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O 1. O bjectivo Neste trabalho, ir-se- observar a degradao do glicognio ao longo tempo: i) em meio cido e temperatura de 100C (degradao qumica); ii) em meio neutro, temperatura ambiente e na presena da enzima amilase (degradao enzimtica). O trabalho integra tambm a construo de uma recta de calibrao usando glucose como acar redutor de referncia. 2. Introduo O glicognio um polmero de glucose que actua como reservatrio de unidades glicosdicas no tecido animal. Num ser bem alimentado, a glucose convertida em glicognio no fgado, glicognio esse que hidrolizado a glucose durante o jejum, onde pode ser totalmente consumido em 24 a 48 horas; aps este perodo, os nveis de glucose no sangue so mantidos a partir de fontes no glicdicas. J a quantidade de glicognio do msculo no afectado pela dieta, permanecendo praticamente constante na ausncia de exerccio violento. O glicognio muscular no contribui directamente para o teor de glucose do sangue (a enzima glucose-6-fosfatase no existe no msculo) mas pode fazlo por via indirecta quando se forma lactato durante as contraces musculares em condies anaerbias. O glicognio um polmero ramificado em que a cadeia principal tem ligaes glicosdicas (14) e com ramificaes em (16). Estruturalmente, semelhante amilopectina do amido, o que permite a sua degradao temperatura ambiente na presena enzima amilase (-1,4-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC. 3.2.1.1.) por hidrlise aleatria das ligaes glicosdicas internas -1,4, sendo o dissacrido maltose o produto final dominante. Na ausncia de catalisador enzimtico, a degradao s conseguida em condies muito mais agressivas (temperatura elevada e meio fortemente cido). A monitorizao da degradao do glicognio baseia-se no aumento de extremidades glicosdicas redutoras que acompanha necessariamente a reaco. De facto, cada ciso numa molcula de glicognio d origem a duas extremidades redutoras, a do glicognio
remanescente, e a do sacrido entretanto removido. Assim, espera-se que haja um aumento do n de extremidades redutoras em soluo com o tempo da reaco de degradao, quer por via qumica quer por via enzimtica. O teor em extremidades redutoras pode ser aferido atravs do teste do reagente DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico, DNS, amarelo), que reage com a extremidade redutora do sacrido formando-se cido 3amino-5-nitrosaliclico (vermelho acastanhado) e cido glucnico, de acordo com a reaco:
O produto da reaco absorve no visvel a = 540nm, o que no acontece com o DNS nem com as restantes espcies no meio reaccional. 3. Reagentes e equipamento - Soluo de NaOH 1.25M - Soluo de HCl 1.5M - Soluo de glucose 1mg/ml - Soluo de glicognio 3mg/ml - Soluo de amilase comercial 0.5mg/ml diluda em H2O (1:120; 1:50; 1:100) - SOLUO A: Soluo de cido 3,5-dinitrosaliclico em meio bsico (1 g cido em 200 ml NaOH 2N) - SOLUO B: Soluo de tartarato de sdio e potssio (300g de tartarato em 500 ml H2O) - Espectofotmetro do visvel - Banhos de gua - Vortex - Pipetas automticas e respectivas pontas - Material corrente do laboratrio 2
4. Procedimento experimental
4.1. Evoluo no tempo da hidrlise do glicognio em meio cido a 100C (degradao qumica)
Identifique 7 tubos (1-7Q). Junte, a cada um deles: 0.5ml sol. glicognio 3 mg/ml 0.5 ml sol. HCl 1.5M Coloque 6 tubos num banho em ebulio e retire-os de 4 em 4 minutos aproximadamente (use o cronmetro; registe o tempo em min:seg.) como indicado na tabela abaixo. Adicione ao tubo no colocado no banho (tubo 1Q) 1 ml de NaOH 1.25M e depois 1ml DNS. Quando retirar cada tubo, arrefea em gelo , junte rapidamente 1 ml de soluo NaOH 1.25 M. Verifique se a soluo j arrefeceu aprox. at Tamb e junte 1 ml de soluo de DNS. Tubo Tempo (min) no banho em ebulio 1Q 0 2Q 4 3Q 8 4Q 12 5Q 16 6Q 20 7Q 24
Aps completar a experincia, rena os tubos (1Q a 7Q). Coloque-os em simultneo num banho de gua em ebulio durante 5 minutos. Ao fim deste tempo retire todos os tubos e arrefea-os em gelo. Leia a A540 nm utilizando o tubo 1Q como branco.
