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ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

Integrantes: Diego Cabello Rodrigo Santana Brbara Tillera Daniel Velsquez Seccin: 1.1 Docentes: BQ. PhD. Genevieve Merabachvili BQ. Rodrigo Tapia

AMINOCIDOS

Ami nocido

Enl a ce peptdico

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AMINOCIDOS
Punto isoelctrico: El punto isoelctrico es el pH al que una sustancia anftera tiene carga neta cero.
Si consideramos un AA sencillo, ste puede adoptar tres formas inicas diferentes:

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PROTENAS

PROTENAS

Enl a ces que estabilizan la estructura terciaria

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AGENTES DESNATURANTES

cidos y bases fuertes. Disolventes orgnicos. Detergentes. Agentes reductores. Concentracin salina. Iones metlicos pesados. Cambios de T. Agresin mecnica.

TCNICAS DE SEPARACIN DE MOLCULAS

Se basan en:

Solubilidad : pH, fuerza inica, disolvente, T. Tamao: dilisis, filtracin, centrifugacin,

cromatografa de filtracin en geles. Carga: cromatografa de intercambio inico, electroforesis. Afinidad: cromatografa de afinidad.

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TCNICAS DE SEPARACIN

Di lisis

Fi l tracin

Centri fugacin

TCNICAS DE SEPARACIN

CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GELES

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

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TCNICAS DE SEPARACIN

CROMATOGRAFA EN PAPEL

QU ES LA ELECTROFORESIS?
El trmino electroforesis proviene de los vocablos griegos lektronque hace referencia a la electricidad y phoros que significa llevar o trasladar. La tcnica de electroforesis permite separar molculas de cargas diferentes a las que se les aplica un campo elctrico, donde migrarn a los electrodos de polaridad opuesta en funcin a su tamao, carga y forma

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FUNDAMENTO
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo).

TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen diversos tipos de electroforesis cuya diferencia radica en los distintos tipos de medios de soporte: Electroforesis capilar. Electroforesis de zona: o Electroforesis en papel, Electroforesis en gel.

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TIPOS DE ELECTROFORESIS
Electroforesis capilar: Esta tcnica separativa se basa en la migracin de las especies de la muestra en disolucin, portadoras de una carga elctrica global, bajo el efecto de un campo elctrico y en contacto con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado.

TIPOS DE ELECTROFORESIS
Electroforesis de zona: Es una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica y biologa molecular por su elevada resolucin. El campo elctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo.

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Electroforesis de zona: Electroforesis en papel: La muestra se aplica sobre una tira de papel filtro humedecido con una disolucin tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampn.

Electroforesis en gel: Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido. Este tipo de electroforesis se halla entre los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados en la separacin de macromolculas.

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Electroforesis en gel: Tipos

Geles de agarosa. Geles de poliacrilamida: 1. Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo) o PAGE-nativa o PAGE-desnaturalizante (SDS-PAGE) o Isoelectroenfoque: se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. 2. Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

PASO PRACTICO

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Objetivo de la actividad prctica:

Aislar la -lactoalbumina de la leche y caracterizarla por electroforesis en gel de poliacrilamida. Caracterizar la a-lactoalbumina por electroforesis en gel de poliacrilamida. Conocer otros tipos de electroforesis Reconocer la utilidad de los componentes del SDS-PAGE.

COMPONENTES DE LA LECHE
La leche es una secrecin nutritiva de color blanquecino opaco producida por las glndulas mamarias de las hembras. La leche esta compuesta principalmente por:
Agua Iones (sales minerales y calcio) Hidratos de carbono (lactosa) Materia grasa Protenas

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La l eche de va ca ti ene una densidad media de 1,032 g/l . Es una mezcla compleja y heterognea compuesta por un sistema coloidal de tres fases: Sol ucin: l os minerales as como los hidratos de carbono se encuentran disueltos en el agua. Sus pensin: l as s ustancias proteicas s e encuentran con el a gua en suspensin. Emul sin: la grasa en agua se presenta como emulsin.

