INSTITUTO TECNOLGICO DE BOCA DEL RO

INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

PRCTICA 1:

PREPARACION DE MATERIAL ESTERILIZADO Y MEDIOS DE CULTIVOS

MATERIA: MICROBIOLOGA
CATEDRATICO: M.C. BLANCA E. SANCHEZ EQUIPO 2: ESTREPTOCOCOS

MARINA EDITH ACOSTA RODRIGUEZ NOEMI GISELA ZAPATA SANTOS LUIS ANGEL HERNANDEZ CEDILLO 3er SEMESTRE

PRACTICA 1

PREPARACION DE MATERIAL ESTERILIZADO Y MEDIOS DE CULTIVOS

Objetivos:

El alumno conocer las tcnicas que se aplican en el laboratorio para preparar material estril que ser empleado en prcticas posteriores. El alumno conocer los diferentes medios de cultivo que se utilizan en microbiologa, su preparacin y los mtodos de esterilizacin y conservacin.

INTRODUCCION

Trabajar en un laboratorio de microbiologa lleva implcito el empleo de material, equipo e instrumental libres de microorganismos que puedan contaminar las muestras que se estn analizando y producir resultados errneos. Antes de iniciar una prctica de microbiologa es indispensable usar bata de laboratorio, mantener la mesa de trabajo limpia y desinfectada y evitar tener otros materiales innecesarios (libretas, mochilas, calculadoras, celulares). La desinfeccin de las zonas de trabajo es importante y puede emplearse cualquier desinfectante comercial. La esterilizacin de material de laboratorio debe hacerse en base al tipo de material que se trate, de manera que existirn diferentes mtodos de esterilizacin. Definicin de conceptos: Para objetos inanimados. 1. Esterilizacin: sterelis. Incapacidad de reproducirse, se eliminan todas las clulas vivas, esporas, virus. Libres de microorganismos por agente qumico esterilizante. 2. Desinfeccin. Destruccin, inhibicin o eliminacin de microorganismos que pueden causar enfermedad. Agentes desinfectantes. Pueden permanecer esporas y algunos microorganismos viables. 3. Saneamiento: la poblacin microbiana se reduce a niveles que se consideran seguros segn la NOM. Para restaurantes para limpiar utensilios.

En tejidos vivos: 1. Antispticos: anti= contra sepsis= putrefaccin. Es la prevencin de la infeccin o sepsis. Antispticos. Destruyen o inhiben el crecimiento de patgenos como no deben daar el tejido los antispticos no son tan txicos como los desinfectantes. 2. Germicida: destruye agentes patgenos (y algunos no patgenos) pero no necesariamente endoesporas 3. Bactericida Elimina el crecimiento de cada 4. Fungicida especie de microorganismo. 5. Algicida 6. Virucida
Inhibe el crecimiento de cada especie de microorganismo.

7. Bacteriosttico 8. Fungiesttico

Medios de cultivo Los medios de cultivo microbianos son los sustratos en los cuales los microorganismos obtienen los nutrientes necesarios para su crecimiento. Estos pueden ser naturales o sintticos. Se clasifican de acuerdo a su funcin en medios simples, enriquecidos, diferenciales y selectivos: pueden presentarse en estado slido llamado agares o medios lquidos continuamente llamados caldos su utilizacin en el laboratorio requiere del conocimiento de las caractersticas nutricionales de los microorganismos que se desean cultivar , de manera que se tengan los nutrientes en las cantidades necesarias para un buen desarrollo evitando antagonismo y estrs celular. En esta prctica se preparan diferentes tipos d medios y se conservaran en las condiciones adecuadas para evitar contaminacin para su utilizacin posterior. Material 4 matraces erlenmeyer de 500 ml 3 tubos de ensaye de 16 x 150 caldo nutritivo 3 tubos de ensaye de 16 x 150 agar nutritivo inclinado 3 tubos de ensaye de 16 x 150 agar nutritivo recto 3 tubos Dunhan o fermentacin Alcohol con Una gradilla con Asa de platino con Algodn con Papel para envolver

