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- INTRODUCCION Las enfermedades infecciosas constituyen un captulo importante en la sanidad animal tanto por los problemas de orden infeccioso o zoonsico, como por las repercusiones econmicas que muchas de estas enfermedades ocasionan a las explotaciones ganaderas. Viendo la importancia de la reproduccin, que es el pilar fundamental en la ganadera se destacan problemas que desembocan en una interrupcin brusca de la gestacin. Por lo que hemos escogido como tema de investigacin la Rinotraquetis Infecciosa Bovina (IBR); que en su carcter de enfermedad infecto contagiosa provoca el aborto e incluso infertilidad del animal. Las prdidas econmicas que en muchos pases ocasionan la IBR, son relativamente altas, en algunos casos alcanzando una morbilidad de 15% y una mortalidad del 5%, repercutiendo en la produccin de los ganaderos y esto a gran escala genera, grandes prdidas econmicas en nuestro pas, que puede ser por escasos conocimientos de la infeccin o por falta de prevencin de la misma. En la provincia de Morona Santiago no se ha realizado en los ltimos aos estudios de tipo epizootiolgico sobre esta enfermedad; as como tampoco un diagnstico preciso del aborto, el cual en los ltimos tiempos ha alcanzado altos ndices de incidencia. En el ecuador se ha diagnosticado la presencia de IBR atravez de pruebas serolgicas y de Eliza como causa del aborto, las cuales en algunos caso se realizan en forma privada. En cuanto se refiere a la regin Oriental no se han realizado ningn diagnostico con respecto a esta enfermedad en los ltimos aos, por lo que nuestra investigacin se encamina a determinar la presencia o no de esta enfermedad como causa principal de infertilidad, aborto, y otras formas de presentacin, cabe resaltar que esta investigacin se realiza en una pequea muestra (30 muestras) de la poblacin, por lo que es necesario tener en cuenta que los resultados obtenidos no son lo suficientemente considerables para interferir a toda la poblacin ganadera total de esta provincia, las muestras tomadas fueron extradas de bovinos procedentes de la provincia de Morona Santiago, que llegan al camal municipal de Cuenca.

2.- OBJETIVOS

2.1. Objetivo general Tener un conocimiento general de las enfermedades causantes de infertilidad, abortos y otras alteraciones en los bovinos, su agente causal, el diagnstico y prevencin de las mismas, as como realizacin de una la teraputica adecuada, recurriendo a investigaciones electrnicas e impresas. 2.2. Objetivos especficos Conocer las enfermedades de tipo viral causantes de diversos trastornos en bovinos, resaltando la IBR, en animales provenientes de la provincia de Morona Santiago, mediante anlisis en el laboratorio de diferentes muestras de sangre. Tener un conocimiento bsico de las principales pruebas de laboratorio que se utilizan para el diagnstico de enfermedades infecciosas, recurriendo a investigaciones en libros electrnicos, y material proporcionado por el laboratorio. Conocer la metodologa de laboratorio, las diferentes tcnicas pero principalmente de la prueba de ELIZA, su procedimiento, as como los requerimientos que la misma posee, mediante investigaciones en diferentes bibliografas especializadas.

