6. PRUEBAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICACIN BACTERIANA 6.1.

INTRODUCCIN La identificacin bacteriana se realiza tras el estudio de las caractersticas tintoriales, morfolgicas y bioqumicas de los microorganismos. La identificacin bioqumica se basa en la habilidad de las bacterias de producir enzimas fcilmente detectables, en las caractersticas metablicas especficas de cada microorganismo, etc. Con este fin, existen en el mercado una enorme variedad de medios de cultivo diseados no slo para permitir el crecimiento y multiplicacin de los microorganismos, sino tambin para inhibir los de otros (medios selectivos) o resaltar determinadas caractersticas metablicas (medios diferenciales). Como la mayor parte de los seres vivos, las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea, captando sustancias necesarias para su multiplicacin y liberando al medio productos de desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno son propias y caractersticas. Esta especificidad depende del genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimtico. La caracterizacin de dichas enzimas es una til herramienta para la identificacin y clasificacin bacteriana. 6.2. ACTIVIDAD BIOLGICA Un ser vivo se define principalmente por desarrollar una serie de actividades biolgicas, durante su ciclo vital. sta actividad biolgica consiste en un variedad de reacciones fsicoqumicas que transcurren en el marco de las clulas y denominamos como bioqumica. El conjunto de reacciones que puede realizar un ser vivo se llama metabolismo y engloba tanto las reacciones de degradacin (catabolismo) como de sntesis (anabolismo). Las reacciones parten de una base denominada nutriente o sustrato, a partir de la cual se obtiene la energa y las molculas necesarias para formar sus propios compuestos. Las bacterias forman un grupo muy heterogneo, ya que la diversidad de especies existentes, pueden realizar todo tipo de metabolismo. Algunas especies poseen dos tipos de metabolismo diferente que utilizan facultativamente, dependiendo de la abundancia nutritiva del medio. Requerimientos qumicos Carbono. Los microorganismos son extraordinariamente diversos tanto respecto a la clase como al nmero de compuestos orgnicos que pueden usar como fuente principal de carbono y energa. Esta diversidad, se manifiesta en el hecho de que no hay ningn compuesto orgnico que exista en la naturaleza que no pueda ser utilizado como fuente de carbono y energa por algn organismo. Los organismos que realizan la fotosntesis y las bacterias que obtienen la energa a partir de la oxidacin de compuestos inorgnicos (quimiolittrofas) usan tpicamente la forma mas oxidada del Carbono, el C02, como nica o principal fuente de Carbono celular. Todos los dems organismos obtienen el carbono principalmente a partir de nutriente orgnicos. Algunas bacterias son capaces de utilizar sustancias muy sencillas como cido actico,

alcohol, citrato sdico, etc. En otras ocasiones, la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azcares en forma de mono o disacridos, como glucosa, lactosa, maltosa, etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azcares ms complejos para obtener energa, como es el caso del almidn. Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso, hidrocarburos como fuente de energa. Por ltimo, existen especies, como por ejemplo Pseudomonas, que pueden utilizar como fuente de energa un gran nmero de componentes hidrocarbonados diferentes. En general, conocer el tipo de azcar utilizado por cada bacteria es muy til para su identificacin bioqumica y consiguiente clasificacin taxonmica. Nitrgeno, azufre, fsforo El nitrgeno y el azufre se encuentran en los compuestos orgnicos de la clula principalmente en forma reducida como grupos amino y sulfhidrilo. La mayora de los organismos fotosintticos, as como muchas bacterias no fotosintticas y hongos, asimilan estos dos elementos en estado orgnico oxidado, como nitratos y sulfatos, su utilizacin implica, pues, una reduccin preliminar. Los requerimientos de nitrgeno y azufre pueden satisfacerse tambin con frecuencia, con nutrientes orgnicos que contengan estos dos elementos en combinacin orgnica reducida (aminocidos o productos ms complejos de la degradacin de las protenas, como las peptonas). Existen muchos tipos de peptonas y son excelentes fuentes de nitrgeno. Entre las ms frecuentes y conocidas se encuentran los extractos de levadura que son extractos hidrosolubles preparados a partir de un lisado de levadura que se utiliza en muchos medios de cultivo. Fsforo, la fuente habitual de este elemento lo constituyen los fosfatos. Iones metlicos (K, Mg, Fe, Zn, Mn, Co, etc.)
RESPIRACIN. El oxgeno se encuentra a disposicin de las clulas en forma de agua. Est

contenido adems en el anhdrido carbnico y en muchos compuestos orgnicos. Muchos microorganismos necesitan adems oxgeno molecular (O2). En funcin del requerimiento de oxgeno para la respiracin celular: a. aerobios obligados o estrictos, slo pueden obtener energa mediante la respiracin y necesitan O2. Entre los microorganismos que son aerobios estrictos, algunos crecen mejor a presiones parciales de oxgeno considerablemente mas bajas que las presentes en el aire. Se denominan mcroaerfilos. b. anaerobios obligados, slo crecen en un medio exento de O2, el O2 es txico para ellos. c. anaerobios facultativos crecen tanto en presencia como en ausencia de O2. Entre ellos hay que distinguir dos tipos: aerotolerantes, bacterias del cido lctico, aunque pueden crecer en presencia de O2, no pueden utilizarlo, sino que obtienen energa exclusivamente por fermentacin. anaerobias facultativas (Enterobacteriaceas) y muchas levaduras pueden obtener energa tanto por respiracin (en presencia de O2), como por

fermentacin (en ausencia de O2). 6.3 RESPIRACIN Y FERMENTACIN Una vez que la glucosa se ha degradado a cido pirvico, este cido puede seguir oxidndose por la va de la respiracin o la fermentacin. La RESPIRACIN (fosforilacin oxidativa) es un proceso, en el que funciona una cadena transportadora de electrones mediante coenzimas que se reducen, hasta llegar a una molcula inorgnica, que acta como aceptor final de electrones (generalmente el O2). La oxidacin produce energa en forma de ATP. Respiracin aerbica se llama as cuando el aceptor final de hidrgeno (electrones) es el oxgeno molecular O2. Respiracin anaerbica es aquella en la que el aceptor final de hidrgeno (electrones) es una molcula inorgnica distinta del oxgeno molecular, como iones nitrato, sulfato o carbonato. FERMENTACIN Este proceso se inicia a partir del cido pirvico, tiene como caractersticas fundamentales: 1. No requiere oxgeno (aunque a veces puede ocurrir en su presencia) 2. No necesita cadenas transportadoras de electrones (ciclo de Krebs) 3. Utiliza molculas orgnicas como aceptor final de electrones 4. Libera energa a partir de azcares u otras molculas orgnicas como aminocidos, cidos orgnicos, etc. 5. Tiene un rendimiento menor que la respiracin En la respiracin toda la energa de la glucosa se aprovecha, ya que los productos finales CO2 y H2O estn exentos de energa. En cambio, en la fermentacin; al dar como productos finales CO2 y un compuesto orgnico (etanol, cido lctico) todava dotado de energa, significa un aprovechamiento incompleto de las posibilidades energticas de la glucosa. La fermentacin es un sistema utilizado frecuentemente por algunos m.o. como, levaduras y determinadas bacterias). Tambin en algunas clulas animales y plantas en condiciones especiales. Algunas clulas (anaerobias estrictas) realizan la fermentacin porque carecen de la dotacin enzimtica precisa para la respiracin; pero es frecuente que esta se produzca cuando las clulas no tienen a su disposicin el oxgeno (anaerobia facultativas). Esta circunstancia se da en las levaduras.

Las levaduras actan sobre el mosto, degradando la glucosa por va respiratoria. Cuando en los lagares, por efecto de la acumulacin del CO2 encima del mosto, el aire no entra en contacto con la levadura, se inicia entonces la fermentacin de la glucosa con la correspondiente formacin de alcohol. Hay que remarcar, respecto al papel que desempea el oxgeno en la respiracin, que el proceso respiratorio, al igual que la fermentacin, es un proceso de oxidacin, pero en el que esta oxidacin sucede no por ganancia de oxgeno, sino prdida de hidrgeno. El oxgeno es, simplemente, el aceptor final de hidrgeno en la respiracin, como lo son otros compuestos orgnicos en la fermentacin.

Metabolismo: Los conceptos heterotrofo y autotrofo pensados para denominar los tipos de nutricin de animales y plantas, no son suficiente para caracterizar la variedad de tipos nutricionales que se dan en los microorganismos. Los tipos nutricionales en este reino, se clasifican segn sea: a. Fuente de energa Fototrofas (Foto) obtienen la energa directamente de la luz. Quimiotrofas (Quimio) obtienen la energa por reacciones red-ox degradando sustancias independientemente de que realizen respiracin o fermentacin. b. Dadores de hidrgeno y fuentes de carbono Organotrofos Utilizan sustancias orgnicas como dadores de hidrgeno Litotrofos Utilizan dadores de hidrgeno inorgnicos (H 2, NH3, H2S, S, CO, Fe2+...) Estos trminos organotrofos y litotrofos sustituyen a los tradicionales: Autotrofo obtienen la mayora del carbono por fijacin del CO

Heterotrofo extraen el carbono celular de sustancias orgnicas.

