbyie luminii de citre o solutie ca urma a reactiei catalizate de o enzim’. Alte metode fotometrice se bazeazi pe modificari ale fuorescenfei sau turbidita{ii solutici induse in urma catalizei enzimatice. 4.2.1.1. Metode spectrofotometrice Metode spectrofotometrice se aplica in cazul reactiilor enzimatice in care au loc modificdri ale proprictatilor spectrale ale substraturilor sau ale produgilor de reactic, modificdri care apar in ultraviolet (200 - 400 nm) sau in vizibil (400 -750 nm) si care 14Metode de determinare a activitatit enzimatice pot fi puse in evidenta la concentrafii foarte mici de substan. Conditiile care trebuie avute in vedere la aplicarea metodelor spectrofotometrice sunt urmitoarele: ‘© eoarece este putin probabil ca substratul si produsul si aibé spectre de absorbtie identice, determinirile trebuie efectuate la o lungime de unda la care transformarea substratului in produs este insotit’ de modificarea absorbjiei; « proprietitile spectrale ale substantei de analizat trebuie cunoscute, pentru ca, cea mai mare sensibilitate pentru determinarea spectrofotometric’ a unui compus se obtine la Iungimea de unda la care acesta prezinta 0 absorbtie maxima; © misuritorile de absorbanti trebuie efectuate pe un domeniu de concentratii pe cate, pentru substanfa de analizat, se respecti legea Lambert-Beer, A=ecl unde: A este absorbanta, adici cantitatea de luming adsorbita (termeni sinonimi densitate optic sau extinctie); ecste coeficicientul de extinctie; Leste lungimea drumului optic. Coeficientul de extinetie este frecvent exprimat in M “| cm“, gi roprezinta absorbanta unei solutii din substanta de analizat avand 0 concentratie de | mol Ja litry laun drum optic de | cm. Un alt mod de exprimare a lui € este sub forma de cm’ mol! gi reprezinti absorbanta unei solufii care contine 1000 moli din substanta de analizat intr-un litru de solutie, la un drum optic de 1 ems valorile absorbantei datorate allor componente ale mediului care absorb lumina trebuie s& fie scazute din valoarea total a absorbanfei prin utilizarea unui blank (proba care nu confine substanfa de analizat); © in cazul determindrii unor substan{e colorate, culoarea trebuie si depind’ exclusiv de substanta de analizat (metoda si fie specifica pentru aceasta) gi sa fie cA( mai stabila in timp; @ absorbanfa determinaté Ia spectofotometre trebuie si aiba valori intre 0,01 si 1,0; ‘© misuritorile continue ale absorbanfei trebuie realizate la o temperatura constant, la care enzima studiati prezinti _activitate maximé (in spectofotometre prevazute cu sisteme de termostatare a probelor). Metodele spectofotometrice aplicate pentru determinarea activititilor enzimatice pot fi directe sau indirecte, continue sau discontinue. Exemple de enzime care pot fi dereminate spectofotometric. (a) Enzime care pot fi determinate prin metode spectrofotometrice directe si continue. Oxidoreductazele NADH sau NADPH dependente pot fi dozate prin astfel de metode pe ambele sensuri ale reactiei. Dozarca se bazeaza pe faptul cA, spectrul de absorbfiei al formei oxidate a coenzimei diferd net de cel al formei reduse, NADH (sau 75Diana Dinu NADPH) avand absorbtie caracteristicd 1a 340 nm, lungime de unds la care forma oxidati nu absoarbe « Lactat dehidrogenaza este 0 enzima care se preteazi unor catalizind o reactie de tipul: tfel de determinari, CH,COCOO’ + NADH + H* ——= CH,CHOHCOO" + NAD* piruvat lactat Lactat dehidrogenaza poate fi determinata spectrofotometric pe ambele sensuri, umnirind, fic