Estudio Cintico de la Fosfatasa cida

Giselle Jimnez 173405 - Ray Marcel Marn 173407 Fecha de realizacin de la prctica: Febrero 27 del 2003 Objetivos Obtener el extracto crudo a partir de una muestra de germen de trigo. Determinar las condiciones de pH, tiempo, temperatura, concentracin de la enzima y concentracin del sustrato, ptimas para que la velocidad de reaccin catalizada por la enzima sea mxima. Calcular el valor dela constante de Michaelis-Menten y la velocidad mxima de reaccin. Analizar el efecto que tiene en la velocidad de reaccin la presencia de un inhibidor. Fundamento terico y reacciones (1, 2) Fosfatasa cida Como ya es sabido, al igual que el qumico en el laboratorio, la naturaleza tambin dispone de catalizadores para aumentar la velocidad de las reacciones que suceden en los organismos vivos. Dichos catalizadores reciben el nombre de enzimas y como es costumbre en la historia de la qumica, primero se descubrieron sus capacidades catalticas y despus su forma y estructura, lo cual sigue siendo hoy motivo de investigacin. Al igual que todos los catalizadores, la funcin de las enzimas es disminuir la energa de activacin de la reaccin (sin afectar el cambio neto de energa entre reactivos y productos) mediante interacciones entre el sustrato y el sitio activo de la enzima, las cuales suelen basarse en la distorsin y debilitamiento de unos enlaces para formar otros.
E ES

S E+P Coordenada de Reaccin

Las enzimas son macromolculas orgnicas o biopolmeros cuya estructura y forma tridimensional son los directos responsables de su actividad biolgica. Las enzimas, por estar constituidas de una o varias protenas, poseen como mnimo una estructura terciaria, sin embargo en la mayora de los casos poseen tambin una estructura cuaternaria. A diferencia de la estructura secundaria que depende de la secuencia de aminocidos genticamente determinada (estructura primaria), las estructuras terciarias y cuaternarias dependen mayormente de las condiciones del medio en que se encuentra la enzima. Esto quiere decir que dependiendo del pH los residuos de aminocidos y por lo tanto la enzima tendrn una carga diferente, lo cual se traduce en interacciones coulmbicas intramoleculares diferentes y por lo tanto una estructura ms globular o ms alargada. Las enzimas deben mantenerse a un pH en el que mantengan la forma globular ya que es esta la configuracin que permite una alta selectividad del sustrato y un ptimo funcionamiento del sitio activo. Es ms, sin forma globular posiblemente no exista ningn sitio activo. En la estructura cuaternaria tambin influyen las condiciones del medio pues esta se debe a interacciones no covalentes intercatenarias e intracatenarias las cuales se pueden ver afectadas por el pH en el caso de los aminocidos cidos o bsicos, por la polaridad del solvente en el caso de las interacciones hidrofbicas, por la presencia de agentes oxidantes o reductores en el caso de la formacin de puentes disulfuro entre cistenas, y por la temperatura ya que esta cambia la energa cintica de las molculas que puede romper desde la delicada estructura cuaternaria hasta la fuerte estructura primaria. En cuanto a la cintica de las reacciones catalizadas por enzimas, tendremos en cuenta el modelo desarrollado por Michaelis-Menten el cual se basa en el siguiente razonamiento:

E+ S

k1 k2

ES

k3

E+ P

En primer lugar se da un proceso reversible que consiste en que el sustrato logra ubicarse en el sitio activo de la enzima en donde sta facilitar la reaccin. All se ha formado el complejo enzima-sustrato que avanzar (en una reaccin comnmente irreversible o cuyo equilibrio est muy desplazado hacia los productos en el comienzo de la reaccin) hacia los productos, siendo esta etapa la ms lenta y por lo tanto la que determine la velocidad de la reaccin. Teniendo en cuenta esto se puede plantear:

KS =

[ E ][ S ] [ ES ] v = k 3 [ ES ]

[1] [2]

Donde KS es la constante de disociacin de del complejo ES. A su vez tambin se puede expresar la concentracin de enzima libre como:

[ E ] = [ E 0 ] [ ES ]
donde [E0] es la concentracin inicial de enzima y Reemplazando [3] en [1] y despejando [ES] se obtiene:

[3]

[E] es la concentracin de enzima libre.

