Prsentation Immunoglobulines (Ig) et des cellules T du rcepteur (TCR) gnes sont assembls pendant le dveloppement des cellules B et T travers

s une srie d'vnements recombinaison spcifique de site appel V (D) J (examin en1994 Lewis ). Rglementation stricte de V (D) J est ncessaire pour assurer la gnration de rcepteurs B et T fonctionnels antigne des cellules et de protger l'intgrit du reste du gnome. Segments de gnes utiliss dans V (D) J sont flanqus par des squences signal de recombinaison tripartites (CNR) qui se composent d'un heptamre hautement conserve, une nonamre AT-riche, et une entretoise intermdiaire de 12 ou 23 paires de bases. Un niveau fondamental de l'ordre est impos par la restriction que la recombinaison a lieu seulement entre les segments de gnes flanqus par des RSS avec des longueurs d'espacement dissemblables ( Tonegawa 1983 ). V (D) J activit recombinase est dtermin par l'expression rgule des gnes activant la recombinaison RAG1 et RAG2 ( [30] et [21] ). L'expression de RAG1 et RAG2 corrle prcisment avec l'activit recombinase dans des lignes cellulaires et des tissus. Par ailleurs, co-transfection de RAG1 et RAG2 d'assemblage d'expression est suffisant pour activer la recombinaison dans de nombreux types de cellules non lymphodes. Par consquent, la restriction de rarrangement des gnes d'progniteurs des lymphocytes B et T peut tre entirement due la ligne et de dveloppement spcifiques au stade de l'expression de RAG gnes. Un mcanisme distinct de la rglementation, cependant, doit tenir compte de la spcificit observe entre la ligne des cellules B et T. Gnes d'Ig sont uniquement cibles pour complter rarrangement des cellules ligne B, et des gnes du TCR ne sont compltement rorganiss dans les cellules de la ligne T. Nanmoins, lorsque des substrats artificiels recombinaison sont transfects dans des cellules B ou T avec une activit recombinase, les constructions sont rarrangs, sans discrimination concernant l'origine des lments RSS ( Yancopoulos et al. 1986 ). Il ya aussi la rgulation temporelle de rarrangement des gnes au sein d'une ligne lymphode donne (revu dans Blackwell et Alt 1989 ). Par exemple, dans les cellules B en dveloppement chane lourde d'Ig (IgH) les gnes sont assembls partir de V, D et J de codage des segments d'une manire ordonne: D H J H rarrangement se produit sur les deux allles chane lourde avant V H -DJ H dbute le rarrangement soit allle.Rarrangement des loci d'Ig chane lgre suit gnralement V H --DJ H rarrangement. Le produit d'un gne IgH totalement rarrangs, la protine , peut jouer un rle dans la rorientation de la recombinase au locus de la chane lgre Ig (revu dans Schatz et al. 1992 ). protines mdiatise aussi lourd exclusion alllique de la chane ( [41] , [20] et [13] ). Pr-B des cellules exprimant la protine continuer exprimer la GCR gnes et loci activement rorganiser leurs chanes lgres. Toutefois, en restant DJ H allles ne sont pas cibls pour d'autres V H --DJ H rarrangement. La discrimination entre les

recombinase DJ H et d'allles Ig ce stade de dveloppement est indispensable pour maintenir la distribution clonale des rcepteurs pour l'antigne des cellules B. Etant donn que seul un sous-ensemble de gnes qui sont capables d'tre rarrangs sont effectivement cibls dans une cellule donne l'activit de recombinase et qu'un mdiateur recombinase commun, tous les rarrangements gniques ( Yancopoulos et al. 1986 ), il est probable que la rglementation est ralis travers le substrat l'accessibilit. L'hypothse de l'accessibilit postule que les gnes d'Ig et TCR rsident gnralement dans une structure de la chromatine qui est rfractaire la reconnaissance par la recombinase ( [43] et [2] ). Dans les cellules lymphodes, les signaux de dveloppement entranerait des changements dans la chromatine qui permettent l'accs des segments de recombinase gne particulier. Rsultats montrant que l'activation d'un locus de corrlation rarrangement avec la transcription du locus gnique germinale soutenir l'hypothse d'accessibilit ( [43] , [5] , [32] et [34] ). Cependant, il reste difficile de savoir si la transcription est le dterminant de l'accessibilit ou en raison de l'accessibilit confre par un autre mcanisme. Afin de rpondre des mcanismes qui visent V (D) activit recombinase J, il est ncessaire de comprendre la raction de recombinaison au niveau biochimique. La recombinaison est initie par le clivage prcise la jonction entre un segment de gne codant et son accompagnement RSS pour gnrer deux intermdiaires d'ADN casses composition non limite, un bout de signal et une fin de codage ( [27] et [28] ). Signal se termine invariablement mouss, 5'-phosphoryle molcules sans nuclotides perdu ou gagn la fin ( [29] et [35] ). Extrmits codantes sont initialement scelle dans une structure en pingle cheveux ( Roth et al, 1992b. et ensuite traites pour des molcules ouvertes () Ramsden et Gellert 1995 ; MSS, donnes indites). Signal se termine et se termine le codage sont joints ultrieurement pour gnrer le signal articulations prcises et htrognes articulations codage. Un systme acellulaire qui catalyse la reconnaissance RSS et les tapes de clivage de V (D) J a t rcemment dcrit ( [17] et [40] ). Dans ce systme, soit un extrait de cellules pr-B nuclaires complt avec la protine recombinante RAG1 ( van Gent et al. 1995 ) ou des protines recombinantes RAG1 et RAG2 seul ( McBlane et al. 1995 ) cliver RSS substrats contenant un plasmide ou d'oligonuclotides pour gnrer le signal et le codage se termine. Nous avons modifi cette approche en vue d'tudier l'initiation de la recombinaison V (D) J des segments de gne endogne au sein de la chromatine. Rsultats
Loci d'immunoglobulines dans les noyaux isols sont des substrats pour In Vitro RSS clivage par la recombinase V (D) J

