O PAPEL DO 2,3-DPG NO METABOLISMO DAS HEMCIAS

Introduo
A descoberta que o 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) influncia profundamente a afinidade entre o oxignio e a hemoglobina foi notvel de duas maneiras: primeiro, pela sua grande importncia e segundo, pelo espao de tempo at sua descoberta (Brewer, 1974). Com respeito ao primeiro ponto, pode-se dizer que a ligao entre hemoglobina, 2,3-DPG, e o metabolismo das hemcias (eritrcitos ou clulas vermelhas) tm profunda implicao para a regulao do transporte de oxignio, e na preservao sangunea e, em muitos casos de interveno teraputica em ampla variedade de doenas. Em vista da grande importncia do 2,3-DPG, e o fato de uma escala relativamente curta de tempo desde a sua descoberta at o presente, esse artigo procurar fazer uma reviso detalhada de como as hemcias, hemoglobinas e 2,3-DPG se inter-relacionam.

As hemcias
As hemcias so clulas que renem certas caractersticas que as distinguem das outras que compem o organismo, pois apresentam dois perodos marcadamente distintos em sua evoluo: um perodo intra-celular sseo, em que se apresenta como clula nucleada (pr-eritroblasto e eritroblasto) cuja maturao leva cerca de 14 dias, e o perodo extra-medular, onde se mostra como clula anucleada (reticulcito e eritcito), vivendo cerca de 120 dias na circulao perifrica.

Figura 1. Ilustrao simplificada das fases de desenvolvimento das hemcias at seu amadurecimento pleno (eritrcito).

Seminrio apresentado pelo aluno Diego Bitencourt de David na disciplina de BIOQUIMICA DO TECIDO ANIMAL, NO Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, no primeiro semestre de 2009. Professor Responsvel pela disciplina: Flix H.D. Gonzlez

Ainda de maneira bem peculiar, as hemcias experimentam profundas alteraes no decorrer do seu desenvolvimento, e a mais expressiva se refere ao trabalho celular representado pela extruso do ncleo. Este realmente um momento de revoluo na histria das hemcias, em que, atravs de sua simples expulso ou atravs da passagem forada pelos plos capilares da medula ssea, o ncleo expelido, sendo esta perda acompanhada da sada de outras organelas. O jovem eritrcito assim formado no possui retculo endoplasmtico, mas exibem ainda vestgios do aparelho de Golgi, mitocndrias, ribossomos os quais desaparecem ao cabo de um a trs dias. Pelo fato de no possurem ncleo e outras organelas so impossibilitados de realizar a sntese de cidos nuclicos ou protenas. Alm disso, essa clula magistralmente suprime a mitocndria, eliminando a respirao celular, a realizao do ciclo de Krebs e a fosforilao oxidativa fazendo com que as hemcias no mais consumam oxignio, passando a desempenhar eficientemente sua funo principal de transporte de hemoglobina, esta, intrinsecamente ligada ao transporte dos gases oxignio (O2) e carbnico (CO2) e tamponamento de ons de hidrognio (H+).

Estrutura e funo da hemoglobina

A hemoglobina (Hb) uma protena com peso molecular de 64.500 dltons que se constitui no principal componente do eritrcito, solvel na gua e formada pela unio de uma protena incolor: a globina, que por sua vez constituda de 2 pares de cadeias de aminocidos, e e de um composto prosttico corado que possui quatro grupos, os quais contm ferro e so chamados de grupo heme (GARNIER et al., 2002).

Figura 2. Representao da hemoglobina com seus dois pares de cadeia alfa e beta (a) e da cadeia bioqumica do grupo heme.

Os benefcios de conter hemoglobina dentro das clulas, ao contrrio de livre no plasma, incluem: uma meia-vida maior (a Hb livre no plasma possui uma meia-vida de apenas algumas horas), a capacidade metablica dos eritrcitos de manter o ferro ligado Hb em seu estado funcional e a habilidade de controlar a afinidade do oxignio pela Hb, alterando as concentraes de fosfatos orgnicos (especialmente o 2,3-DPG).

O 2,3-DPG e seus mecanismos de ao

A presso de oxignio (PO2) necessria para liberar o oxignio nos tecidos. A transferncia se torna mais lenta medida que a presso atmosfrica diminui, mas o organismo responde comeando a produzir quantidades maiores de difosfoglicerato (2,3-DPG). A enzima tem a capacidade de enfraquecer a ligao oxignio-hemoglobina e permite que o oxignio saia com menor presso. Quanto mais elevada for a situao de hipxia (menor PO2), mais 2,3-DPG ser produzido, mantendo o processo de transferncia de oxignio para os tecidos. Portanto, esta enzima tem o potencial de deslocar o equilbrio da curva de dissociao da hemoglobina para a esquerda, facilitando a liberao de O2 em tecidos onde h baixa presso do mesmo, enquanto nos tecidos com alta presso de O2 (pulmo), a molcula de 2,3-DPG deslocada do centro da hemoglobina desoxigenada, facilitando a captao de O2.