[ ES ] =

[ E 0 ][ S ] K S + [S ]

[4]

y reemplazando [4] en [2] se obtiene la ecuacin de Michaelis-Menten:

v=

[ E 0 ][ S ]k 3 K M + [S ]

[5]

en donde KS se hace igual a KM cuando k2 >> k3 es decir cuando la reaccin catalizada es mucho ms lenta que la reaccin de disociacin del complejo ES o tambin llamado complejo de Michaelis. Aunque existe una manera mas larga y elaborada de llegar a la ecuacin de Michaelis-Menten y diferentes modelos de la misma segn sea la naturaleza de la reaccin, de aqu se puede partir para hacer el estudio cintico de la fosfatasa cida. En una ltima modificacin, y teniendo en cuenta que:

Vmax = k 3 [ ES ] max = k 3 [ E 0 ]
se puede plantear la ecuacin de Michaelis-Menten de la siguiente manera:

[6]

v=

Vmax [ S ] K M + [S ]

[7]

Aunque es posible conocer el valor de la velocidad mxima y de la constante de Michaelis en una grfica de v vs. [S], existen otros modelos que nos permiten obtener los valores de una manara ms exacta. Utilizando la ecuacin [7] se puede calcular la velocidad mxima proyectando una recta asinttica con respecto al punto mas alto de la grfica y se puede conocer en valor de KM interpolando en el eje x el valor correspondiente a la mitad de Vmax, pues:

v=

Vmax V [S ] = max 2 K M + [S ]

K M + [ S ] = 2[ S ] K M = 2[ S ] [ S ] = [ S ]
Haciendo un primer rearreglo de la ecuacin [7] se puede obtener tambin:

K 1 1 1 = M + v Vmax [ S ] Vmax
y haciendo otro rearreglo a [7]:

[8]

v = K M

v +Vmax [S ]

[9]

Michaelis-Menten v Vmax 1/v

Lineweaver-Burk v b=Vmax

Eadie-Hofstee

Vmax /2 b=1/Vmax KM [S]

m=KM/Vmax

m=-KM

Vmax / KM 1/[S] v/[S]

-1/KM

Dentro del campo de la cintica de las reacciones catalizadas por enzimas, se puede afirmar que la actividad de la enzima es mxima siempre y cuando esta se encuentre en las condiciones del medio ptimas. Sin embargo es posible influenciar la velocidad de las reacciones tanto en forma negativa como en forma positiva. En el primer caso estamos hablando de los inhibidores los cuales pueden actuar de diferentes maneras. En la inhibicin competitiva, tanto el sustrato (sustancia a transformarse en el proceso cataltico) como el inhibidor pueden unirse a la enzima de manera reversible, lo cual implica que la probabilidad de que el sustrato forme el complejo enzima-sustrato disminuye a medida que la cantidad de inhibidor se hace mayor y viceversa. En este caso no se ve afectada la velocidad mxima ya que esta depende de k3 pero si se ve afectada KM ya que se forma menos cantidad de complejo ES o desde otro punto de vista se aumenta la disociacin de ES. Un segundo tipo de inhibicin es la no competitiva en la que el inhibidor se une al complejo ES para formar un complejo terciario ESI inactivo que tambin se puede disociar adems de unirse a E nicamente. En este caso se ve afectada Vmax pero no KM. Un tercer tipo de inhibicin es la acompetitiva en la que el inhibidor solo se une al complejo ES pero no e la enzima sola. En este caso se afecta tanto Vmax como KM. Un cuarto tipo de inhibicin es la irreversible en la cual el inhibidor se une irreversiblemente a la enzima o al complejo ES. Este es el caso de metales pesados como el Hg2+ y el Pb2+. Otro factor que puede jugar en contra de la velocidad de reaccin es el tiempo, ya que con es transcurso de la reaccin se va formando mas producto el cual puede inhibir la reaccin o simplemente desplazar el equilibrio hacia los reactivos. En cuanto a la influencia positiva, estamos hablando de sustancias que son indispensables para el funcionamiento de la enzima, de tal manera que su ausencia disminuye la actividad de la misma. Estas sustancias reciben el nombre de cofactores los cuales pueden ser iones metlicos como Zn 2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, Fe2+, K+ y Na+. En el caso en que se trata de cofactores orgnicos se les llama coenzimas que en la mayora de los casos son vitaminas. As, cuando la enzima esta en presencia del cofactor o la coenzima se dice que est como haloenzima pero si esta est sola se le llama apoenzima.

Nuestro estudio consiste entonces en ver como todos estos factores (pH, temperatura, [S], [E], tiempo, inhibidor) afectan la velocidad de la reaccin catalizada por la fosfatasa cida y concluir cuales son las condiciones ptimas para que la enzima tenga su mayor actividad. La funcin de la fosfatasa cida es la de hidrolizar los enlaces tipo monoester del cido fosfrico, y en nuestro caso el sustrato a hidrolizar es el -glicerofosfato de sodio: OH OH