sefiderea absorbantei la 340 am ca urmare a consumarii NADH, fie cresterea absorbantei la 340 nm ca urmare a formarii NADI. Se prefer determinarea pe sensul in care este redus piravatul din urmatoarele motive: echilibrul reactiei este deplasat catre acest sens, modificari in absorbant fiind semificative chiar in primele momente ale reactiei; viteza maximi de reactie este mai mare pe acest sens, cea ce face metoda mult mai sensibilZ; la pH-ul la care se determind activitatea, NADH este mult mai stabil decit NAD”. Activitatea acestei enzime se determina la 30°C, pH 7,2 in tampon Tris-HCI 50 mM, la 0 concentratic a piruvatului de 1,2 mM si a NADH de 0,15 mM. Concentratiile substraturilor au fost alese din urmitoarele considerente: piruvatul este si un inhibitor al enzimei pentru ca el se leagi la complexul enzim’- NAD‘ si formeazi un "complex avortiv" (concentrajia de piruvat aleasi este relativ scizuti pentra a impicdica inhibitia prin substrat); concentrafia inifiald aleasd pentru NADH determina o valoarea convenabila a absorbantei, respectiv de 0,9 in cuva cu drum optic de 1 om. (b) Enzime pot fi determinate spectofotomettic prin metode indireete continue, jn care se cupleazi reactia acestora cu reactia catalizata de o alta enzimi, numita enzima auxiliard. in astfel de metode, cnzima auxiliari catalizeaz’ transformarea continua a unui produs de reactie al primei enzime. Enzima auxiliard si cofactorii acesteia trebuie introdugi in mediu de reactie in cantitafi suficiente, pentru a transforma toati cantitatea de produs de reacfie al enzimei testate. Cateva enzime care pot fi dererminate prin metoda reactiilor cuplate sunt urmatoarele: © hexokinaza, poate fi determinata prin cuplarea reactici sale cu cea a glucozo-6- fosfat dehidrogenazei, in prezenta NADP *, Glucozs Bexelinaz®, Giucozo-6-fostat , stent glucozo-6 fosfat dehidrogenaza “> NAHPH + HY Lactona acidului 6-fosfogluconicMetode de determinare a activitatit enzimatice : + fosfofructokinaza, prin cuplarea react sale cu cele catalizate de deus enzime i ‘auxiliare, piruvat kinaza gi lactat dehidrogenaza; 3 Fructoze-6-fesiat ——Sctofrmetekinzs __y» Fructozo-1,6-difosft i ATP ADP pirwvat kinaza Pinyvat Fosfvenolpiruvat NADH + + lactat dehidrogenaza 7 NaD* Lactat + aspartat aminotransferaza, in prezenta malat dehidrogenazei, in calitate de cuvimd auxiliard, Aceast’ enzimi este dozatd optim din ser Tn urmiatoarele conditii: 30°C, 240 mM L-aspartat, 12. mM 2-oxoglutarat, 0,1 mM piridoxal fosfat, 0,18 mM NADH, 0,42 unititi de malat dehidrogenazi/ml, 0,6 unitati de lactat dehidrogenaza/ml, in tampon: ‘Tris-HCl 80 mM, pH 7,8. Piridoxal fosfatul se agaugii in medin deoarece este un cofactor al aminotransferazelor, iar lactat dehidrogenaza pentru a minimaliza interferenta indus de piruvatul din ser. aspartat aminotransferara dorogutrst + Leapatat <=—$—$—_— alporat L-ghitamat NADH + Ht malat dehidrogenazit NAD* malat (6) Enzime care pot fi determinate utilizind substraturi sintetice cromogene. ‘Atunci cAnd reactia enzimaticd nu este fnsofit’ de o modificare a absorbanfei, pot fi utilizate in locul substraturilor naturale, substraturi sintetiec, cromogene, care conduc la produsi de reactie colorati sau care absorb in ultraviolet. Ideal in astfel de determintiri este ca enzima testata si manifeste aceiasi specificitate pentru substratul 71 TT CPDiana Dinu sintetic si pentru cel natural. Utilizarea subsiraturilor sintetice nu este recomandat’ in doziri_de enzime nepurificate, situatic in care acest tip