XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental

VII-031 - IMPLEMENTACIN DE UN MTODO INMUNOLGICO (ELISA) PARA DETECCIN DE CONTAMINACIN POR AMIBAS EN AGUA SUPERFICIAL
Jos Javier Snchez Chvez(1) Bilogo, Univ. Nacional Autnoma de Mxico, Maestra en Ciencias (Biologa). UNAM. Experiencia: 16 aos en limnologa (Eutroficacin de embalses) y microbiologa del agua (Protozoarios y helmintos). Posicin actual: Investigador, laboratorio de Calidad del Agua. IMTA. Profesor de posgrado en Limnologa (DEPFI-UNAM). Asociaciones: FEMISCA, North American Lake Management Society (NALMS). Luis Alberto Bravo Incln Bilogo, Univ. Nacional Autnoma de Mxico, Maestra en Ciencias, (Biologa), UNAM. Experiencia: 12 aos en limnologa (Calidad del agua en embalses y manejo integral de cuencas) y microbiologa del agua (Deteccin de bacterias patgenas por PCR). Posicin actual: Investigador, laboratorio de Calidad del Agua, IMTA. Asociaciones: FEMISCA. Juan Leodegario Garca Rojas Bilogo, Univ. Nacional Autnoma de Mxico, Maestra en Ciencias, (Biologa) UNAM. Experiencia 16 aos en tecnologa enzimtica, biosensores y microbiologa del agua (Deteccin de Vibrio cholerae por ELISA. Posicin actual: Investigador, laboratorio de Calidad del Agua, IMTA, Jefe del rea de Microbiologa. Asociaciones: FEMISCA, Sociedad Mexicana de Biotecnologa y Bioingeniera. Alicia Lerdo de Tejada Brito Bilogo, Univ. Nacional Autnoma de Mxico, Maestra en Ciencias, (Biologa), UNAM. Experiencia: 12 aos en hidrobiologa (Toxicologa acutica). Posicin actual: Investigador, laboratorio de Toxicologa, IMTA. Asociaciones: FEMISCA. Direccin(1): Paseo Cuauhnhuac, 8532 - Col. Progreso - Jiutepec - Mor - CP. 62550 - Mxico - Tel. y Fax: (73) 19-4281 - e-mail: jjsanche@tlaloc.imta.mx RESUMEN Entamoeba histolytica (Eh), es un protozoario que provoca la amibiasis y que adems de transmitirse principalmente por alimentos, tambin se puede transmitir por agua. Este organismo normalmente se encuentra en baja concentracin en el agua, sin embargo, esto no reduce su alto potencial de patogenicidad. En este trabajo, se adapt una metodologa inmunolgica normalmente referida como ELISA (Enzime Linked Immuno Sorbent Assay) para la deteccin de Eh en agua, la metodologa fue estandarizada en muestras de agua sinttica y posteriormente, aplicada en muestras ambientales. De acuerdo a los resultados, esta metodologa puede aplicarse con una sensibilidad y especificidad altas para determinar la contaminacin por amibas en aguas naturales y aguas residuales, que pueden estar relacionadas con fuentes de abastecimiento y distribucin de agua para uso y/o consumo humano. PALABRAS-CLAVE: Entamoeba histolytica, Tcnica Inmunolgica, ELISA, Deteccin de Amibas en Agua, Protozoarios, Aguas Superficiales.