Nous avons prpar extrait nuclaire de la ligne cellulaire pr-B conditionnellement transform 103-bcl2 / 4 (103; Chen et al, 1994. ) et des protines purifies coeur RAG1 (rRAG1) de baculovirus-cellules d'insectes infectes comme dcrit ( van Gent et al 1995. ). Comme indiqu prcdemment ( van Gent et al. 1995 ), l'extrait 103 nuclaire complte par un clivage catalys rRAG1 d'un flux RSS prsent sur un plasmide purifi (voir ci-dessous). Pour dterminer si la recombinase pourrait reconnatre sa cible au sein de structure de la chromatine native, nous avons ragi noyaux intacts template l'extrait nuclaire et rRAG1 et analyses au CNR clivage accompagnement Ig segments de gne. Afin de clivage de test de novo des loci endognes, il tait essentiel que le modle nuclaire et extrait utilis ne contient pas d'ADN avec des pauses RSS prexistantes. Pour ce faire, les modles nuclaires ont t prpars partir de lignes cellulaires transformes ou des cellules primaires de souris RAG-dficient ( [18] , [36] et [37] ) qui n'ont pas de rarrangements de gnes Ig ou TCR ou cass non limite des intermdiaires de rarrangement. Extrait nuclaire de la ligne cellulaire pr-B murines 103 a t utile dans l'analyse du clivage au J H segment de gne 2 du locus IgH puisque cette ligne cellulaire a supprim J H 2 dans le processus de rorganisation de ses allles IgH et n'a donc pas prexistante J H 2 pauses RSS. Toutefois, 103 cellules activement rorganiser V --J dans la culture ( Chen et al, 1994. ) et ont des niveaux levs de J termine signal ( Ramsden et Gellert 1995 ; donnes MSS indit). Pour cette raison, nous avons utilis des extraits de la naissance du ftus thymocytes murins ou bovine (qui ne rorganiser Ig gnes) pour clivage in vitro au niveau du locus Ig. De plus, puisque notre raction en chane de polymrase (PCR) apprt n'amplifient pas bovin Ig ou TCR squences (donnes non prsentes), l'extrait de vache nous a permis d'analyser sans ambigut le clivage RSS tout le locus murin. Pour tester le systme, nous avons ragi noyaux de la RAG2 dficientes ligne cellulaire A-MuLV-transform pro-B de 63 12 ( Shinkai et al. 1992 ) avec 103 extrait nuclaire et rRAG1. Signal extrmits gnres par clivage in vitro la RSS d'accompagnement J H 2 ont t dtects l'aide de la ligature mdie par PCR (LMPCR) test schmatis dans la Figure 1 . ADN rcupr de chaque en raction clivage in vitro a t ligatur un franc, et non phosphoryles linker cassures de l'ADN ont t dtects par PCR avec une amorce de liaison spcifique et une paire de locus imbriques amorce spcifique ( Schlissel et al. 1993 ). Nous avons utilis l'amplification par PCR d'un locus gnomiques nonrearranging (CD14) pour confirmer que des quantits quivalentes d'ADN ont t recouvrs auprs de tous dans les ractions in vitro ( Schlissel et al. 1993 ).

Figure 1 :Schma du dosage LMPCR Utilis pour dtecter le signal se termine dans l'ADN gnomique Le locus des chanes lourdes d'Ig est montr avec des cases reprsentant des segments de gnes de codage et de triangles reprsentant CNR. Les positions des amorces PCR sont indiques par des flches; la position de la sonde d'hybridation blot est indique par une barre solide, et le linker BW est montr comme une paire asymtrique des lignes audacieuses. PCR niche utilisant l'amorce d'ancrage BW-1H et le locus amorce spcifique o et JHF2 sur l'ADN ligatur au lieur BW amplifier spcifiquement J H termine le signal 2. Le produit 224 pb est dtect par transfert de Southern et l'hybridation avec la sonde JHF4. RSS des pauses des loci d'Ig et TCR d'autres ont t dtects en utilisant des analyses analogues diffrents locus amorce spcifique et sondes.

Comme le montre la figure 2 A, nous avons dtect J H 2-brise associs RSS dans 63-12 ADN rcupr partir de ractions de clivage in vitro incubes 30 C, mais pas de ceux incubs sur la glace ( comparer voies 7 et 8). Spcifiques pauses RSS taient absents de ractions de contrle contenant chacune des composantes du systme autonome (pistes 1-3) ou manquent de composants individuels (voies 46). Le produit amplifi co-migr avec dj caractris J H termine signal 2 dans la moelle osseuse de souris et l'ADN de thymus (piste 10; Schlissel et al 1993. ). Par dosage des dilutions en srie de l'ADN rcupr de terminer dans les ractions de clivage in vitro, nous estimons que> 0,2% de l'entre J H 2 loci ont t clivs. En

comparaison, notre test dtecte les pauses LMPCR RSS ~ 2% de J H 2 loci dans l'ADN gnomique du thymus.

Figure 2 : Clivage in vitro de l'endogne J H 2 CNR dans les noyaux isols (A) Dtection de clivage in vitro J H 2 par LMPCR. Les noyaux prpars partir de la ligne RAG2 cellules dficientes pro-B 63-12 ont t incubes avec diffrentes combinaisons de rRAG1 et 103 extraits, soit sur la glace (0 C) ou 30 C comme indiqu ci-dessus de chaque voie. L'ADN rcupr dans les ractions in vitro a t ligatur au lieur BW et analyss des fins signal J H 2 en utilisant LMPCR comme indiqu dans la figure 1 . Un transfert de Southern de produits LMPCR hybrid avec la sonde spcifique de locus JHF4 est montr, avec le J H 2 produit final du signal indiqu par une flche. Des contrles ngatifs et positifs pour la raction de PCR ont t sans matrice d'ADN (piste 9) et linker-ligatur l'ADN gnomique murin thymus (voie 10). (B) amplification d'un locus de contrle nonrearranging (CD14) de l'ADN gnomique rcupr du ractions in vitro montr dans (A). Le produit spcifiquement amplifi a t dtecte par coloration au bromure d'thidium du gel d'agarose et est indiqu par une flche. (C) Dtection de clivage in vitro J H 2 par LMPCR. Les noyaux de la ligne de RAG1 cellules dficientes pro-B AH7 ont t incubes avec rRAG1 et soit 103 l'extraction ou l'extrait de thymus bovin (vache) sur la glace (0 C) ou 30 C comme indiqu ci-dessus de chaque voie. ADN rcupr a t dos pour J H 2 signaux se termine comme dcrit pour (A). L'astrisque indique que la prparation d'extrait ou de la protine a t chauffe 68 C pendant 15 min avant l'addition aux noyaux modle. PCR contrles inclus aucune matrice d'ADN (piste 8) et l'ADN gnomique linker-ligatur de la moelle osseuse de souris (voie 9) et du thymus (voie 10). (D) l'amplification de contrle d'ADN rcupr partir du ractions in vitro montr en (C). PCR a t ralise comme pour (B). Afin de s'assurer que les changements observs dans le clivage in vitro la J H RSS 2 n'tait pas propre aux noyaux modle utilis, nous avons test les noyaux de la RAG1 dficientes ligne cellulaire A-MuLV-transform pro-B AH7. Comme le montre la figure 2 C, clivage spcifique l'J H RSS 2 a t observe lors de l'incubation de AH7 noyaux avec 103 extraire et rRAG1 (piste 7). Fait intressant, rRAG1 seule n'tait pas suffisante pour restaurer l'activit de clivage pour la RAG1 - / - noyaux (piste 1). Cela indique qu'au moins quelques-uns des facteurs essentiels pour la reconnaissance et le clivage de la CNR au sein de la chromatine sont fournis par l'extrait ajout nuclaire, plutt que d'tre retenu dans les noyaux gabarit eux mmes. Par ailleurs, puisque nous avons constat que l'extrait nuclaire et rRAG1 reconnatre et cliver CNR flanquant segments de gnes Ig dans l'ADN gnomique purifi (voir ci-dessous), nous concluons que structure de la chromatine est permissive, mais pas ncessaire, pour cette activit in vitro.