de substraturi pot fi transaformat si sub actiunea altor enzime coprezente. Céteva enzime a clror activitate poate fi misurati cu ajutorul substraturilor sintetice sunt urmatoarele: * Pgalactozidaza, enrimi care hidrolizeaz? glucozi si fructoz. Un substrat sintetic al acesteia este p-nitrofenil-p- galactozidul, unul dintre produsii de reactie find in acest caz. p-nitrofenotul, substanta de culoare galbena, cu absorbanta maxima la 405 nm. © enzime proteolitice pot fi determinate utilizénd diferite oligopeptide sintetice, Tripsina hidrolizeazi substratul sintetic benzoil-arginin-4-nitrofenilalanina, substrat care poate fi transformat si sub actiunea altor serin proteinaze. Utilizarea ca substrat a tetrapeptide’ benzoil-le-Glu-Gly-Arg-4-nitroanilina, conduce 1a obfinerea 4-nitroanilinei, substanti cromofori, cu maxim de absorbfie la 400 nm. in prezenta unor substrauri conjugate cu 4-nitroanilina, sensibilitatea dozirii tripsinei este mai mare. © proteazele neuire pot fi determinate pe substraturi sintetice N-acilate cu acid furilacrilic. Aceste substraturi sintetice au absorbanta caracteristicd la 345 nm, valoarea acesteia seizAnd dup scintarea acestora sub actiunea proteazelor. Cand reactia catalizata de 0 enzima conduce la un produs de reactie care are in structura sao grupare reactivi care nu este prezenti in substrat, metoda de dozare a activiti{ii acesteia poate include un reactiv cromogenic, care reactioneaza direct cu produsul pentru a forma un cromofor. Reactivul utilizat nu trebuie si interfere cu reactia enzimatica. Astfel de metode indirecte sunt in general sau discontinue. Alanin aminotransferaza poate fi dozati print-o astfel de metoda. Piruvatul, produsul de reactie, tratat cu 2,4 —dinitrofenil hidrazin’ preparata in HCI IN, formeazi 2,4-dinitrofenil hidrazona acidului piruvic, substan{a care in prezenta NaOH 0,4N conduce la un compus rogu, cu maxim de absorbtie la 546 nm. Metoda este discontinua deoarece acidul clorhidric stopeaza reactia enzimatica. lactoza, substratul ei natural, Ia 4.2.1.2. Metode fluorimetrice. Fenomenul de fluorescenfa, ca gi cel de absorbjie, este rezultatul unei tranzitii electronice care converteste moleculele care absorb lumina intr-o stare excitata Absorbtia si cxcitarca sunt dou’ cuvinte care descriu acelagi fenomen fizic. Diferenta intre compusii fluorescenti si cei nefluorescenfi este determinati de fenomenul care se produce atunci cind starea excitati revine la cea normal. in cazul moleculelor nefluorescente, energia moleculelor exoitate se pierde sub forma de cildura, iar un compus fluorescent emite o parte din aceasti energie sub formi de lumini. Pe parcursul perioadei dintre absorbtie si emisic (de aproximatiy 10° secunde), moleculele pierd o parte din energia lor prin relaxare vibrationala, astfel ci, lumina emisa are o energie mai mica decit cea excitanta si in consecinfa o lungime de und& mai mare ca aceasta. Metodele fluorimetrice sunt mai sensibile decat cele spectrofotometrice, putind decela concentrafii foarte mici dintr-o substanfi fluorescent’. Toti compusii fluorescenti absorb lumina la lungimea de unda de excitare. Acest lucru inseamna ca 18Metode de determinare a activitajii enzimatice intensitatea luminii incidente (15) scade exponential pe masura ce raza strabate solutia compusului fluorescent. Astfel, relatia intre emisia de fluorescenta (I,) si concentratia substanfci fluorescente (c) este nelineara, fiind de forma: T= [nQ(1- 10"), Q; fiind fractia constanti din energin