Figura 3. Afinidade do oxignio pela hemoglobina: influncia do pH e do CO2 (Adaptado da Universit de Sherbrooke, 2005).

Dois so os fatores que explicam esse efeito: 1) ao direta do 2,3-DPG nas propriedades alostricas da hemoglobina e 2) uma queda no pH intra-eritrocitrio, causada pela elevao da concentrao do 2,3-DPG, que desvia a curva para a direita devido ao efeito Bohr. Na ao direta, o 2,3-DPG liga-se preferencialmente hemoglobina desoxigenada oxigenada. A ligao do 2,3-DPG com a hemoglobina provoca uma mudana conformacional na hemoglobina.

O desvio da curva tambm se d por via indireta, pela alterao do pH. A lei da neutralidade eltrica (Equilbrio de Donnan) das solues se aplica ao contedo dos eritrcitos. O mesmo nmero de cargas inicas positivas deve ser igual ao de cargas inicas negativas. O 2,3-DPG um nion impermevel em relao membrana eritrocitria; portanto, o aumento desse nion intraeritrocitrio desvia o equilbrio de Donnan, fazendo com que ocorra um influxo de ons hidrognio. Isto leva a uma queda do pH intraeritrocitrio. Desta forma, o aumento do 2,3-DPG diminui a afinidade do oxignio pela hemoglobina devido ao efeito Bohr. Os eritrcitos de vrias espcies mamferas tambm contm 2,3-DPG, contudo algumas delas, como ovinos e caprinos, tem hemoglobinas com apropriada afinidade pelo oxignio e no utilizam fatores alostrico intracelulares da hemoglobina como o 2,3-DPG. Pssaros utilizam um fosfato orgnico diferente, inositol fosfato, para modulao intracelular do oxignio afinidade pela hemoglobina.

O papel do 2,3-DPG e outros fatores na curva de dissociao e saturao por O2 da hemoglobina

O organismo humano possui mecanismos de adaptao para compensar a menor PO2 em situaes de hipxia (diminuio da quantidade de oxignio distribudo aos tecidos pelo sangue). Nesses casos, ocorrem alteraes em todos os nveis de transporte de oxignio, desde a inspirao at o nvel das mitocndrias, ou seja, ventilao, difuso, circulao nas propriedades de transporte de oxignio do sangue, microcirculao e na clula. A nvel celular quatro fatores so conhecidos por influenciar a afinidade entre o oxignio e as hemcias (hemoglobina). Estes so pH, dixido de carbono (CO2), temperatura, e certos fosfatos orgnicos (Brewer, 1974), representados na Figura 4. Um decrscimo em pH diminui a afinidade do oxignio atravs do efeito de Bohr. Um aumento no CO2 diminui oxignio afinidade via efeito de Bohr, mas tambm em funo de uma combinao direta do CO2 na forma de carbonato com hemoglobina. Um aumento na temperatura tambm diminui oxignio afinidade. Finalmente, fosfatos orgnicos das hemcias, sendo o DPG quantitativamente mais importante, diminuem a oxignio afinidade.

Figura 4. Curva de saturao e dissociao do oxignio (O2) em relao aos fatores temperatura, pH, CO2 e 2,3-DPG.

A alterao da afinidade do oxignio pela Hb ocasionada por esses efeitos representada pelo deslocamento da curva de dissociao da hemoglobina para a esquerda (maior afinidade) ou para a direita (menor afinidade). O deslocamento da curva pode ser mensurado pela medida da presso parcial de oxignio que satura 50% da hemoglobina, chamada de P50. A P50 padro (P50st) pode ser estimada por uma equao desenvolvida por Severinghaus a partir de uma gasometria venosa (SEVERINGHAUS, 1976), corrigindo para a condio padro (temperatura de 37C, pH de 7,4 e PaCO2 de 40mmHg). A P50st da curva normal de 26,8 mmHg (HSIA, 1998). Aumentos da P50 indicam um deslocamento da curva para a direita e p50 inferiores a 26,8 mmHg indicam um deslocamento para a esquerda (Figura 2). O resultado da P50st usado para detectar alteraes na afinidade do O2 pela hemoglobina devido existncia de hemoglobinas variantes ou modificaes na concentrao do 2,3-DPG. No entanto, o importante efeito fisiolgico determinado pela P50 in vivo, que rapidamente se modifica para a temperatura corporal, PCO2 e pH no sangue.

