Sunteți pe pagina 1din 2

METODA EFECTUARII SECTIUNILOR FINE

Realizarea unui preparat microscopic permanent prin metoda efectuarii sectiunilor fine necesita o tehnica care se desfasoara in mai multe etape. Astfel, recoltarea const n obinerea de material biologic de la organisme vii sau de la organisme moarte, persoane decedate sau animale de experien sacrificate. Recoltarea materialului biologic din organismele vii se poate efectua prin: biopsie, punctie bioptica, aspiratie endoscopica, punctia cavitatilor, raclarea mucoaselor, prelevarea intraoperatorie, recoltarea de material biologic de la cadavrele umane si prin recoltarea de la animelele de experienta. Aceasta procedura se face pe o placa de pluta sau de P.V.C. foarte curata; se folosesc pense fine, fara dinti. La fasonarea pieselor se folosesc lame de ras noi, degresate. Daca tesutul are o consistenta moale (sistem nervos central, testicol) se prefera fixarea unor fragmente mai mari timp de 1-2 ore, perioada in care structurile superficiale se intaresc si permit obtinerea lor. Fixarea are drept scop esential conservarea constituientilor celulari intr-o stare cat mai apropiata de starea vie si de pregatirea lor in vederea manevrelor ulterioare. Aceasta etapa poate fi realizata prin agenti fizici sau chimici. In fixarea prin agenti fizici se incadreaza metodele ce folosesc caldura, desicarea la temperaturi scazute(congelare-desicare sau criodesicare), desicarea la temperatura laboratorului, metodele ce presupun racirea preparatului biologic urmata de actiunea unui fixator lichid(congelare-substitutie), racirea nereprezentand un procedeu de fixare. Dintre toti fixatorii fizici trecuti in evidenta numai caldura asigura o fixare in adevaratul sens al cuvantului, adico o denaturare a proteinelor tisulare incat in majoritatea cazurilor se impune interventia agentilor chimici susceptibili a asigura aceasta denaturare. In functie de tipul de actiune asupra ovalalbuminei se poate face o clasificare a agentilor chimici fixatori in coagulanti (metanol, etanol, acetona, acid nitric, acid clorhidric, trioxidul de croom etc) si necoagulanti (acid acetic, tetraoxid de osmiu, formaldehida). De asemenea exista si amestecuri fixatoare definite ca amestecuri de doi sau mai multi fixatori simpli la care se pot adauga substante destinate realizarii unui anumit pH al solutiei. Acestea se pot sistematiza in patru grupe: amestecuri cromo-osmice, amestecuri cromice fara OsO4 si acid acetic, amestecuri pe baza de metale grele in afara de crom si OsO4 si amestecuri cromo-acetice. Alti fixatori mai sunt amestecul de formol-calciu, fixatorii Clarke si Carnoy si fixatorii Bouin, Susa, Heidenhein. La alegerea fixatorului se tine cont de natura tesutului sau organului, detaliile de structura care trebuie evidentiate si coloratia pe care vrem sa o facem. Urmatoarea etapa este includerea in parafina si are mai multe subetape. Deshidratarea se realizeaza trecand tesuturile fixe prin alcooluri de concentratie crescatoare. Pentru tesuturile fragile se recomanda o deshidratare lenta incepand cu alcool 50. In clarificare piesa este trecuta prin bai succesive de solvent organic: toluen, xilen, benzen, cloroform. Impregnarea cu parafina se face in parafina mentinuta in stare lichida prin plasarea ei intr-un termostat la 56 la care se adauga o mica cantitate de ceara de albine. Durata impregnarii variaza in functie de volumul piesei, fiind in medie de 6 ore. In includerea propriu-zisa piesa se aseaza in parafina noua, neutilizata care se toarna intr-o forma. Racirea acestei parafine duce la solidificarea ei si obtinerea unui bloc gata de a fi sectionat. Parafina este mediul de includere cel mai frecvent utilizat, dar exista si alte medii si tehnici de includere: in paraplast, in celoidina, dubla includere in celoidina si parafina, in dietilen sau polietilen glicol sau in gelatina. A patra etapa este sectionarea si se realizeaza cu ajutorul microtoamelor, existand doua tipuri. Microtoame cu miscare verticala(pentru sectionarea blocurilor de parafina) si microtoame

cu miscare orizontala(mai ales pentru blocurile de celoidina). Pentru blocurile de parafina aceasta operatiune este simpla: se incalzeste port-obiectul metalic, apoi se aplica blocul de parafina, se introduc apoi in apa rece, mentinand in contact cele doua piese pana cand blocul adera solid la port-obiect. Etalarea si lipirea sectiunilor reprezinta ultima etapa a metodei efectuarii sectiunilor fine. Metodele de etalare si lipire variaza in functie de procesul de includere ce a fost folosit. Pentru sectiunile la parafina, paraplan sau Ester Wax (etalarea la bain-marie si etalarea pe lama) panglicile de parafina obtinute prin procesul sectionarii la microtom sunt plisate si trebuiesc etalate pe un mediu lichid, slab incalzit pentru ca pliurile sa dispara. Pentru sectiunile in celoidina pot fi utilizate trei modalitati: transportul sectiunilor culese in etanol 70%, in diferiti reactivi sau coloranti, se poate de asemenea lipi sectiunea pe o lama de sticla cu ajutorul unei solutii de celoidina sau cand colorantii folositi se fixeaza pe celoidina sectiunile trebuiesc lipite cu ajutorul unei solutii de gelatina. Sectiunile in celoidina-parafina sunt in general etalate si lipite ca si sectiunile de parafina, iar sectiunile in polietilen-glicol vor fi etalate folosind o solutie de gelatina sau albumina, dar la rece. Utilizarea mediului Reid si Sarantakos indeparteaza acest inconvenient.