luminii absorbiti de compusul fluorescent. {in practicd relatia dintre fluorescenta, misurati cu ajutorul unui fluorimetra, gi concentratie este mult mai complexa. Atunci cand absorbanta solutiei la lumgimea de undi la care se face excitarea este mare, partea din solutie care emite cel mai puternic este cea care se aila cel mai aproape de sursa de lumina, orientarea acesteia in cuva nepermifind detectia luminii emise. De aceea experimentele de determinari fluotimetrice webuie si inceapi cu observarea fluorescentei din cuva cu capacul aparatului deschis, la diferite lungimi de undi (ochii si pielea nu trebuie expuse la lungimi de und& mai mici de 320 nm). Avnd tn vedere c%, emisia de fuorescenta se produce in toate directiile, detectorul fluorimetrului este setat pentru a colecta doar lumina emis sub un unghi de 90? fata de raza incident. Reprezentarca fluorescentei in functic de concentratia metilumbeliferonei (umbeliferona este 7-hidroxicumarina, substant& puternic fluorescent’), prezentata in Figura 4-2, indica c& este posibil ca o proba sa apare ca fiind nefluorescenti, cind in realitatea ea contine 0 cantitate mult prea mare de substanfi fluorescent, cantitate care nu poate fi detectaté. La concentratii sub 10 UM, curba este linear si devine progresiv nelineara daca absorbtia luminii creste. in practic, se pot obtine relafii nelincare intre florescen{a de emisic si concentrafii daca valorile absorbanjei nu sunt suficient de mici (sub 0,1). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300 350 {imetifumbeliferonii] microM Fluorescent2 aparenti Figura 4-2. Relatia intre fluorescenfa masurata si concentratia de metilumbeliferon’, (Aex= 355 nm, Rem = 355 nm). 19Diana Dinu Exemple de enzime care se pot determina fluorimetric Doar 0 mica parte din compusii naturali care absorb lumina in vizibil sau ultraviolet sunt suficient de fluorescenfi pentru a putea fi utilizati in determinarea activitatilor enzimatice. Citeva enzime care pot fi determinate fluorimetric sunt prezentate in contimuare. © NAD(P)H enzimele pot fi determinate fluorimetric, pe direetia de reactie in care se produce NAD(P)H. in determinarea unor astfel de oxidoreductaze nu se obtin sensibilitati mari pentma od fluorescenta NADH se stinge puternic in solutii apoase. Determinarile sunt influentate si de performantele fluorimetrelor. Spre exemplu, limita inferior’ de detectic a vitezei pentru astfel de oxidoreductaze, prin, inregistrare continua a absorbantei la un spectofotometru Beckman DU7 este de 10 “1M min’, iar prin inregistrarca fluorescentei la un fluorimetru Perkin Elmer LS 5, este cu un ordin de marime mai mica. © Antranilatul, un intermediar cheie in metabolismul aminoacizilor aromatici, este un compus fluorescent, formarea sa fiind baza unei metode de dozare a antranilat sintazei, enzim’ care catalizea7a formarea acestuia conform reactiei: glutamin’ —piruvat + glatamat id \, chorismat antranilat Pentru dozarea acestei enzime excitarea se realizeazi la 325 nm, iar emisia se inregistreaza la 400 nm. ‘© Pentru determinarea unor hidrolaze prin fluorimetrie se utilizeazd substraturi sintetice fluorigenice, substante derivate de la umbeliferona si de la un analog al situ, 7-amino 4-metilcumarina. Studii comparative intreprinse pentru aceiasi enzima, au evidenfiat c& utilizarea substraturilor sintetice fuorigenice conduce la o sensibilitate cu doud ordine de mirime mai mare decit cea obfinut in cazul utilizarii substraturilor sintetice cromogenice, Metilumbeliferona