Fagocitosis

La fagocitosis (del griego -phagos, 'el que come', kytos, 'clula'), es un tipo de endocitosis por el cual algunas clulas rodean con su membrana citoplasmtica a una sustancia extracelular (un slido generalmente) y la introducen al interior celular.
Los organismos unicelulares utilizan la fagocitosis como mecanismo de nutricin a partir de la ingestin de materia del exterior (bacterias, otras clulas, materia inorgnica, etc). Es uno de los medios de transporte defensa algunas clulas de organismos superiores, la de tejidos muertos. fagocitosis es

grueso que utilizan para su los organismos pluricelulares. En muchos

tanto un medio de defensa

ante microorganismos invasores como de eliminacin (e incluso reciclaje)

Clulas fagocticas
En los animales superiores, la fagocitosis es una funcin de clulas especializadas (fagocitos profesionales) del sistema inmune capaces de remover cuerpos extraos y combatir infecciones como primera lnea de defensa natural. Varias clulas ejercen funciones fagocticas:
Neutrfilos Monocitos Macrfagos Clulas Dendrticas

Otras clulas como las clulas de Kupffer en el hgado, las clulas de la microgla en el cerebro, las clulas de Langerhans en la piel, etc., son fagocitarias en la mayora de los animales. Todas stas clulas son macrfagos que reciben diferentes nombres segn el lugar donde se encuentren, debido a que histricamente no se reconocan como el mismo tipo celular.

Los eosinfilos y los basfilos son granulocitos que se desgranulan liberando sus sustancias qumicas sobre clulas o microbios dainos provocando su muerte. Los neutrfilos son tanto fagocitos como granulocitos, contienen grnulos llenos de sustancias qumicas potentes. Estas sustancias qumicas, adems de destruir microorganismos, desempean una funcin clave en las reacciones inflamatorias agudas.
Los macrfagos son clulas fagocticas de gran tamao presentes en la mayora de los tejidos y cavidades, proceden de los monocitos que migran desde la sangre hacia los tejidos. Algunos permanecen en los tejidos durante aos y otros circulan por los tejidos linfoides secundarios. Tambin pueden actuar como clulas presentadoras de antgenos. Los macrfagos expresan receptores de membrana para numerosos antgenos bacterianos, por ejemplo: receptor para lipopolisacrido (CD14), receptores C11b/CD18, receptores para manosas, y receptor para glcidos entre otros. Los macrfagos participan en gran medida de la respuesta inmune innata a infecciones gracias a sus receptores "scavengers", o barredores, que poseen una especificidad a ligandos muy amplia como: lipoprotenas, protenas, poli y oligonucletidos, polisacridos aninicos, fosfolpidos y otras molculas. Los macrfagos son activados por gran variedad de estmulos durante la respuesta inmune. La fagocitosis deantgenos sirve como estmulo inicial pero su cantidad y actividad aumenta por citoquinas que son secretadas porlinfocitos T colaboradores y productos bacterianos. Uno de los ms potentes activadores de macrfagos es elinterfern gamma. Los macrfagos tienen la capacidad de quimiotaxis, es decir la de ser atrados y desplazados hacia una determinada localizacin por la presencia de determinados factores quimiotcticos, como la interleuquina1, trombina, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de complemento C5a, fragmentos de colgeno, elastina, fibronectina,calicrena, activador del plasmingeno, inmunoglobulinas y leucotrienos. Los macrfagos procesan y presentan los antgenos en el complejo mayor de histocompatibilidad MHC de clase II., all son reconocidos por los linfocitos T colaboradores, que producen linfoquinas que activan a los linfocitos B. Losanticuerpos producidos por los linfocitos B activados se adhieren a los antgenos bacterianos o de clulas invadidas por virus y as atraen con mayor avidez a los macrfagos para fagocitarlos.