Extrait nuclaire prpar partir de ftus de thymus bovin a galement t capable de gnrer J H 2 extrmits du signal dans les deux AH7 noyaux ( figure 2 C, piste 4) et 63 12 noyaux (donnes non prsentes). Ces rsultats dmontrent que les facteurs ncessaires pour la coupure J H 2 dans la chromatine cellulaire pro-B sont prsents dans les deux cellules pr-B et pr-cellules T et sont fonctionnellement conserve entre la souris et la vache.
Purifi rRAG1 et rRAG2 seuls ne suffisent pas pour le clivage de CNR au sein des modles complexes

Des tudes antrieures ont montr que rRAG1 et rRAG2 protines de base sont suffisantes pour clivage in vitro de la RSS substrats contenant un plasmide ou d'oligonuclotides ( McBlane et al. 1995 ). Afin de dterminer si les deux protines sont galement suffisantes pour le clivage de CNR endognes qui rsident dans la chromatine ou l'ADN gnomique, nous avons substitu l'extrait nuclaire et rRAG1 utiliss dans les tests in vitro avec des rRAG1 et rRAG2 protines du noyau copurified de baculovirus-cellules d'insectes infectes (R1 + R2) ( McBlane et al. 1995 ). Pour confirmer que les protines purifies ont t RRAG actif, nous avons test si la R1 + R2 prparation pourrait catalyser le clivage d'un RSS dans la pJH200 plasmide ( Hesse et al. 1987 ). En utilisant un test LMPCR de conception similaire ceux utiliss pour dtecter des ruptures dans l'ADN gnomique, nous avons constat que R1 + R2 a t au moins aussi efficace dans la mdiation de clivage RSS de la cible plasmidique que 103 d'extrait complt par rRAG1 ( figure 3 A, de comparer deux voies et 6). Toutefois, R1 + R2 a t incapable de catalyser le clivage au J H RSS 2 en 63-12 noyaux de cellules pro-B ( figure 3 B, ligne 6) ou dans l'ADN gnomique purifi (donnes non prsentes). Comme prvu, 103 extrait nuclaire complte par rRAG1 cliv J H 2 RSS dans 63 12 noyaux ( figure 3 B, piste 2), et l'extrait 103 a galement montr une faible activit de clivage sur ses propres ( figure 3 B, une ruelle 8). Cet extrait pourrait complter R1 + R2 pour J H 2 clivage RSS dans 63 12 noyaux ( figure 3 B, piste 4) et dans l'ADN gnomique (donnes non prsentes). Nous avons galement constat que les extraits nuclaires de thymus ftal bovin et de la transformation pro-B Haftl ligne cellulaire sont capables de complter R1 + R2 pour permettre le clivage RSS de modles nuclaires (donnes non prsentes). Un extrait de cellules HeLa nuclaires a chou pour complter R1 + R2 dans cet essai, mais un extrait de thymus appauvri RAG2 natif par un traitement d'anticorps tait toujours en mesure de complter R1 + R2 (donnes non prsentes). Ces rsultats suggrent qu'il existe des facteurs prsents dans l'extrait nuclaire lymphodes qui sont critiques pour l'activit recombinase sur le complexe de cibles gnomiques dans ces conditions. Nous sommes actuellement le fractionnement extrait nuclaire afin de dterminer si ces facteurs peuvent inclure toute la longueur RAG1 ou des facteurs autres accessoires.

Figure 3 : rRAG1 et rRAG2 protines du noyau ne sont pas suffisantes pour un clivage RSS des modles nuclaires (A) Dtection des pauses RSS gnrs in vitro sur un substrat de plasmide. Dans les ractions in vitro ont t effectues en utilisant comme modle pJH200 et diverses combinaisons de 103 extraits, purifis rRAG1 et copurified rRAG1 + rRAG2 comme indiqu plus haut chaque voie. Aprs incubation, l'ADN plasmidique a t rcupr, linker-ligaturs, et doss pour des pauses l'un des deux CNR contenue dans le plasmide en utilisant LMPCR. Le produit final signal est visible sur un bromure d'thidium-gel color et est indiqu par une flche. Toutes les voies contenait une quantit quivalente de l'ADN comme le montre l'amplification d'une rgion du plasmide qui n'est pas affecte par le clivage RSS (donnes non prsentes). (B) la dtection de J H 2 pauses RSS gnr in vitro dans des noyaux isols. Dans les ractions in vitro ont t ralises comme dcrit pour (A) sauf que 63 12 noyaux ont t utiliss comme modle pour le clivage.Produits de raction ont t analyss pour J H 2 signaux se termine comme schmatis dans la Figure 1 . Un transfert de Southern de produits LMPCR hybrid avec la sonde JHF4 est montr. Un contrle positif pour l'amplification de J H termine le signal 2 a t linker-ligatur l'ADN gnomique murin thymus (voie 11). (C) l'amplification de contrle d'ADN rcupr partir du ractions in vitro montr en (B). PCR a t ralise comme pour la Figure 2 B.
Clivage in vitro des modles nucloprotine Reflte la ligne-Spcificit de V (D) J

Alors que D--J rarrangement du locus IgH et TCR n'est pas limite aux cellules de la ligne correspondante, V--DJ rarrangement de ces loci, ainsi que rarrangement des loci d'Ig et TCR autre, est strictement ligne spcifique. Par exemple, des intermdiaires de recombinaison rompu non limite associe avec le locus de la chane lgre Ig sont prsents dans le dveloppement des cellules B, mais pas dans les cellules T (voir figure 4B, lignes 5 et 6). D'autre part, les pauses dans le locus TCR sont observs exclusivement dans les cellules T. Pour tester si structure de la chromatine au lignage spcifique joue un rle dterminant dans la capacit de la recombinase de discriminer entre les loci d'Ig et TCR, nous avons analys in vitro RSS clivage diffrents loci dans les noyaux des cellules B et T ligne ( figure 4 ). Nous avons constat que seul un sous-ensemble de loci tait accessible clivage in vitro dans chaque type de modle nuclaire et que le modle de l'accessibilit qui rcapitule observe in vivo. Lorsque AH7 noyaux de cellules pro-B ont t incubes avec l'extrait de thymus bovin et rRAG1, nous avons constat que le J H 2 RSS a t accessible clivage in vitro, mais le TCR D 2 RSS n'tait pas ( Figure 4 A). Toutefois, le TCR D deux locus a t cliv in vitro

lorsque l'ADN gnomique purifi a t fourni comme modle ( figure 4 C), ce qui suggre que la structure chromatinienne peut jouer un rle dans la prvention de rarrangement des gnes du TCR dans les lymphocytes B.