COMPONENTE PROTEICO

Casena: (del latn caseus, "queso") es una fosfoprotena (un tipo de heteroprotena) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseingeno.

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-casena: 199 aminocidos, 2 regiones hidrofobicas, con zonas muy polares las cuales le dan el pH 6,6 a la leche.

-casena: 209 aminocidos, extremo c-terminal es hidrofbico y el extremo n-terminal muy hidroflico.
-casena : 169 aminocidos, zona de carga neta positiva que permite interaccin con polisacridos.

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- LACTOALBUMINA
Sntesis de lactosa: Interviene en la reaccin enzimtica implicada en la sntesis de la lactosa. Va a existir por lo tanto una relacin directa entre el contenido en lactosa y el contenido en -lactoalbmina. Fijacin de calcio gran afinidad por el Ca2+ en las zonas con gran cantidad de c. asprtico, de modo que liga un tomo de Ca por molcula, que dan lugar a interacciones inicas aportando gran estabilidad a la estructura y hacindola ms resistente a la a la desnaturacion irreversible por temperatura.

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a- lactoalbumina Punto Is oelctrico Pes o mol ecular (kD) 4,5 14,5

-casena 4,4 23,54

-casena 4,83 23,98

-casena 5,45 19,37

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PROCEDIMIENTOS
1) a)

100ml de leche en vaso precipitado .

1)b

Se debe masar 20 gramos de sulfato de amonio anhdrido .

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2)

Caliente el vaso precipitado a 40 C Y agregar entre 10 a 12 minutos el sulfato de amino. Esperar 10 minutos agitando la solucin.

La casena es afectada por la concentracin de sulfato de amonio, la cual altera la solubilidad del medio, precipitando la protena.

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Procedimientos
3)

Se filtra la solucin y nos quedamos con el filtrado.

4)

Se ajusta el pH del filtrado a 3.0 con HCl concentrado.

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5)

Centrifugar la suspensin por 15 minutos a 5.000 rpm.

6)

Eliminar el sobrenadante y re suspender el sedimento con 10 ml de agua destilada en un vaso precipitado de 50 ml y ajustar el pH entre 8,5 y 9,0 con NaOH, para re suspender la protena.

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7)

Centrifugar por 10 minutos a 5.000 rpm y guardar sobrenadante para cuantificar la concentracin de protenas por mtodo de Biuret.

PREPARACIN DE GEL DE POLIACRILAMIDA

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ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

PAGE es uno de los mtodos ms utilizados para la purificacin, anlisis y caracterizacin de protenas.
PAGE se puede realizar bajo condiciones:

PAGE-nativa PAGE-desnaturalizante (SDS-PAGE)

POLIACRILAMIDA

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GEL DE POLIACRILAMIDA
La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel. Permite separar protenas.
Gel transparente con estabilidad mecnica Qumicamente inerte, de propiedades uniformes. insolubles en agua, relativamente no inicos Permiten buena visualizacin de las bandas durante tiempo prolongado.

POLIACRILAMIDA
Porcentaje de acrilamida
15%

Rango de separacin (tamao)

12-45 kDa

12,5 %
10% 7,5%

15-50 kDa
16-75 kDa 30-100 kDa
Ra ngos de linealidad de sepa raci n segn el ta mao de una protena dependiendo de los porcenta jes de a crilamida y bisacrilamida en un SDS PAGE.

5%

60-212 kDa

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SDS-PAGE
En SDS-PAGE, la separacin es funcin del tamao (masa molecular). Se utilizan agentes desnaturalizantes de protenas.

Detergentes: dodecil sulfato sdico (SDS).

Agentes reductores: 2- mercaptoetanol (DTT).