O Na O P O Na OH
Determinacin de Fsforo
-

O Na O

H2O

Fosfatasa cida OH

OH

HO

P
-

O Na+

Para poder medir la velocidad de la reaccin es necesario que conozcamos la cantidad de reactivo que desaparece en un intervalo de tiempo o la formacin de producto en el mismo. En este caso emplearemos la deteccin del producto mediante el mtodo de Fiske-Subbarow. Este mtodo consiste en adicionar cido molbdico a la solucin para que reaccione con el fosfato y forme cido fosfomolbdico. Posteriormente se adiciona cido ascrbico para formar los xidos de molibdeno de color azul: Fosfato + cido Molibdico cido fosfomolbdico cido fosfomolbdico + cido ascrbico xidos de Molibdeno (azul) Tablas de datos y resultados Curva de calibracin Concentracin del patrn: 0.04mg/ml Masa molar: P = 30.9

Tabla 1. Valores de concentracin de patrn de fsforo y absorbancia obtenidos para la construccin de la curva de calibracin.
Tubo Volumen de Patrn (mL) Abs 660nm [P] (mM) B 0 0 0 1 0.1 0.119 2 0.2 0.231 3 0.3 0.372 4 0.4 0.567 5 0.5 1.09 1.3E-07

2.6E-08 5.2E-08 7.8E-08 1.0E-07

Muestra de clculos:

660 nm = log T660 nm bs

[10]

[ P] =

Vp a tr n 0.0 4m g mL 3 0 9 0 0 5 .0 m L
m gP m ol

[11]

donde Vpatrn corresponde al volumen de solucin patrn de concentracin 0.04mg/mL adicionado a cada muestra, 30900 a la masa molar del fsforo y 5.0 al volumen total de la muestra. Para el dato del tubo 1:

[ P] 1 =

= 2.6 1 0 8 m M 3 0 9 0 0 5 .0 m L
m gP m ol

0 .1 m L.0 4m gL 0 m

Grfica 1. Curva de Calibracin de fsforo.

1.200

1.000 A = 5.3E+06[P] 2 R = 0.9819

0.800 Abs 660nm

0.600

0.400

0.200

0.000 0.00E+00

2.00E-08

4.00E-08

6.00E-08

8.00E-08

1.00E-07

1.20E-07

Concentracin de fsforo (mM)

Determinacin del tiempo ptimo de incubacin

Tabla 2. Valores de absorbancia obtenidos para la muestra a diferentes tiempos de incubacin y concentraciones de fsforo obtenidas a partir de la curva de calibracin.
Tiempo (min) Abs660nm corregida [P] (mM) 5 -0.148 -2.80E-08 17 0.050 9.41E-09 20 -0.042 -7.90E-09 30 0.021 3.95E-09 40 0.074 1.40E-08

Velocidad inicial (pendiente en el origen): 1.2x10-9 mM/min Tiempo ptimo de reaccin: 40 min Muestra de clculos: El valor de Abs660nm fue calculado empleando la ecuacin [10]. La concentracin de fsforo fue calculada segn la ecuacin obtenida por regresin en la grfica 1:

A = 5.3 10 6 [P ]
Para un tiempo de incubacin de 5 minutos:

[12]

[ P] = 5.3 10

0.148

= -2.80 10 -8 mM

[13]

Grfica 2a. Determinacin del tiempo ptimo de incubacin (todos los datos).
1.00E-07 8.00E-08 6.00E-08 4.00E-08 2.00E-08 0.00E+00 0 -2.00E-08 -4.00E-08 Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30 35 40 45

[P] (mM)

sin corregir Abs corrigiendo Abs

Grfica 2b. Determinacin del tiempo ptimo de incubacin (sin el dato de 17 minutos).
1.00E-07 sin corregir Abs 8.00E-08 6.00E-08 4.00E-08 2.00E-08 0.00E+00 0 -2.00E-08 -4.00E-08 Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [P] = 1.2E-09t - 3.3E-08 2 R = 0.9959 corrigiendo Abs [P] = 1.2E-09t + 3.3E-08 2 R = 0.997

Efecto del pH Tiempo de reaccin: 10 min

Tabla 3. Valores de absorbancia, concentracin de fosfato y velocidad de reaccin obtenidos para muestras a diferentes pH.
Tubo PH Abs660nm corregida [P] (mM) V (mM P/min) BB 5.3 0.000 BS 5.3 0.022 BE 5.3 0.284 1 3.0 0.003 5.53E-10 5.53E-11 2 4.0 0.061 1.15E-08 1.15E-09 3 5.0 0.042 7.91E-09 7.91E-10 4 5.3 0.029 5.56E-09 5.56E-10 5 5.6 0.144 2.72E-08 2.72E-09 6 6.2 -0.034 -6.51E-09 -6.51E-10

pH ptimo: 5.6 Muestra de clculos: El clculo de la concentracin de fsforo se realiz utilizando la ecuacin [13], para el tubo 1:

[P] (mM)

[ P] = 5.3 10
0.003
la velocidad de la reaccin se calcul como:

= 5.53 10 -10 mM

v0 =
Para el dato del tubo 1:

[ P]
10 min

[14]

v0 =

5.53 10 10 mM = 5.53 10 11 10 min

mM min

Grfica 3. Efecto del pH en la velocidad de reaccin.