Figure 4 : La spcificit de la ligne V (D) J activit recombinase est conserve in vitro (A) Dans clivage in vitro de modles cellulaires pro-B nuclaire. Les noyaux de la ligne de RAG1 cellules dficientes pro-B AH7 ont t incubes avec du thymus bovin extraits nuclaires et rRAG1 0 C ou 30 C.Produits de raction ont t analyss pour les pauses au CNR d'accompagnement J H 2 (gel de haut) et D 2 (milieu du gel) ( Roth et al. 1993 ) de segments de gnes en utilisant des stratgies LMPCR analogue celui reprsent dans la figure 1 . Southern blots des produits LMPCR hybrids avec des sondes spcifiques de locus sont prsents, avec des flches indiquant le J H 2 et D 2 produits finaux de signal. Contrles d'rompu bout d'amplification sont pas de modle (piste 4), et la moelle osseuse linker-ligaturs (colonne 5) et du thymus (piste 6) d'ADN gnomique. Le contrle de l'amplification dans les produits de la raction in vitro et d'chantillons de contrle a t effectu (gel en bas) que pour la figure 2 B. (B) Dans clivage in vitro de modles cellulaires pro-T nuclaire. Dans les ractions in vitro ont t ralises comme pour (A) sauf que les noyaux de RAG1 dficientes thymocytes ont t utiliss comme modle pour le clivage. Produits de raction ont t analyss par LMPCR pour les pauses RSS D 2 (gel de haut) et J 1 (moyen de gel) des segments de gne. Contrle d'amplification de chaque chantillon est montr dans le gel bas. (C) Dans le clivage in vitro de l'ADN gnomique des modles purifis. Dans les ractions in vitro contenues extrait de thymus bovin, rRAG1, et 1,2 ug ADN gnomique purifi partir soit AH7 cellules (pistes 1 et 2) ou de type sauvage thymocytes murins (voies 3 et 4). Produits de raction ont t analyss par rcuprs LMPCR pour les pauses RSS D 2 (voies 1 et 2, le gel de haut) et J 1 (voies 3 et 4, le gel de haut). Contrle d'amplification de chaque chantillon est montr dans le gel bas. Nous avons ensuite analys in vitro RSS de clivage dans les noyaux des cellules pro-T prpars partir de RAG1 dficientes thymocytes. Dans ces noyaux, CNR dans le locus TCR taient accessibles aux clivage in vitro alors que ceux dans le locus Ig n'ont pas t ( figure 4 B). L'incapacit de la recombinase de cibler le lieu Ig tait spcifique la chromatine des cellules T puisque J 1 se termine le signal ont t gnrs in vitro en cellules pro-B ( un niveau bas, donnes non prsentes) et de cellules pr-B ( un induit niveau, voir ci-dessous) et dans les noyaux ADN gnomique purifi ( figure 4 C). Ces rsultats indiquent que l'accessibilit des lieux et des Ig TCR de la recombinase est mdie par un lment stable de la structure de la chromatine qui est dtermine au moins en partie, par la ligne cellulaire. En analysant in vitro RSS clivage diffrents loci, nous n'avons trouv aucune diffrence dans l'activit de pr-B et extraits cellulaires de cellules pr-T nuclaire (donnes non prsentes). Cette observation corrobore la conclusion que le clivage

rglements dans ce systme in vitro est dtermine par la nature du modle plutt que par une composante d'un extrait particulier.
Clivage in vitro des modles nucloprotine Reflte la rgulation temporelle de V (D) J

Ayant observ que in vitro RSS clivage reflte la ligne de la source du template, nous tions intresss savoir si les noyaux de cellules B diffrents stades de dveloppement serait montrent des diffrences dans leurs schmas d'accessibilit au lieu de clivage in vitro. Dans cette analyse, nous nous sommes concentrs sur le locus Ig depuis son rarrangement est temporellement rglements in vivo ( Blackwell et Alt 1989 ). Un systme modle pour tudier l'activation rglements du locus Ig est fournie par le lipopolysaccharide mitogne bactrien (LPS). Traitement des lignes de cellules pro-B avec le LPS active la fois la transcription des gnes germinale et V --J rarrangement ( Schlissel et Baltimore 1989 ). Nous avons analys l'effet du traitement sur le LPS clivage in vitro la J 1 RSS en utilisant des modles nuclaire prpar de 63 12 cellules cultives en prsence ou en absence de LPS. Comme le montre la figure 5 A, J une brise RSS ont t gnrs uniquement dans les modles de cellules traites avec du LPS (comparer les pistes 7 et 9). Dans certaines expriences, un faible niveau de clivage J 1 a t observe dans les modles partir des cellules qui n'ont pas t traites avec du LPS (donnes non prsentes), mais le clivage tait invariablement stimule (au moins 5 fois) par le LPS-traitement. Ce rsultat suggre que l'amlioration de l'accessibilit du locus Ig confre par le traitement LPS des cellules cultives est mdie par un changement stable en structure de la chromatine.

Figure 5 : L'accessibilit rglemente de J segments de gnes se traduit in vitro (A) Dtection de J 1 signal extrmits gnres in vitro. In vitro ractions de clivage ont t effectues sur les noyaux modle prpar de 63 12 cellules (C) ou de 63 12 cellules qui ont t cultives avec du LPS (L).Les noyaux ont t incubes avec rRAG1 et murines extrait de thymus, comme indiqu ci-dessus de chaque voie. Produits de raction ont t analyss par LMPCR pour les pauses RSS associ J 1. Le produit final est signal spcifique indiqu par une flche. Contrles compos de tampon seulement (voie 10), 63-12 ADN gnomique (voie 11), et induit 103-bcl2 / 4 ADN gnomique (voie 12) ont t ligatures linkeret amplifi en parallle. L'amplification de contrle (B) des produits en raction in vitro. PCR a t ralise comme pour la Figure 2 B. In vivo, command Ig gne rarrangement est pens pour rsulter de l'activation du locus Ig par un signal partir du produit d'un gne IgH totalement rarrangs, la protine (revu dans Schatz et al. 1992 ). Pour tester si l'expression de la protine affecte l'accessibilit de J 1, nous avons analys clivage in vitro de la J RSS 1

dans les noyaux des cellules B de souris dficientes en RAG1 ou RAG1 souris dficientes en portant un transgne rarrang chane lourde ( et Spanopoulou al. 1994 ). Comme le montrent dans la Figure 6 Un dveloppement des cellules B dans les souris dficientes en RAG est arrt la pro-B (CD19 + , CD43 + , . Krop et al 1996 ) stade ( [18] et [36] ). Elevage d'un transgne fonctionnellement rarrang chane lourde sur le RAG - / - rsultat de base dans la progression des cellules B la cellule pr-B (CD19 + , CD43 - ) le stade de dveloppement ( Figure 6 B) ( [37] et [45 ] ), quel point rarrangement des gnes Ig est normalement active. Modle noyaux ont t prpars partir des cellules B purifies partir de moelle osseuse l'aide biotinyl anticorps anti-CD19 ( Krop et al. 1996 ) et des billes de streptavidine paramagntiques. Les noyaux ont galement t prpars partir de la piscine nonselected de cellules (CD19 - ). qui a consist essentiellement de granulocytes et de macrophages (donnes non prsentes) Figure 6 C et la figure 6 D montrent la puret de l'positivement et ngativement les cellules slectionnes dans chaque contexte. In vitro ractions de clivage contenue soit 103 extraire ou extraire des thymocytes et murin rRAG1. ADN rcupr partir des ractions a t analyse par LMPCR pour le signal de fin associ J H 2 ou J 1, respectivement ( figure 6 E). Comme vu prcdemment avec les 63-12 et AH7 noyaux, les deux RAG-dficient et RAG-noyaux dficients transgniques ont t substrats pour clivage in vitro J H 2 ( figure 6 E, les voies 9 et 11). Toutefois, le signal se termine associ J 1 ne pouvait tre dtect dans les noyaux de cellules dficientes RAG transgniques ( Figure 6 E, comparer voies 25 et 27). Analyses ont montr que la dilution modle in vitro de clivage J RSS 1 a t amliore d'au moins 30 fois en RAG noyaux dficients transgniques surexprimant RAG noyaux dficients (donnes non prsentes). Par consquent, nous concluons que l'expression des protines a un effet direct sur le locus Ig, rsultant en une altration de la structure de la chromatine, qui permet la reconnaissance par la recombinase V(D)J.