Energa Fuente de C dador de electrones Foto (luz) auto (CO2) Lito (comp. inorg.) Quimio Hetero rgano (comp. org) En general, basta con indicar el proceso de obtencin de energa y el dador de hidrgenos. 1. Foto lito trofoh Fotoautolitotrofo (plantas, cianobacterias, bacterias rojas del S) 2. Foto rgano trofo h Fotoheterorganotrofo (Piloodobacterias, bacterias rojas no S) 3. Quimio lito trofo h Quimioautolitotrofo (bacterias nitrificantes) 4. Quimio rgano trofo h Quimioheterorganotrofo (animales, hongos, bacterias) (1 y 4 ------------> Eucariotas)

Bacterias fototrficas. La capacidad de utilizar la luz como fuente de energa para el crecimiento es propia de dos grupos de bacterias: 1. Cianobacterias. Utilizan agua como dador de hidrgenos y liberan oxgeno en presencia de la luz solar (fotosntesis oxignica). 2. Bacterias rojas y verdes. No pueden utilizar el H2O como dador de hidrgenos, sino que necesitan un dador de [H] fuertemente reducido (H2S, H2, materia orgnica). Como consecuencia estas bacterias no liberan oxgeno durante la fotosntesis (fotosntesis anoxignica). Se las considera como reliquias de los primeros tiempos de la fotosntesis. Son bacterias unicelulares acuticas , de color rojo, naranja o verde, en

funcin del contenido que posean de pigmentos fotosintticos: bacterioclorofilas y carotenoides. En las zonas anaerbicas de los lagos (10-30 m. de profundidad) se da un crecimiento estacional de las bacterias rojas del azufre por darse condiciones para su crecimiento: Radiacin solar en la zona del espectro azul, verde-azul (450-500 nm) que corresponde a la zona de absorcin de los carotenoides. H 2S (descomposicin sulfatos y protenas) CO 2 y materia orgnica. El metabolismo de las bacterias fototrficas representa el grupo de organismos metablicamente ms verstil. Hay grupos con capacidades de desarrollo diversas: anaerbicamente con luz y aerbicamente en la oscuridad anaerbicos estrictos y fototrofos obligados Dador de hidrgenos: H 2S, H2, S (segn grupos). Fuente de carbono: CO 2, materia orgnica (segn grupos). Bacterias aerbicas quimiolitotrofas. Bacterias de suelos y aguas con capacidad de utilizar compuestos o iones inorgnicos como dadores de hidrgenos y CO2 como fuente de carbono. La Nitrobacterias (Nitrosomas, Nitrobacter), son bacterias nitrificantes que oxidan el NH4+ (liberado en el proceso de descomposicin microbiana de la materia orgnica) a NO2- y ste a su vez de NO2- a NO3NH3 ------ -----> NO2- Nitrosomas NO2- -----------> NO3- Nitrobacter S0, S2-, S2O32--------------> SO42- Thiobacillus thiooxidans Fe2+ --------------> Fe3+ Thiobacillus ferrooxidans La obtencin de energa tiene lugar, por lo general, a travs de la respiracin con O2 y slo escasos m.o. pueden utilizar NO3-, NO2-, N2O como aceptor de electrones (R.anaerobia). Fijacin del nitrgeno molecular: Solo algunos procariotas son capaces de captar y fijar el nitrgeno atmosfrico (N2). En parte en formas de vida libre, en parte en simbiosis con plantas superiores, pueden pasar al N2 inerte a una combinacin orgnica, incorporndolo directamente (Rhizobium) o a travs de las sustancias celulares a la protena del suelo. N2 + 8 [H] -------> 2 NH3 + H2 La fijacin simbitica del N2 por leguminosas (Rhizobium) produce 100-300 Kg N/(Ha.a.) Los microorganismos de vida libre fijadores de N2 aportan al suelo entre 1-3 Kg. N/(Ha.a.)

Las lluvias pueden aportar al suelo entre 3-30 Kg N/(Ha.a.)

Respiracin anaerobia: En sedimentos, lagunas y suelos permanentemente inundados (condiciones anxica) se desarrollan bacteria que utilizan como fuente de carbono y dadores de hidrgeno los compuestos producidos por las bacterias fermentadoras, o que estas no han utilizado (final cadena alimentaria). NO -------> N2, N2O (xido nitroso) sulfato, azufre -----> H 2S CO 2, CO32-------> CH4, CH3COOH Fe3+ --------> Fe2+
3-

Los respiradores anaerbicos tienen gran importancia por: Ciclos de los elementos y mantenimiento de los equilibrios en la biosfera. Respiracin anaerbica como forma predominante en las primeras etapas de formacin de la biosfera en la Tierra (almacenamiento de carbono orgnico en los sedimentos arcaicos). Cuando los campos no estn bien aireados se produce un proceso de desnitrificacin por la respiracin de los nitratos. Tipos de fermentaciones anaerbicas puesto que la vida surgi en una atmsfera carente de oxgeno, la fermentacin anaerbica constituye el mecanismo biolgico mas primitivo destinado a obtener energa de los alimentos. 6.4 VAS FERMENTATIVAS DEL CIDO PIRVICO: 1. Lctica. Se produce cido lctico en la fermentacin del pirvico. a. Homolctica se produce nicamente cido (Lactobacillus, Streptococcus en la produccin de derivados de la leche1 : yogur, queso, leche cida..., ) b. Fermentacin heterolctica. aparecen ademas del cido lctico, otros compuestos como etanol o dixido de carbono. I. cido mixta. II. Butanodilica 1. Fermentacin alcohlica el cido pirvico se transforma en etanol y dixido de carbono (tpica en levaduras muy rara en bacterias). Esta fermentacin la realizan levaduras del tipo Saccharomyces y, dependiendo de la cepa de levadura y del proceso de fabricacin, se originan gran variedad de bebidas alcohlicas: wisky, cerveza, sidra, vino... La fermentacin de los polisacridos de la harina en el proceso de fabricacin del pan es tambin un ejemplo de fermentacin alcohlica. El dixido de carbono es el responsable del ahuecamiento de la masa y tanto el como el alcohol desaparecen en el proceso de coccin. 2. Fermentacin propinica. Va lenta. (Corynebacterium) 3. Fermentacin butrica - butlica (tpica de anaerobios) 4. Fermentacin ptrida o PUTREFACCIN Consiste en la desintegracin de las grandes molculas proteicas de los residuos vegetales y cadveres animales llegando a formarse aminocidos. En este proceso se liberan gases como el amonaco, dixido de carbono, hidrgeno, metano y otros de olor ftido, como el sulfuro de hidrgeno, el nidol y el escatol. se producen tambin ptomanas (muy txicas).

la enzima -galactosidasa permite a estos m.o. hidrolizar la lactosa en glucosa-galactosa

Fermentacin actica El trmino fermentacin se suele utilizar en un sentido ms amplio, al aplicarlo tambin, para referirse a una serie de procesos en los que s interviene oxgeno, aunque el producto final es un compuesto orgnico y por tanto no hay degradacin completa de la materia orgnica (fermentaciones oxidativas). La fermentacin actica la realizan bacterias del gnero Acetobacter transformando el etanol en cido actico, por un proceso de oxidacin en presencia de oxgeno (vino en vinagre). Los m.o. aerbicos que producen el vinagre forman una telilla sobre la superficie del vino, para poder permanecer en contacto con el aire. 6.5. CARCTERES BIOQUMICOS. Basadas en el estudio del metabolismo de diferentes tipos de sustrato, las reacciones bioqumicas son un carcter taxonmico, que permite la clasificacin de las bacterias por su posesin de enzimas. 1. ENZIMAS EXTRACELULARES: Las biomolculas de estructura polimerizada como almidn, protenas y lpidos, tienen un peso molecular excesivo para atravesar la membrana celular. Para que la clula pueda utilizar dichas sustancias como sustrato, ser preciso que disponga del equipo enzimtico adecuado. Estas molculas deben ser primero hidrolizadas por enzimas extracelulares especficas, en sus respectivas unidades de construccin. Estas molculas de bajo peso molecular podrn ser entonces transportadas al interior de las clulas y utilizadas en el metabolismo celular.