2.80E-09 2.30E-09 1.80E-09 v 0 (mM P/min) 1.30E-09 8.00E-10 3.00E-10 -2.00E-10 2.5 -7.00E-10 pH 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

Efecto de la temperatura Tiempo de reaccin: 10min

Tabla 4. Valores de absorbancia, concentracin de fosfato y velocidad de reaccin obtenidos para muestras a diferentes temperaturas.
Tubo T C Abs660nm corregida [P] (mM) V (mM P/min) BB 18 0.000 BS 18 0.008 BE 18 0.187 1 0 0.123 2.33E-08 2.33E-09 2 18 0.107 2.03E-08 2.03E-09 3 37 0.107 2.03E-08 2.03E-09 4 60 0.249 4.71E-08 4.71E-09 5 92 0.038 7.17E-09 7.17E-10

Temperatura ptima: 60C Muestra de clculos: La concentracin de fosfato y la velocidad de reaccin fueron calculadas con las ecuaciones [13] y [14]. Por ejemplo para el dato correspondiente a una temperatura de 0C:

[ P] = 5.3 10
0.123 v0 =

= 2.33 10 -8 mM

2.33 10 8 mM = 2.33 10 9 10 min

mM min

Grfica 4. Efecto de la temperatura en la velocidad de reaccin.

5.00E-09 4.50E-09 4.00E-09 3.50E-09 3.00E-09 2.50E-09 2.00E-09 1.50E-09 1.00E-09 5.00E-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Temperatura (C)

Efecto de la concentracin de la enzima Tiempo de reaccin: 10 min

Tabla 5. Valores de absorbancia, concentracin de fosfato y velocidad de reaccin obtenidos para muestras con diferente concentracin de la enzima.
Tubo V de enzima (mL) Abs660nm corregida [P] (mM) V(mM P/min) BB 0.0 0.000 BS 0.0 0.000 BE 0.1 0.137 1 0.1 0.018 3.39E-09 3.39E-10 2 0.1 0.116 2.20E-08 2.20E-09 3 0.2 0.173 3.27E-08 3.27E-09 4 0.3 0.018 3.39E-09 3.39E-10 5 0.4 0.240 4.54E-08 4.54E-09

Actividad del extracto enzimtico: 2.1x10-8 mM P/min mLextracto Muestra de clculos: La concentracin del fosfato y la velocidad de reaccin fueron calculadas con las ecuaciones [13] y [14], respectivamente. Para el tubo 1:

v 0 (mM P/min)

[ P] = 5.3 10
0.018 v0 =

= 3.39 10 -9 mM

3.39 10 9 mM = 3.39 10 10 10 min

mM min

Grfica 5a. Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de reaccin (todos ls datos).

5.00E-09 4.50E-09 4.00E-09 3.50E-09 v 0 (mM P/min) 3.00E-09 2.50E-09 2.00E-09 1.50E-09 1.00E-09 5.00E-10 0.00E+00 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 Volumen de extracto enzimtico (mL)

Grfica 5b. Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de reaccin (sin el dato de 0.300mL de extracto enzimtico).
5.00E-09 4.50E-09 4.00E-09 3.50E-09 v 0 (mM P/min) 3.00E-09 2.50E-09 2.00E-09 1.50E-09 1.00E-09 5.00E-10 0.00E+00 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 Volumen de extracto enzimtico (mL) v 0 = 2.1E-08Vextracto R = 0.9267
2

Efecto de la concentracin del sustrato

Tiempo de reaccin: 10 min

Tabla 6. Valores de absorbancia, concentracin de fosfato y velocidad de reaccin obtenidos para muestras con diferente concentracin del sustrato.
Tubo [S] (mM) Abs660nm corregida [P] (mM) V(mM P/min) 1/[S] 1/V BB 0 BS 40 BE 0 1 1 0.097 1.84E-08 1.84E-09 1 2 2 0.136 2.58E-08 2.58E-09 0.50 3 4 0.010 1.94E-09 1.94E-10 0.25 4 8 0.038 7.29E-09 7.29E-10 0.13 5 12 0.150 2.85E-08 2.85E-09 0.083 6 16 0.061 1.15E-08 1.15E-09 0.063 7 20 0.069 1.30E-08 1.30E-09 0.05 8 40 0.123 2.33E-08 2.33E-09 0.025 4.30E+08

0.000 0.000 0.187

5.44E+08 3.87E+08 5.16E+09 1.37E+09 3.51E+08 8.66E+08 7.68E+08

Muestra de clculos: La concentracin del fosfato y la velocidad de reaccin fueron calculadas con las ecuaciones [13] y [14], respectivamente. Para el tubo 1:

[ P] = 5.3 10
0.097 v0 =

= 1.84 10 -8 mM

1.84 10 8 mM =1.84 10 9 10 min

mM min

Grfica 6a. Efecto de la concentracin de sustrato y presencia de inhibidor en la velocidad de reaccin (todos los datos).
4.00E-09 3.00E-09 2.00E-09 1.00E-09 v 0 (mM P/min) 0.00E+00 0 -1.00E-09 -2.00E-09 -3.00E-09 -4.00E-09 -5.00E-09 [S] (mM) Sin inhibidor Con inhibidor 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Grfica 6b. Efecto de la concentracin de sustrato y presencia de inhibidor en la velocidad de reaccin (sin los datos de 1, 2 y 12mM de sustrato en ausencia de inhibidor).
3.00E-09 2.00E-09 1.00E-09 v 0 (mM P/min) 0.00E+00 0 -1.00E-09 -2.00E-09 -3.00E-09 -4.00E-09 -5.00E-09 [S] (mM) 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Grfica 7a. Grfica de Lineweaver-Burk (con todos los datos de la grfica 6b).
6.00E+09 5.00E+09 4.00E+09

1/v 0 (min/mM P)

3.00E+09 2.00E+09 1.00E+09 0.00E+00 -1E-08 0.05 -1.00E+09 -2.00E+09 -3.00E+09

1/v 0 = 2.1E+10(1/[S]) - 4.3E+08 R = 0.9392

2

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

1/[S] (1/mM)

Grfica 7b. Grfica de Lineweaver-Burk (sin el dato de 4mM de sustrato).

1.40E+09 1.26E+09 1.12E+09 1/v 0 (min/mM P) 9.80E+08 8.40E+08 7.00E+08 5.60E+08 4.20E+08 2.80E+08 1.40E+08 -0.04 0.00E+00 -0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 1/v 0 = 9.1E+09(1/[S]) + 2.6E+08 R = 0.982
2

1/[S] (1/mM)

Grfica 8. Grfica de Eadie-Hofstee para evaluar el efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de reaccin.
1.20E-10 1.00E-10 8.00E-11 6.00E-11 4.00E-11 2.00E-11 0.00E+00 0.00E+00 v 0 = -0.0182(v 0 /[S]) + 1E-10 R = 0.7537
2

v 0 (mM P/min)

5.00E-10

1.00E-09

1.50E-09

2.00E-09

2.50E-09

v 0/[S] (1/min)

Segn la grfica 7b se obtienen los siguientes valores para KM y Vmax:

Vm ax =

1 1 = = 3.8 10 9 m M m in 8 m in b 2.6 10 mM

K M = m V a x= 9.1 1 09 m mMm i n 3.8 1 0 9 m M = 3 5m M m M m in

A partir de la grfica 8 se obtiene:

)(

Vm a x = 1 1 0 1 0 m M m in
K M = 0.0182 mM
Efecto de la presencia de un inhibidor Inhibidor: HgCl2 Concentracin del inhibidor: 0.5mg/mL Tiempo de reaccin: 10min
Tabla 7. Valores de absorbancia, concentracin de fosfato y velocidad de reaccin obtenidos para muestras con diferente concentracin del sustrato en presencia de inhibidor.
Tubo [S] (mM) Abs660nm corregida [P] (mM) V(mM P/min) 1/[S] 1/V BB 0 0.000 BS 40 BE 0 1 1 -0.041 -7.75E-09 -7.75E-10 1 -1.29E+09 2 2 -0.201 -3.82E-08 -3.82E-09 0.5 -2.62E+08 3 4 -0.030 -5.71E-09 -5.71E-10 0.25 -1.75E+09 4 8 -0.015 -2.92E-09 -2.92E-10 0.13 -3.42E+09 5 12 -0.030 -5.71E-09 -5.71E-10 0.083 -1.75E+09 6 16 -0.186 -3.53E-08 -3.53E-09 0.063 -2.83E+08 7 20 -0.044 8 40 -0.065

0.000 0.252

-8.41E-09 -1.23E-08 -8.41E-10 -1.23E-09 0.050 0.025

-1.19E+09 -8.13E+08

Muestra de clculos: La concentracin del fosfato y la velocidad de reaccin fueron calculadas con las ecuaciones [13] y [14], respectivamente. Para el tubo 1:

[ P] = 5.3 10
v0 =

0.041

= 7.75 10 -9 mM

7.75 10 9 mM = 7.75 10 10 10 min

mM min

Respuesta al cuestionario Mediante qu cdigo se identifica la fosfatasa cida y que indica cada nmero? El cdigo EC que identifica a la fosfatas cida es EC.3.1.3.2 en donde los nmeros de izquierda a derecha indican lo siguiente:

3 Indica que la enzima corresponde al grupo de la hidrolasas (al que siempre le corresponde
el nmero 3).

1 Indica que la enzima lleva a cabo la hidrlisis sobre un enlace tipo ester. 3 Indica que la hidrlisis se lleva a cabo en esteres de monofosfato. 2 Este es el nmero que le corresponde a la fosfatasa cida.

