UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA SETOR DE CINCIAS AGRRIAS E DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE AGRONOMIA

DAUANE CARNEIRO GOMES EDUARDO AUGUSTO TEIXEIRA OLIVEIRA JOO FRANCISCO ROLIM CANHA TAIS DA SILVA

PRTICA 11 CROMATOGRAFIA EM COLUNA

PONTA GROSSA 2011

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DAUANE CARNEIRO GOMES EDUARDO AUGUSTO TEIXEIRA OLIVEIRA JOAO FRANCISCO ROLIM CANHA TAIS DA SILVA

PRTICA 11 CROMATOGRAFIA EM COLUNA

Relatrio obteno

apresentado de nota

para parcial,

relacionada ao segundo semestre na Universidade Estadual de Ponta Grossa, rea de Cincias Agrrias e de Tecnologia.

Profa: Joelma Adriane W. Albach

PONTA GROSSA 2011

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SUMRIO

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INTRODUO .........................................................................................4 OBJETIVO ................................................................................................7 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ........................................................8 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................9 CONCLUSO ..........................................................................................11 RESPOSTAS DAS QUESTES PROPOSTAS PELO PROFESSOR....12 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.........................................................13

1. INTRODUO A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Ela est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a torna uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao. O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilizao atribuda a um botnico russo ao descrever suas experincias na separao dos componentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a passagem de ter de petrleo (fase mvel) atravs de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de clcio (fase estacionria), qual se adicionou o extrato, levou separao dos componentes em faixas coloridas. Este provavelmente o motivo pelo qual a tcnica conhecida como cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar errnea idia de que o processo seja dependente da cor. Apesar deste estudo e de outros anteriores, que tambm poderiam ser considerados precursores do uso dessa tcnica, a cromatografia foi praticamente ignorada at a dcada de 30, quando foi redescoberta. A partir da, diversos trabalhos na rea possibilitaram seu aperfeioamento e, em conjunto com os avanos tecnolgicos, levaram-na a um elevado grau de sofisticao, o qual resultou no seu grande potencial de aplicao em muitas reas. A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura. As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando- se diversos critrios, sendo alguns deles listados abaixo:

1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfico Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP),
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cromatografia por centrifugao (Chromatotron) e cromatografia em camada delgada (CCD), so diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais sero mais bem compreendidos quando classificados por outro critrio.

2. Classificao pela fase mvel empregada Em se tratando da fase mvel, so trs os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia supercrtica (CSC), usando-se na ltima um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crtica. A cromatografia lquida apresenta uma importante subdiviso: a cromatografia lquida clssica (CLC), na qual a fase mvel arrastada atravs da coluna apenas pela fora da gravidade, e a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), na qual se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso para a eluio da fase mvel. A CLAE foi inicialmente denominada cromatografia lquida de alta presso, mas sua atual designao mostra-se mais adequada. No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A diferena entre os dois tipos est na coluna. Enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionria um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior dimetro empacotadas com a fase estacionria.

3. Classificao pela fase estacionria utilizada Quanto fase estacionria, distingue- se entre fases estacionrias slidas, lquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria ser constituda por um lquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre como ele. fases Suportes modificados ligadas, so por

considerados

separadamente,

quimicamente

normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separao.

4. Classificao pelo modo de separao Por este critrio, separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio, troca inica, excluso ou misturas desses mecanismos. Para se ter uma viso mais ampla dos diferentes tipos de cromatografia, os mesmos esto
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dispostos no diagrama da Figura 1. Dentre os vrios tipos de cromatografia, especial nfase ser dada cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia lquida clssica e de alta eficincia (CLAE) e cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR).

Cromatografia em coluna

Cromatografia lquida clssica Esta tcnica muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de reaes qumicas. As fases estacionrias mais utilizadas so slica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionria lquida. Fases estacionrias slidas levam separao por adsoro e fases estacionrias lquidas por partio. Suportes quimicamente modificados tambm tm sido usados, sendo o processo de separao misto neste caso. Esses suportes so acondicionados em tubos cilndricos geralmente de vidro, de dimetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. A Fig. 3 uma ilustrao de uma coluna cromatogrfica empacotada com slica, sendo mostrados seus demais constituintes.