Almidn ------- amilasa --------> Maltosa ---------- maltasa ----------> Glucosa Triglicridos ---- lipasas --------> cidos grasos + glicerol Protenas -------- proteasas (protelisis) --------> Peptonas ----------> Aminocidos 2. HIDRATOS DE CARBONO A. Polisacridos: Almidn: La amilasa hidroliza el almidn. si aadimos al medio una pequea cantidad de Lugol, este reacciona con el almidn, dando color azul intenso. Alrededor de las colonias que poseen amilasa, aparece una zona clara que indica que el almidn ha sido consumido. B. Disacridos. Lactosa: La bacterias que poseen la encima -galactosidasa son capaces de desdoblar la lactosa (medios Mc Conkey, KIA...) en glucosa y galactosa. La glucosa es fermentada y acidifica el medio. La disminucin del pH del medio se evidencia por el uso de indicadores. Las bacterias que carecen de la enzima galactosidopermesasa dan fermentacin tarda de la lactosa (prueba ONPG2). C. Monosacridos Capacidad de metabolizar (GLU, ARA3). 3. PRTIDOS.

a. Protenas completas: Gelatina. Protena derivada del colgeno, uno de los componentes del tejido conjuntivo. La enzima gelatinasa hidroliza la gelatina y la lica, sobre todo en la superficie del medio. La prueba se realiza a 22 C (la gelatina funde a 30 C y dara falsos "+") b. Aminocidos. Se pueden degradar de tres formas: I. Desaminacin: Eliminacin del grupo amino (-NH2). La prueba de la fenilalanina consiste en desaminar este aminocido (fenilalanina desaminasa) dando cido fenilpirvico. Aadiendo FeCl3 forma un complejo verde intenso.(TDA 4) II. Descarboxilacin: Ruptura del grupo carboxilo (-COOH), por la enzima descarboxilasa, producindose la alcalinizacin del medio y formacin de CO2. Son importantes las descarboxilaciones anaerbicas. Aminocidos lisina 5, ornitina 6 .
2

ONPG - Las bacterias que poseen -galactosidasa pero no galactosidopermeasa dan (-) en la prueba de la lactosa. La ONPG (ortonitrofenolgalactosido) atraviesa fcilmente la pared bacteriana y es desdoblada por la -galactosidasa en galactosa ms un radical de color amarillo. Se utiliza esta prueba bioqumica para la identificacin de las bacterias fermentadoras tardas de la lactosa (entre 2-15 das en fermentar la lactosa).
3

GLU, ARA capacidad de metabolizar los monosacridos glucosa y arabinosa

4

TDA- Se detecta la presencia de la enzima TDA (triptofano desaminasa) La enzima produce la desaminacin del sustrato (triptfano) Identificacin: la adicin de FeCl3 da verde obscuro si esta presente TDA
5

LDC - En la degradacin proteica intervienen numerosos hongos y bacterias (Bacillus cereus, Mycoides, Pseudomonas, Proteus vulgaris...). Las bacterias que poseen la enzima lisina descarboxilasa pueden catabolizar anaerbicamente aminocidos (lisina) segn la siguiente reaccin de descarboxilacin: Lisina H2N - (CH2)4-CHNH2-COOH ------->H2N-(CH2)4-CH2-NH2 (cadaverina) + CO2

III. Degradacin total del aminocido (descarboxilacin + desaminacin) Indol H

2S 8 7

a. Derivados de aminocidos: Urea 9 1. LPIDOS La lipasa acta sobre los lpidos dando cidos grasos . Las sales de estos cidos grasos se emplean como nica fuente de carbono (agar citrato10) . La produccin de sustancias alcalinas provocan el viraje del azul de bromotimol (amarillo pH<6 y azul pH>7,6) 2. VAS DE OBTENCIN DE ENERGA: a. Respiracin (enzimas respiratorios: Oxidasa11, Catalasa12, reduccin de nitratos13)

b. Fermentacin (amplia variedad de tipos) I. cido mixta. Prueba de RM II. Butanodilica. Prueba VP

ODC - Degradacin anaerbica de aminocidos. La enzima ornitina descarboxilasa permite degradar: Ornitina ------(descarboxilacin)---------->H2N-(CH2)4-NH2 (putrescina) + CO2
7

IND - La degradacin total del aminocido triptfano por la enzima triptofanasa Triptofano-------descarboxilacin + desaminacin-------> indol+ piruvato+amonaco Indol + p-dimetilaminobenzaldehdo (R. Kovaks) ----------------> anillo color rojo
8

H2S - La fermentacin de aminocidos sulfurados: cistena, metionina (generalmente se aade al medio de cultivo una fuente adicional de azufre en forma de tiosulfato de sodio) puede dar H2S. Al unirse a las sales de hierro da un precipitado de color negro
9

URE - H2N-CO-NH2 -----------------ureasa------------> CO2+NH3+H2O (+ rojo fenol)

10

CIT. La capacidad de metabolizar lpidos se evidencia utilizando cidos grasos (o mejor sus sales) como nica fuente de carbono. La produccin de sustancias alcalinas provocan el viraje del azul de bromotimol (amarillo pH<6 y azul pH>7,6)
11

OX - Deteccin de la enzima respiratoria citocromo c. Realizar la prueba de la Oxidasa con una colonia, en un papel de filtro, antes de empezar con la galera. De esta forma si da un resultado positivo, se descarta el grupo de enterobacterias. El test API 10S est pensado para identificar enterobacterias y otros bacilos Gram (-)
12

Catalasa Capacidad de eliminar el perxido de hidrgeno 2 H2O2 --------> H2O + O2

13

NO2 - Detecta la presencia de la enzima nitratoreductasa que permite a las bacterias reducir los nitratos a nitritos (aceptor final de electrones) NO3- -------> NO2- ---------> N2, NH3, N2O3 Se visualiza mediante el reactivo de Griess (-naftilamina y cido sulfanlico) (+ color rojo).

1. OTRAS PRUEBAS BIOQUMICAS a. Coagulasa: Lo poseen las bacterias que coagulan el plasma, al inhibir el efecto anticoagulante del EDTA o del oxalato presente en el plasma. b. DNAasa: La desoxiribonucleasa desdobla el DNA en sus nucletidos constituyentes. c. Hemlisis: Capacidad de producir la lisis de los hemates de la sangre. d. Motilidad Observacin de la difusin lateral de la turbidez, en la siembra por picadura en un tubo con agar blando (0,4 % de agar). e. Produccin de pigmentos: Determinados medios estimulan a las bacterias a producir pigmentos.

6.6 A.

DESCRIPCIN DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUMICAS. PRESENCIA DE OXIDASA

Fundamento La prueba se basa en comprobar la existencia de protenas citocromo c que forman parte de algunas cadenas transportadoras de electrones propias del metabolismo respirador. La presencia de citocromo c se manifiesta por la capacidad del colorante tetrametil-pfenilendiamina de oxidarse al ceder electrones al citocromo c, apareciendo una coloracin azul (forma oxidada). Fig. 6.1 Esta prueba permite diferenciar el grupo Enterobacteriacea (que carece de citocromo c) del gnero Pseudomonas (que posee citocromo c). Reactivos Tetrametil-p-fenilen diamida en solucin de alcohol isoamlico al 1,1 %. El reactivo, una vez preparado, no tiene color o es ligeramente rosado. A causa de la capacidad de autooxidacin que tiene, se debe guardar a 4 C y preservarlo de la luz. Procedimiento 1. Sembrar en estra escocesa, para obtener colonias aisladas, dos placas de agar sangre o TSA (no utilizar medios glucosados) con inculos de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. 2. Incubar a 37 C durante 48 h. 3. Tomar una colonia y extenderla encima de un papel de filtro Whatman n 1 (utilizar asa de platino, pipeta de plstico, torunda algodn impregnada, palillo de madera). 4. Dejar caer una gota de reactivo sobre la colonia a determinar. 5. Las bacterias productoras de oxidasa, oxidan rpidamente el reactivo y la colonia se vuelve de color violeta (durante los primeros 30-60 seg)

B. PRUEBA DE LA CATALASA Fundamento. En los ambientes acuosos, que contienen oxgeno disuelto, como el citoplasma de las clulas, aparecen formas txicas derivadas del oxgeno. Las bacterias que viven en ambientes aerobios necesitan un equipo enzimtico capaz de neutralizar estas formas txicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular.Fig. 6.1. Son ejemplos de catalasa positivo Escherichia coli y catalasa negativo Enterococcus faecalis.

Procedimiento 1. Tomar una colonia con un palillo de madera y depositarla en el centro de un porta. 2. Aadir una gota de perxido de hidrgeno (3%). 3. Si la reaccin es positiva, se produce inmediatamente un apreciable burbujeo de O2.