Cmo podra purificar la fosfatasa cida del germen de trigo? La fosfatasa se extrae con agua mediante varios lavados (4), durante un tiempo de 30 minutos cada uno, para posterior centrifugacin. Se puede adicionar una cierta cantidad de Mn 2+ en solucin el cual va actuar como cofactor de la enzima y permitir que actividad de la misma sea alta durante todo el proceso, lo cual cobra importancia a la hora de hacer la reaccin y medir la cantidad de fosfato liberado por el mtodo de Fiske Subbarow. Nuevamente la mezcla es centrifugada. Con el sobrenadante se hace una primera precipitacin por fuerza inica adicionando una solucin de sulfato de amonio al 37% y al sobrenadante se le hace una segunda precipitacin adicionando una solucin de sulfato de amonio al 57%. Luego de esto la solucin se calienta a 60C por 2 minutos y luego se enfra a 8C y se centrfuga. Al sobrenadante se le hace un tratamiento con bentonita y de nuevo se centrifuga. De nuevo se hace una precipitacin adicionando una solucin de sulfato de amonio al 47%, centrifugando a adicionando al sobrenadante una solucin de sulfato de amonio al 61%. Se centrifuga y se conserva el sobrenadante. A ste se le adiciona solucin de sulfato de amonio saturada, EDTA 0.2M y metanol, se centrfuga y el sobrenadante se somete a una dilisis durante 11 horas con EDTA 0.01M. Finalmente se realiza una cromatografa de intercambio inico con una columna de DEAE-celulosa y se seca por liofilizacin. Cmo se define la unidad de actividad? Esta es una de las medidas que se emplean para ver la efectividad o eficiencia de la enzima en las condiciones de trabajo. La unidad de actividad se define como la cantidad de sustrato transformado (en mg) por minuto (mg/min). En condiciones se logra la mejor extraccin de la fosfatasa cida de la levadura? Hay que tener en cuenta tres pautas para lograr una extraccin exitosa de la fosfatasa cida de la levadura. En primer lugar se necesita hacer un lisado con agitacin, pero este no es eficiente si el pH no es alcalino. Esto se logra con la adicin de bicarbonato de sodio que mantiene el pH cerca de 8. A pesar de esto se reporta que la adicin de tolueno mejora notablemente la extraccin. Esto es, por cada 4 libras de levadura se adicionan 1000mL de agua, 350mL de tolueno y 130g de bicarbonato de sodio y se deja agitando durante 4 horas en un bao a 37C. Para la fosfatasa cida de la levadura en qu condiciones se logra la mxima estabilidad en soluciones de etanol? La mxima estabilidad se logra en presencia de Mg2+, a temperaturas de 0C o menores y a valores de pH entre 7 - 8.5. Cul es la constante de sedimentacin de la enzima de la levadura purificada? La constante de sedimentacin de la enzima es 1.4 Svedberg. Cules son las caractersticas de estabilidad trmica de la fosfatasa cida de la levadura y las caractersticas de inactivacin por agitacin? La enzima presenta diferente estabilidad a una temperatura relativamente alta (50C), dependiendo del pH al que se encuentre y como es obvio de la presencia o ausencia de cofactor que en este caso es el Mg 2+. En ausencia de magnesio presenta su mxima actividad o estabilidad en un pH cercano a 8.0 y en presencia del metal a un pH entre 8.0 y 8.5. Sin embargo el aumento en la actividad de la enzima al adicionar el magnesio, no es el mismo a lo largo de toda la escala de pH. Al avaluar la disminucin de la actividad en funcin del tiempo de calentamiento a 50C, se observo que excepto para los valores de pH mencionados, en los dems casos siempre se ve un descenso rpido de la actividad en los primeros 30 minutos y despus se va estabilizando el valor de la actividad remanente. Tambin se observ que luego de mantener la enzima durante 15 minutos en calentamiento y enfriar a 20C se recupera entre el 20 - 30% de la actividad enzimtica inicial, pero la sustancia no es estable y tiende a descomponerse. La enzima tambin fue desnaturalizada por agitacin y se observ un comportamiento similar al anterior al analizar la actividad de la enzima en funcin del tiempo de agitacin. Empieza con una fuerte disminucin pero luego disminuye con menor rapidez En este caso tambin se ve como la adicin de