4.2. Evoluo no tempo da hidrlise do glicognio em meio neutro temperatura ambiente na presena de amilase (degradao enzimtica)
Identifique 7 tubos (1-7E). Junte, a cada um deles: 0.5ml sol. glicognio 3mg/ml 0.5 ml H2O destilada 1 ml sol. amilase (ltima a ser adicionada) Prepare tambm uma amostra sem enzima (ASE), juntando num tubo 0.5ml soluo de glicognio e 1.5 ml de H2O. Adicione imediatamente 1 ml da soluo de DNS ao tubo 1E. Retire os restantes tubos da srie (2-7E) de 3 em 3 minutos (use o cronmetro; registe os tempos em min:seg.) como indicado na tabela abaixo e adicione 1 ml de reagente de DNS.
1E 0
2E 3
3E 6
4E 9
5E 12
6E 15
7E 18
ASE 18
Aps completar a experincia, rena os tubos (1-7E e ASE). Leve todos os tubos, em simultneo, ebulio durante 5 minutos. Retire em simultneo e arrefea. Leia a A540 nm contra o tubo 1, que funciona como branco . Mea tambm a absorvncia da ASE. Caso tenha curiosidade, repita a experincia anterior substituindo a soluo de amilase comercial por uma soluo de saliva (1 gota) em ca. 10 ml de gua destilada.
Adicione a cada tubo 1 ml de reagente de DNS. Leve depois todos os tubos, em simultneo, ebulio durante 5 minutos. Retire em simultneo e arrefea. Leia as Absorvncias a 540 nm contra o tubo 0, que funciona como branco.
5. Bibliografia Plummer DT (1987) An Introduction to practical biochemistry 3rd Ed, McGraw-Hill Book Co (London) pp180-186 Rawn J (1983) Biochemistry, Harper & Row Publishers Inc (NY), pp.668-692 Bohinski RC(1983) Modern Concepts in Biochemistry 4th Ed, Allyn&Bacon Inc (Boston) pp214-216. Protocolo Experimental Monitorizao da degradao do Glicognio DQ, FCT-UNL (2007) 6. Relatrio e clculos 1. Determinao das concentraes das solues-padro de glucose. Construo da recta de calibrao 2. Construo do grfico da concentrao em acar redutor em funo do tempo em segundos para as duas situaes (hidrlise qumica e enzimtica). Expresso do teor em extremidades redutoras em termos de equivalentes de glucose. 3. Discusso dos resultados tendo em conta: a absoro da ASE; a quantidade de produto formado por hidrlise qumica e enzimtica aps um dado perodo de tempo. 7. N O R M AS PA R A A E L A B O R A O D O R E L A T R I O Os relatrios devero ser redigidos correctamente e descrever o trabalho efectuado utilizando linguagem clara e no ambgua. Qualquer figura, grfico, etc. retirado da literatura dever ser devidamente referenciado. O relatrio ter o seguinte formato: Pgina de rosto, que contm: Ttulo do trabalho Data de execuo do trabalho, dia da semana, perodo (manh-tarde) n do grupo e identificao dos membros do grupo (nome e nmero da FCT) Nome do docente responsvel
Resumo (max. 1 pg) Indica o objectivo ou objectivos do trabalho e os mtodos utilizados. Contm os principais resultados quantitativos e/ou concluses obtidos. Resultados e discusso Apresenta, de forma completa mas concisa, todos os resultados experimentais obtidos, sempre que possvel em tabelas e grficos (construdos utilizando uma folha de clculo como o Excel) numerados e identificados com ttulos explicativos. As tabelas devero especificar as unidades e os valores devero ter o n correcto de algarismos significativos. Os grficos devero ser devidamente dimensionados e expressar as unidades e a graduao dos eixos. Quando existam valores obtidos a partir de regresso linear, deve apresentar-se o valor de R correspondente. Nos casos em que necessrio efectuar uma srie de clculos anlogos, dever exemplificar-se com um caso e tabelar os restantes. A discusso inclui a comparao dos resultados obtidos com os previstos e com os apresentados na literatura e sugestes para as razes dos eventuais desvios verificados. Incluir tambm uma avaliao global do trabalho e sugestes para alteraes que paream pertinentes, devidamente justificadas. Referncias Anexos (facultativo)