Figure 6 : Un rarrang chane lourde Transgene Modifie Ig Locus structure pour permettre J 1 RSS clivage in vitro (A et B) par cytomtrie de flux non fractionne cellules de moelle osseuse partir RAG1 dficientes (A) ou RAG1 dficientes transgniques (B) des souris colores par anti-CD19 et anti-CD43 anticorps. Analyse en flux (C et D) en cytomtrie de fractionnement des cellules de moelle osseuse provenant RAG1 dficientes (C) ou RAG1 dficientes transgniques (D) chez la souris. Cellules de moelle osseuse ont t colores avec biotinyl anticorps anti-CD19 et spars en utilisant des billes paramagntiques recouvertes de streptavidine en deux fractions, une enrichi cellules B (CD19 + ) et une fraction appauvrie cellules B (CD19 - ) fraction. La puret des deux fractions a t value

par la recoloration des anticorps anti-CD19. Expression de la CD19 positive (lourd traage) et ngatif (la lumire de traage) des cellules slectionnes est affiche. (E) En clivage in vitro des modles nuclaires. Ractions de clivage contenue noyaux de cellules B purifies partir de RAG1 dficientes (r) ou RAG1 dficientes transgniques (rx) de moelle osseuse ou de cellules non-B purifie partir de RAG1 dficientes moelle osseuse transgniques (depl.). Les noyaux ont t incubes avec rRAG1 et soit 103 extrait (chantillons 1-13) ou de l'extrait thymocytes murins (chantillons 17-29).Produits de raction ont t analyss par LMPCR pour le signal de fin associ J H 2 (gel de haut) ou J 1 (gel de fond). Southern blots des produits LMPCR hybrides avec soit J H (haut) ou J (en bas) le locus des sondes spcifiques sont indiques. ADN contrle positif se composait de linker-ligatur l'ADN de thymus murins pour J H pauses RSS 2 (voie 16) et linker-ligatur l'ADN murin de moelle osseuse pour J une casse (voie 32). Des contrles ngatifs ne comprenait pas la matrice d'ADN (voies 14 et 30) et linker-ligatur 63-12 ADN gnomique (voies 15 et 31). Contrle d'amplification (F) de la raction in vitro dans les produits analyss dans (E) des fins RSS casse (une partie seulement des chantillons est reprsente). PCR a t ralise comme pour la Figure 2 B. Ni J H 2 ni J 1 se termine signal ont t gnrs in vitro lorsque les noyaux de modle ont t prpars partir de cellules non lymphodes primaires (les nonslectionns, CD19 - fraction de RAG-dficient de moelle osseuse transgniques; Figure 6 E, les voies 13 et 29). De mme, les noyaux d'une ligne cellulaire mastocytome, P815, ne sont pas des substrats pour clivage in vitro, soit au IgH ou loci Ig (donnes non prsentes).Nous concluons de ces expriences que dans les cellules non lymphodes, les gnes d'Ig existent dans une structure de la chromatine qui est inaccessible la recombinase V (D) J. Ceci est cohrent avec les observations que les cellules non lymphodes transfectes avec RAG1 et RAG2 d'assemblage d'expression rorganiser substrats artificiels recombinaison, mais ne pas rorganiser leurs loci endognes Ig et TCR ( Schatz et al. 1992 ). Par consquent, l'expression de RAG1 et RAG2 est susceptible d'tre seulement une partie du mcanisme par lequel V (D) J est activ dans les prcurseurs lymphodes. Altrations spcifiques dans la structure de la chromatine semblent tre ncessaires aussi bien.
Structure de la chromatine joue un rle dans l'exclusion alllique

V (D) J rarrangement est rglement de telle sorte que l'individu B une cellule exprime une seule chane fonctionnelle lourde et une chane lgre fonctionnelle, un phnomne connu sous le nom d'exclusion alllique ( Pernis et al. 1965 ). Alors que l'exclusion de la chane lgre alllique pourrait s'expliquer par l'inactivation de la recombinase, l'exclusion alllique des chanes lourdes ne peuvent pas, car les cellules subissant V --J rarrangement souvent (50% -90% du

temps; [1] et [10] ) contiennent non rarrang V H et partiellement ramnag DJ H segments de gne. Reciblage de la recombinase telle qu'elle ignore l'allle IgH seconde dans des cellules avec un allle IgH rarrangs fonctionnellement dpend l'expression en surface de la protine ( Kitamura et Rajewsky 1992 ). Pour rpondre au mcanisme de l'exclusion alllique des chanes lourdes, nous avons utilis LMPCR pour dterminer l'effet de l'expression gnique IgH sur V H et DJ H RSS clivage in vivo ( figure 7 A). Nous avons purifi les cellules B de la moelle osseuse de type sauvage et chane lourde transgnique ( Nussenzweig et al. 1987 ) bass sur des souris CD19 expression tel que dcrit ci-dessus. L'ADN gnomique de ces cellules a t dos pour le signal de fin associ au segment DFL16.1 gnes et de segments de gnes de la V H 558 familles. Nous avons choisi d'analyser DFL16.1 comme un modle D H segment de gne, car il est frquemment utilise in vivo, apparaissant dans ~ 50% du DJ H rarrangements dans le foie ftal ( Chang et al. 1992 ) et en A-MuLV-transform de pr- lignes de cellules B ( Reth et al. 1986 ). Nous nous sommes concentrs sur le V H 558 familles, car il comporte environ 50% de la murins V H rpertoire. Puisque D H J H rarrangement se produit presque exclusivement par la suppression, des pauses 5 'de D H RSS, ainsi que des pauses V H CNR, sont rvlateurs de V H -DJ H rarrangement. Comme le montre la figure 7 A, des pauses 5 'de D H RSS ont t considrablement rduits dans l'ADN transgnique par rapport ADN de type sauvage (~ 25-30 fois comme dtermin par dilution modle; donnes non prsentes). Pauses au CNR d'accompagnement V H segments de gne ne pouvait tre dtecte dans l'ADN de type sauvage. Ainsi, l'exclusion alllique dans le modle transgniques est associe une diminution de clivage la fois 5 'de D H et V H CNR .