Los neutrfilos son los leucocitos ms abundantes (>70%). Su tamao es de 10-20m de dimetro y se clasifican como granulocitos debido a sus grnulos citoplasmticos de lisosimas y de lactoferrina. Pasan menos de 48 horas en la circulacin antes de migrar a los tejidos, debido a la influencia de los estmulos quimiotcticos. Es en ellos donde ejercen su accin fagoctica y eventualmente mueren.

Los monocitos son clulas circulares cuyo dimetro oscila entre 15 a 30 m y poseen una alta relacinncleo/citoplasma. Se originan en la mdula sea y constituyen cerca del 5% del total de leucocitos de la sangre, donde permanencen slo unos tres das. Depus atraviesan las paredes de las vnulas y capilares (diapedesis) donde la circulacin es lenta. Una vez en los rganos, se transforman en macrfagos, lo que se refleja en el aumento de su capacidad fagoctica, de la sntesis de protenas, el nmero de lisosomas y la cantidad de aparato de Golgi, microtbulos y microfilamentos. Estos ltimos se relacionan con la formacin de pseudopodos, responsables del movimiento de los macrfagos.

Reconocimiento y unin de partculas por fagocitos

A pesar de que la fagocitosis de partculas fue demostrada por Haeckel en 1862 y que los macrfagos y micrfagos fueron descriptor por Metchnikoff en 1892, el rol de los factores sricos que intervienen en este proceso fue puesto en evidencia recin en 1904 cuando Wright y Douglas determinaron que dichas sustancias eran fundamentales para una ptima ingestin.

Etapas de la fagocitosis
1- Quimiotxis Es la etapa de movilizacin y reclutamiento de clulas fagocticas por medio de interacciones celulares a la zona o tejido lesionado. El fagocito se adhiere a la superficie del endotelio previamente activado por citoquinas, a travs de uniones moleculares de baja afinidad entre receptores en el fagocito y selectinas presentes en el endotelio. En un punto especfico, determinado por la presencia y activacin de quimioquinas, los fagocitos movilizados establecen interacciones intercelulares de gran afinidad con el endotelio por medio de integrinas y otros ligandos endoteliales. En especial las molculas endoteliales LFAa, CR3 y VLA-4 se adhieren a ligandos especficos sobre los fagocitos, entre ellos VCAM-1 e ICAM-1.

Los fagocitos atrados por gradientes de concentracin de las quimioquinas, atraviesan entonces el epitelio vascular hacia el foco de infeccin patgena. 2- Opsonizacin La opsonizacin se consigue recubriendo las partculas con anticuerpos especficos de la clase IgG, con o sin complemento. Debido a que los fagocitos tienen receptores de membrana para el fragmento Fc de IgG, reconocen a estas partculas recubiertas por los anticuerpos. La IgM no tiene capacidad de opsonizar, pero su unin a las partculas induce la activacin del sistema de complemento. Esto lleva a que el componente C3b se deposite sobre las partculas, las cuales son reconocidas por los receptores de los fagocitos para el fragmento C3b. A pesar que el reconocimiento de partculas recubiertas con IgG y/o C3b va los receptores Fc y C3b, es el principal mecanismo de ingestin de partculas extraas, llamado fagocitosis inmune, existen otros factores que median o ejercen su influencia sobre este proceso.

3- Adherencia Receptores especficos sobre la membrana de los fagocitos permiten la adherencia sobre los microorganismos, ya sea a productos microbianos especficos o sobre opsoninas del sistema inmune del hospedador. Receptores de membrana presentes en las clulas fagocticas:

Receptor de manosa. Este receptor tiene afinidad por los componentes de manosa presentes en las glucoprotenas y glucolpidos de las paredes celularesbacterianas. Scavenger. Estos receptores se unen directamente a microorganismos y a moleculas de LDL modificadas. CD14. Es un ligando con preferencia especfica al lipopolisacrido presente en ciertas bacterias y est asociado a un receptor tipo Toll. Transmembrana de 7 helices alfa. Es un receptor recientemente descubierto, cuya funcin est asociada a seales de quimioquinas y ciertos pptidosmicrobianos. Receptores para los fragmentos Fc de los anticuerpos opsonizantes IgG2 e IgG3.