INTRODUCCIN Existen aproximadamente 11,300 especies de amibas (Lugo y Snchez, 1995), se presentan en hbitats que incluyen aire, suelo y agua. Se clasifican como especies patgenas (que parasitan al hombre o animales), y no patgenas (que son de vida libre). Desde el punto de vista taxonmico se agrupan en Gimnamebas (amibas desnudas), que carecen de una estructura rgida externa y viven en ambientes acuticos como el mar, ros y lagos; en amibas testadas que presentan una concha o testa que las cubre; finalmente, as tambin se reconocen otras especies de amibas que presentan un esqueleto interno. Los quistes de amibas son esfricos con dimensiones que oscilan entre 10 y 20 m en estado maduro, presentan cuatro ncleos, dichos ncleos presentan endosoma central, discreto y brillan como puntos luminosos al microscopio.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental La manera de adquirir la amibiasis es a travs de ingestin de quistes o trofozoitos, ya sea por alimentos slidos o lquidos; en trminos generales la mayor proporcin de gente afectada se contagia por alimentos slidos, ya que el protozoario se reproduce en ste medio. En Mxico y Amrica Latina, se ha detectado que existe una cantidad elevada de descargas de agua residual que tienen posibilidad de contaminar las redes de distribucin de agua potable, dichas descargas pueden estar contaminadas con Eh y por lo tanto, existe un mayor riesgo de adquirir la enfermedad a travs del agua para consumo humano. Mundialmente la amibiasis est catalogada como la tercera parasitosis causante de muerte, del 10 al 30% de la poblacin se considera infectada y entre el 1 y 2% sufre de la enfermedad, presentando una mortalidad mayor a 100 mil decesos cada ao (WHO, 1997). En Latinoamrica, se agrava la amibiasis por dos aspectos: a) se ubica principalmente dentro de climas tropicales y subtropicales, sitios en donde se desarrollan con mayor frecuencia enfermedades intestinales, b) debido a las malas condiciones socioculturales y sanitarias de la poblacin rural. Hoy da est considerada, despus del paludismo y la esquistosomiasis, la enfermedad parasitaria gastrointestinal ms importante (Conde y Mora, 1992). Por ello, es indispensable su deteccin, as como el estudio de las vas de infeccin y mecanismos que permitan evitar la propagacin de estos organismos patgenos. A pesar de que las bacterias han sido utilizadas por normatividad como el nico indicador de la calidad microbiolgica del agua, se ha reunido suficiente evidencia que indica que las bacterias, no son adecuadas para predecir la presencia de virus o protozoarios. Para evaluar con precisin la presencia de enteropatgenos (bacterias, protozoarios, virus o helmintos) en agua, se requiere que cada uno sea evaluado por separado (Helmer, et al., 1991; Margolin, 1997), de tal manera que las interferencias con otros organismos tambin puedan ser discriminadas mediante pruebas cruzadas de especificidad, como lo llevan a cabo las reacciones inmunolgicas del complejo antgeno-anticuerpo. De todos los casos de enfermedades gastrointestinales transmitidas por agua, solamente el 50% son atribuidos a microorganismos especficos, toxinas o qumicos; hace 40 aos se pensaba que Gardia lamblia era inocua y Cryptosporidium parvum y Escherichia coli enterotoxignica eran del todo desconocidos. En la actualidad, existen reportes de gastroenteritis causadas por especies de Microsporidia sp., Ciclospora sp., Isospora sp. y Blastocystis hominis en individuos inmunocomprometidos (LeChevallier, et al. 1990). Estos protozoarios estn emergiendo como potencialmente riesgosos para la salud humana por hidrotransmisin y sin embargo, an no existen mtodos para su deteccin en muestras clnicas o ambientales. El desarrollo de estos mtodos permitir una mejor vigilancia epidemiolgica y la capacidad de monitorear estos organismos. Segn Helmer, et al. (op. cit.), existen cuatro vas de transmisin de organismos patgenos, desde su origen fecal hasta su regreso al huesped humano (ver fig. 1):

Mariscos

Consumo

Consumo

Agua Potable

Contacto Cultivo de mariscos

HOMBRE

Consumo Cosecha Plantas

Tratamiento

Excrecin Patgenos Irrigacin Aguas costeras Descarga Excretas, agua residual

Extraccin Suelo

Descarga Infiltracin

Agua Superficial y Subterrnea

Figura 1. Principales vas de exposicin humana a patgenos en el ambiente acutico.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental Abastecimiento de agua potable, aguas superficiales, o subterrneas contaminadas; Actividades recreativas en aguas costeras, particularmente deportes de contacto corporal con el agua; Consumo de mariscos contaminados, especialmente cuando se comen crudos; Irrigacin de cosechas con agua residual domstica/municipal.