C. PRUEBA DEL INDOL Fundamento. Esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias. Esta enzima degrada el aminocido triptfano a indol, compuesto que se determina en el ensayo. Para realizar esta prueba, la bacteria se cultiva en un caldo de triptona con NaCl al 0,5 % (medio especialmente rico en triptfano). Si la bacteria tiene la enzima triptofanasa, al aadir al medio el reactivo de Kovacks, este formar un complejo con el indol y se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba ser considerada positiva. El genero Enterobacter da negativo en la prueba del indol y Escherichia coli positivo. Fig 6.1 Procedimiento 1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. caldo de triptona (BTW) sendos inculos de Enterobacter y Escherichia coli. 2. Incubar 24 h. a 37 C 3. Aadir a 1 ml. de los tubos incubados 5 gotas de reactivo de Kovacks, dejndolo caer por la pared interior del tubo. Lectura de resultados. En caso dudoso incubar hasta un mximo de 5 das. D-E. PRUEBAS DEL ROJO DE METILO (RM) Y VOGES-PROSKAUER (VP). Fundamento. Las bacterias que en anaerobiosis fermentan los azcares pueden realizar esto por distintas rutas. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos fases: primero la metabolizarn aerobiamente, consumiendo rpidamente el oxgeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). Esta fermentacin puede ser de dos tipos: a. Fermentacin cido-mixta. Los productos finales son cidos orgnicos (frmico, actico, lctico y succnico) y etanol. Fermentacin caracterstica de los gneros Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia. b. Fermentacin butiln-gliclica. Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario. Fermentacin caracterstica de los gneros Enterobacter, Serratia y la mayora de especies Erwinia. La liberacin de cidos orgnicos en el primer tipo de fermentacin (cido-mixta) generar un acusado descenso del pH que podr ser detectado aadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo (rojo a pH de alrededor 4,0). Si la fermentacin que se ha llevado a cabo es del tipo butiln-gliclica, la produccin de acetona puede ser detectada aadiendo al medio KOH y alfa-naftol (prueba Voges-Proskauer) que reaccionar con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico.Fig. 6.2 y 6.3. Prueba del Rojo de metilo (RM). Procedimiento: 1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. de de caldo RMVP, sendos inculos de Enterobacter aerogenes y de Escherichia coli. 2. Incubar 48-72 h a 37 C. 3. Aadir a 1 ml. de los tubos incubados cinco gotas de rojo de metilo. 4. Observar el color resultante: En caso de duda incubar 48 h. ms. 5. Interpretacin: El medio de cultivo toma color rojo: (+). El medio permanece amarillo o color amarillo naranja (indica que hay productos cidos dbiles): (-) Prueba de Voges-Proskauer Glucosa --> c. pirvico -->Acetona --->Diacetilo ---->Complejo rojo + KOH (aire)+ naftol

Procedimiento: 1. Sembrar en 2 tubos con 5 ml. de de caldo RMVP, sendos inculos de Enterobacter aerogenes y de Escherichia coli. 2. Incubar 48 h a 37 C 3. Aadir a 1 ml. de los tubos incubados 10 gotas de -naftol al 5 % y 10 gotas de KOH al 40 % (por este orden) 4. Agitar para mezclar y colocar los tubos en posicin de mxima inclinacin durante 10-15 min. (facilita la difusin del O2 atmosfrico). 5. Observar a las 2, 12 y 24 horas. 6. Observar el color resultante: Interpretacin: Aparicin del color rosa eosina: (+). En caso de duda incubar 48 h. ms. Los productos finales neutros (butanodiol y en menor cantidad etanol) predominan sobre los cidos; como consecuencia, la cantidad total de cido que se forma por mol de Glucosa fermentada es considerablemente ms pequea en una fermentacin butanodilica que en una fermentacin cido-mixta.

Fermentacin de la lactosa Lactosa C12H22O11 ------(hidrlisis por enzima lactasa)------->

dGlucosafermentacion dGalactosa

La capacidad de fermentar la Lactosa (disacrido formado por dos monosacridos, unidos por el enlaces -1,4, entre la glucosa y la galactosa), depende de la presencia de la enzima galactosidasa. La utilizacin efectiva de la Lactosa, tambin requiere la presencia de la Galactsido permeasa que favorece la entrada de la lactosa en el interior de la clula. Las bacterias que producen -galactosidasa pero les falta permeasa no pueden incorporar Lactosa a una velocidad suficiente para producir una fermentacin rpida y vigorosa, y generalmente, se clasifican como NO fermentadores de lactosa. La fermentacin de Lactosa es especialmente caracterstica de Escherichia y Enterobacter, y ausente de Shigella, Salmonella y Proteus. La formacin de Gas en la fermentacin de azcares es un carcter de valor considerable para la diferenciacin taxonmica de estos grupos, ya que permite diferenciar entre los formadores de gas del gnero Escherichia y los patgenos del grupo Shigella y Salmonella typhi, que fermentan sin producir gas. En una fermentacin cido-mixta simple, solamente se puede formar gas por descomposicin del cido frmico. La produccin de gas refleja la presencia de Hidrogenoliasa frmica. Esta enzima no es esencial para el metabolismo fermentativo; existen colonias de Escherichia coli (especie tpicamente productora de gas) que no son productoras de gas. Las bacterias que realizan la fermentacin Butanodilica tambin presentan diferencias respecto a la presencia de la Hidrogenoliasa frmica. La colonias del gnero Enterobacter casi siempre tienen esta enzima y son intensos productores de gas; los del gnero Serratia no lo presentan y en ellos la produccin de gas es inapreciable. Resumen de los patrones de fermentacin del grupo entrico FERMENTACIN CIDO-MIXTA A. Producen CO2+H2 (poseen hidrogenoliasa frmica): Escherichia Proteus

Salmonella (la mayora de especies) Photobacterium (algunas de las especies) B. No producen gas (carecen de hidrogenoliasa frmica): Shigella Salmonella typhi Yersinia Vibrio Aeromonas (algunas especies) Photobacterium (algunas especies Beneckea (la mayora de las especies) MODIFICACIN BUTANODILICA DE LA FERMENTACIN CIDO-MIXTA A. Producen CO2 + H2 (poseen hidrogenoliasa frmica): Enterobacter, Aeromonas hydrophila, Photobacterium phosphoreum B. Producen nicamente CO2 (carecen de hidrogenoliasa frmica); formacin de gas ligeramente apreciable o indetectable: Serratia, Erwinia herbicola, E. carotovara... F. AGAR MC CONKEY. Es un medio selectivo por contener sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de bacterias no entricas. Es tambin un medio diferencial, porque contiene lactosa y un indicador de pH. Las bacterias capaces de fermentar este azcar producirn un cambio en el pH del medio por la liberacin de productos cidos. Como consecuencia sus colonias aparecern de color violeta, contrastando con la coloracin amarillenta de las colonias de bacterias no fermentadoras de lactosa. G. AGAR SANGRE. Es un medio general rico en nutrientes, por lo que permitir el crecimiento de una amplia variedad de bacterias. Adems es un medio diferencial, ya que permite comprobar si la bacteria es capaz de hemolizar los eritrocitos del medio de cultivo. Algunas bacterias, sobre todo los estreptococos, pueden romper los hematies de la sangre (Hemlisis). Si la hemlisis que se produce es total , se denomina betahemlisis; si es parcial alfa-hemlisis, y cuando no existe, se habla de hemlisis tipo gamma. Los tres tipos de hemlisis se manifiestan de la siguiente manera: -hemlisis: Halo verde alrededor de la colonia, debido a una destruccin parcial de los hemates. -hemlisis: Halo intensamente claro alrededor de la colonia por la lisis total de los hemates. -hemlisis: Ausencia de halo claro. H. AGAR CITRATO DE SIMMONS. Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como nica fuente de carbono, fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno y azul de bromotimol como indicador de pH. nicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato (indica presencia de la enzima citrato permeasa) podrn multiplicarse en este medio y, al hacerlo, utilizarn los fosfatos presentes liberando iones amonio. Estos iones amonio que evolucionan a amonaco, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una fuerte basificacin del medio que se manifestar por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Incubar a 37 C 18-24 h. I. AGAR FENILALANINA. La mayora de las bacterias poseen enzimas capaces de hidrolizar especficamente algn aminocido, liberando al medio los grupos amino (desaminacin). En este medio el aminocido presente es la fenilalanina, y es empleado para determinar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa en las bacterias. La accin de esta encima se evidencia por la aparicin en el medio del producto resultante (cido fenilpirvico), que se detecta mediante la adicin de cloruro de hierro (III), resultando un compuesto de coloracin verde oscura.

Procedimiento: 1. Efectuar una siembra en estra de un cultivo fresco. 2. Incubar 18-24 h a 37 C 3. Aadir varias veces cloruro de hierro (III) al 10 %. Esperar hasta 5 min. 4. Resultados: Color inicial del medio (-). Color verde intenso (+).

J. AGAR KLIGLER (KIA). Este medio diferencial complejo (de color rojo) es muy til, ya que demuestra varias caractersticas enzimticas de la bacteria. Esta compuesto principalmente por dos azcares en distinta proporcin (glucosa al 0,1 % y lactosa al 1 %), tiosulfato sdico, citrato frrico y rojo fenol como indicador de pH. Para estudiar el comportamiento de las bacterias en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, la siembra en este medio de cultivo se realizar tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la profundidad de este (anaerobiosis). La informacin que podemos obtener es la siguiente: a. Fermentacin de la glucosa: viraje a color amarillo en el fondo del tubo inclinado. Si la bacteria fermenta slo la glucosa, en la superficie del tubo inclinado la utilizar por va respiratoria, y, donde la tensin de oxgeno disminuya lo suficiente, emplear una pequea proporcin por va fermentativa. Esto generar una pequea cantidad de cidos que sern neutralizados por las aminas derivadas de la descarboxilacin oxidativa de las protenas (proceso que depende del oxgeno). Como resultado, el medio mantendr su color rojo en la superficie, al no haber cambio de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad del tubo inclinado emplearn desde el primer momento la glucosa por va fermentativa, generando cidos que no sern neutralizados, provocndose un descenso de pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiar a amarillo. b. Fermentacin de la lactosa: viraje a color amarillo en la superficie del tubo inclinado. Si la bacteria, adems, fermenta la lactosa, los cidos producidos modifican tambin el pH de la superficie del medio. En este caso las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de cidos producidos en esta fermentacin, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentracin que la glucosa. Como consecuencia, el color del medio en la superficie cambiar a amarillo. c. No fermentacin de los azcares: el tubo inclinado no cambia de color. Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), como, por ejemplo, el gnero Pseudomonas, el medio permanecer de color rojo. En este caso, los azcares son respirados, degradndose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH. d. Produccin de gas en la fermentacin: aparicin de burbujas, rotura o elevacin del agar del fondo del tubo. Enzima hidrogenoliasa frmica. e. Produccin de cido sulfhdrico: aparicin de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias respiradoras anoxibinticas son capaces de emplear el tiosulfato sdico como aceptor final de electrones de la transportadora. Como consecuencia, este compuesto se reduce a cido sulfhdrico, que, a su vez, reacciona con el hierro Fe2+ presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro (fig. 6.1). Los iones Fe2+ proceden de los Fe3+ del citrato frrico y aparecen debido a los cambios en los potenciales redox producidos al someter al autoclave al medio de cultivo. f. La degradacin de las peptonas (aerbica o anaerbicamente) origina un proceso de descarboxilacin que produce amonaco, produciendo el viraje del indicador a un rojo

intenso.

