INDICE

I. INTRODUCCIN

PG. 1

II. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD 2.1 Inoculacin de animales susceptibles 2.2. Inoculacin de huevos embrionados (fecundados) 2.3 Aislamiento en cultivos celulares 2.3.1 Sistemas de cultivo ms utilizados 2.3.2 Aislamiento y deteccin

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I. INTRODUCCIN Debido a que los virus, como ocurre con los plsmidos, se replican solo dentro de clulas vivas, la investigacin sobre virus requiere el uso de hospedadores apropiados. Para el estudio de los virus bacterianos se usan cultivos axnicos en medio lquido o en medio semislido con agar. Como la mayor parte de las bacterias son fciles de cultivar, resulta relativamente simple estudiar los virus bacterianos y por esta razon se dispone de un crecimiento detallado de la multiplicacin de estos virus. En lo que respecta a los virus de los animales, el hospedador inicial puede ser un animal susceptible al virus, pero a efectos de investigacin es deseable disponer de hospedadores mas manejables. En 1907 el bilogo estadounidense Ross Granville Harrison descubre que los tejidos vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera de su rgano original. Este fue el comienzo para el desarrollo de los cultivos de tejidos y mas adelante el de los cultivos celulares (lineas celulares). Muchos virus animales pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o cultivos celulares, y el uso de tales cultivos ha facilitado enormemente la investigacin sobre los virus. Los anticuerpos, al ser especficos de antgeno y por tanto especficos del patgeno, son componentes crticos de la respuesta inmune, interaccionan especficamente con el antgeno sobre las clulas diana pero no matan a las clulas. Existe un grupo de enzimas inespecficas conocido en conjunto como complemento que puede fijarse a los anticuerpos unidos al patgeno y lisar las clulas con el anticuerpo unido. La respuesta inmune es especfica para anticuerpos individuales y depende de anticuerpos especficos, pero puede ser mediada o estimulada a travs de mecanismos especficos como el complemento. En muchos casos, la inmunidad mediada por anticuerpos no es un mecanismo eficaz para controlar la diseminacin de la infeccin. Algunos agentes infecciosos parasitan el organismo desde el interior de las clulas. P.ej. los virus animales se reproducen utilizando los sistemas celulares del hospedador y, en consecuencia, gran parte de su ciclo vital transcurre en el interior de las clulas del hospedador. Teniendo en cuenta que los anticuerpos estn armados para reconocer al patgeno libre en la sangre, o a nivel de las superficies mucosas, las clulas infectadas del hospedador deben ser identificadas y destruidas por diferentes medios, generalmente a travs de interacciones clula a clula propias de la inmunidad celular. Por

fortuna, todos los patgenos endgenos producen antgenos que a su vez son presentados sobre la superficie de clulas diana infectadas.

II. PRUEBAS DE INFECTIVIDAD

2.1 Inoculacin de animales susceptibles En los primeros intentos para cultivos de virus, se utilizaba el husped animal definido del agente por estudiar. Estos intentos tropezaban con la complejidad propia del animal entero, y las grandes diferencias de sensibilidad de un animal a otro, incluso dentro de una misma especie. El descubrimiento y desarrollo de - 8cultivo in Vitro de clulas capaces de mantener la duplicacin hizo que ya no se requiriera a los animales para la conservacin ordinaria de la mayor parte de agentes virales. Hoy en dia la inoculacin de animales susceptibles es usada en estudios de infectividad, ya que algunos virus no provocan efectos reconocibles en cultivos celulares pero originan la muerte en animales. Tambin es usada para estudiar la oncognesis viral, la patogenia de los padecimientos virales, la respuesta inmune a los virus y el efecto de los factores ambientales sobre las infecciones virales, as como el aislamiento primario de ciertos agentes. El mtodo que se utiliza para inocular los virus a los animales depende de la sensibilidad del husped respecto al virus, as como de la naturaleza de la prueba o del experimento. Es frecuente recurrir a las siguientes vas de inoculacin: - Intravenosa - Intracerebral - Intraperitoneal - Intranasal - Intratraqueal - Intradermica Una vez lograda la duplicacin del virus, se recogen tejidos pertenecientes a las zonas correspondientes del organismo, se les secciona u homogeniza y se almacena (generalmente a baja temperatura) para emplearla despus como fuente de virus. El procedimiento general para una prueba de infectividad es realizar una dilucion seriada de la muestra desconocida, normalmente por diluciones decimales sucesivas, e inyectar muestras de cada dilucion a un cierto nmero de animales sensibles. Tras un periodo de incubacin adecuado, se