magnesio contrarresta el efecto desnaturalizante y ms an cuando esta a una temperatura de 0C. Tambin se observo que en la medida en que haya ms protena la inactivacin por agitacin ser menor. Discusin de Resultados y Conclusiones La curva de calibracin con el patrn de fosfato result bastante lineal dentro del rango de bajo error permitido por la curva de Crawford del error relativo, la cual establece que los valores de absorbancia deben encontrarse entre 0.2 y 1 para tener bajo margen de error. En nuestro caso solo tres valores se salen de este rango: el blanco (lo cual es obvio), el primer punto despus del blanco y el ltimo punto. Sin embargo el primer punto despus del blanco se ve bastante colineal, pues est muy cerca de 0.2. El ltimo punto si tiene un valor de absorbancia de ms de 1 lo cual se ve reflejado en la grfica 1. Por esta razn fue el nico valor que no se tuvo en cuenta para hacer la regresin lineal. En la optimizacin del tiempo se presentaron dos errores de tipo experimental. El primero tiene que ver con el segundo punto de la grfica 2. En este caso el blanco de la enzima present un valor de 0 absorbancia, por lo que a la hora de corregir la absorbancia de la mezcla de reaccin, esta resulta ms alta y se sale de la tendencia lineal. Por esta razn este valor fue eliminado. El segundo error es que los blancos quedaron ms concentrados de lo que debera ser, logrando en varios casos presentar una absorbancia (total de los blancos) mayor que la de la mezcla de reaccin, dando como resultado absorbancias negativas y por lo tanto concentraciones de fsforo negativas. Estos errores solo son atribuibles a fallas en la consecucin del experimento, que a nuestro modo de ver estn muy ligadas con los siguientes aspectos: Los tubos en que se realizan las medidas no son del mismo dimetro ni de la misma calidad, lo cual va a hacer que en todos los casos la cantidad de luz dispersada, reflejada, y absorbida sea diferente. Es por esto que en colorimetra se recomienda trabajar siempre con la misma celda y ubicarla siempre de la misma manera en el instrumento. El material utilizado para hacer las medidas de volumen, si bien ha sido diseado para mediar esas cantidades, no son lo ms preciso que se puede encontrar en un laboratorio, adems de que su uso consecutivo (cerca de 500 pipeteadas en toda la prctica) no permite mayor reproducibilidad en las medidas. Sin embargo, teniendo en cuenta que no se est trabajando en las condiciones ms cmodas y que siempre est el factor tiempo presionando, los resultados no deben presentar tanta discrepancia con lo esperado, por lo tanto, tanto estos, como otros errores experimentales que se mencionaran ms adelante, estn relacionados tambin con el desempeo de nosotros. Luego de hacer estas aclacaraciones y volviendo al tema de la optimizacin del tiempo, se ve como se guarda una relacin directamente proporcional entre la cantidad de fosfato producido y el tiempo de reaccin, lo cual no indica que en todos los casos la velocidad de reaccin inicial es la misma. Tambin se puede decir que la velocidad total de reaccin durante el tiempo evaluado es siempre la misma, pues no se observa un cambio en la pendiente. Esto nos indica que la enzima no ha llegado a saturarse de producto y que la reaccin inversa o la inhibicin por parte de ste no ha tomado partido an y por lo tanto el tiempo ptimo de reaccin es 40min o talvez ms (seguramente ms). Sin embargo, en la literatura (3) se reporta un tiempo ptimo de 20minutos En las medidas de optimizacin del pH, aunque se llega a un valor acorde con el reportado en la literatura (3) que es 5.8, no se observa el mismo comportamiento en lo referente al cambio de la velocidad con respecto al pH, pues es de esperarse que se obtenga una curva continua en la que se aumente la velocidad hasta lograr un mximo y posteriormente descienda. En nuestro caso se ve una grfica truncada que no obedece a otra cosa que al error experimental del que se habl anteriormente. Sin embargo, como ya se mencion, el resultado del experimento (pH ptimo de 5.6) est muy cerca que en el reportado en la literatura. En el estudio de la temperatura ptima, si se obtuvo un resultado muy diferente al reportado en la literatura, pues all se reporta como temperatura ptima 37C (3) y nuestros resultados dicen que la temperatura ptima es 60C, lo cual no puede ser, pues a 50C se desnaturaliza la fosfatasa cida de la levadura (4). Paradjicamente, aparece tambin que la velocidad de la reaccin es mayor a 0C que a 18 y 37C. La nica explicacin para ese comportamiento, aparte del error experimental, es que debido a la