caldo lactosado 3 tubos Dunhan o fermentacin con Papel aluminio lactosa bilis verde brillante 9 cajas de petri estriles Tijeras 4 pipetas estriles de 5 ml Masking tape y marcador 4 pipetas estriles de 1 ml cerillos Metodologa PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO 1. De acuerdo a las instrucciones que se especifican en cada medio de cultivo prepare la cantidad suficiente para que se tengan los tubos de ensaye que se especifican en la tabla de material 2. Los medios de cultivos se preparan empleando los matraces Erlenmeyer de 500 ml. Un matraz para cada medio de cultivo. Seguir las instrucciones para su disolucin. 3. Una vez preparados los medios de cultivo se distribuirn en los tubos de ensaye conforme se solicitan en el acuerdo del material. 4. Para el llenado de los tubos de ensaye con caldo utilizar aprox. 10 ml por tubo. Para los tubos de fermentacin cuidar que la campana interna quede perfectamente llena de medio sin burbujas de aire. 5. Las cajas de petri se esterilizan primeramente para ser utilizadas con el medio en prctica posterior. PREPARACION DE MATERIAL ESTRIL Tubos de ensaye 1. Lavar perfectamente los tubos de ensaye antes de vaciar los medios de cultivo. 2. Colocar en cada tubo el medio de cultivo. 3. Colocar en cada tubo un tapn de algodn con las instrucciones que se den. 4. Colocar en cada tubo un gorro de papel aluminio 5. Colocar los tubos en la lata y protjala con papel de aluminio 6. Si los tubos que se le proporcionan son de rosca, entonces cada tubo limpio, conteniendo cada medio de cultivo, cirrelo perfectamente para evitar que se sellen al esterilizarse. Pipetas

1. Ponga en cada pipeta un filtro de algodn, de tal manera que el auire pase libremente a travs de l. 2. Flamee el extremo de la pipeta para quemar el exceso de algodn. 3. Marcar en la envoltura el volumen de cada pipeta y la fecha de esterilizacin. Cajas de Petri 1. Envolver con papel aluminio conjuntos de tres cajas de Petri perfectamente limpias. 2. Colquelas en posicin normal y anote la fecha de esterilizacin. Resultados Esterilizacin: Al saber el uso de la autoclave se pudo esterilizar las pipetas, los medios de cultivo y las cajas Petri a 121 lbs. 1 por 25 minnutos. Preparacin de medios de cultivos: Para la preparacin de los medios de cultivo hicimos clculos para preparar la cantidad que necesitbamos, ya que el frasco que contienen el medio de cultivo solo trae instrucciones para preparar un litro de medio. A continuacin se describen los clculos realizados para su preparacin: Agar nutritivo Para preparar 1000 ml se necesitan 23.3gr de caldo nutritivo en polvo y como solo necesitbamos 60 ml mediante una regla de tres simple calculamos que se necesitan 1.4 gr del medio. Agregamos 10 ml en cada tubo de ensaye

Caldo nutritivo Para preparar 1000 ml se necesitan 8 gr de caldo nutritivo en polvo y como solo necesitbamos 30 ml mediante una regla de tres simple calculamos que se necesitan 2.4 gr del medio. Agregamos 10 ml en cada tubo de ensaye

Caldo lactosado Para preparar 1000 ml se necesitan 13 gr de caldo nutritivo en polvo y como solo necesitbamos 40 ml mediante una regla de tres simple calculamos que se necesitan .52 gr del medio. Agregamos 12 ml en cada tubo de ensaye

Caldo lactosa bilis verde brillante Para preparar 1000 ml se necesitan 40 gr de caldo nutritivo en polvo y como solo necesitbamos 40 ml mediante una regla de tres simple calculamos que se necesitan 1.6 gr del medio. Agregamos 12 ml en cada tubo de ensaye

Por ltimo colocamos los medios en los tubos de ensayo en las siguientes proporciones: 3 tubos con 10 ml de caldo nutritivo 6 tubos con 10 ml de agar nutritivo 3 tubos con 12 ml de caldo lactosado con campana 3 tubos con 12 ml de lactosa bilis verde brillante con campana.

Conclusiones y observaciones Al empezar a envolver todo el material que se va a requerir para la prctica posterior lo que es el estar envolviendo es muy tardado ypor tenenmos que cumplir con las instrucciones. Despus en la esterilizacin, cuando se lleva al autoclave esta es muy tarda.