Figure 7 : Dcollet RSS dans des cellules prsentant lourds exclusion alllique de la chane (A) In vivo gnr termine RSS cass. ADN gnomique Linker-ligatur a t prpar partir de moelle osseuse fractionns de type sauvage (WT) et chane lourde transgnique (tg) souris. Cellules de moelle osseuse ont t spars selon CD19 expression dans une cellule B-enrichi piscine (WT B, tg B) et une cellule B appauvri piscine (WT non-B, tg non-B). L'ADN linker-ligatur a t dos pour un locus de contrle nonrearranging (flche tiquete C, le gel de haut), et pour les flux RSS des pauses en amont de DFL16.1 (5 'D H , au milieu de gel) et en aval de V H 558 (V H , en bas gel) des segments de gne. 5 'de D H et V H pauses RSS ont t dtects en utilisant des analyses LMPCR qui sont conceptuellement identique celle montre dans la Figure 1 . Plus prcisment amplifi produits finaux du signal sont indiqus par des flches. La faiblesse de 5 'de D H signal de fin rompu vu dans la bande 2 est probablement d la contamination des cellules B (~ 5%) dans les cellules B appauvri la population. PCR contrles inclus aucune matrice d'ADN (piste 5), et linker-ligatur l'ADN murin de moelle osseuse (piste 6) ou d'ADN de thymus (piste 7). (B) Dans clivage in vitro au CNR d'accompagnement V H 558 et DFL16.1 segments de gnes dans les noyaux des cellules B matures et immatures. Noyaux d'AH7 cellules pro-B (pro) ou partir IgD + splnocytes (IgD +) ont t utiliss comme modles pour clivage in vitro par l'extrait de thymus bovin et rRAG1. Dans les produits de raction ont t analyss in vitro pour les pauses en amont de DFL16.1 (5 'D H , gel du haut) ou en aval de V H 558 (V H , gel en bas) en utilisant des segments de gnes LMPCR. Les contrles comprennent pas la matrice d'ADN (piste 8), et linker-ligatur l'ADN gnomique de la moelle osseuse de souris (voie 9) ou du thymus (voie 10). Les chantillons 2-7 contiennent des quantits quivalentes d'ADN comme indiqu par l'amplification d'un locus de contrle (donnes non prsentes). (C) Dans clivage in vitro de V H 558 CNR dans l'ADN gnomique purifi. L'ADN gnomique de AH7 cellules pro-B (voies 1 et 2) ou des splnocytes matures (voies 3 et 4) a t incub avec l'extrait de thymus bovin et rRAG1 0 C ou 30 C. Produits de raction ont t analyss pour les pauses RSS V H 558 segments de gnes que pour (A) et (B). Les contrles comprennent pas la matrice d'ADN (piste 5) et le linker-ligatur l'ADN gnomique murin de la moelle osseuse (piste 6). Amplification d'un locus de contrle a montr que les chantillons contiennent des quantits quivalentes 1-4 de l'ADN (donnes non prsentes). Pour dterminer si structure de la chromatine joue un rle dans le clivage de la CNR rglement flanquant DJ H et V H gnes, nous avons analys ces vnements clivage in vitro ( figure 7 B). Substrats nuclaires ont t prpars partir de la ligne cellulaire pro-B AH7 ou partir de cellules B purifies partir de la rate de souris base sur l'expression de surface de l'IgD, un marqueur de maturit des

cellules B. Nous avons utilis IgD +cellules dans ces expriences, puisque la structure de leurs allles IgH ressemble celle des cellules en voie d'exclusion alllique des chanes lourdes, mais elles n'expriment plus RAG1 et RAG2 et n'ont donc pas prexistante pauses RSS. Alors que 5 'de D H CNR taient accessibles aux clivage in vitro dans les deux noyaux de cellules pro-B et IgD + noyaux des cellules B ( figure 7 B, le gel de haut, lignes 4 et 7), CNR flanquant VH segments de gne taient seulement clive modles de cellules pro-B (gel en bas, comparez les pistes 4 et 7). Le manque d'dtectable clivage in vitro V H CNR dans les IgD + noyaux pourrait simplement tre d un manque de substrat dans les cellules de ce stade de dveloppement, car ils contiennent moins non rarrang V H segments de gnes que les cellules pro-B. Toutefois, lorsque l'ADN gnomique purifi partir des cellules B matures pro et a t utilis comme modle pour clivage in vitro, nous avons constat que V H CNR ont t soumis un clivage dans les deux types d'ADN ( figure 7 C). Par consquent, la quantit de disponibles V H CNR n'est pas ce que les limites clivage in vitro ces squences dans IgD + noyaux de cellules B. Ces rsultats suggrent que la maturation des cellules B est accompagn par une altration de la structure de la chromatine qui se traduit par l'inaccessibilit slective de V H segments de gne. Discussion Les expriences prsentes dmontrent in vitro de V (D) J activit recombinase sur des substrats physiologiquement pertinents: des segments de gnes endognes dans les noyaux intacts. Des extraits nuclaires partir de sources avec des niveaux levs de RAG l'expression des gnes en protines complts par rRAG1 de base ont t capables de catalyser le clivage prcis de substrats nuclaires. Cette approche nous a permis d'aborder les questions de rgulation du dveloppement qui ne peuvent pas tre traites par des systmes in vitro qui utilisent des substrats artificiels recombinaison. Comme discut ci-dessous, nous avons constat que l'activit recombinase sur des cibles nucloprotine est fondamentalement diffrent de son activit sur cibles ADN purifis de faible complexit. Montants de recombinaison RAG1 et RAG2 protines essentielles qui sont adquats pour le clivage de substrats artificiels ne peut catalyser le clivage du CNR au sein de la chromatine ou l'ADN gnomique, ce qui suggre que des facteurs additionnels peuvent tre requis. Par ailleurs, au sein de la chromatine CNR sont diffrentiellement accessibles un clivage selon la ligne et le stade de dveloppement de la source de la chromatine.
Le rle de l'extrait nuclaire de clivage RSS de nucloprotine substrats in vitro

Alors que l'extrait nuclaire ne dtermine pas le rglements ciblant de la recombinase dans ces expriences in vitro (voir ci-dessus), il ne fournit cependant une activit qui est essentiel pour la reconnaissance et le clivage de la CNR au sein de l'ADN gnomique et de la chromatine. Nous avons constat que purifie recombinante RAG1 et RAG2 domaines de base, tout suffisant pour le clivage du

CNR sur des substrats artificiels ( McBlane et al 1995. ; voir ci-dessus), ne peut pas cliver CNR au sein de l'ADN gnomique purifi ou de noyaux intacts. Extraits nuclaires de cellules lymphodes complt les protines recombinantes pour permettre le clivage de ces cibles complexes, ce qui suggre que l'initiation de la recombinaison V (D) J in vivo peut exiger des facteurs en plus des protines RAG base. Ces facteurs pourraient tre impliqus dans l'augmentation de la spcificit de reconnaissance ou de RSS dans la stabilisation d'un complexe protine ou protineADN interaction qui est important pour l'activit recombinase. Ces facteurs pourraient tre cruciale pour le clivage de segments de gnes endognes dans l'ADN gnomique ou de la chromatine, mais pas ncessaire pour le clivage de substrats plasmidique in vitro ou in vivo, les situations dans lesquelles la complexit et la concentration de la cible sont trs diffrents. Il est possible que ces facteurs pourraient inclure RAG1 natif ou RAG2. Toutefois, le thymus d'extrait appauvri RAG2 natif par un traitement d'anticorps a conserv sa capacit complter et noyau rRAG1 rRAG2 (donnes non prsentes), et extraits actifs dans le nuclaire RSS de clivage ont t fortement stimul par le noyau rRAG1 ( Figure 2 et Figure 3 ). En fractionnant actifs extraits nuclaires, il devrait tre possible d'identifier les facteurs qui sont ncessaires pour complter et rRAG1 rRAG2 domaines de base de clivage efficace du CNR endogne.
Le rle de la structure de la chromatine dans l'tape-Spcificit du dveloppement de V (D) J

Grce des comparaisons de l'activit in vitro sur des modles clivage RSS nuclaires de cellules B de divers stades de dveloppement, nous avons tudi le rle de structure de la chromatine dans le modle rglement d'activation et d'inactivation le locus qui caractrise le dveloppement des cellules B. Nous montrons que des modles partir des cellules qui ont atteint le stade de cellules pr-B de dveloppement par l'expression d'un transgne chane lourde rarrang montrent un clivage renforce J segments de gnes in vitro. In vivo, les effets concidents d'expression chane lourde sur la transcription gnique germinale du locus Ig et son rarrangement suggrent que la protine fournit un signal que les rsultats en matire d'accessibilit modifi du locus ( [26] et [33] ). En analysant les noyaux isols in vitro, nous avons directement montr que le signal envoy par la protine a un effet spcifique sur la structure du locus Ig qui amliore son accessibilit la recombinase. Nous concluons que la protine active rarrangement des gnes Ig en affectant directement le locus Ig de manire cellulaire autonome plutt que par la promotion de la prolifration des cellules prB au sein d'une population htrogne. Dans les cellules subissant l'exclusion alllique des chanes lourdes, comme model par les cellules B transgniques , V H --DJ H rarrangement est spcifiquement supprime ( [41] et [20] ). Ceci est accompagn par une transcription diminu grce la ligne germinale V H locus (mais pas le DJ H locus) et une diminution des niveaux de pauses RSS associ avec DJ H allles ( Schlissel et Morrow