alta temperatura, el sustrato se haya hidrolizado sin la intervencin de la enzima. Esta hiptesis, sin embargo, pierde toda validez al comparar con el bajsimo valor de velocidad que se obtuvo para una temperatura mayor (92C). En cuanto al estudio de la cantidad de enzima, se ve un comportamiento similar al esperado, aunque con ciertos puntos alejados de la curva. Sin embargo se pudo obtener un valor para la actividad del extracto enzimtico que no es comparable con el de la literatura ya que aqu se tiene unidad de actividad por mL de extracto y no por mg de protena como est definida la actividad especfica. Tampoco es posible hacer la conversin ya que no se conoce la concentracin de la enzima. En la grfica 5b se observa como la velocidad de la reaccin empieza a estabilizarse a partir de una cierta cantidad de enzima. Esto se debe seguramente a que se ha agotado el sustrato y se obtiene la misma cantidad de fosfato as la cantidad de enzima sea mayor. Este resultado es coherente con la grfica 2b pues de all se dedujo que la cantidad de sustrato no se lograba hidrolizar totalmente en el tiempo de 40 minutos, cuando la concentracin de enzima utilizada (0.2mL de extracto) aparece dentro la parte lineal de la grfica 5b. En cuanto a la determinacin de KM y Vmax, se puede comentar lo siguiente: El conjunto original de datos no permite obtener grficas similares a las que se plantearon en el marco terico del informe, tanto en presencia como en ausencia de inhibidor. Si se eliminan tres puntos de la grfica correspondiente al experimento sin inhibidor (grfica 6a), se obtiene una grfica muy parecida a la que predice la ecuacin de Michaelis-Menten (grfica 6b), sin embargo al trazar la grfica de Lineweaver-Burk con la ecuacin [8] (grfica 7a) se obtiene un valor de Vmax negativo y una KM negativa. Eliminando un cuarto dato, se logra ajustar la recta (grfica 7b) de tal manera que se obtienen valores positivos de KM y Vmax. Al comparar con la literatura (3) resulta desproporcionado hacer una comparacin de los valores de KM, pues mientras que all se reporta un valor de 0.27mM, nosotros obtuvimos un valor de 35mM, por este mtodo. Utilizando el mtodo de EadieHofstee, (grfica 8) se obtiene un valor mucho menor: 0.0182mM. Sin embargo, segn se recomienda en la literatura (2), resulta ms confiable la grfica de Eadie-Hofstee ya que en esta se tienden a distribuir mas homogneamente los datos a lo largo de la grfica. A pesar de estas aclaraciones, no se puede dar fe de ninguno de estos valores ya que fueron obtenidos a partir de grficas incompletas, pues sera mucho ms certero un valor obtenido con todos los datos experimentales. De igual manera, se puede decir que la confiabilidad del valor de velocidad mxima no es mucha basados en los mismo argumentos. Estos valores tan alejados nos indican, en el primer caso, que la formacin del complejo enzima sustrato no est muy favorecida, lo cual es coherente con el tiempo ptimo de reaccin hallado, que es el doble del que reporta la literatura, es decir que la enzima no tiene una muy buena actividad. El valor de 0.0182 para KM no es coherente con estos resultados (a pesar de lo anteriormente explicado), pues significa que la formacin del complejo enzima sustrato esta muy favorecida y por lo tanto la reaccin se debera completar mucho mas rpido. En cuanto al comportamiento de la enzima en presencia de inhibidor, se ve, ignorando las fluctuaciones del error experimental, como la velocidad se disminuye notablemente al mismo valor en todos los casos. Aqu tambin se obtienen concentraciones negativas debido a que el blanco absorbi ms que todas las muestras. Aqu lo que se concluye es que no se da ningn tipo de inhibicin reversible, sino que se da un proceso de inhibicin irreversible como se esperaba debido a que se trata de mercurio. Por esta razn no se obtiene un comportamiento que est de acuerdo al modelo de Michaelis-Menten, ya que no hay la formacin de complejos enzima sustrato que progresen hacia los productos, y por lo tanto no se puede determinar ni KM ni Vmax (2). Tabla Resumen de Resultados
Tiempo ptimo pH ptimo T ptima Actividad del extracto KM Vmax Tipo de inhibicin Resultado 40min 5.6 60C 2.1x10-5 M/min*mL 35mM (Burk); 0.0182mM (Eadie) 3.8x10-9mM/min (Burk); 1x10-10mM/min (Eadie) irreversible Literatura 20min3 5.83 37C3 3000 mol/mg
3

0.27mM3 irreversible1

Bibliografa 1. 2. 3. 4. Bohinski R. C. Bioqumica, 5Ed, Pearsons Education, 1991, pp 173-195 Fersht A. Estructura y Mecanismo de los Enzimas, Ed Revert, 1980, pp 85-96 Joyce B.K. Grisolia S. Purification and Properties of a nonspecific acid phosphatase from wheat germ, The journal of Biological Chemistry 235: 2278-2281, 1960 Tsuboi K.K., Wierner G., Hudson P.B. Acid phosphatase. VII: Yeast phosphomonoestearase: isolation procedure and stability characteristics. The Journal of Biological Chemistry 224: 621635 1957.