4- Ingestin La unin a receptores de adherencia promueve seales de comunicacin intracelular que resultan en la invaginacin de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su ligando patognico. Al rodear por completo al complejo receptor-molcula, la membrana se une en sus extremos y libera al interior de la clula unfagosoma. Esto puede ocurrir en mas de un punto de la membrana celular.

5- Digestin Los fagocitos cuentan con variados mecanismos microbicidas, los cuales se activan al fusionarse el fagosoma con un lisosoma intracelular. Las enzimas del lisosoma se liberan dentro del fagolisosoma recien formado actuando sobre su contenido. Otros componentes txicos usados en la digestin de microorganismos son los intermediarios reactivos del O2 y el xido ntrico. Qu ocurre luego de la fagocitosis? El macrfago luego de fagocitar al antgeno lo transporta a los ganglios linfticos. All presenta fragmentos del antgeno a los linfocitos T, que produce la formacin delinfocitos T citotxicos, que pueden destruir directamente las clulas infectadas y de linfocitos T helper, que facilitan el desarrollo de los linfocitos B. Los linfocitos T citotxicos presentan en su superficie unas molculas receptoras semejantes a los anticuerpos, mediante las cuales se unen especficamente a los antgenos de la membrana de las clulas. El linfocito inyecta sus enzimas en el interior de la clula y provoca su degradacin. Los linfocitos B se activan ante la presencia del antgeno y se encargan de elaborar anticuerpos especficos. Sin embargo, no empiezan a producir anticuerpos hasta que no reciben la "seal" de los linfocitos T helper. Finalmente, superada la infeccin, otro tipo de linfocitos T supresores se encargan de detener las reacciones inmunitarias.

Existen enfermedades provocadas por deficiencias en la actividad fagoctica de las clulas fagocitarias como ser la enfermedad granulomatosa crnica. Esta enfermedad se contrae de forma hereditaria recesiva y es rara (alrededor de uno en un milln de nacidos). Se caracteriza por la presencia de granulomas decaractersticas inflamatorias crnicas. La causa de esta enfermedad es la insuficiencia en la actuacin de los fagocitos lo que provoca infecciones recurrentes producidas por bacterias productoras de catalasa. Los macrfagos y neutrfilos se encuentran impedidos de crear la explosin respiratoria

dado que presentan el complejo enzimtico NADPH-oxidasa defectuoso que cataliza la siguiente reaccin:

El hecho de que las infecciones recurrentes se deban a microorganismos catalasa positivos es que estos no son destruidos en su totalidad por lo fagocitos debido a que su catalasa destruye el poco perxido de hidrgeno que logran producir los fagocitos.

Mtodos para medir fagocitosis y muerte intracelular

1- Mtodos in vivo para estimar fagocitosis Estos mtodos dependen bsicamente de la medicin del clearance de la circulacin de material inyectado por va intravenosa (coloides, bacterias, macromolculas, eritrocitos opsonizados, etc.). Proveen informacin del estado funcional de los macrfagos del hgado (clulas de Kupffer) y en menor medida de los macrfagos de los pulmones (macrfagos alveolares) y del bazo. Sin embargo, la interpretacin de estos resultados es dificultosa, porque esta eliminacin de partculas est influenciada tambin por otros factores como la velocidad del flujo sanguineo, la presencia o ausencia de factores opsonizantes, la adhesividad de las partculas que pueden adherirse a las paredes de los vasos y a los cambios de las poblaciones fagocticas en el hgado. 2- Mtodos in vitro para estimar fagocitosis La ventaja de la medicin de la fagocitosis in vitro radica en que las poblaciones celulares, las partculas, los factores opsonizantes y dems condiciones experimentales estn bin definidas. Los mtodos deben cumplir con las siguientes condiciones: 1) Las partculas no ingeridas asociadas a las clulas deben ser facilmente distinguibles de las partculas ingeridas. 2) La ingestin debe ser 0 a tiempo 0. 3) La velocidad y el grado de ingestin deben alcanzar una cintica de orden 0 al aumentar la relacin partcula:clula. Los mtodos que cumplen con estos criterios pueden ser divididos en dos grupos: 1) Los mtodos que miden el aumento en el nmero de partculas intracelulares 2) Los mtodos en los cuales la disminucin del nmero de partculas extracelulares es tomado como una medida de la fagocitosis.