poate fi detectati fluorimetric la concentratii de 10" M, Proprietifile fluorescente ale acestei substanfe (Aex = 360 nm, Aem= 455 nm) se datoreazi formei anionice a acesteia, forma care nu se formeazs la pH-ul acid, pl la care actioneazé multe hidrolaze. Pentru a putea doza astfel de hidrolaze, reactia cate se desfasoara la pH acid este stopata, iar anionul fluorescent se formeazA prin aditia unui tampon puternic alcalin. ‘Multe metode continue fluorescente utilizate in determinarea peptidazelor utilizeaz& substraturi oligopeptidice in care legitura scindata este una amidica formatit cu 7-amino 4-metilcumarina. Spcetrul de fluorescent al substratului este diferit de cel 80.Metode de determinare a activitayit enzimatice al produsului de reactie, activitatea peptidazelor putind fi monitorizata continu pe un domeniu larg de pH. 4.2. Metode electroc! ce Metodele electrochimice utilizate in determinarea activitatilor enzimatice sunt: polarografia, electrodul de oxigen $i titrarea potentiomeiricd. Polarografia este o metoda prin care se studiaza substantele electro-active. Substanfele electro-reductibile sau electro-oxidabile accepti sau cedeaza clectroni de la, sau unui electrod, atunci cand un potential corespunzator este aplicat. Potentialul la care 0 substanti este redusi sau oxidaté este o caracteristicd a acesteia, iar curentul electric care trece reflect viteza de clectroliz’. Cand viteza de reactie este determinata pe baz: concentratieci unei substanfe electro-active care suferi un proces de electrolizi, modificirile induse in tenstunea curentului clectric indict modificari la nivelul concentratiei substantei. Desi multe studii de enzimologie vizeazA procese de transfer de electroni sau reactii redox, polarografia este foarte putin utilizat’, 4.2.2.1, Electrodul de oxigen. Cel mai utilizat electrod este electrodul Clark, clectrod alcatuit dintr-un catod de platind caruia i se aplica un voliaj negativ gi un electrod de referinfi Ag/AgCI Legitura intre cei doi electrozi se realizeaz’t printr-o solufie saturati de KCI. Intregul clectrod este acoperit de 0 membrana de polictilena sau de teflon cu grosimea de 0,03- 0.13 mm, Aceasti membrani, impermeabili pentru apa gi soluti, previne ottivirea prematuri a clectrozilor de cite materialul biologic si actioneazi ca o barieri neconducdtoare intre electrozi si solutia sau gaml in care se masoari oxigenul, Membrana este totusi permeabila pentru oxigen. Oxigenul din solutie este determinat prin masurarea curentului electric produs dupa reducerea sa electrolitic’ la catod. Curent produs poate fi misurat cu ajuioral unui sistem corespunzator de amplificare sau cu un inregistrator. Reactiile care se desfigoara la catod sunt urmitoarele: O, + 2H,0 + 2e° ——~ 20H~ + HQ, HO, + 2e ——~ 20H" si aratd preluarea a 4 ¢“/mol de oxigen. Reactia nu este influentat& de pH-ul mediului, Proprietate importanti in determinitile biochimice, Relafia existenti intre voltajul negativ aplicat la catod si rispunsul electrodului sub formi de curent produs evidentiaz un platou al curentului produs la o tensiune aplicati cuprinsa intre 0,6 gi 0,9 V. Pe acest platou curentul produs este proportional cn activitatea chimicd (sau cu potenfialul sau presiunea parfiala) a O, de la suprafafa clectrodului. Majoritatea mediilor in care se realizeaza determinari biochimice au o activitate chimicd egali cu unitatea, cea ce inseamnd ci existi o proportionalitate intre curentul produs $i concentrafia oxigenului la suprafaya electrodului. Este