(C12H 25Na SO4)

HO(CH 2)2SH

SDS-PAGE

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SDS-PAGE
Tetrametiletilendiamina (TEMED):
Iniciador de la reaccin

Persulfato de amonio (PSA): Catalizador

SDS-PAGE
Presenta dos medios o buffer: -Gel concentrado superior (menor %acrilamida/bisacrilamida, pH mas cido) -Gel resolutivo inferior (medio alcalino, separa las protenas)

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Separacin y caracterizacin de -lactoalbumina de otras protenas de la leche por SDS-PAGE

Reactivos:
Acrilamida Bisacrilamida Tris HCl concentrado SDS PSA Glicina Glicerol

Azul de bromofenol 2-mercaptoetanol Isopropanol Metanol CH3COOH glacial TEMED Azul de Coomassie R-250 Agua desionizada

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Materiales:
Vasos precipitados Tubos eppendorf Tubos falcon

Cmara Electroforesis
(mini-PROTEAN tetra cell, bio-Rad)

Fuente de poder

Acrilamida- bisacrilamida
30:0.8 % p/v (100 ml)

Persulfato de amonio 10% p/v (10ml)

Dodecil sulfato sdico 10% p/v (100ml)

Preparar:

Solucin de decoloracin (500 ml):

Metanol 10% v/v CH3COOH 10% v/v

Solucin de tincin (500ml):

Azul de Coomassie 0.1% p/v Metanol 45% v/v CH3COOH 10% v/v

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Buffer Gel Concentrador Superior (50 ml):

Tris 0.5 M SDS 0.4% p/V HCl (ajustar a pH 6.8)

Buffer Gel Resolutivo Inferior (100 ml):

Tris 1.5 M SDS 0.4% p/V HCl (ajustar a pH 8.8)

Preparar:

Buffer de corrida 5X (1L):

Tris 125 mM Glicina 1M SDS 0.5% p/V

Buffer de carga (10ml)

Tris 0.06 M pH 6.8 Glicerol 10% p/v SDS 2% p/v Azul de bromof enol 0.05%

PROCEDIMIENTO
4

Gel resolutivo Inferior (10 ml)

Gel concentrador superior (5 ml)

Acrilamida- Bisacrilamida 12.5%

Acrilamida- Bisacrilamida 5%

TRIS 0.375 M pH 8.8

2
60l PSA 10% 20l TEMED

TRIS 0.120 M pH 6.8

50 l PSA 10% 20l TEMED

Agua desionizada

Agua desionizada

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PROCEDIMIENTO
Montar las placas de Vidrio en la cmara de electroforesis en forma vertical
Vaciar el gel resolutivo inferior entre las placas y dejar polimerizar a T ambiente (20 min. aprox)
Una vez polimerizado, vaciar el gel concentrador superior sobre el otro gel inferior. Insertar la peineta y dejar polimerizar a T ambiente (15 min. Aprox) Cuando el gel concentrador superior haya polimerizado, retirar la peineta, verificando que los pocillos hayan quedado bien formados.

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PROCEDIMIENTO
Luego se introduce dentro de la cmara electroforesis y agregar hasta el borde con buffer de corrida 1X

Preparar las muestras y el estndar de peso molecular.

Cargar el volumen de muestra necesario en los pocillos de gel concentrador.

Iniciar la migracin electrofortica, aplicando un voltaje de 100 volts por 2 horas. Aprox

PROCEDIMIENTO

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PROCEDIMIENTO
Cuando el frente de migracin haya llegado cerca del extremo Inferior del gel, se apaga la fuente de poder.

Se retira el gel da la cmara, se abren las placas y se saca cuidadosamente del gel
El gel se deja inmerso en un deposito con la solucin de tincin, durante 30 min. a T ambiente

Luego se retira el gel y se deposita en la solucin de decoloracin durante 24 horas a T ambiente.

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PROCEDIMIENTO
COLORACIN DECOLORACIN

PESO MOLECULAR
Podemos estimar el peso molecular de una protena corrida en electroforesis con ayuda de una curva estndar de razn de migracin.

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PESO MOLECULAR
Se corre junto con las muestras experimentales una mezcla de protenas de peso conocido

PESO MOLECULAR
Midiendo luego de la corrida, la distancia viajada por el tinte y las muestras, podemos comparar la razn de migracin de los estndares con la de los experimentales y determinar el tamao aproximado de estos.

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RESULTADOS

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