3.- REVISION DE LITERATURA

3.1. DEFINICION La Rinotraquetis infecciosa bovina es una enfermedad altamente infecciosas provocada por u virus (IBR). (Henderson, J.A.- 1988) Se caracteriza por inflamacin, edemas hemorragias y necrosis de las membranas mucosa del tracto respiratorio y lesiones pustulosas de rganos genitales del macho y la hembra (Burrows.W.-) En los animales enfermos se observa rinotraquitis, conjuntivitis y fiebre, la evolucin es corta con una alta tasa de recuperaciones. Puede presentarse encefalitis, la forma sistmica de la enfermedad en los neonatos, y la Vulvovaginitis pustulosa infecciosa ( IVP) causadas tambin por el mismo virus( Rodostits. O.M.- 1988) El curso en la mayora de los casos es de diez das, pero aproximadamente en 10% puede ser ms prolongado. Los animales afectados crnicamente pierden mucho peso, y un aproximado del 3% muere. El virus puede invadir a la placenta y el feto atravez de la corriente sangunea materna causando aborto o mortinato generalmente en el ltimo tercio de la gestacin. La enfermedad causada por este virus comnmente aparece sola; por ejemplo, un brote de Vulvovaginitis por lo general no se acompaa de infeccin respiratoria superior o viceversa. No hay peligro de que esta variedad de herpes virus bovino cause infeccin en el humano. 3.2. SINONIMAS Rinotraquetis infecciosa de los bovinos , rinotraquitis vrica de los bovinos, nariz roja, rinitis necrosante. 3.3. TAXONOMIA Armstrong, Pereira y Andrewes han clasificado al virus incluido en el grupo de los herpes virus, lo que confirmara su enorme variabilidad, predicha ya por Baker, McEntee y Gillespie. Familia: Herpesviridadae Subfamilia: Alphaherpesvirinae Especie: Herpesvirus bovino 1 (Mohanty. S.A Y DUTTA.S.K. 1983)
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3.4. HISTORIA La rinotraquitis infecciosa bovina fue descrita por primera vez en 1954 por Schroeder y Moys como una infeccin leve y poco significativa , fue aislada por primera vez en Estados Unidos en 1956.Acctualmente esta enfermedad tiene distribucin mundial. Fue descrito por primera vez por Madin , York y Mckercher en 1956. La identificacin de anticuerpos en una muestra de sangre recogida en 1941 y luego conservada, revel que esta enfermedad ya exista anteriormente, aunque no haba sido diagnosticada 3.5. DISTRIBUCION GEOGRAFICA La enfermedad se haba observado antes por otros investigadores en Colorado y California. Desde entonces el virus ha sido aislado en muchos pases del mundo. La entidad patgena descrita originalmente en frica como Epi _ vag, se halla producida por el virus de IBR. La enfermedad ha sido reportada en Europa: Inglaterra, Alemania, Francia, Yugoeslavia, y Nueva Zelandia: Sud frica, Tanzania. E n Amrica se ha encontrado de EEUU, Canad, Mxico, Cuba, Colombia, Brasil, Argentina, Per , Repblica Dominicana , y Ecuador.(OPS _ 1986) 3.6. ETIOLOGIA Se ha aislado un herpes virus, llamado herpes virus bvido de los animales enfermos, y puede desarrollarse en cultivos tisulares para producir enfermedades respiratorias, aborto y conjuntivitis, as como encefalitis a la inoculacin intracerebral. Ocurren diferencias menores de las cepas pero no explican claramente la diversidad de patrones epidemiolgicos y patgenos de conducta de este herpes virus. El virus IBR es idntico a la Vulvovaginitis infecciosas (IPV) de las vacas y de la balanopostitis de los toros, pero pocas veces se encuentran juntas las modalidades respiratorias y genitales del mismo padecimiento. (BLOOD.D.C; HENDERSON.JA. Y RODOSTITS. O. M._ 1988) En los ltimos aos se ha comenzado a estudiar ms en detalle haciendo uso de la biologa molecular. Una de las caractersticas de este virus es la capacidad de producir una INFECCION LATENTE, primero en las mucosas, luego en ganglios y nervios del husped habitual, el bovino. Ello le permite eludir al sistema inmunolgico del organismo y perpetuarse, aprovechando las situaciones de bajas de defensas (estrs por manejo o alimentacin, corticoides, etc.) y replicarse con
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una nueva manifestacin clnica. El perodo de incubacin suele ser de 2 a 6 das, y el reservorio natural del agente es el propio ganado vacuno, aunque puede afectar a caprinos, suinos y conejos que no son reconocidos como reservorios. Al afectar al aparato respiratorio o reproductivo el virus realiza su multiplicacin en la membranas mucosas del mismo causando erosiones, lceras, formando cuerpos de inclusin intracelulares (Cowdry tipo A) La invasin al sistema nervioso central se realiza desde la cavidad nasal y regin farngea por las ramas del nervio trigmino. Los toros infectados a travs de IPVIBR, pueden desarrollar una balanopostitis pustulosa grave. Estos toros pueden contaminar el semen y constituirse en una forma muy peligrosa de difusin de la enfermedad. El virus IBR puede conservarse perfectamente en el semen congelado y de esta forma ha logrado difundirse ampliamente por todo el mundo. 3.7. MORFOLOGIA DEL VIRUS Los virus, o virus verdaderos, se separan de las bacterias no solo por las dimensiones extraordinariamente pequeas de algunos de ellos sino ms eximente por contener un solo tipo de cido nucleico, DNA, o RNA, al parecer , nunca los dos; por su reproduccin solamente por su cido nucleico, y por la incapacidad de la partcula viral para crear o sufrir divisin binaria. 3.8. VIRUS ANIMALES Los virus animales se distinguen en varios tipos diferenciales morfolgicos con el microscopio electrnico, incluyendo el examen de preparaciones con tinciones negativas. Dentro de los virus animales existen varios animales, interesndonos de esta clasificacin solamente el herpes virus ( Burrows.W._ ) 3.9. PROPIEDADES DEL VIRUS El virus de la Rinotraquetis infecciosa bovina tiene una densidad de 1.22 g /m en gradiente de tartrato de potasio. El DNA de doble tira tiene una densidad de 1.731 g/m en CsCl y un contenido de guanina ms citosina de 72%. E l virion contiene 18 protenas estructurales con pesos moleculares que fluctan de 25000 a 29000, y 8 son glucosilados. El DNA viral se sintetiza 5 hora despus de la infeccin, 3 horas antes de la aparicin de descendencia del virus, y es completo al cabo de 12 horas.