Cuestionario 1. investiga los diferentes tipos de esterilizacin que existen indicando para que tipo de material se utilizan y las condiciones del mtodo, temperatura, tiempo, etc. MTODOS FSICOS: Fuego Directo: Este procedimiento consiste en exponer a la llama de un mechero de Bunsen el objeto que se desea esterilizar. Cuando ste es de metal se deja permanecer en el rea de reduccin de la llama hasta que se ponga al rojo (asas de cultivo; algunas agujas, etc) . Si es de vidriose deja un tiempo prudencial, procurando que la llama llegue a todos lados. Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario dejarlo enfriar en un sitio asptico. Este procedimiento tiene limitaciones debido a que deteriora los objetos y si son de gran volumen, la esterilizacin nunca es perfecta. Calor Seco: El calor seco produce desecacin de la clula, esto es txico por niveles elevados de electrolitos y fusin de membranas, residuos que quedan adheridos al objeto estril. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos.An as se sigue utilizando el calor seco en todos los laboratorios para la esterilizacin de placas de petri y pipeteros (recipientes metlicos para alojar pipetas para la siembra de sustancias lquidas). No es corrosivo para metales e instrumentos. Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no voltiles.

Estufas: colocar los instrumentos a esterilizar en el interior de una estufa interior a una temperatura entre 150 y 190 C. En la actualidad la mayora de las estufas de esterilizacin o de cultivo se termorregulan por medio de un termostato hidrulico. Se pueden introducir instrumentos de vidrio como cajas de petri, tubos de ensaye, pipetas, vasos de precipitados, matraces, etc. Calor Hmedo: El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: *El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructurasbiolgicas son producidas por reacciones que eliminan agua. *El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. AUTOCLAVE Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin. El modelo ms usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120 a una atmsfera de presin (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos. Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de metal. Se cierra asegurando la tapa, ajustando los bulones y se da calor, dejando abierta la vlvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante. Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A partir de all se cuenta el tiempo de esterilizacin, luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave nuevamente. TIEMPO 15 MINUTOS 20 MINUTOS Guantes de hule Cristalera general Bandeja MATERIALES Sondas

en Jeringas de vidrio

30 MINUTOS

Equpio transfusin

de Ropa, torundas

45 MINUTOS

Material de acero

Del tiempo, temperatura y presin usados en la esterilizacin depende el xito alcanzado. Generalmente los datos presin y temperatura son fijados, y el nico factor que se vara es el tiempo. Los materiales necesitan diferentes tiempos de esterilizacin dependiendo de su textura, porosidad, y otras caractersticas propias de cada material. Algunos materiales como el hule, necesitan poco tiempo,

mientras otros como el metal quirrgico necesitan ms. Los siguientes datos han sido tomados para una temperatura de esterilizacin de 250F (121C) a 15-20 PSI. El mtodo utilizado para envolver los paquetes deber garantizar el mantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento. Como Cargar el Autoclave a) Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulacin de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo). b) Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de material seco. Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rpido contacto del vapor con las superficies de las vasijas y su contenido. Tambin facilita el secado. c) Esterilizar los lquidos separndolos de otros materiales. d) Cuando se esterilizan lquidos, debe hacerse con los recipientes destapados. e) La cristalera deber esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales (nunca con la boca hacia arriba). Ebullicin: Durante mucho tiempo se "hirvieron" los utensilios y materiales quirrgicos o jeringas hipodrmicas para esterilizarlas. El agua a 100 C no garantiza una adecuada esterilizacin, no obstante posee la propiedad de desprender las colonias o los microorganismos y destruir aquellos que son susceptibles a sta temperatura. Un claro ejemplo de ello fue el sistema utilizado hasta hace pocos aos para esterilizar jeringas de vidrio y agujas hipodrmicas de nquel con embocadura de bronce en el mejor de los casos, platino, hirvindolos en agua. FILTRACIN: Este procedimiento es aplicable a la esterilizacin de lquidos y gases, especialmente los primeros. Cuando el lquido a filtrar no puede resistir, sin descomponerse , la accin del calor, se aplica la tcnica de filtracin, la que puede efectuarse mediante presin o aspiracin. Se basa en el pasaje de lquidos a travs de sustancias porosas que detienen a los microbios. Los antiguos filtros se fabricaban en forma de bujas que son cilindros huecos abiertos por una extremidad y cerrados por otra, de paredes de espesor variable. Existen tres tipos bsicos de filtros: a- Filtros profundos o Filtros de profundidad: Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retencin de las partculas se produce por una combinacin de absorcin y de retencin mecnica en la matriz.

b- Membranas filtrantes: Tienen una estructura continua, y la retencin se debe principalmente al tamao de la partcula. Partculas ms pequeas al tamao del poro quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos electrostticos. c- Filtros de huella de nucleacin (Nucleoporo): Son pelculas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiacin y sustancias qumicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partcula con un tamao mayor al del poro. MTODOS QUMICOS: La Iodopovidona (pervinox), el Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o Cloruro de Zefirano) son ejemplos de antispticos tiles para desinfectar manos y superficies. Cuando la superficie es resistente, el mejor agente biocida es el Hipoclorito de Sodio (agua lavandina).