1994 ). Nous avons montr que la rgulation ngative de V H --DJ H rarrangement des cellules B transgniques est associ un chec de la recombinase de cibler CNR flanquant deux V H segments de gnes et DJ H gnes. Les niveaux rduits de V H et 5 'de DH pauses dans les cellules B transgniques par rapport aux cellules B de type sauvage ne peut pas tre attribue des niveaux infrieurs de l'activit recombinase dans les cellules transgniques, car les cellules des deux milieux ont des niveaux quivalents de J H pauses (donnes non prsentes). Par ailleurs, la rduction de ces ruptures n'est pas due un manque de substrat dans les cellules transgniques car elles contiennent au moins autant de DJ H allles que les cellules de type sauvage ( Schlissel et Morrow 1994 ; donnes non prsentes). Analyse de clivage in vitro de V H et DJ H gnes montre que l'accessibilit de V H segments de gnes est rgule par le dveloppement. Dans les noyaux partir matures IgD + cellules B, CNR flanquant V H segments de gnes ne sont pas clivs lors recombinase a t fourni. Toutefois, le V H locus a t sensible aux clivage in vitro lorsque le substrat compos de deux noyaux de cellules pro-B intacte ou purifie d'ADN gnomique de cellules B pro-ou mature. Par consquent, l'accessibilit de V H CNR au sein des noyaux d'clivage in vitro est dtermine par la maturit des cellules que les noyaux sont isols. Ceci suggre qu'une modification rguls par le dveloppement dans la structure de la chromatine au V H locus pourrait jouer un rle dans l'exclusion alllique de la chane lourde. Depuis le clivage d'une paire entretoise 12 pb RSS et une entretoise 23 pb RSS semble tre ncessaire in vivo ( Roth et al. 1992a ), l'inaccessibilit de V H CNR pourrait entraner la suppression de clivage observ la fois V H et DJ H gnique segments. Tout en restant V H segments de gne dans les IgD + noyaux ne sont pas accessibles in vitro RSS clivage, allles Ig non rarrang ont t (donnes non prsentes). La constatation selon laquelle ajout recombinase peut accder et cliver J CNR de maturit chromatine des lymphocytes B suggre que la cessation de la recombinaison in vivo Ig est principalement due l'inactivation de RAG1 et RAG2 plutt que d'une altration de la structure de la chromatine. Ceci est cohrent avec la possibilit d'diter des rcepteurs dans les cellules B matures qui ont ractiv RAG expression des gnes ( [9] et [38] ). Surtout, la ractivation de RAG l'expression du gne dans les lymphocytes matures pourrait galement conduire des vnements impliquant un rarrangement aberrante locus Ig ou TCR et proto-oncogne loci ( Korsmeyer 1992 ).
Clivage in vitro de la CNR endogne Fournit une analyse directe de l'accessibilit Locus

Nos rsultats confirment le rle de l'accessibilit locus en ciblant rarrangement des gnes qui a t suggr par plusieurs tudes antrieures corrlatifs. La plupart de ces tudes se sont appuys sur la transcription dans le voisinage d'un locus comme une dfinition de l'accessibilit (revu dans Schatz et al. 1992 ). Ici nous mesurer directement l'accessibilit en termes de reconnaissance et de clivage RSS. Depuis

transcription active ne se produit pas sur les substrats utiliss dans ce systme in vitro (PNT ne sont pas fournis), nous concluons que l'accessibilit rglemente n'est pas dtermine par l'acte de transcription, mais par un lment stable de la structure de la chromatine. Cette structure semble tre dpendant la fois la ligne et le stade de dveloppement de la cellule. Bien que la corrlation entre la transcription et l'activation de V (D) J a t taye de faon convaincante, il existe des mcanismes potentiels de la rglementation de l'accessibilit locus qui ne reposent pas ncessairement sur la transcription. Dans un modle simpliste, emballs dans des loci chromatine sont gnralement inaccessibles pour l'interaction avec les protines ( Workman et Buchman 1993 ). Dans certains types de cellules, la chromatine environnante segments de gne particulire pourrait tre remodele la suite de la transcription ou un autre mcanisme pour permettre l'accs sans rapport avec la recombinase. Il est galement possible que la composition de la chromatine des loci de certains objectifs activement rarrangement des gnes. Facteurs troitement lis pourraient recruter la recombinase travers interactions protine-protine ou en prsentant le RSS dans une structure de la chromatine modifis. De cette faon, des lments activateurs transcriptionnels pourrait servir un second rle et spare comme amliorateurs de recombinaison ( Fernex et al. 1995 ).Alternativement, les facteurs spcifiques associs un locus pourrait agir de faon ngative pour empcher l'accs recombinase ( Hiramatsu et al. 1995 ). L'approche que nous avons dcrit fournit un test direct pour l'accessibilit locus et devrait nous permettre de dfinir les caractristiques de la chromatine ncessaire pour l'activit rgule V (D) J recombinase. Procdures exprimentales
lments du systme de clivage in vitro Dans

Des extraits nuclaires sont prpars comme dcrit ( Parker et Topol 1984 ) et stockes en aliquots -80 C. L'extrait 103 est prpar partir de 1 litre 103-bcl2 / 4 cellules (un cadeau de N. Rosenberg) qui avait t cultiv la temprature non permissive (39 C) pendant 10 heures pour induire RAG l'expression des gnes et de l'activit recombinase ( Chen et al . 1994 ). Les cellules ont t maintenues 33 C, 5% de CO 2 dans du RPMI 1640 supplment avec 10% srum de veau foetal, 20 mM de glutamine, 500 UI / ml de pnicilline, 500 pg / ml de streptomycine, 50 uM -mercaptothanol, et 0,5 mg / ml de G418. La concentration en protines de l'extrait tait d'environ 1 103 pg / pl (MicroBCA dosage, Pierce). L'extrait de thymus bovin a t prpar partir de tiers trimestre de thymus de veau ftal (Antech). La concentration en protines de l'extrait bovin tait d'environ 1 pg / pl. L'extrait de thymus murins a t prpar partir de souris de 10 jours, g de type sauvage et avait une concentration de protine de ~ 250 ng / ul.