La deteccin, cuantificacin y/o identificacin de microorganismos enteropatgenos en agua es importante, debido a la gran cantidad de enfermedades adquiridas por hidrotransmisin. Segn Garca et al. (1998), entre los principales patgenos que pueden ser transmitidos por el agua en Mxico destacan los siguientes Tabla 1: Tabla 1. Patgenos que pueden ser transmitidos por el agua. Organismo Patgeno Efectos en la salud Protozoarios Cryptosporidium parvum - Diarrea Entamoeba histolytica - Disentera amibiana Giardia lamblia - Diarrea acuosa Naegleria fowleri - Meningoencefalitis. Bacterias Campylobacter jejuni - Gastroenteritis (disentera) Escherichia coli - Gastroenteritis (diarrea acuosa, a veces sanguinolenta) Legionella pneumophila - Infeccin respiratoria aguda Salmonella spp. - Tifoidea y salmonelosis (disentera y fiebre entrica) Shigella spp. - Disentera bacilar Vibrio cholerae - Clera (diarrea acuosa) Yersinia enterocolitica - Gastroenteritis (fiebre entrica). Virus Adenovirus - Infecciones respiratorias, conjuntivitis, gastroenteritis Astrovirus/Calcivirus - Gastroenteritis Coxsackievirus A - Meningitis e infecciones respiratorias Coxsackievirus B - Miocarditis, meningitis e infecciones respiratorias Echovirus - Meningitis, diarrea, fiebre e infecciones respiratorias Virus de la Hepatitis A - Hepatitis infecciosa Norwalk virus - Diarrea acuosa, vmito y fiebre Poliovirus - Meningitis y parlisis Rotavirus - Diarrea acuosa y vmito. Helmintos Ascaris lumbricoides - En general, producen enfermedades del aparato intestinal Hymenolepis spp. (disentera, helmintiasis, desnutricin, entre otras). Trichiuris trichiura Fuente: (Modificado de Garca et al. , 1998) En el Instituto Mexicano de Tecnologa del Agua (IMTA) durante el ciclo 1998-1999, se adapt una metodologa para la deteccin de amibas en muestras sintticas. En este estudio se revisaron las tcnicas existentes para detectar Eh en muestras clnicas, y se adecuaron dos tcnicas: a) La tcnica de Leeds I usada para la concentracin de parsitos en agua por medio de centrifugacin y b) El anlisis del antgeno especfico de EHSA por medio de ELISA. La tcnica de ELISA, Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (Tijseen, 1985, Roit et al., 1985 y Kabir, 1991), requiere de sensibilizar con anticuerpos las placas del anlisis. El principio funcional de ELISA es la reaccin con antgenos especficos que dan lugar a la produccin de anticuerpos en organismos superiores. La reaccin de fijacin en superficie es un mtodo denominado sndwich que adems de ser rpido, ha permitido reconocer reacciones antgeno-anticuerpo con muy buena sensibilidad y especificidad (Ongerth, 1989). Se obtuvo la curva de sensibilidad para deteccin del protozoario y se identific la presencia de Eh en muestras inoculadas de pacientes infectados con amibas. Las muestras estudiadas involucraron dos de las cuatro vas ambientales ya mencionas (ver Fig. 1): de agua costera en zonas recreativas y de agua superficial utilizada para abastecimiento pblico. Zonas de estudio - Los muestreos se realizaron en una baha mexicana de uso turstico ubicada en costas del Ocano Pacfico en los meses de abril, junio, julio, agosto y octubre, de 1999. Del mismo modo y en septiembre, se muestrearon tres presas nacionales ubicadas en la regin hidrolgica nmero 18 y finalmente, dos descargas municipales en el estado de Morelos, Mxico.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental OBJETIVOS 1. 2. 3. Aplicar la tcnica de concentracin por centrifugado y de anlisis por Ensayo Inmunoenzimtico (ELISA), para detectar Entamoeba histolytica, en muestras de agua sinttica. Determinar la especificidad de la tcnica de ELISA empleando otras especies de protozoarios. Evaluar la aptitud del mtodo por medio de la deteccin de este protozoario (Eh), en muestras ambientales procedentes de descargas municipales, presas de almacenamiento y agua de mar (baha).

METODOLOGA Tanto la colecta como la tcnica de concentracin de las muestras de agua analizadas para la deteccin de E. histolytica, fueron tomadas del mtodo de Leeds I (APHA, 1995), para la identificacin de E. histolytica. Todas las muestras sintticas se prepararon en 4 L de agua destilada y una muestra inoculada de heces fecales con Eh, dichas muestras, fueron proporcionadas por el Instituto Nacional de Pediatra (INP), las cuales fueron previamente identificadas en colaboracin con el personal del INP, usando las tcnicas de Faust y ELISA. Las muestras de agua ambiental se colectaron en garrafones de plstico de 5 L a prueba de fugas, se transportaron en hieleras desde el sitio del muestreo hasta el laboratorio a unos 4C y se almacenaron entre 2 y 8C, todas se examinaron en un perodo mximo de 8 das despus de realizado el muestreo. Las pruebas de especificidad se prepararon tambin con agua destilada y heces fecales con Entamoeba coli, Iodamoeba butschlii o Gardia lamblia, previa identificacin por el mtodo de Faust, a las que se aplic la tcnica de ELISA para detectar el antgeno especfico de Eh. Concentracin de la muestra - A continuacin, se describe brevemente la metodologa de deteccin de Eh. Homogeneizar la muestra y centrifugar en tubos de 250 mL a 2,500 r.p.m. durante 10 min. Eliminar el sobrenadante con precaucin de no aspirar el botn de sedimento. Remover el sedimento y vaciar su contenido en tubos de 50 mL, centrifugarlos a 2,500 r.p.m. durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y depositar el sedimento en tubos de 15 mL, los cuales se centrifugan nuevamente a 2,500 r.p.m. durante 10 min. Extraer el sobrenadante y vaciar el sedimento sobrante a un solo tubo de 15 mL, dejando de 3 a 5 mL de muestra (ver figura 2).