TABLA DE LECTURA E INTERPRETACIONES DE RESULTADOS EN AGAR TRES-AZCARES-HIERRO Gnero y especie Fondo inclinada Superficie Produccin de SH2 Escherichia coli AG A Enterobacter aerogenes AG A Enterobacter cloacae AG A Citrobacter freundii AG A + Klebsiella pneumoniae A/AG R/K Alcaligenes faecalis R/K R/K Proteus vulgaris AG(1) K/A + Proteus mirabilis AG(1) K/A + Proteus morganii AG(1) R/K Proteus rettgeri A/K R/K Salmonella typhi A R/K +,(2) Salmonella typhimurium A/G R/K + Salmonella paratyphi B A/G R/K + Salmonella enteritidis A/G R/K + Salmonella paratyphi A A/G R/K Salmonella gallinarum A R/K + Salmonella choleraesuis A/G R/K Shigella flexneri A R/K Shigella dysenteriae A R/K Shigella boydii A R/K Shigella sonnei A R/K Pseudomonas aeruginosa R/K R/K -

CLAVE INTERPRETACIN Color y aspecto Fondo Superficie inclinada A Amarillo Fermentacin de GLUCOSA y formacin de CIDO Fermentacin de LACTOSA y/o SACAROSA con produccin de CIDO G Aparicin de burbujas o grietas Formacin de GAS a partir de GLUCOSA K Rojo intenso No fermentacin de GLUCOSA y formacin de ALCALI

No fermentacin de LACTOSA ni SACAROSA. Formacin de ALCALI. R No hay cambio del color original (Rojo anaranjado). No fermentacin de GLUCOSA No fermentacin de LACTOSA ni SACAROSA SH2 + Enengrecimiento - Sin ennegrecimiento Formacin de SH2 No formacin de SH2 NOTAS: (1) Algunas cepas son A, sin produccin de gas. (2) Slo en parte superior de la columna, y a veces formando anillo a las 48 h.

6 6 6 6-- PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS

89 89 89 89

K. AGAR MANITOL SAL. ste es un medio selectivo y diferencial muy utilizado para el aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus. La alta concentracin de sal (NaCl al 7,5 %) le proporciona su carcter selectivo, ya que slo este tipo de microorganismos osmotolerantes y los microorganismos osmfilos pueden multiplicarse en l. Adems, en su composicin el nico azcar presente es el manitol, que nicamente son capaces de fermentar las cepas patgenas de este gnero bacteriano, diferencindolas as de las que no lo son. La produccin de cidos proveniente de la fermentacin del manitol es detectada por un viraje del indicador de pH presente en el medio (rojo fenol) a amarillo. Staphylococcus aureus, fermentador del manitol, crecer en el medio dando lugar a colonias grandes rodeadas de un halo amarillo, mientras que Staphylococcus hepidermidis, que no fermenta el manitol, dar

lugar a colonias pequeas rodeadas de un halo prpura (a veces permite el desarrollo de Enterococcus faecalis, pero con un crecimiento muy pobre).

L. PRUEBA DE LA COAGULASA. Fundamento. Es una enzima semejante a la protrombina, que transforma el fibringeno en fibrina, dando un cogulo visible. Lo producen las bacterias que coagulan el plasma, inhibiendo el efecto anticoagulante del EDTA (etilendiamino tetractico) presente en el plasma. Es ejemplo de coagulasa positivo Staphylococcus aureus. Procedimiento 1. En tubos de 5 ml colocar 0,5 ml de plasma de conejo-EDTA rehidratado. 2. Aadir con asa Kolle 1 colonia bacteriana. 3. Homogeneizar con asa Kolle. 4. Incubar 4 h a 37 C. Lecturas a la 1/2 , 4 y 24 h. 5. Comprobar si presenta coagulacin por hemlisis del plasma de conejo

6.7. DIFERENCIACIN ENTRE E.COLI Y ENTEROBACTER CLOACAE. PRUEBAS IMVIC. Escherichia coli crece bien sobre medios de cultivo que contengan glucosa, o lactosa y peptona. Para establecer ya desde un principio condiciones selectivas para que puedan crecer pocas bacterias, se utiliza la lactosa. La utilizacin de lactosa supone la capacidad de escindir la lactosa con formacin de gas, mediante la -galactosidasa, enzima utilizado por coliformes y bacterias lcticas. Como algunas bacterias del cido lctico son capaces de desdoblar la lactosa formando gas, por lo que podran falsear los resultados, son necesarios otros procedimientos para la diferenciacin. Si se siembran en placa organismos de un cultivo de este tipo sobre agar eosina-azul de metileno Levine (lactosa-peptona-eosina-azul de metileno) las colonias de E.coli se diferencian porque sus colonias son planas de 2-3 mm de dimetro de color violeta oscuro y centro negro con un brillo metlico caracterstico de color verdoso con luz reflejada. . Los organismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. Para una diferenciacin ms exacta de las dos especies se ha acostumbrado a seguir un mtodo rutinario denominado "IMVIC". I: Indol M: Rojo de metilo IMVC Escherichia coli + + - Enterobacter cloacae - - + + Procedimiento: 1. Preparar dos placas de agar nutritivo. 2. Preparar un cultivo puro de E. coli y E. cloacae por siembra escocesa en las placas de agar nutritivo. 3. Incubar 48 h. a 37 C. V: Voges Proskauer C: Citrato

4. Observar al microscopio mediante una tincin Gram los diversos tipos de colonias aisladas. 5. Tomar una colonia y resuspenderla en un tubo de ensayo con 5 ml de solucin Ringer. 6. Realizar la batera de pruebas IMVIC. (ver 6.6.C, 6.6.D-E, 6.6.H)

6.8. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE UN CULTIVO MIXTO. Procedimiento 1. Realizar en una placa de agar TSA una siembra escocesa de la muestra de partida (cultivo mixto de un bacilo Gram negativo (E.coli) y un coco Gram positivo S.epidermidis). 2. Incubar a 37 C durante 48 h. 3. Realizar una Tincin Gram de cada tipo de colonia aislada. 4. A partir de cada tipo de colonia, realizar un agotamiento por estras en placas de agar sangre y de agar Mc.Conkey. Incubar a 37 C durante 24 h.. 5. Comprobar el aspecto de las colonias. Verificar que en la placa de agar sangre se multiplican ambas bacterias y en la placa de agar Mc.Conkey slo crecer el bacilo Gram negativo. Observar en la placa de agar sangre si se ha producido hemlisis y de qu tipo es, y en la placa de agar Mc.Conkey si ha sido fermentada la lactosa. 6. A partir de las colonias de los cocos Gram positivos se realiza la prueba de la catalasa, que permite diferenciar entre Staphylococcus y Streptococcus. Para ello tomar con palillo de madera una colonia Gram+ del agar sangre y colocarla sobre un portaobjetos limpio. Aadir una gota de reactivo de la catalasa (perxido de hidrgeno) . Si la prueba es positiva (aparicin de burbujas), sembrar en el medio agar manitol sal . Incubar a 37 C durante 24 h. 7. A partir de las colonias de los bacilos Gram negativos se realiza la prueba de la citocromo c oxidasa. Para ello, colocar un trocito de papel de filtro sobre un portaobjetos limpio. Con un palillo de madera tomar una colonia Gram - del agar sangre y extenderla en el papel de filtro. Aadir encima una gota del reactivo oxidasa Observar si aparace coloracin azul. Confirmar que el bacilo Gram negativo es una enterobacteria (citocromo c oxidasa negativa). 8. A partir de una colonia del bacilo Gram negativo sembrar los siguientes medios diferenciales: agar citrato de Simmons, agar fenilalanina, caldo de triptona con NaCl al 0,5 %, dos caldos de RMVP y agar de Kliger (KIA). Todos estos medios se siembran tal como se explic en el captulo 4 , excepto el agar de Kliger, que se siembre con una aguja de inoculacin como muestra la fig. 6.4. 9. Incubar todos los medios a 37 C durante 24 h. 10. Aadir los distintos reactivos (4 gotas/tubo) a sus correspondientes cultivos. Las pruebas del citrato, manitol y KIA no requieren la adicin de ningn reactivo. Anotar los cambios de color en las distintas pruebas. Con la ayuda de la tabla n 6-1, y 6-2 identificar las bacterias analizadas.
6 6 6 6-- PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS

6.9 MTODOS MINIATURIZADOS DE IDENTIFICACIN BIOQUMICA La batera de pruebas bioqumicas descrita es la forma clsica y general de identificacin de enterobacterias y cocos Gram + . Sin embargo, actualmente estos mtodos estn siendo sustituidos por micropruebas en sistemas semiautomticos, que permiten una identificacin ms rpida y menos laboriosa, imprescindible en grandes laboratorios (sistema API, etc.). SISTEMA API. El sistema API comercializa diversas versiones (API 20 E, API 10 S, ...) miniaturizadas y estandarizadas de los procedimientos convencionales para la identificacin de miembros de la familia de las Enterobacterias y otras bacterias Gram negativas relacionadas. Consiste en una coleccin de microtubos (pocillos) donde se puede reproducir una serie de pruebas bioqumicas con una sola colonia de bacterias. En un soporte de plstico estn alineados los microtubos que contienen los medios deshidratados (liofilizados). La siembra se realiza con una pipeta a partir de una suspensin bacteriana procedente de un cultivo puro. Algunos microtubos se cubren con parafina para crear anaerobiosis. Procurar no producir burbujas, mezclar lquido de microtubos distintos, ni llenar los microtubos demasiado, salvo indicacin. API 10 S. (BIOMERIUX) Las caractersticas bioqumicas que se estudian son: ONPG: hidrlisis del ortonitrofenolgalactosidasa por la -galactosidasa, liberando ortonitrofenol de color amarillo. GLU (glucosa), ARA (arabinosa): la utilizacin de hidratos de carbono por las bacterias produce cidos, que originan una cada del pH. El indicador azul de bromotimol virar de azul a amarillo. LDC: actividad lisina descarboxilasa. Transforma la lisina en una amina llamada cadaverina que incrementa el pH. El indicador virar de amarillo a rojo. ODC: actividad ornitina descarboxilasa. la enzima transforma la ornitina en una amina llamada putrescina, producindose un incremento del pH y un viraje de indicador de amarillo a rojo. CIT: utilizacin del citrato como nica fuente de carbono. Esto produce un aumento de pH y que el indicador (azul de bromotimol) vire de verde a azul. H 2S: produccin de sulfhdrico a partir del tiosulfato. El sulfhdrico producido reacciona con las sales de hierro, obtenindose un precipitado negro. URE: actividad ureasa. Esta enzima libera amonaco a partir de la urea, producindose un incremento de pH y que el indicador (rojo de fenol), vire de amarillo a rojo. TDA: actividad triptfano-desaminasa. Esta enzima forma cido indol pirvico a partir del triptfano. El cido producido forma un compuesto marmceo en presencia de cloruro de hierro (III). IND: produccin de indol a partir del metabolismo del tritfano. El reactivo de Kovacs forma un complejo rojo con el indol.

Pruebas complementarias: OXI: prueba de la oxidasa. Se basa en comprobar la produccin de la enzima citocromo c oxidasa por parte de las bacterias. La presencia de citocromo c se manifiesta por la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamida de oxidarse frente al citocromo c, apareciendo una coloracin azul (forma oxidada). NO

2:

nitrato reductasa. Esta enzima reduce el nitrato a nitrito. La aparicin de nitritos se manifiesta por la coloracin de rojo que adquiere el medio tras aadir los reactivos cido sulfanlico y N,N dimetil-alfa-naftilamina.

Procedimiento: 1. Preparar una cubeta de incubacin con tapa. Anotar n de identificacin de la muestra 2. Sacar la galera API de la envoltura y colocarla en la cubeta en posicin inclinada. 3. Con asa de Kolle se toma una colonia bien aislada de un cultivo de 24 h. y se emulsiona en agua estril. 4. Con la pipeta Pasteur se inocula la galeria API. 5. Llenar la seccin tubular del microtubo colocando la punta de la pipeta contra el lado de la cpula. 6. Llenar la seccin tubular y la cpula de los microtubos CIT 7. Despus de inocular, llenar completamente las cpulas DE LOS MICROTUBOS LDC , ODC , H2S , URE , con aceite de parafina. 8. Humedecer la tapa con agua, para evitar evaporacin. Eliminar el exceso de agua, tapar y dejarlo incubar en estufa 24 h a 37 C. 9. Anotar los resultados obtenidos segn la tabla adjunta. 10. Una vez anotados los resultados obtenidos, el sistema API 10 se complementa con las siguientes pruebas bioqumicas: A. TDA - aadir en el microtubo TDA 1 gota de cloruro de hierro (III) al 10 % B. IND - aadir en el microtubo IND 1 gota de reactivo de Kovacs C. OX - aadir 1 gota del reactivo de la oxidasa (tetrametil-p-fenilendiamina al 1 %) en el microtubo ONPG o al H2S si es negativo. D. NO2 - aadir en el microtubo GLU 2 gotas de cido sulfanlico al 0,8 % (NIT 1) y 2 gotas de N,N dimetil-alfa-naftilamina al 0,5 % (NIT 2). Nota: Respetar el orden indicado para la 4 pruebas, ya que se liberan productos gaseosos que podran interferir en otros microtubos de la galera. Tabla 6.2
RESULTADOS TEST

SUBSTRATO REACCION O ENZIMAS NEGATIVO POSITIVO ONPG Ortonitrofenolgalactosido -galactosidasa incoloro amarillo (1) GLU Glucosa fermentacin / oxidacin (4) azul/ azul verdoso amarillo o gris ARA Aarabinosa fermentacin / oxidacin (4) azul/ azul verdoso amarillo LDC Lisina lisina descarboxilasa amarillo/ naranja rojo/ naranja ODC Ornitina ornitina descarboxilasa amarillo rojo/ naranja (3)

CIT citrato sdico utilizacin del citrato verde palido/ amarillo azul-verde/ azul (3)
H 2S tiosulfato de sodio produccin de H2S Incoloro/ grisaceo depsito negro (2) URE Urea ureasa amarillo rojo/ naranja TDA (5) Triptfano triptfano desaminasa amarillo marrn oscuro IND (6) Triptfano produccin de indol amarillo anillo rojo OXI (7) En microtubo:

ONPG o H2S citocromo oxidasa incoloro / violeta claro violeta oscuro (2 min) NO2 (8) En microtubo: GLU reduccin de nitratos a NO2 reduccin a gas N2 amarillo (2-3 min) violeta (+Zn) rojo amarillo

(1) Un amarillo muy plido debe considerarse como positivo. (2) La produccin de H2S puede variar de un depsito negro denso a una lnea negra muy fina alrededor del fondo del tubo. Examinar cuidadosamente el fondo del tubo antes de considerar la reaccin negativa. Un viraje a marrn del medio es una reaccin negativa a menos que haya un depsito negro. Esto sucede con organismos TDA positivos. (3) La lectura debe hacerse en la cpula (aerobiosis). (4) La fermentacin empieza en la parte inferior de los tubos, la oxidacin en la cpula. (5) TDA - aadir 1 gota de cloruro de hierro (III) al 10 %. (6) IND - aadir 1 gota de reactivo de Kovacs. La reaccin se leer a los dos minutos despus de aadir el reactivo de Kovacs. Despus de varios minutos, el HCl liberado por el reactivo de Kovacs puede reaccionar con el material plstico de la cpula resultando un cambio de amarillo (negativo) a rojo pardusco (se contina considerando negativo). (7) Aadir en el microtubo H2S o ONPG 1 gota de tetrametil-p-fenilendiamina al 1 %. Esperar 20 min antes de considerar la reaccin negativa. (8) NO2 - aadir en el microtubo GLU 2 gotas de cido sulfanlico al 0,8 % y 2 gotas de N,N dimetil-alfa-naftilamina al 0,5 %. Antes de aadir los reactivos, observar si el tubo GLU (positivo o negativo) presenta burbujas. Estas burbujas son indicio de la reduccin de nitratos a N2. Despus de haber aadido los reactivos de reduccin de nitratos, confirmar un posible test negativo aadiendo polvo de zinc. Un color rojo despus de 10 min confirma la reaccin negativa, un color amarillo indica la reduccin de los nitratos a un estado de nitrgeno. 6 6 6 6-- PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS

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IDENTIFICACIN DE LOS MICROORGANISMOS: A los test contenidos en API 10 S, se suman los test de la oxidasa (OXI) y el de reduccin de nitratos (NO2), como test 11 y 12. 1. Los resultados pueden ser: A. Positivo: Se anota el valor correspondiente (1, 2, 4) B. Negativo: Se anota un 0.