El virus del IBR/ IPV, se absorbe de la superficie de los eritrocitos de ovino, porcino y humano tipo o , propiedad esta que ha sido utilizada para la prueba diagnstica de hemoaglutinacin pasiva. La morfologa y la estructura del virus de la IBR son tpicas del grupo del herpes se seala cuerpos elementales son de 120 a 180 m de tamao. El virus pierde su infectividad tras 50 das a 22 C y despus de 19 das a 37 C. Se inactiva a 20 minutos por exposicin a 56 C. a 60 C. Sobrevive durante 9 meses. Es sensible a la accin del ter, acetona y alcohol etlico. Es estable a PH de 6- 9, pero pierde su actividad por debajo de 6. Las comparaciones antignicas de diversas cepas de IBR y de IVP, no descubre diferencias marcadas entre ellas. 3.10. PATOLOGIA CLINICA DE IBR La gran variedad de manifestaciones clnicas que acompaan a las infecciones por IBR y los diversos grados de intensidad de la misma dan lugar a confusin. No obstante, pueden clasificarse como formas clnicas diferentes. a) Enfermedad del tracto respiratorio: se manifiesta con temperatura, disnea, disminucin del apetito, secrecin nasal abundante que luego se transforma en mucopurolenta cuando comienzan las complicaciones secundarias con bacterias. A veces estos sntomas son acompaados de conjuntivitis con secreciones claras que luego se transforman en mucopurolenta b) Enfermedad del Tracto digestivo: se presenta con diarrea y lceras en la mucosa con materias fecales blanquecinas. Pero resulta extremadamente difcil diferenciar tanto clnicamente como anatomopatolgicamente de las lesiones producidas por el virus BVD u otros virus bovinos (ej.: Rotavirus) o bacterias (ej.: Salmonella). c) Encefalomielitis: de los bovinos jvenes se produce en ciertas ocasiones y es caracterizada por incoordinacin y movimientos en crculo, o bien mirada sobre los flancos, hasta que finalmente se produce la muerte. d) Vulvovaginitis pustular infecciosa (IPV): Varios aos atrs se le atribua esta manifestacin clnica a otro virus, hoy se reconoce como una nica identidad etiolgica. La Vulvovaginitispustulosa es la infeccin de la mucosa vaginal con secrecin mucopurulenta. Muchas veces pasa desapercibida en cierta forma benigna, en otras las hembras adoptan una postura de dolor perineal
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caracterstico y miccin permanente. Aunque otros agentes (como Mycoplasmas) pueden presentar lesiones similares debe buscarse los mismos asociados a los sntomas respiratorios en el rodeo. e) Muerte embrionaria y Abortos: Aunque mayoritariamente se presenta como abortos del ltimo tercio, tambin son frecuentes las repeticiones de celo por esta virosis. Cuando existe un aborto generalmente presenta cierto grado de autolisis, edemas y tejidos friables. Debido esto al tiempo entre la muerte del feto y su expulsin que es por lo general entre 8 y 45 das. Lo cual debe diferenciarse de algunas afecciones bacterianas (Leptospirosis o Brucelosis) que expulsan el feto rpidamente y no se observan autolisis marcada. 3.11. CULTIVO El virus de IBR puede cultivarse en una diversidad de cultivos hiticos. Se usa generalmente clulas renales de origen bovino. Permiten el crecimiento las clulas de rin de cerdo, ovino y cabra. Tambin se han usado las clulas Hela. Se produce un efecto citoptico. No permiten el crecimiento de virus los cultivos celulares de fibroblastos de embrin de pollo ni los embriones de pollo intactos.

3.12. EPIDEMIOLOGIA Son susceptibles de padecimiento los bovinos de todas las razas y edades en la infeccin experimental pero la enfermedad natural se observa principalmente en animales de ms de 6 meses de edad. Aunque rara vez se ha informado el padecimiento puede afectar en forma natural a cerdos, cabras, venados, lo cual puede sugerir que las formas silvestres pueden actuar como reservorios. La observacin de identidad de estos dos virus con un virus Europea que produce tambin vaginitis plantea un problema de epidemiologia. Se ha postulado que el virus quiz fue llevado a norte Amrica desde Europa por bovinos infectados, pero que continua produciendo lesiones solamente en las vas genitales hasta que su incorporacin a poblaciones de gran densidad de bovinos en campos de pasto estimularon su paso rpido por muchos huspedes fomentando asi su adaptacin al aparato respiratorio. Como el virus se encuentra en concentracin mxima en las vas respiratorias, se considera como fuentes principales de infeccin el exudado nasal y las gotas expulsadas con tos.

La incorporacin de animales a un grupo procede a menudo al estallido de un brote de enfermedad. S in embargo, puede originarse en ciertos nmero de granjas lecheras en un rea y diseminarse desde est a las haciendas vecinas hasta que queda afectada toda la regin. Cada brote alcanza su intensidad mxima hacia la segunda o tercera semana y termina a la cuarta o sexta semana. El agente se perpetua en los rebaos por infecciones latentes que se reactivan ocasionalmente y se acompaan de multiplicacin y eliminacin vrica, situacin que hace que esta sea una enfermedad de muy difcil control y gran difusin. El virus puede persistir en el animal y ser eliminado intermitentemente por periodos hasta de 17 meses despus de que se ha hecho la infeccin en forma experimental o puede permanecer latente por tiempo indefinido despus de la infeccin natural o el uso de vacunas con virus vivo atenuado a un que no es necesariamente es eliminado por el animal durante el periodo de latencia.