1) Aumento en el nmero de partculas intracelulares Puede ser determinado por microscopa ptica o electrnica, siempre que se pueda establecer una clara distincin entre las partculas extra e intracelulares. Esto es muy dificultoso empleando microscopa ptica salvo que se utilicen partculas de ltex que se puedan disolver con xilol cuando estn adheridas a la clula pero no hayan sido internalizadas, glbulos rojos extracelulares lisados con agua o cloruro de amonio, o bacterias como Staphylococcus aureus lisadas con lysostaphin que no hayan sido an fagocitadas. 2) Disminucin del nmero de partculas extracelulares Se utilizan para determinar la velocidad de fagocitosis de microorganismos y complejos inmunes. El nmero de microorganismos extracelulares puede ser determinado directamente por mtodos microbiolgicos o indirectamente empleando microorganismos marcados radioactivamente. Desventajas en el empleo de microorganismos marcados radioactivamente: 1- La marca representa un promedio del nmero de microorganismos. 2- El nmero promedio de bacterias por unidad de marca puede cambiar debido a la divisin bacteriana, cuando se utilizan microorganismos viables; o debido al decaimiento de la marca en el caso que se empleen microorganismos muertos y marcados que hayan sido guardados por un tiempo. Ms an, los mtodos en los que se emplea radioactividad no suministran informacin acerca de la actividad microbicida de factores sricos o de factores liberados por los fagocitos durante el ensayo. Estas desventajas pueden evitarse utilizando bacterias viables no marcadas. No obstante, tambin en este caso existen ciertos inconvenientes: La determinacin del nmero de bacterias viables intracelulares es inadecuado, porque este nmero no solo representa el resultado de la fagocitosis sino que tambin incluye la muerte intracelular durante el tiempo de estudio. La estimacin de la fagocitosis como una disminucin de los microorganismos extracelulares, requiere la separacin de dichos microorganismos no fagocitados de las clulas fagocticas. Adems, los resultados de estos experimentos estn influenciados por factores bactericidas presentes en el medio extracelular, aglutinacin de los microorganismos y por la proliferacin bacteriana. Por lo tanto, estos experimentos requieren controles adecuados para cada tipo de clulas fagocticas, para las distintas especies de microorganismos y para el suero usado para la opsonizacin. Mtodos que miden la actividad microbicida de los fagocitos

1- Directos: Se mide la disminucin de la viabilidad de los microorganismos como una medida de la actividad bactericida. 2- Indirectos: Medicin del consumo de O2 , produccin de H2O2 o reduccin del nitroblue tetrazolium. Todas estas mediciones se piensa que reflejan la actividad microbicida de los fagocitos. Sin embargo, estos mtodos solo proveen informacin acerca del funcionamiento de los mecanismos microbicidas dependientes de O2, y por lo tanto, no pueden reemplazar totalmente a los ensayos microbiolgicos.