Substrats nuclaires ont t prpares comme dcrit ( Parker et Topol 1984 ) et se sont avrs tre intacte par microscopie. Les noyaux ont t remises en suspension une concentration finale de 50 000 / ul dans 20 mM HEPES (pH 7,6), 2 mM MgCl 2 , 70 mM de KCl, 0,1 mM d'EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mM de fluorure de phnylmthylsulfonyle, glycrol 25% et congels en aliquots -80 C. Sources des noyaux inclus l'A-MuLV-lignes cellulaires transformes 63-12 (driv de RAG2 souris dficientes, un cadeau de FW Alt) et AH7 (driv de RAG1 souris dficientes, un cadeau de C. romaine et D. Baltimore) , la ligne de mastocytome murin P815 cellulaire (un cadeau de A. et D. Huang Pardoll), et les cellules murines primaires soit de la moelle osseuse fractionne ou de la rate (voir cidessous) ou le thymus. Pour les noyaux prpars partir de LPS-traits de 63 12 cellules, les cellules ont t cultives pendant 12 heures 10 pg / ml de LPS (Difco) avant la rcolte. Purifi substrats ADN gnomique ont t prpars en utilisant soit des mthodes standard ( Ausubel et al. 1987 ) ou un kit Puregene (Gentra). Le substrat plasmidique pJH200 ( Hesse et al. 1987 ) a t prpar en utilisant un kit Qiagen. Protines RAG recombinantes ont t purifies essentiellement comme dcrit ( van Gent et al 1995. ) partir des cellules d'insectes infectes par baculovirus recombinants AcD23 et AcD25 (cadeaux de D. van Gent et M. Gellert) qui expriment les domaines fondamentaux de RAG1 (acides amins 384 - 1008) et RAG2 (acides amins 1 387), respectivement. La puret et la concentration de chaque prparation de protine a t estime partir de Coomassie teint gels SDSPAGE.
Dans les ractions de clivage in vitro et analyse LMPCR

Les ractions ont t effectues dans un volume de 20 ul avec 100.000 noyaux ou la quantit indique d'ADN gnomique ou plasmidique comme modle. Ractions contenues ~ 0,6 pg rRAG1 et extraire ~ 2 mg nuclaire.Les conditions de raction (y compris tous les composants) ont t: 40 mM HEPES (pH 7,6), 2,5 mM de TrisCl (pH 8,0), 110 mM de KCl, 1 mM MnCl2, 2,5 mM DTT, 0,2 mM MgCl 2 , 0,05 mM de fluorure de phnylmthylsulfonyle, 0,025 mM EDTA, du glycrol 7% (v / v). Ractions de clivage l'aide copurified rRAG1 et rRAG2 (R1 + R2) contenait 0,9 mg ~ + R1 R2. Les ractions ont t incubes pendant 30 min sur la glace suivi par 60 minutes, soit sur la glace ou 30 C. Acides nucliques a t rcupr dans les ractions de clivage in vitro comme dcrit ( van Gent et al. 1995 ) et ligatur ( Schlissel et al. 1993 ) 20 pmol BW linker (Mueller et Wold 1989 ). Contrle ADN ligatur dans l'ADN gnomique parallles gnralement inclus partir du type sauvage de moelle osseuse de souris et le thymus et de 63 12, AH-7, et les lignes 103-bcl2 / 4 cellules. Aprs la ligature, un volume gal de tampon de lysePCR (10 mM Tris-HCl [pH 8,3], KCl 50 mM, 0,45% de NP-40, 0,45% Tween-20) a t ajout et les chantillons ont t dnaturs 95 C pendant 15 min.Typiquement, 1 / 12 de chaque chantillon a t analys dans chaque raction PCR.

Nich amplification par PCR des extrmits casses dans l'ADN gnomique a t ralise en utilisant l'amorce d'ancrage BW-1H et une paire de locus amorce spcifique essentiellement comme dcrit ( Schlissel et al. 1993). Les produits de PCR ont t effectues sur un gel d'agarose, transfrs sur une membrane de nylon (Zetabind), et hybrid avec un locus oligonuclotidiques spcifiques tiers. Les squences du locus-spcifiques amorce de PCR et les sondes ont t tires de squences publies Ig et TCR et seront fournis sur demande. Les images ont t gnres en utilisant une phosphorimager (Molecular Dynamics) et quantifis l'aide du logiciel ImageQuant (version 4.1). L'identit des produits de signal de fin LMPCR a t confirm soit par squenage ( Schlissel et al. 1993 ) ou par la sensibilit des enzymes de restriction ( van Gent et al. 1995 ), comme dcrit.Les quantits relatives des extrmits d'ADN casses spcifiques dans diffrents chantillons ont t estimes par dilution en srie linker-ligatur l'ADN et la dtermination de la dilution laquelle les signaux d'hybridation identiques ont t obtenus. Toutes les expriences ont t rptes au moins trois fois gnrer des rsultats sensiblement identiques. Extrmits casses gnrs par clivage l'entretoise 12 pb RSS des pJH200 ( Hesse et al. 1987 ) ont t amplifis en utilisant un seul tour de PCR (27 cycles) avec un apprt BW-1H et oJH200-3 (5'-AACAATTTCACACAGGAAACAGC-3 ') . L'identit de la fin du signal a t confirm par deux mthodes: l'une, comigration avec un produit fini bris gnrs par la digestion des enzymes de restriction du plasmide sur un site correspondant au segment de codage / frontire RSS, et deux, l'hybridation avec un oligonuclotide interne, oJH200-4 (5'-GGGCTGCAGG TCGACGGATCCGCGCTAAGG-3 '). PCR avec une paire d'apprt qui amplifient des squences plasmidiques affect par clivage RSS a t utilis pour confirmer que des quantits quivalentes d'ADN plasmidique ont t rcuprs dans toutes les ractions in vitro.
Purification de cellules primaires

RAG-dficient thymocytes: thymocytes ont t prpars partir de mois RAG1 souris dficientes ( Spanopoulou et al, 1994. ). Thymus ont t dissqus dans du PBS, perturb par cisaillement entre des lames de microscope dpolies, et filtre travers maille de nylon. CD19 + B cellules: les cellules B ont t purifis partir de la moelle osseuse de RAG1 dficientes, RAG1 dficientes chane lourde transgniques ( . Spanopoulou et al, 1994 ), de type sauvage, et transgniques ( . Nussenzweig et al 1987 souris) en utilisant biotinyl monoclonal anti-CD19 et de billes paramagntiques streptavidine (MiniMACS systme, Milltenyi Biotech; SLA et MSS, donnes indites). La puret des populations slectionnes a t value par cytomtrie en flux aprs recoloration des cellules avec des anticorps anti-CD19 suivie par un anticorps secondaire conjugu la phycorythrine. Fractions enrichies

de lymphocytes B ont t> 90% CD19 + et les fractions ont t puiss <10% CD19 + . IgD + cellules B: matures IgD + cellules B ont t purifis partir de rate de souris de type sauvage en utilisant monoclonal biotinyl anti-IgD anticorps et des billes paramagntiques streptavidine comme dcrit ci-dessus. La piscine de la slection positive des cellules B splniques tait typiquement> 95% IgD + . Remerciements Nous remercions le Dr Fred Alt pour la ligne 63 12 cellules, les Drs. Chris Romain et David Baltimore pour la ligne AH7 cellulaire, les Drs. Dik van Gent et Martin Gellert des baculovirus recombinants exprimant RAG1 et RAG2 domaines de base, le Dr Eugenia Spanopoulou pour RAG1 souris dficientes, et le Dr Phil Leder pour les souris transgniques . Le manuscrit a t amlior par les commentaires utiles des Drs. Jef Boeke et Drew Pardoll et divers membres du laboratoire de Schlissel. MSS reconnat le soutien d'une bourse de la Fondation Culpeper et une bourse de chercheur recherche sur le cancer. PS a t soutenue par le NIH RO1 AI22833, comme ce fut soutenu par les NIH RO1 HL48702, KH a t soutenu en partie par T32-AI07247, et ca a t soutenue par le Programme de formation scientifique mdicale.