3.13. ANATOPATOLOGIA Las lesiones tpicas se encuentran en la superficie de las mucosas y son como placas o pstulas blanquecinas adheridas por la existencia de necrosis que son el resultado de acmulos de leucocitos, fibrina y clulas epiteliales necrosadas. En el tracto respiratorio son frecuentes en trquea y conductos nasales. En el tracto genital su manifestacin es la Vulvovaginitis pustulosa en las hembras y la balanopostitis en el macho. 3.13.1. Factores epidemiolgicos que parecen favorecer la diseminacin del virus: Alta densidad de animales en un espacio cerrado Introduccin contina de animales que pueden estar infectados o ser portadores del virus en forma latente, reactivndose este por el estrs del transporte y la aclimatacin a un nuevo ambiente. Presencia de un elevado nmero de terneros destetados en el momento en que los anticuerpos maternales frente al IBR han disminuido, lo que ocurre aproximadamente a las 10 semanas de edad.

3.13.2. Factores que conducen al establecimiento de animales portadores. Animales enfermos que eliminan virus por diferentes secreciones.
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Animales cuya inmunidad pasiva ha disminuido. Animales infectados sin signos clnicos aparentes. Animales infectados de modo latente. Animales en que la tasa de anticuerpo protector ha disminuido considerablemente y son re infectados.

3.14. FUENTES Y VIAS DE INFECCION El virus puede permanecer en estado latente toda la vida del hospedador o bien puede reactivarse peridicamente y producir importantes daos al animal infectado. Este virus puede reactivarse por tratamientos con corticoesteroides, infecciones vricas o bacterianas. La principal fuente de contagio de la enfermedad para nuevos animales son los animales portadores, que por medio de gotitas contaminadas mediante aerosoles, aunque tambin por contacto o ingestin con secreciones, excreciones y exudados contaminados as como fmites. La diseminacin vrica a travs de puentes intercelulares o sincitios, podra ser un mecanismo importante para la propagacin vrica despus de la reactivacin, ya que durante este estado, la transicin clula-clula podra estar protegida de los anticuerpos neutralizantes, por lo que es necesario la activacin de la inmunidad celular (Clulas T8 citotxicas) para poder atacar al virus dentro de la clula. Dentro de los cuadros clnicos que se describen esta la forma respiratoria- ocular observndose; apata, anorexia, total o parcial, disnea con respiracin superficial, taquipnea y presencia de tos seca. 3.15. SIGNOS CLINICOS Cuando comienza la Vulvovaginitis es repentina y aguda. Si se transmite por la va venrea aparece a las 24 o 48 horas despus del apareamiento; regularmente las novillas son ms afectadas que las vacas, ya que los labios bulbares se inflaman y se vuelven muy dolorosos, en animales de piel clara estn muy congestionados. Esto va acompaado del desarrollo de numerosas vesculas rojas en la mucosa. Pueden romperse pronto, o bien desarrollar internamente unas pstulas que dan lugar a unas lceras hemorrgicas de 3mm o ms de dimetro.
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3.16. ENTRADA Y DISEMINACION Las entradas potenciales para el ingreso del VHB-1 son la cavidad nasal, la oro faringe, ojos y tracto genital. Usualmente una primera replicacin ocurre en las clulas epiteliales de la puerta de entrada y al menos tres formas de difusin del virus deben ser consideradas: a. Infeccin restringida a reas locales.- Pueden ocurrir infecciones del tracto respiratorio superior o del tracto genital. Los sntomas de la enfermedad pueden ser principalmente atribuidos a la destruccin de las clulas epiteliales debido a la replicacin viral con produccin y excrecin de altos ttulos virales. Debido a que la respuesta inmune es eficiente, estas infecciones son usualmente auto limitante y la recuperacin del animal es dentro de 1 a 2 semanas. b. Difusin sistmica por viremia.- El VHB-1 puede infectar monocitos con moderada replicacin viral y tambin puede infectar macrfagos y linfocitos los cuales pueden servirle de vehculo a diferentes tejidos del animal. c. Difusin neuronal.- Durante la replicacin inicial en las clulas epiteliales, el virus puede ingresar por los axones celulares de las terminaciones nerviosas. Luego, va axonal, pueden alcanzar los cuerpos neuronales del ganglio trigmino donde el virus se establece en latencia.