Os adsorventes possuem partculas na faixa de 60-230 mesh, de modo a possibilitar um fluxo razovel do solvente atravs da coluna. O uso de slica de partcula menor (230-400 mesh) como adsorvente para essas colunas requer a utilizao de um sistema de bombeamento para o empacotamento e eluio, sendo conhecido como Cromatografia Flash. A principal etapa ao se utilizar essa tcnica o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definir a eficincia da separao. Enquanto a alumina empacotada em sua forma original, a slica deve s-lo na forma de suspenso. coluna adiciona-se uma pequena quantidade de solvente e depositase na sua extremidade inferior um chumao de algodo com espessura de aproximadamente 0,5 cm para impedir a passagem de partculas da fase estacionria. A adio de slica deve ser feita com a torneira semi-aberta. O adsorvente adicionado lentamente coluna fixada na posio vertical, batendo-se continuamente ao longo da mesma para que todo o ar seja expulso, de modo a se obter uma compactao uniforme. A existncia de ar entre as partculas leva formao de canais na coluna, os quais alargam as bandas eludas.

Nunca se deve permitir que o nvel do solvente desa abaixo do nvel do adsorvente, o que poderia acarretar rachaduras, comprometendo a eficincia da coluna. Aps o empacotamento, conveniente que se passe uma certa quantidade do eluente (duas a trs vezes o volume da coluna) a ser utilizado atravs da coluna antes da introduo da amostra. Esta adicionada coluna com o auxlio de uma pipeta no momento em que o nvel do eluente esteja o mais prximo possvel do adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a serem eludas. Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente ento adicionado cuidadosa e continuamente. A escolha do eluente segue os princpios discutidos em CCD, mas neste caso ele pode ser mudado durante o processo cromatogrfico. Se, por exemplo, a amostra constituda por duas substncias, uma apolar e outra polar, utiliza-se primeiramente um eluente apolar e em seguida um eluente polar. O volume das fraes a serem recolhidas funo da quantidade de amostra e do grau de dificuldade da separao. Para anlise das mesmas, recorre-se a alguma tcnica auxiliar, usualmente CCD. Em vista de que geralmente algumas partculas da amostra

permanecem irreversivelmente adsorvidas fase estacionria, a cada separao necessrio um tratamento para a recuperao do adsorvente.

2. OBJETIVO Separao dos pigmentos do espinafre por cromatografia em coluna.

3. MATERIAL E MTODOS

Materiais utilizados - Folhas de espinafre - Mistura de ter de petrleo/acetona (80:20) - Slica gel - Algodo - ter de petrleo - lcool etlico

Preparao da amostra Primeiramente preparou-se a amostra a ser cromatografada. Amassouse as folhas de espinafre num almofariz juntamente com 50 ml da mistura ter de petrleo/acetona (80:20). As folhas foram amassadas at a obteno de uma colorao esverdeada.

Preparao da coluna Em seguida, preparou-se a coluna para a cromatografia. Colocou-se um pedao de algodo na parte inferior da coluna (espessura de 0,5 cm), no caso, uma bureta. Empacotou-se a coluna com 40 g de slica gel, utilizando ter de petrleo. Preparou-se a suspenso do solvente e adicionou-se lentamente pela extremidade superior da coluna, com a torneira semi-aberta, tomando cuidado de sempre bater continuamente na mesma, para que todo o ar seja expulso, obtendo uma compactao uniforme, tomando cuidado para que a slica no secasse dentro da coluna. Em seguida adicionou-se o solvente com o auxlio de uma pipeta, pelas paredes da coluna. Verificou-se a uniformidade da coluna, e, em seguida, adicionou-se 4 ml do extrato bruto, e eluiu-se com ter de petrleo, sempre pelas paredes da coluna. Recolheu-se as fraes as quais continham as primeiras substncias. Adicionou-se lcool etlico aps a separao das substncias, para a eluio das outras substncias.

