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Por Richard J. Robers Publicado en PNAS el 26 de abril de 2005 en el n17 vol 192 paginas 59055908 Las enzimas de restriccin han demostrado se invaluables en el mapeo fsico del DNA. Ellas ofrecen oportunidades sin igual para diagnosticar el contenido de la secuandcia de DNA y son usadas en campo tan dispares como la forencia criminal y la investigacin bsica. De hecho, sin las enzimas de restriccin, la industria de la biotecnologa no podra haber prosperado como lo ha hecho. Los primeros experimentos que demostraban la utilidad de las enzimas de restriccin fueron llevados a cabo por Danna y Nathans y publicados en 1971. Este estudio pionero sento las bases para las practicas modernas de la biologa molecular en las que las enzimas de restriccin son herramientas siempre presentes, aunque generalmente se presuponen all. Hoy en da, es difcil imaginar un momento en que nuestros congeladores de laboratorio no estaban bien abastecidos con enzimas de restriccin, cuando la secuenciacin del ADN no era posible, o cuando los genes slo eran accesibles a los genetistas y no podian ser simplemente clonados por tecnologa de ADN recombinante. Sin embargo, en diciembre de 1971, apareci un paper clave en PNAS que conforman el escenario de gran parte de lo que ahora es de rutina (1). En ese documento, Kathleen Danna y Daniel Nathans de la Universidad Johns Hopkins (Baltimore) mostraron por primera vez que la enzima de restriccin denominada endonucleasa R descubierta por Hamilton Smith y Kent Wilcox (2), se podra utilizar para producir en concreto fragmentos de ADN del virus de simio 40 (SV40). Adems, los autores muestran que estos fragmentos pueden ser muy bien separados unos de otros por una electroforesis en gel de poliacrilamida. La imagen resultante (Fig. 1) proporcion un ejemplo visual inmediato de lo poderosa que la combinacin de endonucleasas de restriccin y electroforesis en gel sera. A principios de ese ao, tuve la suerte de escuchar a un seminario dado por Nathan en la Facultad de Medicina de Harvard (Boston) y de inmediato comenz a pensar en las posibilidades. Era un momento en mi vida cuando me di cuenta de que mi plan medio-formado para la investigacin futura se redujo y un nuevo camino se abrio. Fue debido a esta presentacin que he desarrollado mi propia pasin por endonucleasas de restriccin. Mirando hacia atrs en el paper de Nathan Danna hoy en da, uno se sorprende por la sencillez y la elegancia de los experimentos. Al igual que con todos los grandes trabajos pioneros, se puede decir,''Pero cmo obvio!''Sin embargo, en ese momento, Smith, que haba descubierto y caracterizado endonucleasa R, no haba reconocido inmediatamente el valor de una enzima que puede romper el ADN en particular. Nathan fue quien hizo el salto intuitivo clave y, a continuacin, pas a demostrar no slo que los fragmentos resultantes podran utilizarse para producir un mapa fsico de SV40 (3), sino tambin que este mapa fsico permite la asignacin del origen de replicacin
( 4) y la ubicacin de SV40 genes (5). Estos son estudios pioneros para establecer las bases modernas de la biologa molecular. De repente, todos queran mapear el ADN y el uso de cualquier enzima de restriccin a disponible para examinar sus genomas favoritos (en esos das, por lo general un fago o ADN viral). Cuando me mud de Harvard a Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY) en 1972, pude por primera vez purificar las pocas endonucleasas de restriccin conocidas y, a continuacin, comenze a buscar ms, idealmente las que me permitieran reconocer diferentes secuencias y que eso permitiera permitir muchas de las aplicaciones que habitualmente vemos hoy. Debido a la omnipresencia de la distribucin de estas enzimas, tuvieron xito mucho mas alla de nuestro sueos mas alocados (6).