3.17. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO En base a una sospecha clnica y para un correcto diagnstico de estos cuadros es necesario, o bien aislar el virus de muestras de rganos e hisopados o demostrar un incremento del ttulo de anticuerpos sricos. Para ello es importante distinguir: 1 La Fase Inicial de incubacin con viremia. 2 La Fase de Manifestacin Clnica, donde se presentan las lesiones antomopatolgicas. 3 La Fase de Convalecencia que puede ser muy prolongada, con anticuerpos circulantes. El aislamiento viral se puede llevar a cabo por inoculacin de cultivos celulares especficos (ej.: MBDK); se pone de manifiesto por Inmunofluorescencia. Las muestras debern ser remitidas a 4C (nunca congeladas).
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3.18. Muestras patolgicas a estudiar segn la forma clnica del IBR Respiratoria-Ocular.- exudado nasal o conjuntival, traqueal, y suero sanguneo. I.P.V./B.: exudado vaginal o prepucial, semen. Reproductiva.- aborto, placenta, sangre entera o suero del aborto, suero sanguneo de la vaca. Nerviosa.- cerebro Sistmica: epitelio ulcerado del aparato digestivo Mastitis: leche y contenido de vescula en ubre. Cutnea: epitelio ulcerado de espacio interdigital. Histopatolgicamente se puede localizar ciertos cuerpos de inclusin en clulas epiteliales de biopsias vaginales en la etapa primaria de la enfermedad (VPI). Las tcnicas serolgicas utilizadas son seroneutralizacin (SN), Inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemoaglutinacin pasiva y en menor grado inmunodifusin y fijacin de complemento. El suero deber ser remitido refrigerado a 4C no hemolizado y en muestras pareadas para su comparacin. Para lograr el diagnstico etiolgico de esta virosis es necesario el aislamiento viral o su demostracin por tcnicas inmuno especficas (ej.: IFI) o la seroconversin. 3.19. TRATAMIENTO No existe tratamiento especfico, pero es probable que la administracin de antibiticos de amplio espectro tenga efecto alguno en el virus, evita las prdidas provocadas por invasores bacterianos secundarios. Debe de identificarse el ganado enfermo, aislarse y observarse con frecuencia en busca de manifestaciones de traquetis bacteriana secundaria y neumona acompaada de anoxia y toxemia, para tratarlo segn el caso. La traquetis es especialmente difcil de tratar; se requiere administrar antibiticos diariamente durante varios das y en ocasiones es recomendable el sacrificio del animal en aras de la economa. 3.20. PREVENCION Estas tcnicas de prevencin pueden mantener la salud del hato y su bioseguridad.
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Vacunacin. Existen vacunas a virus vivo modificado, virus vivos modificados sensibles a temperatura especfica y virus muerto. Es necesario utilizar vacunas de virus vivo modificado o sensibles a temperatura especfica, para el control de IBR, es la nica manera de estimular inmunidad de clulas T citotxicas, las cuales son capaces de atacar al virus mientras esta en la clula. - Aislar los animales recin comprados (cuarentena). - Cuidar las tcnicas de Inseminacin Artificial y trasplante de embriones - Evitar movimientos de ganado dentro y fuera de la granja. - Sanidad: Cambie las agujas / guantes de palpacin para evitar infecciones iatrognicas. - Controlando infecciones persistentes (DVB): El control de las infecciones persistente es un gran reto en todo tipo de explotacin. Estas tcnicas pueden ayudar. Vacunacin: Aumenta el nivel de resistencia de los animales que pueden estar en contacto con animales infectados. Identificacin: Monitoreo del hato a travs de mtodos de aislamiento viral, pruebas clnicas y ELISA captura de antgeno. Control: Escoja y agrupe animales PI, analice y evite que animales PI nuevos entren al hato. Eliminacin del hato de animales PI. 3.21. CONTROL Los mtodos y vacunas disponibles para el control eficaz de la Rinotraquetis infecciosa bovina no han resultado del todo satisfactorio. La enfermedad puede aparecer en forma impredecible en cualquier momento; incluso lugares cerrados en los que no se introducen nuevos animales pueden permanecer libres de la enfermedad durante varios aos, pero sbitamente pueden experimentar un brote agudo. Por tanto no se cuenta con una tcnica de control completamente confiable que mantenga alejada la enfermedad de un rebao o una regin y el control del padecimiento depende de la adquisicin de inmunidad despus de la exposicin natural o de las vacunas.

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4. MATERIALES Y MTODOS 4.1. Materiales 4.1.1. Recursos Humanos - Estudiantes Investigadores - Propietarios de los animales 4.1.2. De Laboratorio - Microscopio electrnico - Papel absorbente Fsicos - Kit para la prueba de ELISA - Bovinos - Muestras de sangre Biolgicos - Solucin Salina al 7 - Agua destilada 4.1.3 De campo - Lazos - Tubos de ensayo sin anticoagulante - Agujas Nmero 14 por uno un cuarto - Gradillas para tubos - Masking tape - Vehculo de transporte - Lpiz - Hielera - Refrigerante o hielo - Transporte (vehculo particular) - Fichas de control (ver instrumento) 4.1.4. Centros de Referencia: Laboratorio de Microbiologa del Instituto Nacional De Higiene y Medicina Tropical LIP Salud Animal. 4.2. Metodologa de Laboratorio, de la Prueba de ELISA. TECNICA INMUNO-ENZIMATICA INDIRECTA 384 reacciones de pocillo simple