Figura 2. Equipo y material utilizados para concentrar muestras de agua, en la deteccin de E. histolytica. 4

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental Deteccin del antgeno especfico de Eh por ELISA - La tcnica de ELISA se realiz con un kit inmunolgico, el anlisis se sintetiza en la Fig. 3 y el equipo de lectura se presenta en la Fig. 4.

Inocular 300 L de muestra concentrada en la solucin de dilucin

Aadir controles y muestras, esperar 60 min y hacer 3 lavados en cada pozo

Figura 3. Procedimiento para la deteccin del antgeno especfico de E. histolitica en agua (EHSA).

Aadir enzima conjugada y esperar 30 min, hacer 5 lavados

Aadir Sustrato de color y esperar 10 min

Aadir Solucin de Lectura parada de reaccin y leer.

Figura 4. Lectura de ELISA por espectrofotmetro y comparacin visual para la deteccin de E. histolytica en muestras de agua.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental RESULTADOS Curva de sensibilidad del mtodo ELISA - Los resultados de sensibilidad se muestran en la Fig. 5. Se observa que el valor positivo superior de la muestra sinttica (INP), fue de 0.602 densidad ptica (DO), con 1 g de heces contaminadas con Eh disuelta en 4 L de agua destilada y el valor positivo inferior de DO, fue de 0.053 con 0.050 g de heces, que equivale a una concentracin de 12.5 mg/L. Al pasar de 0.050 a 0.025 g de heces diluida en 4 L de agua, la tcnica ya no fue capaz de detectar el antgeno especfico de Eh, lo que equivale a una concentracin de 6.25 mg/L.
1

0 .9 0 6 0 .8 1 1 Densidad ptica
0 .7 5

0 .8

0 .8 2 2

0 .8 3 8 0 .7 5 5

0 .6 0 2
0 .5

0 .2 3 5
0 .2 5

0 .0 9 9
0

0 .0 6 9

0 .0 5 3 0 .0 5

0 .0 1 2 0 .0 2 5

0 .5

0 .2 5

0 .1

g r d e h e c e s c o n E . h is t o ly t ic a C o n tro l + C o n tro l M u e s t r a IN P

Figura 5. Curva de sensibilidad de la tcnica inmunolgica para detectar de E. histolytica en muestras de agua sinttica. Las pruebas cruzadas de especificidad que se llevaron a cabo con Entamoeba coli, Iodamoeba butschlii y Giardia lamblia, fueron negativas en los tres casos. As mismo los resultados obtenidos en la tcnica de ELISA, corroboran que la cantidad de muestra de agua usada (de 100 a 300 L), proporciona resultados constantes y reproducibles. Resultados en descargas de la baha - Se colectaron un total de 19 muestras, 14 de descargas de una zona costera y 5 de baha (agua de mar). En junio, se reportaron dos resultados positivos en baha (descarga 1). Estos resultados positivos se presentaron durante el verano y antes de la poca de lluvias. En septiembre y octubre se presentaron otros cuatro resultados positivos, en descargas de la baha (descarga 2 en dos ocasiones) y descargas 4 y 5 ya en plena poca de lluvias. En la tabla 2, se muestran los resultados de deteccin de E. histolytica en la baha, stos corresponden a los muestreos de abril, junio, julio y en el mes de octubre se increment el nmero de descargas monitoreadas por las avenidas de la poca de lluvias. Resultados en las presas - En la tabla 3, se muestran los resultados de deteccin de E. histolytica en el sistema de presas en poca de lluvias, se analizaron 15 muestras, se incluyeron 8 muestras en el cuerpo de agua (frente a la descarga correspondiente) y 7 descargas municipales. Los resultados obtenidos detectaron dos descargas con muestras positivas (descarga 3 y 7). En el cuerpo de agua de los tres embalses no se detect este patgeno. En Morelos (Tabla 4), se detect una muestra positiva en el efluente de la descarga municipal 1; esta ltima se identific primero por la tcnica de Faust y posteriormente por la tcnica de ELISA, resultando positiva en ambas.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental En la figura 6 se resumen los resultados: se analizaron un total 80 muestras, con el fin de detectar la presencia de Eh por medio de ELISA en muestras de agua ambiental. Se encontr que el 33.3% fueron positivos para agua residual del Edo. de Morelos; 27.3% para descargas a baha; 13.3% en descargas a embalses y ausencia (0%) dentro de los embalses y agua de mar. Tabla 2. Resultados de E. histolytica en Baha 1999. Fecha de Estacin Muestreo 04/Abr/99 Baha 1 29/Jun/99 Descarga 1 Baha 2 Descarga 1 Baha 2 Baha 1 06/Jul/99 Baha 1 Descarga 1 13/Sep/99 Descarga 2 Descarga 1 Descarga 3 Descarga 4 Descarga 5 Descarga 6 25/Oct/99 Descarga 1 Descarga 5 Descarga 6 Descarga 3 Descarga 2 B: muestra de Baha D: muestra de descarga.