Metabolismo das hemcias e origem do 2,3-DPG

O transporte de oxignio pelas hemcias no uma atividade que, por si, dependa de energia metablica. Todavia, necessrio que alm da elevada concentrao de hemoglobina em soluo,

todos os constituintes das hemcias sejam preservadas de leses oxidativas e que a hemlise osmtica seja evitada. Assim, a manuteno dos constituintes globulares no estado ativo, a conservao de ingredientes inicos atravs da membrana e a flexibilidade das hemcias em circulao so propriedades que requerem energia metablica. Como o eritrcito maduro no possui mitocndrias, sua energia obtida por duas vias principais: a via glicoltica anaerbia (Embden-Meyerhof) e a via das pentoses fosfato ou derivao da hexose monofosfato, ou ainda via do fosfogliconato, cujas vias esto ilustradas na Figura 5. Sob circunstncias normais, cerca de 90% da glicose da hemcia metabolizada pela via anaerbia e 10% pela via no produtora de ATP (Luebering-Rapaport). J em condies de estresse oxidativo, a via de oxidao das pentoses pode ser responsvel por at 90% do consumo de glicose (LEE et al., 1999). A via glicoltica de Embden-Meyerhof forma trs importantes produtos: NADH, um co-fator na reao da metahemoglobina redutase; ATP, o principal nucleotdeo fosfato de alta energia; e 2,3DPG, um regulador da funo da hemoglobina. Atualmente, considera-se que a sntese e degradao do 2,3-DPG esto sob o controle de duas enzimas, a difosfoglicerato-mutase (BGPM) e a difosfoglicerato-fosfatase (BPGP), respectivamente.

Efeito metablico do 2,3-DPG

Outra das funes do 2,3-DPG, no relacionadas diretamente com as propriedades respiratrias da hemoglobina, consistem na inibio de algumas enzimas da gliclise, da via das fosfopentoses e do metabolismo dos nucleotdeos, regulando a produo de ATP. Estes efeitos inibidores resultam da interao do 2,3-DPG com as protenas catalticas e/ou formao de quelatos com um cofator indispensvel, o Mg2+. Conforme referido anteriormente, a atividade glicoltica diminui nos eritrcitos que contem elevada concentrao de 2,3-DPG. Em princpio esse efeito inibidor influenciado por determinadas condies intraglobulares, tais como a porcentagem de deoxihemoglobina presente. De todas as enzimas da gliclise, a hexoquinase (HK) a que se revela mais sensvel inibio pelo 2,3-DPG, deste modo influenciando toda a seqncia metablica; em contrapartida, se desconhece a relevncia fisiolgica do efeito inibidor produzido pelo 2,3-DPG nas restantes enzimas glicolticas (fosfofructoquinase, aldolase, desidrogenase do gliceraldedo-fosfato, fosfogliceratoquinase) que no parecem ser afetadas significativamente por concentraes elevadas de 2,3-DPG. Quanto piruvato-quinase, embora seja inibida por concentraes elevadas de 2,3DPG, no dever exercer grande influncia no consumo da glicose em eritrcitos com 2,3-DPG em excesso, atendendo a localizao em que se encontra na seqncia glicoltica.

Observaes permitiram concluir que cerca de 50% da inibio da gliclise em eritrcitos com 2,3-DPG elevado seria devido diminuio do pH intraglobular, induzida pelo 2,3-DPG; nestas condies, a atividade glicoltica torna-se dependente da inibio da fosfofructoquinase, por diminuio do pH. O resto do efeito inibidor seria causado pela inibio da hexoquinase pela 2,3DPG, independentemente da variao do pH.

Figura 5: Representao esquemtica da gliclise, do ciclo das pentoses e do ciclo de LueberingRapaport nos eritcitos.

Fatores que regulam a sntese e degradao do 2,3-DPG

Os principais fatores que regulam a concentrao do 2,3-DPG dentro dos eritrcitos so dois: a alterao do pH intra-eritrocitrio e a hipxia (Figura 7).

pH
Pequenas alteraes do pH intracelular podem interferir na gliclise e no metabolismo do 2,3DPG. A elevao do pH intracelular estimula a gliclise, aumenta a atividade da DPG-mutase (enzima que converte 1,3-DPG em 2,3-DPG) e inibe a atividade da DPG-fosfatase (enzima que decompe o 2,3-DPG em 3-fosfoglicerato), resultando numa maior sntese e menor degradao de 2,3-DPG. Por outro lado, a queda do pH intracelular provoca um efeito contrrio, diminuindo a concentrao de 2,3-DPG e contribuindo para a sntese de lactato (DUHN e GERLACH, 1971). Esse mecanismo de sntese e degradao do 2,3-DPG assume grande importncia clnica na preservao de estoques de sangue, uma vez que a degradao do 2,3-DPG diminui a afinidade da hemoglobina para o oxignio, dificultando a oxigenao dos tecidos perifricos. Entre outros processos utilizados para maior preservao do sangue coletado, salienta-se a elevao do pH no meio da colheita e preservao, alm da adio de diversos compostos (Ex: fosfato inorgnico, piruvato azul de metileno, cido ascrbico) ou a conservao das amostras congeladas.