ESTUFAS DE ESTERILIZACION POR OXIDO DE ETILENO Destruye todos los organismos y microorganismos conocidos, incluso esporas y virus. Esteriliza sin deterioro artculos de goma, plstico, metal, madera, lana, piel, papel, productos farmacuticos. Esterilizacin con embalajes: a este gas son permeables sustancias como polietileno, nylon, celofn, etc. El xido de etileno era bactericida, esporicida, con gran poder de penetracin, efectivo a bajas temperaturas y penetra sustancias porosas; para evitar su poder explosivo y su alto potencial inflamable se mezcl con CO 2 en una proporcin de 7,15 veces el volumen de xido de etileno. El tiempo de esterilizacin que requiere el material depende de mltiples variables, el vaco que se produce, la humedad, la concentracin del gas expresado en gs./l y la temperatura, es decir que reduciendo la temperatura aumenta el tiempo de exposicin requerido. El gas se adquiere en botellas metlicas o cartuchos que se vaporizan, cambian de lquido a gas a 10 C. Todos los artculos debern airearse por 6 hs. despus de una esterilizacin. El Oxido de etileno es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plastico, papel, etc.), equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y adems cancerigeno.

Con aldehdos Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas, provocando una modificacin irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimtica. Estos compuestos destruyen las esporas. Glutaraldehdo: Consiste en preparar una solucin alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos. Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo fro. Puede esterilizar plstico, goma, vidrio, metal, etc. RADIACIN: Su accin depende de:

El tipo de radiacin El tiempo de exposicin La dosis

Radiaciones Ionizantes: Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos, estructuras proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolbiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. Rayos Ultravioleta: Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilizacin en quirfanos. Rayos Gamma: Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energia atomica. Este tipo de esterilizacin se aplica a productos o materiales termolbiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibiticos, vacunas, alimentos, etc.

2. Escriba otra definicin de medio de cultivo Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el mediode cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

3. Defina los siguientes conceptos y en cada caso de ejemplos: Medios de cultivo simples. su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos poco existentes. Es el medio ms frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemlo: agar nutritivo o caldo nutritivo. Medios Selectivos. Estos han sido modificados de alguna manera para inhibir el desarrollo de un grupo de organismos, mientras que permite el desarrollo de otro grupo proveniente de una flora mixta. La modificacin puede consistir en la alteracin del pH. Tambin se puede incluir a un medio slido substancias inhibidoras que dejen crecer ciertos tipos de bacterias pero no otras sensibles a tal agente, teniendo entonces un medio que puede ser moderadamente altamente selectivo, P. ej. S-110, S.S. y S.D.A. los cuales a la vez son diferenciales y selectivos. Medios Enriquecidos. Son aquellos a los que se les pueden agregar substancias para enriquecerlo, como p.ej. si es slido y se le agrega sangre, se denomina agar sangre, el cual puede ser utilizado en el aislamiento de bacterias muy exigentes en sus requerimientos nutricionales. Tambin se puede estudiar en este medio la accin de productos solubles bacterianos como las hemolisinas, en cuyo caso la colonia est rodeada de una aureola clara, donde estas enzimas han destruido los glbulos rojos. Ejs. De medios enriquecidos: Medio de suero de Loeffler para bacilos diftricos, Medio de Lowenstein-Jensen, para bacilos tuberculoso, Caldo Selenito Cistena y Caldo Tetrationato.

Medio Diferencial. Es aquel en el que se ha aadido una clase de indicador, generalmente un colorante, que permite diferenciar entre distintas reacciones qumicas que se producen durante el crecimiento Ej. E.M.B. (Eosina-azul de Metileno) que se utiliza para el aislamiento de enterobacterias Gram negativas. La presencia del azul de metileno inhibe a las bacterias Gram positivas.

BIBLIOGRAFA GERARD J. TORTORA BERDELL D. FUNKE, CHRISTINE L. CASE 1993 INTRODUCCION A LA MICROBIOLOGA EDITORIAL ACRIBIA S.A. 3 EDICION ZARAGOZA, ESPAA METODOS DE MICROBIOLOGIA

CH. COLLINS EDITORIAL ACRIBIA S.A. MICROBIOLOGA AUTOR: PREESCOTT HARLEY EDITORIAL: MCGRAWHILL AO: 2002