Tipo de muestra B D B D B B B D D D D D D D D D D D D

Antgeno especfico de Entamoeba histolytica Ausencia Presencia Ausencia Presencia Ausencia Ausencia Ausencia Ausencia Presencia Ausencia Ausencia Presencia Ausencia Ausencia Ausencia Presencia Ausencia Ausencia Presencia

Tabla 3. Resultados de E. histolytica en los embalses, septiembre 1999. Estacin Embalse Tipo de Antgeno especfico de muestra Entamoeba histolytica Descarga 1 Presa 1 D Ausencia Cuerpo de agua 1 CA Ausencia Descarga 2 D Ausencia Cuerpo de agua 2 CA Ausencia Descarga 3 D Presencia Cuerpo de agua 3 CA Ausencia Descarga 4 Presa 2 D Ausencia Cuerpo de agua 4 CA Ausencia Descarga 5 D Ausencia Cuerpo de agua 5 CA Ausencia Descarga 6 D Ausencia Cuerpo de agua 6 CA Ausencia Descarga 7 Presa 3 D Presencia Cuerpo de agua 7 CA Ausencia Cuerpo de agua 8 CA Ausencia CA.- muestra del cuerpo de agua (junto descarga del mismo nombre) D: muestra de descarga. Tabla 4. Resultados de deteccin de E. histolytica en Morelos, 1999 Fecha Lugar Estacin Tipo de Antgeno especfico de muestra Entamoeba histolytica 06/Ago/99 Descarga Mpal. 1 Efluente D Presencia 14/Sept/99 Descarga Mpal. 2 Influente D Ausencia 2 muestras

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100% 80% 60%

66.7 72.7 86.7 100 100

Negativo a Eh Positivo a Eh

%
40% 20% 0%
Agua residual Desc. a baha

33.3

27.3

13.3
Desc. a presas

Agua Superf. Agua de mar

Figura 6. Frecuencia de aparicin de amibas (Eh) en muestras de agua ambiental. Con las modificaciones desarrolladas en IMTA, ya es posible la deteccin de E. histolytica en agua, las tcnicas inmunolgicas superan las metodologas clnicas como los procedimientos de flotacin y sedimentacin, incluso el de inmunofluorescencia (IFA), que segn LeChevallier, et al. 1990, supera el factor de recuperacin hasta en 12 veces ms que el mtodo de flotacin.

DISCUSIN Las nuevas metodologas con anticuerpos monoclonales (ELISA), como la implementada en este trabajo incrementan su eficiencia a travs de sensibilidad y especificidad. En mtodos cuantitativos se reportan porcentajes de recuperacin, por ejemplo, en el caso de tcnicas clnicas se logran factores de recuperacin del 30% en adelante; en el caso de Inmunofluorescencia (IFA), Ongerth (1989) reporta factores de recuperacin hasta del 74% (LeChevallier et al., 1990). En el IMTA en 1998-1999, se ha desarrollado con xito la deteccin de E. histolytica y Giardia lamblia en muestras de agua y por medio de ELISA, que cambia el porciento de recuperacin por especificidad y sensibilidad. De hace dos aos a la fecha, en el Hospital Infantil de Mxico se ha demostrado la buena respuesta que ha tenido el anlisis clnico de ELISA en muestras slidas para la deteccin de Eh. Rocha et al. (1999), tambin reportan excelentes resultados de sensibilidad y especificidad con porcentajes que son mayores (95% y 100%) a los publicados por una tcnica comercial (87 y 99%; Alexon ProSpecT, 1996). Sin embargo, en comparacin con las tcnicas microscpicas y por la naturaleza de la reaccin inmunolgica antgenoanticuerpo de ELISA esta tcnica es slo cualitativa. Por lo que las tcnicas tradicionales deben seguir practicndose, como apoyo a las investigaciones relacionadas con protozoarios y otros parsitos que afectan al hombre. Con relacin a los anlisis de ELISA para la deteccin de Eh practicados en muestras de agua, slo existe el antecedente de Snchez y Bravo (1999), donde se aplic la tcnica en muestras inoculadas con Eh, y se obtuvieron valores de 90 y 100% de sensibilidad y especificidad, respectivamente, los que son semejantes a los valores reportados por Rocha et al. (op. cit.) y Alexon ProSpecT (op. cit.). Se llev a cabo una prueba comparativa, en donde se identific primero por microscopa la presencia de Eh en la descarga municipal 1 de Morelos (Fig. 7), y posteriormente se analiz por ELISA, resultando positiva al procedimiento inmunolgico implementado en el IMTA para la determinacin de Eh.