mejor manera de tratar de caracterizar los fragmentos de ADN producidos por los cortes con endonucleasa R. Los gradientes simplemente carecan de la resolucin que permitira que los fragmentos que ser separados, caracterizados y mapeados. Nathan por lo tanto, recurriero a otra tcnica, electroforesis en gel de poliacrilamida, cuya utilizacin ha sido promovida por Ulrich Loening (12) para separar las especies de ARN. Danna, en el laboratorio de Nathan, rpidamente realiz un experimento sencillo. Ella tom una pequea cantidad de ADN purificado SV40 estudiado en su laboratorio, incubados con algunas endonucleasas R, y se corrio el digesto sobre uno de los geles de poliacliamida de Loening. En aquellos das, la mayora de los geles se prepararon en tubos de vidrio, no la tabla geles que es comun hoy en da. Una vez que el gel se haba corrido dos mtodos se podran utilizar para encontrar el ADN resultante, que en este caso ha sido marcado radiactivamente. El primer mtodo consiste en expulsar el gel del tubo y colocarlo en contacto con una pelcula de rayos X para autorradiografa. El resultado, utilizando el ADN marcado con 14C, se muestra en la fig. 1. El segundo mtodo es el gel para cortar en rodajas y utilizar un contador de centelleo para cuantificar la radiactividad en cada rebanada. Los resultados de este tipo de anlisis, en este caso, utilizando el ADN que se haban marcado con 32P, se muestran en la fig. 3. Una ventaja inmediata de la autorradiografa es evidente. El tercer y cuarto picos que se muestran en la Fig. 3 se pueden ver en la autorradiografa (Fig. 1) cada uno contiene dos fragmentos de la etiqueta de CD y EF. La resolucin necesaria para separarlos simplemente no est disponible por corte de geles. Danna y Nathan procedi a trabajar en muy buenas estimaciones de la longitud de cada uno de estos fragmentos sobre la base del porcentaje del total de SV40 ADN que estaba presente y utilizando el conocido SV40 masa molecular de ADN de 3 10^6 kDa, que corresponden a 5, 200 pares de bases (13). El equipo cuidadosamente comparo los valores de sedimentacin, mediciones de radiactividad e incluso mediciones de longitud EM para asegurarse de que los resultados de cada mtodo fueron consistentes. Debido a que la secuencia de reconocimiento endonucleasa R fue GTYRAC, Danna y Nathan esperabvan que el corte tendria lugar aproximadamente una vez cada 1.000 pares de bases. Es un poco sorprendente, por tanto, que los 4.500 pares de bases del ADN de SV40 se reducira en 11 fragmentos. Danna Nathan y consider la posibilidad de que el ADN SV40 fue heterogneo. Sin embargo, el cuidado de las mediciones de longitud de los fragmentos excluia esta posibilidad. Ahora sabemos que era, de hecho, la preparacin de la I endonucleasa que fue heterognea, ya que no contena una enzima de restriccin, sino dos. Este descubrimiento fue realizado en varios laboratorios, entre ellos Smith, tan pronto como las autoridades nacionales designadas utilizaron ADN T7 como sustrato para el ensayo. Resulta que, por casualidad, el ADN del bacterifago T7 tiene el reconocimiento de los sitios slo una de las dos enzimas de restriccin presentes en la preparacin de endonucleasas. La enzima original que caracteriza por Smith, ahora se llama HindII (reconocimiento de secuencias GTYRAC), mientras que la segunda enzima, para los que no hay sitios en T7 ADN, es HindIII. Su reconocimiento es la secuencia AAGCTT (14), y de esta enzima tiene seis sitios en SV40 ADN, y no ms de uno podra haber anticipado por casualidad.