Cintica de fagocitosis Cuando 5 x 106 granulocitos fueron incubados con varias concentraciones de S. aureus (5 x 104 5 x 109 / ml) en presencia de suero, se observ una disminucin en la velocidad de fagocitosis cuando se utilizaba una relacin bacteria:granulocito superior a 10:1. Con relaciones 100:1 y 1000:1, solo se obtena informacin confiable de la cintica de fagocitosis por perodos de 90 y 60 minutos, respectivamente, debido a la ruptura de los granulocitos saturados con bacterias. Investigaciones realizadas empleando una concentracin de granulocitos de 5 x 104 , no evidenciaron una disminucin apreciable de microorganismos extracelulares. Los ensayos de fagocitosis empleando una concentracin de granulocitos entre 5 x 10 5 y 5 x 107 con distintas concentraciones de bacterias, se caracterizaron por una velocidad de fagocitosis inicial que dependi de la relacin bacteria:clula y del nmero de granulocitos. Estos experimentos demostraron que la velocidad de fagocitosis in vitro depende de la relacin bacteria:clula y de la concentracin de ambas bacteria y granulocitos. Se puede concluir que los ensayos de fagocitosis llevados a cabo en perodos de 120 minutos y empleando una relacin bacteria:clula de 1:1 (concentracin 5 x 106/ml) daban informacin confiable sobre la velocidad de fagocitosis (ver fig. 46.8).

Fagocitosis por monocitos humanos de sangre perifrica y macrfagos peritoneales murinos La actividad fagoctica de los macrfagos murinos fue menor que la de los monocitos humanos. Estos resultados obtenidos empleando S. aureus tambin se verifican empleando otros microorganismos (ver fig. 46.9).

Actividad opsonizante del suero La incubacin de S. aureus con granulocitos o monocitos (relacin 1:1) en presencia de varias concentraciones de suero a 37 C revel que tanto la velocidad como el mximo grado de fagocitosis dependen de la concentracin de suero. Estos experimentos demuestran que por lo menos una concentracin de suero de 2,5 % es necesaria para una ptima fagocitosis de S. aureus por granulocitos (fig 46.10a) y 1 % por monocitos (fig. 46.10b). Experimentos similares empleando E. colidemostraron requerimientos de suero distintos para ambos tipos de fagocitos (fig. 46.10).

Cales son las fuentes para la obtencin de clulas fagocticas? - Sangre perifrica: obtencin de monocitos y polimorfonucleares - Cavidad peritoneal: obtencin de macrfagos maduros - Alvolos: obtencin de macrfagos pulmonares

Para aumentar el nmero de clulas fagocticas a obtener a partir de una determinada fuente se emplean agentes inductores. Diferentes agentes inductores inespecficos son mostrados en la siguiente tabla:
Agente inductor Concentracin/dosi Tpo de s cosech a p.i 0.5 ml i.p. (ratn) 5% en SF i.p. Glucgeno 10 ml (cobayo) 0.5 ml (ratn) Caldo proteosa/pepton a 10 % i.p. 1-1.5 ml (ratn) das 3 % i.p. Caldo tioglicolato 1-3 ml (ratn) das Aumento muy marcado de macrfagos.Exudad o sucio, gotitas includas, clulas muertas, animales enferman, etc. Aumento marcado de macrfagos. Clulas muy activas, pero citoplasma con vacuolas lipdicas Aumento muy marcado de macrfagos Aumento moderado de macrfagos. 3-6 Aumento marcado de macrfagos 3-5 das 3-5 4872 hs Observaciones

Suero de ternero/caballo

Aumento moderado de macrfagos. Aumento moderado de macrfagos. Aumento temprano de PMN Aumento de macrfagos

Aceite mineral

0.1-0.5 ml (ratn)

4-6 das

Glicerol

Emulsin 1 % 0.5-2 ml (ratn)

1-5 das

Hidrolizado de casena Agua de peptona

5 % en SF 0.2 ml (ratn) 10 % en SF 0.5-1 ml (ratn) Mayor a 5 das Mayor a 4 das

Otros agentes inductores de uso comn son almidn 2%, gelatina 4%, caldo carne-corazn, extracto de cerebro, etc