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Figura 7. Quiste maduro de E. histolytica en el efluente de una planta de tratamiento de agua residual en Morelos. En este sentido, algunas tcnicas clnicas de identificacin han sido preferidas por ser rpidas y sencillas, adems de considerar la presencia o ausencia del patgeno en lugar de su cantidad, para el caso de dar un diagnstico clnico, slo es necesario detectar la presencia de algunos organismos viables para que se considere un paciente como enfermo o portador. Cuando el patgeno se localiza en agua, las acciones preventivas a considerar an estn en proceso de investigacin, ya que a la fecha, no se conoce un tratamiento eficiente que pueda eliminar satisfactoriamente la viabilidad del patgeno. A la fecha, no se han realizado estudios que intenten obtener un factor que cuantifi que de manera indirecta, los quistes de E. histolytica con las lecturas de la densidad ptica del lector de ELISA. Los valores del espectrofotmetro podran ser directamente proporcionales con la cantidad especfica de quistes. Por ejemplo, una tcnica cita que el lmite de deteccin del antgeno especfico de Eh (EHSA), es de 40 nanogramos/mL (Alexon ProSpecT, 1996), pero no indica a qu cantidad de quistes de amibas corresponde dicho valor del EHSA. En cuanto a las pruebas de reactividad cruzada la tcnica reporta negativa a 17 especies con morfologa muy semejante a Entamoeba histolytica, como los son: Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Iodamoeba butschlii, Endolimax nana, Gardia lamblia, Dientamoeba fragilis, Ascaris lumbricolides, Criptosporidium parvum, Hymenolepis nana, Taenia sp., Trichuris trichura, entre otros. Los resultados de los experimentos llevados a cabo en el presente trabajo son semejantes ya que fueron negativos para tres especies. Las enfermedades transmitidas por el agua generalmente se asocian por: contaminacin directa (por excretas y/o agua residual) a un cuerpo de agua; deficiencias en el tratamiento de agua; ausencia de tratamiento, y/o por contaminacin del agua despus del tratamiento. Estas situaciones se presentan basicamente en sistemas de agua municipal y aguas para uso recreativo, que no tienen procesos adecuados para la remocin de microorganismos, as como las evidentes descargas de aguas residuales en aguas superficiales. Por otro lado, se debe considerar el riesgo de contaminacin por agua residual, en reas cercanas a fuentes subterrneas (Helmer et al., 1991). La resistencia a la desinfeccin de los quistes de protozoarios fue estudiada en un principio con E. histolytica, en la cual la viabilidad fue determinada por exclusin de eosina, esto es, si un quiste permanece sin color cuando es expuesto a la tintura de eosina es considerado como viable, por lo contrario, cuando sta penetra y se tie el quiste, se considera como no viable.

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XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental Holff (1979), encontr que la exclusin de eosina es consistente con estimaciones de quistes viables que pueden ser encontrados por excitacin in vitro. Jarrol et al. (1981), estudi el efecto del cloro sobre quistes viables, bajo diferentes condiciones; encontr que la sobrevivencia de los quistes se incrementaba cuando el pH tenda a ser ms alcalino. La temperatura del agua, concentracin de cloro y el tiempo de exposicin fueron importantes en la sobrevivencia de los quistes y especialmente, que los quistes de protozoarios pueden ser inactivados por cloracin. Jarroll et al. (op. cit.), prob 6 desinfectantes que son usados para tratamiento de pequeas cantidades de agua, todos los desinfectantes destruyen el 100% de los quistes a 20C, sin embargo en agua turbia algunos desinfectantes fueron menos eficientes que en agua clara. Se comprob que altas concentraciones de cloro y yodo inactivan a los quistes de protozoarios. En contraste con la informacin anterior, Helmer et al. (1991) reporta que en la prctica la desinfeccin de agua residual, usualmente por la aplicacin de cloro, nunca ha sido exitosa. Aaden que, aunque el cloro proporciona una buena reduccin de las bacterias excretadas, la desinfeccin con este producto no posee la capacidad para remover protozoarios y helmintos. Otro mtodo que se ha utilizado es la radiacin ultravioleta, que ha sido considerada como una alternativa potencial para desinfectar en pequeos sistemas de agua de distribucin, Rice et al. (1982), citan que los quistes de protozoarios fueron altamente resistentes a la radiacin ultravioleta, de este modo, ellos concluyen que la radiacin ultravioleta, por s sola, no debe ser usada como quisticida. En relacin con la filtracin, Logsdon y Lippy (1982) analizaron la remocin de bacterias, quistes de protozoarios y virus por coagulacin, sedimentacin y filtracin. En filtros lentos de arena, sistemas usados en pequeos abastecimientos de agua, presentan una eficiencia de remocin del 90% de organismos de 7 a 12 m, que corresponde al tamao de los quistes. La filtracin rpida se usa en poblados y sistemas de agua de mayor tamao, tambin sirve para remover patgenos. Sin embargo, la armada de los EE.UU. (U.S. Army, 1944), encontr que quistes de E. histolytica pasaron a travs de filtros rpidos a velocidades entre 4.4 a 6.6 mm/s con pobre o nula coagulacin. Logsdon y Lippy (op. cit.), encontraron que, con una adecuada coagulacin y velocidades de filtracin no mayor a 2.7 mm/s, se remueven el 99% de quistes.