Codificacin del germen. Sumando los 3 valores obtenidos en cada triada se obtiene un nmero. Con la secuencia de 4 nmeros encontrados, se busca en las tablas a que bacteria corresponde. Tabla 6.3.

Ejemplo: Citrobacter freundii ONPG GLU ARA + + + | | | 1 2 4 \ | / \ | / LDC ODC CIT + | | | 0 0 4 \ | / \ | / H2S URE TDA + | | | 1 0 0 \ | / \ | / IND OX NO2 + | | | 0 0 4 \ | / \ | /

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97 97 97 97

TABLA N 6.3 DIRECTORIO DE PERFILES PARA INTERPRETACIN TEST API 10 S

OO16 Pseudomonas putrefaciens 2.665 Proteus 6.514 Salmonella (2) OO75 Proteus vulgaris 2.674 Proteus mirabilis 6.524 Klebsiella / Serratia O206 Pseudomonas putrefaciens 2.675 Proteus mirabilis 6.604 Enterobacter cloacae O216 Pseudomonas putrefaciens 2.707 Vibrio 6.614 Citrob.freund./Salmon.(2) O221 Proteus morganii 2.714 Salmonella (2) 6.674 Proteus mirabilis O225 Proteus morganii 2.724 Serratia 6.704 Salmonella (2) O261 Proteus morganii 2.764 Proteus mirabilis 6.707 Vibrio O265 Proteus morganii 2.774 Proteus mirabilis 6.714 Salmonella (2)

O274 Proteus mirabilis 6.715 Salmonella (2) O412 Pseudomonas putrefaciens 3.004 Shigella (2) O416 Pseudomonas putrefaciens 3.005 Escherichia coli/Shigella (2) 7.000 Enterobacter agglomer O422 Pseudomonas aeruginosa 3.007 Aeromonas hydrophila 7.001 Enterobacter agglomer O475 Proteus vulgaris 3.014 Citrobacter freundii 7.005 Escherichia coli O500 Pseudomonas maltophilia 3.024 Yersinia pseudotuberculosis 7.006 Aeromonas hydrophila O504 Pseudomonas maltophilia 3.105 Escherichia coli 7.007 Aeromonas hydrophila O616 Pseudomonas putrefaciens 3.107 Aeromonas hydrophila 7.014 Citrobacter freundii O664 Proteus mirabilis 3.204 Shigella (2) 7.025 Yersinia enterocoltica O674 Proteus mirabilis 3.205 Escherichia coli 7.034 Citrobacter freundii 3.224 Yersinia enterocoltica 7.040 Enterobacter agglomer agglomer. Enterobacter 1.500 Pseudomonas maltophilia 3.225 Yersinia enterocoltica 7.041 Enterobacter agglomer agglomer. Enterobacter 1.504 Pseudomonas maltophilia 3.305 Escherichia coli 7.044 Enterobacter agglomer agglomer. Enterobacter 3.307 Aeromonas shigell./Vibrio(2) 7.045 Enterobacter agglomer agglomagglomer. 2.004 Shigella (2) / Klebsiella 3.402 Pseudomonas cepacia 7.105 Escherichia coli 2.005 Shigella 3.404 Klebsiella / Serratia 7.107 Aeromonas hydrophila 2.035 Proteus vulgaris 3.406 Pseudomonas cepacia 7.115 Escherichia coli 2.045 Providencia 3.407 Aeromonas hydrophila 7.124 Klebsiella / Serratia 2.055 Proteus vulgaris 3.465 Proteus rettgeri 7.125 Kleb. pneumon. oxytec 2.064 Proteus 3.502 Pseudomonas cepacia 7.204 Shigella/Enterobacter 2.065 Proteus 3.507 Aeromonas hydrophila 7.205 Escherichia coli 2.074 Proteus 3.524 Klebsieella / Serratia 7.214 Citrobacter freundii 2.075 Proteus vulgaris 3.614 Citrobacter freundii 7.224 Yerinia enterocoltica 2.104 Salmonella typhi (2) 3.674 Proteus mirabilis 7.225 Yersinia enterocoltica 2.105 Escherichia coli 3.704 Serratia marcescens 7.234 Citrobacter freundii 2.114 Salmonella (2) 3.707 Vibrio (2) 7.305 Escherichia coli 2.221 Proteus morganii 3.724 Serratia marcescens 7.314 Salmon. arizonae(2) 2.224 Yersinia enterocoltica 7.315 Escherichia coli 2.234 Proteus mirabilis 4.402 Pseudomonas fluorescens 7.400 Enterobacter agglom. agglomer. Enterobacter 2.241 Proteus morganii 4.406 Pseudomonas fluorescens 7.401 Enterobacter agglom. agglomer. 2.245 Proteus morganii 4.422 Pseudomonas aeruginosa 7.405 Enterobacter agglom. 2.254 Proteus mirabilis 4.426 Pseudomonas aeruginosa 7.407 Aeromonas hydrophila 2.261 Proteus morganii 7.414 Citrobacter freundii

6 6 6 6-- PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS

98 98 98 98

2.264 Proteus mirabilis 6.000 Acinetobacter calcoacticus 7.415 Citrobacter freundii 2.265 Proteus morganii 6.004 Shigella (2) 7.425 Kleb. pneumon. oxytec 2.274 Proteus mirabilis 6.005 Shigella (2)/Escherichia coli 7.434 Citrobacter freundii 2.305 Edwardsiella tarda 6.045 Providencia 7.440 Enterobacter agglom agglomer. Enterobacter 2.307 Vibrio 6.065 Proteus 7.441 Enterobacter agglom agglomer. Enterobacter 2.314 Salmonella (2) 6.104 Salmonella (2) 7.444 Enterobacter agglom agglomer. 2.315 Edwardsiella tarda 6.105 Salmonella (2)/ E. coli 7.445 Enterobacter agglom agglomer. 2.324 Enterobacter hafniae 6.114 Salmonella (2) 7.504 Klebsiella / Serratia 2.365 Proteus morganii 6.204 Salmonella (2)/Shigella (2) 7.505 Kleb. pneumon. oxytec 2.374 Proteus mirabilis 6.205 Escherichia coli 7.507 Aeromonas hydrophila 2.402 Pseudomonas aeruginosa 6.214 Citrobacter / Salmonella (2) 7.524 Klebsiella pneumoniae

2.404 2.405 2.422 2.425 2.426 2.444 2.445 2.464 2.465 2.474 2.475 2.545 2.624 2.634 2.644 2.654 2.664

Klebsiella ozaenae 6.224 Yersinia enterocoltica 7.525 Kleb. pneumon. oxytec Providencia 6.225 Yersinia enterocoltica 7.604 Enterob. cloac/Serratia Pseudomonas 6.261 Proteus morganii 7.605 Citrobacter Proteus rettgeri 6.265 Proteus morganii 7.614 Citrobacter freundii Pseudomonas aeruginosa 6.274 Proteus mirabilis 7.615 Citrobacter freundii Providencia 6.304 Enterob. hafniae/Salmon(2) 7.624 Enterobacter cloacae Providencia 6.305 Escherichia coli 7.634 Citrobacter freundii Proteus 6.307 Vibrio 7.714 Salmonella (2) Proteus rettgeri 6.314 Salmonella (2) 7.702 Pseudomonas cepcea Proteus 6.400 Acinetobacter calcoacticus 7.704 Enterobacter / Serratia Proteus 6.402 Pseudomonas fluorescens 7.706 Pseudomonas cepcea Providencia 6.406 Pseudomonas fluorescens 7.714 Salmon. arizonae (2) Proteus mirabilis 6.414 Citrob. freund./Salmon.(2) 7.724 Enterobacter / Serratia Proteus mirabilis 6.422 Pseudomonas aeruginosa 7.725 Kleb. pneumon. oxytec Proteus mirabilis 6.426 Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis 6.445 Providencia Proteus mirabilis 6.475 Proteus vulgaris

6 6 6 6-- PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS

99 99 99 99

6.10. Calculo probabilstico. Galera API 10 S La bacteria Proteus vulgaris correspondera a cualquiera de las siguientes secuencias numricas: 0075, 0475, 2055, 2075, 6475. La fiabilidad del resultado obtenido no es igual en todos los casos, por lo que es preciso realizar un clculo probabilstico. En la tabla adjunta, figuran las frecuencias con que una bacteria determinada dar positivo en la prueba bioqumica considerada. Ello nos indica un margen de fiabilidad. Por ejemplo, si la bacteria que queremos identificar ha dado:

 POSITIVO a ONPG: descartamos como candidatas a las bacterias que nunca dan positivo (0 % de pruebas), Edward tarda y P.vulgaris. NEGATIVO a NO 2: descartamos las que siempre dan positivo (100 % de pruebas), E.coli, Shigella sp., Edward tarda, Salmonella sp., K. neumoniae, etc. Este descarte de bacterias permite reducir el nmero de candidatas. Suponiendo que despus de aplicar este criterio selectivo se centraran las posibilidades en las bacterias siguientes: K.oxytoca, P. rettgeri y Y. enterocolitica. Se procede entonces a completar un cuadrante con el conjunto de pruebas realizadas. A modo de ejemplo, el cuadro siguiente lo realiza con 4 de las pruebas.