important ca solutia in care se 81Diana Dinu | Exercifi * Se determin’ activitatea unei enzime urmirind scAderea concentratiei substratului in timp. Concentrajia inijiala a substratului a fost de 0,5 mmoli, Dupi 15 minute de actiune a enzimei concentratia substratului in mediu a fost de 0,2 mmoli. $tiind ca in eterminare s-au utilizat 0,3 ml de preparat enzimatic avind 0 concentratie proteic’ de 10 mg/ml, sa se calculeze activitatea acestei enzime in U/mg si in pKat/kg, © Sc dozeazi activitatea amilazica printr-o metodi spectrofotometrici. Mediul de reactic contine: 0,5 mi solufie de amidon 0,6% si 0,2 ml preparat enzimatic diluat de 10 ori, Dup% 10 minute, reactia enzimatic& este stopata cu acid acetic 6%, iar amidonul rimas nehidrolizat este determinat pe baza reactic ou iodul. Densitatea optica la 546 nm, lungime de unda la care complexul iod-amidon are maxim de absorbtie, a avut valoarea de 0,35. in paralel s-a efectuat si un martor tn care reactia enzimaticd a fost stopata la timpul zero, prin adiugarea acidului acetic inainte de preparatul enzimatic. Martorul a avut 0 densitate optica la 546 nm de 0,85. Extractul nediluat a avut © concentrafie proteici de 1 mg/ml. S& se calculeze activitatea ile specificate si sa se exprime ca mg amidon hidrolizat in timp de | minut sub actiunea a | mg de protein’, © O solutie care confine un amestec de NAD * si. NADH are absorbanta la 340 nm de 0,316. Valoarea absorbanfei solutici la 260 nm este de 1,11. Calculafi concentratiile | dc NAD’ si NADH din amestce stiind of: : ‘Lungime de und’ Cc fie molard (Mem) am NAD* NADH i 260 ~ 18000 15 000 j 340 0 6320 4 * Se dozeazi activitatca lactat dehidrogenazci printr-o metodi spectrofotomettic’ Mediul de reactie, cu un volum de 0,9 mi, confine lactat si NAD * intr-o solutic tampon adecvata. Reactia enzimatica este declangat’ prin adiugarea a 0,1 ml solutie enzimatica diluata de 100 de ori. Dupa 3 minute de reactic se inrogistreazii o crestere a absorbanjei la 340 nm de 0,12. Stiind cA: preparatul enzimatic nediluat a avut 0 concentatie protcici de 10 mg/ml, coeficientul de absorbfie molard al NADH, la 340 rm, are valoarea de 6,32x10° M~ cm ~ si drumul optic a fost de 1 cm, si se calculeze activitatea enzimei in Ulmg si in Kat/mg, «Se determina activitatea fosfatazei alcaline utilizénd ca substrat p-nitrofenil fosfatul. Unul dintre produgii reacfiei, p-nitro fenolul, in mediu alealin formeaz& un compus cu. | maxim de absorbjie la 405 nm. Mediu de reactie confine 0,2 ml solutie enzimatici gi i 1,8 ml tampon substrat 125 mM. Dupi 20 de minute de la adaugarea solutici enzimatice, se adaugi in mediu S ml NaOH 0,2 M gi se determin’ o valoare a absorbantei a 405 nm de 0,450. fn paralel se efectueaz’ si un martor a circi absorbant la 405 nm este de 0,05. S& se calculeze activitatea en.rimei $i si se exprime in Using, stiind c& cocficientul de absorbtic molard al p- nitrofenolului, la 405 nm, are 90Metode de determinare a activitdjii encimatice valoarea de 18,3x10° M' cm“, drumul optic a fost de | em, iar concentrafia proteicat a solujiei este de 2 mg/ml Se determina activitatea P-galactozidazei. Pentru aceasta 0,25 ml extract enzimatic a fost incubat cu o solutie 3x10” M p-nitrofenil B-galactozid si tampon, volumul total al amestecului de reactic find de | ml. Periodic, din amestecul de reactie s-au luat probe de 0,1 ml la care s-au adiugat 2,9 ml NaOH 0.1 N. Concentratia p-nitrofenolului cliberat a fost determinata prin misurarea absorbanfci la 405 nm