Mapeo de ADN
Otra caracterstica del paper de Danna y Nathan que ayudaron a convertirlo en un clsico que se prevea claramente varias aplicaciones potenciales de endonucleasas de restriccin que despus resultaron ser de gran utilidad. Por ejemplo, los autores mostraban claramente la posibilidad de utilizar esos fragmentos para preparar un mapa fsico del genoma de la SV40, una proeza que luego fue realizada en el laboratorio Nathan (3). Los autores tambin demostraron que es posible localizar el origen de replicacin (4) y la posicin de principios y finales de los genes de SV40 en este mapa de restriccin(5), y que cualquier gen individual podra ser mapeado por las pruebas de actividad biolgica en experimentos de transformacin (15). Incluso fue ms perspicaz al indicar la posible creacin de mutantes informantes mediante la supresin de uno o ms de los fragmentos especficos (16). Estas supresiones y otras eran fcilmente visualizadas por el anlisis de la enzima de restriccin, ya sea porque faltan fragmentos fueron quitados por completo o ms cortos si se encuentra la supresin de los mismos. Esta caracterstica se convirti rpidamente en un estndar de uso de mapas de enzimas de restriccin. En una sentencia que prefigura el actual uso diagnstico de la digestin con endonucleasa de restriccin, los autores sealaron:''De este modo, hemos encontrado que el ADN de cepas SV40 de pequea placa, gran placa y minuteplaca muestran diferencias especficas en el particular, la movilidad de los fragmentos de ADN.'' Las variaciones de longitud, que ahora se conoce como polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLPs), encontrado en minisatlites humanos y utilizado con tanto xito por Alec Jeffreys con fines forenses (17), son uno de las aplicaciones mas conocidas hasta por el pblico en general.
Biolabs empez vender estas enzimas como su principal lnea de productos, y muchas otras compaas pronto siguieron su ejemplo.
Secuenciacin de ADN
Otro uso importante de los fragmentos de las enzimas de restriccin fue en los primeros das de la secuenciacin del ADN. Cuando Fred Sanger empez a desarrollar mtodos para la secuenciacin del ARN, es porque hay muchas pequeas molculas de ARN como ARNt y ARN 5S en lo que practicar, que es siempre crucial a la hora de los nuevos mtodos que estn siendo os. Sin embargo, no haban molecular pequeas de ADN. Esta situacin cambi cuando se convirti en fragmentos de restriccin disponible, y algunos de los primeros primers utilizados por el laboratorio de Sanger fueron los diminutos fragmentos de ADN se produce cuando X174 fue cortado por enzimas de restriccin reconoce cuatro pares de bases (24). Esta metodologa se haba iniciado a principios de 1970, y durante un tiempo mi laboratorio continuamente envio muestras de enzimas de restriccin para el Consejo de Investigaciones Mdicas Laboratorio de Biologa Molecular (Cambridge, Reino Unido). Los mapas de enzimas de restriccin tambin ayudaron en el montaje de secuencias de ADN mediante el suministro de referencia til y manejable que permite segmentos de ADN para ser aislado y secuenciado antes del montaje. La secuenciacin por mtodos qumicos desarrollados por Wally Gilbert y Allan MAXAM tambin dependen en gran medida de enzimas de restriccin para proporcionar el 5 termini, que podra ser etiquetado con 32P antes de la degradacin qumica (25).
1971. Desde diagnstico de ADN, ADN forense, y la rutina de control de las muestras de ADN en el laboratorio de investigacin surgieron todos desde los mtodos descritos este clasico documento.
El Premio Nobel
Es particularmente apropiado que cuando el Comit Nobel decidi en 1978 que debera figurar en el ticket para el descubrimiento de enzimas de restriccin y sus usos, seleccionaron Nathan, que se uni a Arber y Smith (Fig. 4). Arber haba proporcionado el marco terico que describe la biologa de la restriccin y modificacin y aislado con xito la primera enzima de restriccin de tipo I, EcoBI. Smith haba descubierto la primera enzima de restriccin de tipo II, endonucleasa R. Nathan Pero fue el primero en realizarse y, a continuacin, demuestra cun poderosa puede ser enzimas de restriccin cuando se utiliza para la cartografa fsica de SV40 ADN y sus genes. El tro sent las bases que ha llevado a la actual adiccin a las enzimas de restriccin como rutina, pero esencial, herramientas para bilogos moleculares.