cuentan los animales vivos y muertos inyectados con cada una de las diluciones de la serie. Se suele considerar como valor de referencia la dilucion a la cual la mitad de los animales mueren. Aunque los mtodos de diluciones seriadas son ms prolijos y menos exactos que los basados en cultivos celulares, resultan esenciales en el estudio de algunos tipos de virus. Otros usos de las inoculaciones en animales susceptibles son la comprobacin de la inocuidad y poder protector de vacunas (poliomielitis), elaboracin de stas (rabia, viruela), efecto neutralizante de sueros inmunes y de pacientes (con fines comerciales y diagnsticos), etc., aunque su importancia se restringe cada vez ms por los avances logrados con los cultivos de tejidos. Entre los animales que se emplean estn monos, conejos, aves, ratas y ratones; estos ltimos ms que ningn otro.

Diferentes tipos de animales usados en laboratorio para la inoculacin de virus 2.2. Inoculacin de huevos embrionados (fecundados) Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante mas de 15 aos. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrin de pollo es un medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo adems un medio estril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrin en desarrollo. Tambin se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo de incubacin mas prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usandose huevo de gallina de 6 a 8 das de incubacin aproximadamente (a veces se usa huevos de mas tiempo de incubacin). Para preparar los huevos para el cultivo, en primer lugar se desinfecta la superficie de la cscara con yodo, y se perfora con un pequeo taladro estril. Tras la inoculacin, el agujero del taladro se sella con gelatina y se incuba el huevo. Los virus slo pueden reproducirse en determinadas partes del embrin; por consiguiente, se deben inyectar en la region apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infeccin puede producir una lesion tisular local conocida como pstula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico del virus. El mtodo exacto de inoculacin y la edad del embrin que se emplea, dependen del virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la cavidad amnitica de embriones de 7 a 8 das; pero el virus se duplica fcilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 das, despus de varias resiembras (adaptacin) en el amnios. Los focos mas utilizados para la inoculacin, a parte de las cavidades amnitica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrin en desarrollo, recurriendo a la inculacion intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplic el virus dentro de las clulas de las membranas o del embrin, puede liberarse a los lquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrin y en las clulas de la

membrana amnitica, pasa al liquido amnitico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros

virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las clulas en las lesiones o

pstulas que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solucion salina isotnica las membranas, logran liberarse estos virus. En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrin de pollo puede provocar la muerte del embrio (p.ej. virus de la encefalitis), producir pstulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas en los lquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2). En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la tcnica de inoculacin de huevos embrionados al correlacionar el nmero de pstulas contadas con la dilucion viral inoculada. Actualmente el mtodo preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculacin en huevos embrionados libres de patgenos especficos (SPF) o huevos negativos a anticuerpos especficos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 das de incubacin y se incuba a 35-37C durante 4-7 das. Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubacin se refrigeran a 4C y el lquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinacin. Si se detecta actividad de hemoaglutinatin hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reaccin negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.

Inoculacin de huevos embrionados para cultivo de virus de la gripe aviar

Estructura y puntos de inoculacin en un huevo embrionado

2.3 Aislamiento en cultivos celulares Los virus son microorganismos intracelulares y para evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en lneas celulares que permitan su desarrollo. Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados para la propagacin de los virus,
constituyen, desde 1950, el sistema ms empleado para el aislamiento y propagacin de la mayora de los virus, consisten en un sistema formado por clulas provenientes de un rgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composicin qumica definida y en condiciones de temperatura, pH, aireacin y humedad controladas. Dentro de stos, los ms

usados son los cultivos en monocapa, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensin, explantos, cultivos de rganos, cultivos en microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa de clulas que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene. Estos cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un agente que dispersa las clulas (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados) para luego transferir la suspensin celular obtenida a un recipiente de vidrio o plstico en donde las clulas se adhieren y multiplican. La invasin viral se evidencia a travs de un cambio celular o efecto citoptico (EC) y mediante pruebas complementarias.