CONCLUSIONES Se comprob que la metodologa para la deteccin de E. histolytica, es adecuada para su uso en muestras ambientales de agua. No obstante la baja concentracin de quistes en agua, los resultados confirman que la cantidad de 300 L de muestra concentrada es adecuada para detectar amibas en agua ambiental. Se obtuvo la curva de sensibilidad para E. histolytica en muestras inoculadas en 4 L de agua destilada y se encontr que el lmite de deteccin del antgeno especfico de E. histolytica fue de 12.5 mg/L en muestras sintticas. Las pruebas cruzadas de especificidad a la presencia de Entamoeba coli, Iodamoeba butschlii y Gardia lamblia, fueron negativas, por lo tanto esta tcnica resulta hasta el momento, especfica para la deteccin de E. histolytica. ELISA mostr alta sensibilidad (90%) y especificidad (100%), en comparacin con la tcnica de inmunofluorescencia que supera hasta en 12 veces las tcnicas clnicas. De un total de 80 muestras analizadas el porcentaje de aparicin de resultados positivos para E. histolytica en descargas municipales de Morelos fue de 33.3%; en descargas a baha fue del 27.3% y para las presas de almacenamiemnto de agua 13.3%13.3%. Todas las muestras ubicadas dentro de los cuerpos de agua estudiados fueron negativas, posiblemente E. histolytica se encuentre en bajas concentraciones por lo que ser necesario adaptar las tcnicas para estas condiciones. Por ejemplo, adecuar el volumen de muestra de agua, dependiendo de la calidad microbiolgica de la misma. ABES - Associao Brasileira de Engenharia Sanitria e Ambiental 10

XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental El anlisis de E. histolytica cuesta alrededor de $20 USD por muestra y el tiempo de anlisis, despus del proceso de concentracin, es de 8 horas con una capacidad mxima de 94 muestras por corrida. Es probable que los resultados negativos en todas muestras de agua marina, sean producto de interferencias provocadas por la salinidad del agua. La metodologa para detectar E. histolytica en muestras de agua potable por medio de ensayo Inmunoenzimtico (ELISA), contribuye al desarrollo de nuevas metodologas, que promueven un manejo integral del recurso hdrico en los pases latinoamericanos.

RECOMENDACIONES Se recomienda monitorear la presencia de quistes de Eh y otros protozoarios patgenos, en sedimentos de cuerpos de agua utilizados para abastecimiento y recreacin, tanto de agua dulce como marina. Se sugiere muestrear las descargas de embalses de almacenamiento de agua, considerando los horarios de mayor gasto y las diferentes estaciones del ao. En zonas costeras de uso recreativo, se recomienda aplicar la tcnica de ELISA, cuando se presente alguna de las siguientes condiciones en fuentes de abastecimiento: A) Descargas de agua residual, B) Exceso de contaminacin fecal y C) Presencia de otros factores socioculturales de riesgo para la transmisin de enfermedades hdricas. Se recomienda verificar la deteccin de E. histolytica en agua de mar para adecuar la tcnica inmunolgica en muestras de agua salada en caso de ser necesario. Debido a la importancia que presentan el riesgo de la hidrotransmisin de patgenos a la poblacin, se recomienda hacer pruebas de remocin de quistes de protozoarios por los mtodos de tratamiento fsico de agua existentes.