INICIO DE LA PRUEBA.- El kit SEREL1SA IBR/IPV Ab Mono Indirecta se basa en una tcnica inmuno-enzimtica indirecta que permite la deteccin de anticuerpos

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contra el virus BHV-1 en sueros de bovinos individuales. La reaccin consta de tres pasos: 1. Cada muestra de suero 5- distribuye en un pocillo sensibilizado con un antgeno viral. Los anticuerpos presentes en la muestra se fijan especficamente al antgeno adherido al fondo del pocillo. 2 Despus de un paso de lavado, se agrega un conjugado monoclonal (AcM) anti. IgG bovino /Peroxidasa. Este se fija sobre los sitios antignicos libres, formando un complejo: (AgHAc)-(AcM anti-lgG bovino /peroxidasa). 3. El exceso de conjugado se elimina mediante un segundo lavado. La enzima unida al complejo es revelada tras la adicin de un substrato que se transforma en un producto coloreado. Las densidades pticas correspondientes son ledas e interpretadas en funcin a los valores del umbral obtenidas del control positivo.
COMPOSICION Y CONSERVACIN DEL KIT
REACTIVOS RECONSTITUCION Y CONSERVACION 4 micro placas conteniendo 6 tiras de Para usar dentro de las 4 semanas posteriores a la apertura de 2 x 8 pocillos sensibilizados con la bolsa, la cual deber cerrarse despus de cada uso. el antgeno viral. Solucin de lavado (W) Diluya 10 veces en agua destilada. Usar dentro de las 48 horas (Concentrado 10X) despus de la dilucin Diluyente de la muestra (SD) Control Negativo (N) Control Positivo (P) Diluyente del conjugado (CD) Conjugado (concentrado 100X) AcM anti-gB / peroxidasa (CJ) Listo para usar Listo para usar. Listo para usar. Listo para usar. Diluya 100 veces en CD. Usar dentro de los 30 minutos

despus de la dilucin. Substrato de peroxidasa tampona- do Listo para usar. (PS) Solucin detencin - stop (S) Listo para usar. Film adhesivo 12 lminas

Materiales y reactivos requeridos (no incluidos)

Agua destilada o desmineralizada. Juego de pipetas o pipetas ajustables para medir entre 0 a 1000 ul Se requiere una desviacin de medida inferior a 10% para los volmenes <10 ni e inferior a 5% para todos los otros volmenes indicados. Probetas graduadas (100 ml y 1000 ml). Lavador de microplacas manual, automtico o semiautomtico.
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Lector de microplacas equipado con filtros para lectura bicromtica; 450 nm y 630 nm. Tambin es posible utilizar un lector monocromtico; equipado con un filtro de 450 nm. Incubadora a +37C 3C.

Precauciones - La calidad de los resultados depende del cumplimiento del procedimiento (ver inciso VI) y de las buenas prcticas de laboratorio. - No mezclar o asociar reactivos procedente de KITS que llevan nmeros de lote diferentes. - No utilice los reactivos despus de la fecha de vencimiento. - Previo a su uso, coloque todos los reactivos a temperatura ambiente por lo menos durante 1 hora. - Maneje todos los reactivos y muestras como si fuesen materiales bio-peligrosos. - Evite el contacto de los reactivos con la piel y los ojos. De ocurrir contacto, inmediatamente lvese el rea afectada con agua fria. - Nunca pipetear los reactivos con la boca. - Evite la contaminacin entre muestras durante la recoleccin, almacenamiento o transporte de las mismas. Las puntas de las pipeta deben cambiarse para cada muestra. - Evite la contaminacin de la solucin de substrato con iones metlicos, agentes oxidantes o detergentes Asegrese que todos los recipientes estn limpios. No utilice el mismo recipiente o las mismas puntas para el conjugado y el substrato. - Se recomienda eliminar los reactivos y los materiales en contacto con los reactivos segn la legislacin vigente. Las fichas de seguridad del producto estn disponibles bajo demanda. Frases de riesgo R23/25' Txico por inhalacin y por ingestin. R35: Causa quemaduras graves. R36/37/38; Irrita los ojos, la piel y las vas respiratorias. R41; Riesgo de lesiones oculares graves. R42/43: Posibilidad de sensibilizacin por inhalacin y por contacto cc la piel. S7: Mantenga el recipiente bien cerrado. S24: Evtese el contacto con la piel. S26: En caso de contacto con los ojos, lvense inmediatamente abundantemente con agua y acdase a un mdico.
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S30: No echar jams agua a este producto S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustresele la etiqueta)

MUESTRAS

La prueba se realiza en sueros individuales. Las muestras deben ser almacenadas como se detalla a continuacin
Muestras Suero o plasma Refrigerado (+ 5"C) mx. 7 das Congelado (- 20'C) SiTemperatura La! (20'C) NO