No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un laboratorio de diagnstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares. Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios, cepas y lneas celulares (MRC5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus de la misma familia, el citomegalovirus (CMV) slo crece en cultivos primarios de pulmn fetal humano o bien en algunas cepas celulares derivadas del mismo rgano y especie (MRC-5). Por otro lado, una lnea celular como HEp-2 puede ser bastante sensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros, pero no permitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; adems, es posible que los pasajes sucesivos de una lnea la hagan disminuir su sensibilidad a algunos virus, como sucede con Hep-2 en relacin a VRS.

2.3.1 Sistemas de cultivo ms utilizados

Cultivos primarios: Se caracterizan por tener varios tipos de clulas. La mayora son de crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10 subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p. e., clulas de rin embrionario humano (REH).

Cepas de clulas diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la produccin de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales txicos. Estn constituidas por un tipo de clulas que retienen su nmero cromosmico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmn.

Lneas celulares: Son clulas inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n) nmero de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., clulas Vero (rin de mono verde africano), LLC-MK2 (rin mono rhesus) y BSC-1 (tambin de tejido normal de rin de mono) y HeLa y HEp-2 derivadas de clulas humanas malignas. stas generalmente tienen un nmero variable de cromosomas y a veces tambin son denominadas lneas celulares heteroploides. Otras lneas celulares existentes son A9 (fibroblastos subcutneos de ratn), BHK21 (fibroblastos de hmster), BRL3A (epitelio de hgado de rata), GHI, GH3 (epitelio de rata), L929, LS, S180 (fibroblastos de ratn), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitos de ratn), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratn suizo), 3T3-A31 (fibroblastos de ratn BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de rin de rata). Algunos ejemplos de lineas celulares son: HEP-2: Clulas heteroploides humanas derivadas de carcinoma larngeo. Recomendadas para RSV y ADENOVIRUS. MDCK: Lnea celular diploide de rin canino; para INFLUENZA y ocasionalmente PARAINFLUENZA. LLC-MK2: Lnea celular heteroploide de rin de mono Rhesus. Se recomienda para el aislamiento del virus PARAINFLUENZA. Requiere el agregado de tripsina cristalina al medio. MRC5: Lnea celular diploide fibroblstica de pulmn embrionario humano. Se recomienda para el aislamiento de CITOMEGALOVIRUS, HERPESVIRUS.

Entre las lneas celulares que se emplean con ms frecuencia estn las clulas Hep- 2, HeLa y Vero, en cuanto a clulas diploides las ms utilizadas son las lneas de fibroblastos de pulmn (MRC5) que se usan para el aislamiento de citomegalovirus (CMV). El cultivo primario ms utilizado es el rin humano embrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulacin frecuente como el herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc. En todo caso la eleccin por una u otra lnea celular depender del virus que se quiera evidenciar. 2.3.2 Aislamiento y deteccin Aunque el aislamiento viral es una buena tcnica para el diagnstico de infecciones virales asintomticas, crnicas y recurrentes, su eficacia depende del momento en que se tome la muestra, del transporte ptimo y rpido de las muestras; adems que se debe escoger el tipo de clulas que sean permisivas para el virus que se va a demostrar. Para los cultivos virales se utilizan monocapas celulares adheridas al lecho de un tubo, que requieren de sustratos esenciales para su mantenimiento, una solucin amortiguadora y un pH adecuado, adems se deben suplementar con suero fetal bovino, que contiene mltiples factores promotores de crecimiento celular. Una vez que la monocapa se inocula con una muestra pretratada que proviene de un individuo infectado, el virus se puede descubrir por:

EFECTO CITOPATICO (ECP): El efecto citoptico son cambios degenerativos especficos observados en una lnea celular como consecuencia de la replicacin de un virus infectante. ste puede aparecer despus de 3 4 das. A travs de stos cambios morfolgicos celulares es posible poner en evidencia la presencia de un virus en determinado tipo de cultivo de clulas. La observacin microscpica de las clulas en busca de ECP debe realizarse diariamente. El ECP puede ser de varios tipos: la formacin de sincicios, o de vesculas o inclusiones o el redondeamiento y desprendimiento de la monocapa celular. A veces la inoculacin de una muestra o el virus semilla produce efectos txicos transitorios o irreversibles sobre el cultivo celular. Estos pueden tener un efecto parecido al ECP. Tal toxicidad puede hacerse evidente dentro de las 24 horas y puede ser reducida o evitada cambiando el medio. Algunos ECP caracteristicos de virus son: 1. Virus Respiratorio Sincicial: formacin de sincicios o clulas gigantes en Hep-2. 2.Adenovirus: clulas redondeadas en Hep-2 con formacin de racimos dejando reas sin clulas.

CUERPOS DE INCLUSION: En ciertas virosis es posible comprobar la presencia de estructuras anmalas dentro del citoplasma o ncleo de las clulas parasitadas, demostrables por tincin segn mtodos de Mann, Sellers o Giemsa. Por lo general estas estructuras, llamadas cuernos de inclusin, muestran afinidad por colorantes cidos (eosina o fucsina cida) y son eosinfilas.

Las inclusiones intracitoplsmicas son redondas u ovales, de aspecto granular, y caracterizan a algunas infecciones, como la rabia (cuerpos de Negr) y la viruela (cuernos de Guarnieri). Las intranucleares son de dos tipos, A y B; la primera provoca fuerte reaccin de la materia nuclear, de modo que la inclusin se aprecia con un halo claro a su alrededor, libre de cromatina. Estas formas se ven en la fiebre amarilla y el herpes simple; las de tipo B ocasionan poca respuesta en la clula y por lo comn ocupan los espacios sin cromatina. Se observan en la poliomielitis. Los cuerpos de inclusin son de distintos tamaos; se presentan uno o varios en el citoplasma o en el ncleo y, por fusin, algunos ocupan todo el espacio nuclear, como sucede en el sarampin. Por medio del microscopio electrnico se ha comprobado en unos cuantos su integracin por agregados de cuerpos elementales, aunque falta conocer su verdadera estructura. Los cuerpos de inclusin son de enorme valor en determinadas virosis (los cuerpos de Negri son peculiares de la rabia), pero en tejidos sanos y en enfermedades no virales se han encontrado formaciones parecidas a ellos. El aspecto particular y caracterstico de cada tipo de inclusin suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formacin de cuerpos de inclusin ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados. Aparte de la accin citoptica directa, la lesin de las clulas infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antgenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular.

HEMADSORCIN: Existen otros mtodos para descubrir y caracterizar un virus en cultivo celular cuando todava no se produce el ECP, o ste no es evidente o en los casos en que el virus se debe reconocer por otras propiedades o caractersticas en cultivo. Dentro de las tcnicas que ayudan a identificar estas propiedades virales est la hemadsorcin, que consiste en que cuando el virus infectante incorpora protenas virales con propiedad de hemaglutininas en la membrana celular, las clulas infectadas se pueden descubrir por la adsorcin de eritrocitos de ciertas especies animales, que se puede observar al microscopio de luz. Es el caso de los ortomixovirus y paramixovirus que se pueden reconocer por la hemadsorcin de eritrocitos

de

cobayo

las

clulas;

la

identificacin

se

confirma

con

la

inmunofluorescencia directa mediante anticuerpos especficos. Esta tcnica se basa en la capacidad de glbulos rojos de determinada especie animal de unirse a protenas virales que estn siendo incorporadas en la membrana plasmtica en las clulas infectadas. Agregando glbulos rojos a una monocapa infectada con virus es posible observar microscpicamente la adherencia de los mismos a clulas que contienen virus y que estn expresando antgenos virales en su superficie. Por medio de esta tcnica, es posible demostrar la infeccin por aquellos virus que presentan protenas hemoaglutinantes.