fafi de un martor care contine p-nitrofenil -galactozid, tampon si NaOH in aceleasi concentratii ca si proba. Coeficientul de absorbtie molar’ al p- nitrofenolului, la 405 nm, are valoarea de 18,3x10° Mt cm“, iar concentratia soluici proteice este de 5 mg/ml. Absorbanta p- aitofenolului la 405 nm in cava de 1 cm este prezentati in tabelul urmitor: ‘Timp de incubare A vinute) 405nm 2 0,09 4 0,18 6 0,27 8 0.45 Sa se calculeze activitatea enzimei in U/mg. Glutamat dehidrogenaza izolata din ficat poate fi determinata printr-o metoda in care viteza cu care decurge reactia enzimatiod este urmariti prin descresterea absorbantei la 340 nm, Amestecul de reactie are un volum de 0,9 ml gi contine: 2-oxoglutarat, NH; si NADH. Reactia enzimaticd este declangata prin adjugarea a 25 jul de preparat enzimatic. Absorbanta 1a 340 nm la timpul zero (momentul adiugarii enzimei) a fost de 0,310. Dupa 2 minute de reactie absorbanfa la acciagi lungime de unda a fost de 0.230, Cuva in care s-a Ficutcitrea a avut un drum optic de L om, iar coeficientul de absorbfie molari al NADH la 340 nm este de 6,32x10° M“! cm ~!. Stiind ed, extractul proteic utilizat a avut o concentratic proteicd de 25 mg/ml, st se calculeze activitatea enzimei in U/mg si in Kat/mg, NADH peroxid de hidrogen oxidoreductaza a fost determinata printr-o metodi Spectrofotometrica continua. Viteza de reactie a fost monitorizata prin descresterea absorbantei 1a 340 nm. Mediul de reactic a avut un volum de 2,9 ml si a confinut NADH si Hz02. Reacfia enzimatica a fost declangata prin adiugarea a 0,lml enzima diluata de 1000 de ori. Dup’ 3 minute de la declangarea reactiei s-a constatat 0 scidere a absorbantei 1a 340 nm de 0,12. Cuva in care s-a facut citirea a avut un drum optic de 1 cm, iar cocficientul de absorbtic molar’ al NADH la 340 nm este de 6,32x10° M ~ cm”, Stiind ca, extractul proteic nediluat a avut 0 concentratio proteicé de 10 mg/ml, si se calculeze activitatea enzimei in. U/ing si in Kav/mg, Glutamat oxaloacetat transaminaza poate fi determinata in ser printr-o metoda care foloseste ca enzima auxiliara malat dehidrogenaza, viteza cu care decurge reactia fiind umniriti prin descresterea densititii optice Ia 340 nm. Amestecul de reactie confine: exces de aspartat, 0,1 ml ser, 0,3 pmoli de NADH gi malat dehidrogenaza in exces intr-un volum total de 0,9 ml. Reactia enzimatica este declangata prin adiugarea unui exces de 2-oxoglutarat intr-un volum de 0,1 ml, Dupa o scurt perioad’ de timp S ‘inregistreazi o sc&dere a densitifii optice Ue 0,04/min, Cuva in care s-a ficut citirea 91Diana Dimi avut un drum optic de 1 em, fat coeficientul de absorbtic molaré al NADH Is 340 nm are valoarea de 6,32x10° M7 cm “l Stiind c& serul utilizat a avul © concentratic protcici de 7,2 mg/100 ml, s& se calculeze aetivitaten enzimei in ‘Umg si in Ka’mg, « Piruvat kinaza a fost determinats printr-o meted care uflizeaza ca enzims auxiliand se jehidrogenaza. Mediul de teactie, cu un volum de 1,9 ml a confinut: fosfoenol piruvat in exces, NADH, 0,2 ml preparat enzimatic si enzimi auxiliar’ in exces Reactia a fost declansaié prin ad’ugarea 2 0,1 ml de solufie de ADP. Absorbanta la timpul zero a fost de 0,57, iar dupa 3 minute de reactio a szut ia.0,45. Cuva in care s~ tore eitvea a avat-un drum optic de I em, iat coeficientul de absorbfie molar all NADH la 340 nm este de 6,32x10° Mem“. Stiind 0, extractul proteic utilizat a avat o eoncentratie de 5 mg/ml, sa se calculeze activitatea enzimei in U/mg si in Katimg,