PROCEDIMIENTO.- Cumpla estrictamente con el procedimiento descrito a continuado

Utilice controles negativos y positivos en duplicado para cada prueba realizada y/o para cada placa.
PASOS PRELIMINARES

1. Establecer cuidadosamente un plan de distribucin e identificad' de controles y muestras. 2. Prepare las muestras de suero a ser analizadas. Diluciones !' pueden realizarse previamente en tubos de hemolisis, en los pocillos de la prueba.
DISTRIBUCION DE CONTROLES Y MUESTRAS

1. Distribucin de los controles: - Los controles vienen listos para su uso. Despus de agitar los frascos, agregue 100 ul de control negativo (N) a los pocillos A1 y A2 y 100 ul de control positivo (P) a los pocillos 81 y B2.

2. Distribucin de las muestras: Agregue 100 ul de las muestras de suero diluidos 1/10 a cada pocillo- En caso de dilucin directa en los pocillos de prueba, agregue 90 ul del diluyente de muestra (SD) ms 10 ul de muestra de suero individual. Las muestras pueden ser analizadas, individualmente o en duplicado. Las tiras siempre deben colocarse sobre el marco porta tiras, de manera que tanto el lavador como el lector puedan ser utilizados. Cubra lo pocillos con el film adhesivo, cortado en el tamao necesario para cubrir el nmero de tiras usadas. Mezcle agitando suavemente la placa de forma manual o usando un agitador de placas.

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3. Incubacin de la placa: - Protocolo de incubacin corta: 2 horas 5 min. a + 37'C 3'C, - Protocolo de incubacin larga: toda la noche (14-18 horas) a + 5C 3'C.
1.- LAVADO:

. Solucin de lavado: diluya la solucin concentrada de lavado (W) 1:10 en agua destilada o desmineralizada. Retire cuidadosamente el film adhesivo y lave 4 veces. I - Adicin de conjugado Prepare la solucin del conjugado, diluyendo el concentrado CJ 1:100 en diluyente de conjugado CD. Se necesita 2 ml de solucin final para cada tira, lo que significa 20 ul de conjugado CJ en 1980 ul de CD Atencin: debido a la baja concentracin del conjugado, solo debe utilizarse dentro de los 30 minutos posteriores a su preparacin. 2Distribucin del conjugado: Agregue 100 pl del conjugado diluido a todos los pocillos y cubra con una nueva pieza de film adhesivo. . 3Incubacin del conjugado: Incube por\1_hora 5 min. a + 37C 3"C.
LAVADO: Retire cuidadosamente el film adhesivo y lave 4 veces. 2.- REVELADO

1.

Adicin del substrato: Agregue 100 ul del sustrato de Peroxidasa tamponado (PS) a cada pocillo. No cubra con el film adhesivo durante esta etapa. Mezcle agitando suavemente la placa de forma manual, o bien utilizando un agitador de placas.

2.

Incubacin del substrato: Incube 30 minutos 5 min. a temperatura de laboratorio (+ 20C 5C), protegiendo de la luz.

3.

Adicin de la solucin detencin- stop Agregue 50 ul de solucin detencin -stop (S) a cada pocillo. Mezcle agitando suavemente la placa de forma manual, o bien utilizando un agitador de placas. Asegrese que los pocillos no tengan burbujas.

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4.

Medicin de la densidad ptica: Mida la densidad ptica (DO) bicromticamente a 450 y 630 nm o monocromticamente 450 nm (en la banda amarilla). Se recomiendan las lecturas bicromtica. Si se utiliza un lector monocromtico, asegrese de limpiar el fondo de los pocillos previo a la lectura - la densidad ptica (DO) del control positivo (P) es > 0.3, y, - la densidad ptica (DO) del control negativo (N) es < 0,2*DO P (el ndice de validacin es <-0.1*DO P. Para el clculo del ndice ver la parte VIII).
EXPRESION E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Existen dos mtodos posibles para el clculo e interpretacin de resultados:

Mtodo 1: CALCULO DEL INDICE DE LA MUESTRA

Calcular el valor ndice como sigue: ndice = 0.50 * (DO muestra - 0.4 x DO P) Los puntos de corte son: Punto de corte positivo: 0 Punto de corte negativo: - 0.075 x* DO P DO = Promedio de las densidades pticas, si la prueba se ha realizado por duplicado. . Todo suero individual que presente un ndice > 0 es considerado como positivo Todo suero individual que presente un ndice < - 0.075 x DO P es considerado como negativo Todo suero individual que presente un ndice entre.- 0.075 x DO P y 0 es considerado como sospechoso. Mtodo 2: ANALISIS DE LAS DENSIDADES OPTICAS Calcular el punto d corte de las DO correspondiente a: [0.25 x (CO P)] (Punto de corte negativo) a [0.4 x (DO P)] (punto de corte positivo). Compare el DO de la muestra con estos puntos de corte.

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Interpretacin de resultado:

5.