ONPG CIT URE IND S.marcenses 94 97 28 95 P.rettgeri 1 70 98 90 Y.enterocoltica 81 0 93 66 Pruebas bioq.

+ - + -

S.marcenses 0,94 % 0,03 % 0,28 % 0,05 = 0,0003948 P.rettgeri 0,01 % 0,30 % 0,98 % 0,10 = 0,0002940 Y.enterocoltica 0,81 % 0,99 % 0,93 % 0,34 = 0,2535607 Suma total =

0,2542495

Clculo de probabilidad porcentual: S.marcenses =

0,0003948 0,25442495

%1000,15%

P.rettgeri =
0,0002940 0,2542495

%1000,11%

Y.enterocoltica =
0,2535607 0,2542495

%10099,72%

Conclusin: Con una probabilidad de un 99,5 % se trata de la bacteria Y.enterocoltica. % Identificacin = 80.0 Identificacin aceptable % Identificacin = 90,0 " buena % Identificacin = 99,0 " muy buena % Identificacin = 99,9 " excelente

6 6 6 6-- PRUEBAS BIOQUMICAS

PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS

100 100 100 100

TABLA 6.4. CLCULO PROBABILSTICO

O N P G

G L U A R A L D C O D C C I T H2S U R E T D A I N D O X I N O
2

E. coli 95 100 83 77 70 0 3 1 0 94 0 10
0

Shigella sp. 26 99 50 0 0 0 0 0 0 38 0 10
0

Edward. tarda 0 100 1 100 100 0 94 0 0 100 0 10

0

Salmonella sp. 3 100 94 96 95 74 85 0 0 3 0 10

C. freundii 93 100 96 0 32 62 65 3 0 6 0 98 K. pneumoniae 99 99 99 74 0 95 0 63 0 0 0 10

0

K. oxytoca 99 99 96 86 1 84 0 60 0 100 0 10
0

E. cloacae 99 100 99 1 96 94 0 1 0 0 0 10
0

H. alvei 71 99 90 100 97 13 0 4 0 0 0 10
0

S. liquefac. 98 100 98 87 99 85 0 5 0 0 0 10
0

S. marcescens 94 100 19 98 95 97 0 28 0 1 0 95 S. odorfera 95 100 95 97 43 87 0 0 0 99 0 99 P. mirabilis 1 96 1 1 98 57 83 99 98 2 0 93 P. vulgaris 0 97 1 0 0 31 83 98 99 94 0 10

0

Prov. rettgeri 1 99 1 0 0 70 0 98 99 90 0 98 Y. enterocoltica 81 99 69 0 90 0 0 93 0 66 0 98

A g a r M c C on k ey A g a r K IA F e rm en ta c i n g lu co

sa F e rm en ta c i n l a c to sa

RM ( F . c id o m ix ta )

V P ( F . b u ta n o d i li c a ) A g

a r C it ra to

A . F en il a la n in a

F o rm a c i n d e g a s

H
2

S F o rm a c i n d e in

d o l F o rm a c i n d e a c e to n a P ro te li s is 3 - Proteus vulgaris - K/A + - + - + + ! + + - + 4 - Klebsiella + A/A + + ! + + - + - + 5 - Escherichia coli + A/A + + + - - - + - + - 6 6 6 6-- PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS PRUEBAS BIOQUMICAS

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Cuestionario pruebas bioqumicas 1. En que se distinguen las bacterias segn sean: a. anaerobias obligadas

b. anaerobias facultativas c. aerotolerantes 2. Se siembran 2 gotas de inculo de 5 tipos de microorganismos con diferentes tipos de requerimientos de O2, en un agar que se mantiene lquido a 45 C. Se agita hasta homogeneizar los tubos y se enfra rapidamente. Se incuban los tubos 48 h. a 37 C. Considerando que los medios satisfacan todos los requerimientos qumicos de los metabolismos de los diversos microorganismos. De acuerdo con el esquema que refleja los diversos tipos de crecimiento que ha habido en cada tubo, explica que tipo de microorganismo ha crecido y que metabolismo ha utilizado.

3. Distingue entre los trminos: metabolismo, catabolismo, anabolismo. 4. Distingue entre Fototrofo y quimiotrofo 5. Efecta una asociacin entre los trminos siguientes : fotolitotrofo Champin fotorganotrofo Lechuga Quimiolitotrofo Escherichia coli Quimiorganotrofo Bacterias nitrificantes

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6. Qu es la gliclisis? Cules son las sustancias que forma en su degradacin? 7. Describe la funcin del ATP 8. Cules son las diferencias ms significativas entre respiracin y fermentacin?

9. Porqu la fermentacin desprende menor energa que la respiracin? 10. Qu informacin del metabolismo de una bacteria nos permite conocer la siembra por picadura en un agar KIA, respecto a: a. Tipo de sustrato que ha fermentado b. Exigencia de O2 c. Tipos de enzimas que posee la bacteria 11. Qu procesos bioqumicos se pueden observar en un hemocultivo tipo Agar sangre? 12. Clasifica en selectivos o generales los siguientes medios: a. TSA b. A. Sangre c. A. Mc Conkey d. Levine e. A. Citrato f. Solucin Ringer g. TSB h. RMVP i. A. Manitol sal 13. El medio RMVP: A qu pruebas bioqumicas se aplica? Qu sustancias se buscan en cada caso?Cmo las identificamos?

14. Qu informacin nos aportan las siguientes pruebas bioqumicas: Prueba del Indol Prueba de la Oxidasa Prueba de la Catalasa Agar Citrato 15. Efectuar las asociaciones adecuadas entre los trminos siguientes: A - Fermentacin cido-mixta 1 - Prueba de la ONPG B - Fermentacin de lactosa 2 - Agar KIA (por picadura en tubo) C - Aerobios/Anaerobios facultativos 3 - Prueba del Rojo Metilo (RM) D - Fermentacin de protenas 4 - Desaminacin/descarboxilacin E - Fermentacin butanodilica 5 - Enzima -galactosidasa F - Fermentacin de lpidos 6 - Coenzima Citocromo c G - Fermentadoras tardas de lactosa 7- Prueba de Voges Proskauer (VP) H - Respiracin 8 - Prueba de la catalasa I - Respiracin anaerbica 9 - Agar Sangre J - Hemlisis 10 - Agar Citrato

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103 103 103 103

16. Efectuar las asociaciones adecuadas entre los trminos siguientes: A - Fermentacin cido-mixta 1 - cido lctico B - Respiracin 2 - cidos orgnicos C - Respiracin anaerbica 3 -C02 + H20 D - Fermentacin de protenas 4 - Acetona E - Fermentacin butanodilica 5 - cido lctico y otros cidos orgnicos F - Fermentacin homolctica 6 - Indol G - Fermentacin heterolctica 7 - N02- , SO32-......

Indicar para las siguientes afirmaciones Verdadero o Falso: 17. Las bacterias aerobias estrictas no pueden fermentar. 18. En ausencia de oxgeno molecular siempre se producir fermentacin, nunca respiracin. 19. La fermentacin no se produce en condiciones de aerobiosis. 20. La fermentacin se puede producir en condiciones de anaerobiosis. 21. Si hay produccin de cidos la bacteria ha respirado. 22. Si se produce CO2 , podemos asegurar que ha habido respiracin. 23. Las enterobacterias son anaerobias facultativas. Pueden obtener energa por respiracin y por fermentacin. 24. Las bacterias aerotolerantes pueden respirar. 25. En una fermentacin, los nitratos pueden actuar como aceptores finales de electrones. 26. En la respiracin anaerbica el amonio no puede actuar como aceptor final de electrones. 27. Si una bacteria da positivo en la prueba de la oxidasa puede respirar. 28. Si una bacteria da negativo con la prueba de la oxidasa, no puede respirar. 29. Todas las bacterias aerobias o anaerobios facultativos darn positivo con la catalasa. 30. Las bacterias aerotolerantes nunca darn positivo en la prueba de la oxidasa. 31. Una bacteria que de negativo a las pruebas de oxidasa y catalasa ser anaerobia estricta. 32. De acuerdo con los perfiles bioqumicos correspondientes (tabla 6.4 ), justifica el comportamiento previsto en el agar KIA (superficie/fondo/gas/H2S) , de las bacterias:

E.coli, Salmonella sp., Proteus vulgaris

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104 104 104 104

33. Consulta los resultados que se obtienen en el agar TSI (pag. 87-88) con Pseudomona aeruginosa. Describe los procesos bioqumicos que se habrn producido 34. Consultando la tabla pag. 83, justifica la procedencia del nombre de la bacteria "enterobacter aerogenes". 35. Los resultados de un test API lOS han sido:
ONPG GLU ARA LDC ODC CIT H2S URE TDA IND OX N0 2

a. Determinar el cdigo que corresponde al perfil bioqumico obtenido y buscar en la tabla 6.3 a que bacteria corresponde. b. Utilizando la tabla 6.4 determinar por clculo probabilstico cul sera el nivel de identificacin obtenido.