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4. RESULTADOS E DISCUSSO

Na primeira parte do experimento, j estava preparado o pigmento do espinafre, assim iniciou-se a montagem da slica em uma bureta, a qual requeria-se muita ateno e cuidado na preparao, pois qualquer erro manual poderia acarretar em rachaduras na slica e ainda a falta de solvente (ter de petrleo) poderia fazer com que a slica secasse, consequentemente no

conseguiria um bom rendimento. Mas mesmo com toda informao ocorreram inmeras rachaduras, mesmo assim efetuou-se o procedimento, pesou-se a slica (4g) misturou-se ao ter de petrleo e colocou-se na bureta, demorou esse processo, pois como invivel a colocao de mais solvente, aps colocar o solvente lentamente na bureta esperava-se o mesmo cair em um erlenmeyer para introduzi-lo novamente na bureta. Aps isso foi adicionado o extrato de espinafre eluido em ter de petrleo, e mesmo com as inmeras rachaduras que afetaram a infiltrao dos compostos e do rendimento, conseguiu- se a extrao de um pigmento amarelo, o beta-caroteno, comprovando que o mesmo pouco polar, assim como o solvente (ter de petrleo) responsvel pelo arraste do pigmento, alm do mais a maior quantidade do solvente no permite a adsoro do pigmento a slica. Como o segundo pigmento que era de colorao verde, certamente clorofila, continuou acima da fase estacionaria, provando que era mais polar do que o primeiro a ser retirado, pois tinha mais afinidade com a slica que polar, utilizou se um solvente com maior polaridade (etanol) para arrastar a clorofila, e ainda assim ficou-se observando para que o solvente no passasse pela slica para no haver ressecamento, porm devido ao curto tempo de aula no foi possvel observar a etapa de retirada do pigmento (clorofila) do extrato de espinafre, mas atravs do outro grupo pode-se observar a extrao do pigmento verde, verificando assim que o mtodo da cromatografia em coluna eficiente, at mesmo para extrao de pigmento ou compostos desejveis, alm de uma boa separao dos compostos verificada pela polaridade dos mesmos, s que bem trabalhosa pois exige muita ateno, alm de tempo disponvel para sua realizao.

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5. CONCLUSO

Com o experimento da cromatografia em coluna, apesar de terem ocorrido rachaduras na slica, pois nela a formao da fase estacionaria um processo, que exige muita ateno, foi possvel aprender um novo mtodo de cromatografia onde h a separao dos compostos de diferentes polaridades, sendo assim uma boa maneira para se extrair pigmentos, nesse caso o amarelo e o verde. Com o extrato de espinafre eluido com ter de petrleo, o primeiro composto a percolar pela fase estacionaria foi um pigmento de colorao amarela, o beta-caroteno, com pouca polaridade assim como o ter de petrleo, o segundo composto a ser retirado foi a clorofila de colorao verde, com a utilizao de etanol, que tem maior polaridade assim como a clorofila, como solvente.

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6. RESPOSTAS DAS QUESTES PROPOSTAS

1) Explique o processo de separao de misturas em uma cromatografia em coluna. Na cromatografia em coluna, o slido utilizado na fase estacionria deve ser um material insolvel na fase mvel associada (eluente); sendo que os mais empregados so a slica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de p finamente dividido. A mistura a ser separada colocada na coluna com um eluente pouco polar e aumenta-se gradativamente a polaridade do eluente e conseqentemente o seu poder de arraste de substncias mais polares. 2) Quais as substncias separadas na eluio com ter de petrleo e com o etanol? -caroteno e clorofila. 3) Desenhe as estruturas qumicas dos compostos -caroteno, clorofila A e B. -caroteno

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7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALLINGER, N.L.; CAVA, M.P.; DE JONGH, D.C.; LEBEL, N.A. e STEVENS, C.L. Qumica Orgnica. Trad. R.B. de Alencastro. Rio de Janeiro: Guanabara Dois, 1976.

COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introduo a mtodos cromatogrficos. Campinas: Editora da Unicamp,1997.

NETO, F.R.A.; CGAR em anlise de resduos. Qumica Nova, v. 18, n. 1, p. 6567, 1995.

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