PROCEDIMIENTO DE LA PRCTICA

Se har una investigacin descriptiva, donde se ha planificado estudiar en el Camal del Cuenca. - Se tom el nombre de cada animal en la ficha correspondiente - Sujecin del animal - Venopuncion vena yugular y tubo de ensayo - Traslado de muestras bajo refrigeracin al laboratorio - Realizacin del diagnstico por parte del laboratorista

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6.

ANALISIS RESULTADOS

Una vez realizada la prueba de laboratorio (micro Eliza) con el objetivo de diagnosticar la presencia o ausencia del virus Rinotraquetis infecciosa bovina en el suero sanguneo de ganado procedente de la provincia de Morona Santiago, los resultados fueron en el 100% negativo ante la prueba De micro Eliza. La interpretacin se realiza en forma porcentual. Se tomaron 30 muestras lo que representa el 100%, siendo en su totalidad negativo, se lo interpreta mejor forma grfica. Esto fue determinado en bovinos de distintas haciendas de diferentes edades y de distintos sexos, el nmero determinado de las muestras fueron de 30 cabezas de ganado de los cuales se obtuvieron todos negativos Para los anlisis del diagnstico respectivo se envi muestras de sangre en tubos recolectadas en el camal de cuenca al Instituto Nacional De Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Inquieta Prez ANALIS ESTADSTICO Rinotraquetis infecciosa bovina Bovinos procedentes de la provincia de Morona Santiago Muestras tomadas en el camal de Cuenca

RESULTADOS
POSITIVOS NEGATIVO 30 TOTAL 30

Bovinos100%

positivo negativo

0%

100%

100% 20

7.- CONCLUSIONES

Una vez realizado la investigacin de la presencia o ausencia del virus de la Rinotraquetis infecciosa bovina, en una pequea muestra (30 muestras de sangre) de bovinos procedentes de la provincia de Morona Santiago, los resultados obtenidos el laboratorio mediante la utilizacin de la prueba de micro Eliza, los resultados fueron en un 100% negativos. Las muestras analizadas en el laboratorio fueron 30, esto representa el 100%, cabe resaltar que las muestras fueron tomadas una por cada bovino adulto en su mayora. Es importante tener en cuenta que esta pequea muestra (30 bovinos estudiados) investigada, no es lo suficientemente considerable para interferir en la poblacin total, debido a que se desconoce el nmero total de bovinos existentes en mencionada provincia, por lo que resulta de muy poca confiabilidad para interferir en la poblacin general, debido a esto no se puede dar una conclusin con fines de tratamiento y control de esta infeccin viral. Es importante hacer notar que, aunque la prevalencia encontrada en esta investigacin es relativamente baja, el virus constituye un alto riesgo para los animales propensos, y en caso de no realizar un diagnstico adecuado y completo en una zona o regin de inters para el investigador, y as mismo la realizacin de una teraputica incorrecta, esta infeccin puede traer grandes problemas en las poblaciones ganaderas del pas, y con ello elevadas prdidas econmicas , debido a que este virus es de distribucin mundial, y adems se transmite con mucha facilidad de una poblacin a otra.

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8. RECOMENDACIONES.

Segn los resultados estadsticos se verifica la ausencia de la enfermedad en esta pequea muestra de animales investigados, pero es necesario no dejar a lado la importancia de la realizacin de programas de prevencin de la Rinotraquetis infecciosa bovina debido a que la enfermedad existe en nuestro pas. Se debe realizar estudios de la prevalencia de la IBR por lo menos cada 5 aos; ampliando las zonas estudiadas e incrementando el nmero de animales, mediante la prueba de micro Eliza para obtener resultados confiables Utilizar el diagnstico de laboratorio como nico medio confiable para detectar la presencia de la enfermedad. Informar los resultaos encontrados al propietario de los animales y recomendar una programa vacunacin con fines preventivos para evitar la ingreso de la enfermedad en la zona.

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9. BIBLIOGRAFIA

BLOOD, D.C., HENDERSON, J. A y RODOSTITS, O .M. Medicina veterinaria. Sexta edicin Mxico D.F. Editorial Interamericana.1988. BURROWS, WILLIAM, Tratado de microbiologa. Vigsima edicin. Editorial interamericana. Mxico D.F. 1974. Alonzo P. Revista 2005 .RINOTRAQUEITIS INFECCIOSA BOVINA. [Sitio en internet].disponible en. http://www.santaelena.com.uy/imgnoticias/2323.pdf. Consultado el 20 de Noviembre del 2011. Manual Merck de informacin mdica.2009.Rinotraqueitis infecciosa bovina. [Sitio en internet] Disponible en: http://www.msd.es/publicaciones/mmerck_hogar/seccion_02/seccion_02_0 09.html. Consultado el 19 Noviembre del 2011. REDVET. Revista electrnica de veterinaria.Vol.N11. Noviembre 2005.diagnstico de Rinotraquetis infecciosa bovina. [Sitio en internet].Disponible en: http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n111105/110515.pdf. Consultado el 18 de Noviembre del 20011

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