AGRADECIMIENTOS Agradecemos a la QFB. Mnica Mirabal; QFB. Gerardo Garca; Tec. Lab. Valente Gamez; Tec. Lab. Silvia Valencia y Tec. Lab. Adn Prez, personal de laboratorio del departamento de parasitologa del Instituto Nacional de Pediatra (INP), quienes brindaron su tiempo en la capacitacin sobre tcnicas clnicas de E. histolytica. As mismo, se agradece al INP, las facilidades para donar muestras para la realizacin del presente estudio.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. 2. ALEXON, PROSPECT. Entamoeba histolytica Microplate Assay. Advancing the Diagnosis of Intestinal Infections. Catalog #560-96. Sunnyvalley, California, 3 pp., 1996. APHA, AWWA, WEF. American Public Health Association, American Water Works Association & Water Environmental Federation. Standard Methods for the Examination for Water and Wastewater 19th Ed. Washington, D.C., USA. chap.9, p.117, 1995. CONDE, B.M. y Z.C. MORA. Entamoeba histolytica; Un desafo vigente. Rev. Salud Pblica de Mxico, v.34, n.3, p.335-341, May.-Jun, 1992. GARCA, R.J., RAMREZ, A.V., CORTS M.J., SNCHEZ, C.J., BRAVO, I.L. y C.M. MILLN. Desarrollo y aplicacin de mtodos para identificacin de enteropatgenos (enterovirus, bacterias y parsitos) en agua. Subcoordinacin de Calidad del Agua. Coordinacin de Tratamiento y Calidad del Agua. IMTA, SEMARNAP. (informe final). Mxico, 42 pp., 1998. HELMER, R., HESPANHOL, I. & SALIBA, L.J. Public Health Criteria for the Aquatic Environment: Recent WHO Guidelines and their Application, Wat. Sci. Tech., v.24, n.2, p.35-42. 1991.

3. 4.

5.

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11

XXVII Congresso Interamericano de Engenharia Sanitria e Ambiental 6. HOLFF, J.C. Desinfection resistance of Giardia cysts: origins of current concepts and research in progress. In: W. Jakubowski & J.C. Hoff, Eds. EPA Symposium on Waterborne Transmission of Giardiasis. EPA-600/9-79-001. U.S. Enviromental Protection Agency, Ohio. 1979. JARROLL, E.L., BINHAM, A.K., & MEYER, E.A. Effect of Chlorine on Giardia lamblia Cysts Viability, Appl. & Envir. Microbiol., v.41, n.2, p.483. Feb., 1981. KABIR, S. Production and characterization of monoclonal antibodies to outer-membrane protein antigens of Vibrio cholerae O1. J. Med. Microbiol., v.34, p.167-173. 1991. LeCHEVALLIER, M.W., TROK, M.T., BURNS, M.O. & R.G. LEE. Comparison of the Zinc Sulfate and Immunofluorescence Techniques for Detecting Giardia and Crytosporidium. In: Proceedings of the 1988 Water Technology Conference. American Water Works Association, Missouri. p. 75-82.1990. LOGSDON, G.S. & LIPPY, E.C. The role of Filtration in Preventing Waterborne Diseases. Jour. AWWA, v.74, n.12, p.649, May, 1982. LUGO, A. y SNCHEZ, R.M. Amebas amigas. Rev. Informacin Cientfica y Tecnolgica, CONACyT, Mxico, p.13-14, Ene.-Feb., 1995. MARGOLIN, A.B. Control of Microorganisms in Source Water and Drinking Water. In: Hurst, C.J. (Ed.). Manual of Environmental Microbiology. American Society for Microbiology. Washington, D.C. p.195-197, 1997. ONGERTH, J.E. Giardia Cyst Concentrations in river Water. Proceedings of the Water Technology Conference. American Water Works Association, p.81-86, 1989. RICE, E. W.; HOFF, J.C.; & SCHAEFFER, F. W. Inactivation of Giardia Cysts by Ultraviolet Irradiation. Appl. & Envir. Microbiol., v.42, n.3, p.546, Sep., 1982. ROCHA M.O., MELLO R.T., GUIMARAES T.M., TOLEDO V.D., MOREIRA M.D. & C.A. COSTA. Detection of a Giardia lamblia coproantigen by using a comercially available inmunoenzimatic assay, in Belo Horizonte, Brazil. Rev. Inst. Med. Tropical de Sao Paulo, Brasil, v.41, n.3, p.151-154, 1999. ROIT, M.Y.; BROSTOFF, J. & MALE, K.D. Immunology. Gower Medical Publishing. London Ltd. Section 25, 1985. SNCHEZ, Ch.J. y BRAVO, I.L. ELISA Technique for the Detection of Entamoeba histolytica in Seeded Water Samples In: 19th International Symposium of the North American Lake Management Society (NALMS), Nevada. Dec., 1999. TIJSEEN, P. Practice and Theory of Enzyme Immunossays. In: R.H. Burdon & P.H. Van Knippenberg, Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier, New York. p.14-16, 1985. U.S. ARMY. Efficiency of Standard Army Purification Equipment and Diatomite Filters in Removing Cysts of Endamoeba histolytica from Water. War Dept. Report 834, Washington, D.C., 1944. WHO. Report of the Expert Consultation on Amoebiasis. A WHO/PAN American Health Organization/UNESCO. Division of Control of Tropical Diseases (CTD/SIP). WHO Weekly, 1997.

7. 8. 9.

10. 11. 12.

13. 14. 15.

16. 17.

18.

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