Figura 6. Manuteno da bolsa de sangue versus a concentrao de 2,3-DPG (Adaptado de Lacerda, 2005)

Hipxia
O stress hipxico produz um aumento nos nveis de DPG. Isso inclui exposio altitude, anemia, insuficincia cardaca, e alguns casos de doenas pulmonares. Trs hipteses buscam explicar esse mecanismo. A primeira atribui ao eritrcito desoxigenado o desvio do pH plasmtico para o lado alcalino, visto que a hemoglobina desoxigenada um cido mais fraco do que a forma oxigenada. Como dito acima, o pH intra-eritrocitrio alcalino aumenta a sntese do 2,3-DPG (DUHN e GERLACH, 1971). A segunda hiptese baseia-se no fato de o 2,3-DPG possuir maior afinidade pela hemoglobina desoxigenada do que pela oxigenada. Em situao de hipxia, h um aumento da hemoglobina desoxigenada, fazendo com que o 2,3-DPG ligue-se mais facilmente hemoglobina. Desta forma, ocorre uma diminuio do 2,3-DPG livre. Essa queda do 2,3-DPG livre reduz sua ao como inibidor da DPG mutase, resultando assim num aumento da sntese do 2,3-DPG (DUHN e GERLACH, 1971). A terceira teoria atribui hipxia um estmulo eritropoeiese, aumentando o nmero de eritrcitos relativamente jovens. Tem sido demonstrado que os eritrcitos jovens possuem maior concentrao de 2,3-DPG que os mais velhos (SAMAJA et al, 1991).

Figura 7: Representao simplificada do efeito do pH e da hipxia sobre a regulao da formao de 2,3-DPG no eritrcito.

As adaptaes resultantes da hipxia, principalmente hematolgicas, so freqentemente buscadas por atletas, que procuram na melhoria das condies de transporte do oxignio um melhor desempenho em atividades de alta exigncia fsica ao nvel do mar ou em altitudes prximas. Para alcanar esses efeitos, desenvolveu-se o Treinamento de Altitude (TA), muito difundido entre os atletas de alto nvel, que inclui, durante a temporada, um perodo de permanncia em locais acima de 2.000 metros (Geller, 2005). Dentre as mudanas fisiolgicas e bioqumicas que ocorrem, pode se ressaltar o 2,3-DPG como fator fundamental no incremento da eficincia de transporte de oxignio e sua essencialidade na liberao do oxignio aos tecidos perifricos sob baixas presses de O2. A representao esquemtica dessas modificaes apresentada na Figura 8, que ilustra tambm o treinamento de atletas sob condies de hipxia atravs de aparelhos simuladores de altitude.

Altitude

PO2

Ventilao CO2 expirado pH (alcalose) HCO3 eliminado via urina

hematcrito 2,3-DPG tamanho da mitocndria produo de hemcias

Figura 8: Representao simplificada dos efeitos da altitude sobre a fisiologia e bioqumica da respirao para aclimatizao humana nesses ambientes (Ilustrao adaptada de Geller, 2005 em condies de hipoxia em aparelho simulador de altitude (GO2) para avaliao do desempenho fsico).

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Outros fatores de regulao do 2,3-DPG A regulao na concentrao do 2,3-DPG tambm feita por mecanismo de feedback negativo, ou seja, um aumento na concentrao do 2,3-DPG, por aumento do pH ou por hipxia, levar: 1) reduo do pH intra-eritrocitrio, por desvio no equilbrio de Donnan, como explicado anteriormente e 2) a um aumento o 2,3-DPG livre (DUHN e GERLACH, 1971). Ambos os efeitos levaro a uma reduo na concentrao do 2,3-DPG. Alm desse fator, recentemente tm sido demonstrados que a concentrao de hemoglobina e Mg2+, tambm podem estar regulando a sntese e degradao do 2,3-DPG, contudo os mecanismos de ao desses fatores permanecem desconhecidos (Mulquiney & Kuchel, 1999).

Referncias bibliogrficas
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