26 DE MAYO DE 2011 UNIVERSIDAD AUTNOMA DE QUERTARO

Palacios Prez Alexander

LABORATORIO DE QUMICA ORGNICA

M. EN C. CARMEN PEZA LEDESMA

PRCTICA 6

Cromatografa en Columna: Identificacin y purificacin de un Compuesto

Objetivo:
*Conocer la tcnica de cromatografa en columna, sus caractersticas y los factores que en ella intervienen. *Utilizar la cromatografa en columna para la separacin de mezclas de compuestos orgnicos. *Controlar por cromatografa en columna la separacin de una mezcla de compuestos *Conocer la tcnica cromografa para identificar o comparar compuestos *Elegir los disolventes adecuados para un proceso de separacin/purificacin de un compuesto.

Marco Terico:
En la cromatografa de columna las molculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las molculas por la fase estacionaria o por la fase mvil. Si una molcula A tiene ms afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajar ms rpido que A. La cromatografa nos ayuda a identificar y separar protenas. As como comparar muestras o saber la polaridad de un compuesto, usando una columna con cargas positivas o negativas. La cromatografa de adsorcin o Lquido-Slido es la forma clsica de la cromatografa de lquidos. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. La cromatografa Lquido-Slido es ms til para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografa tambin se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular de este mtodo es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en mezclas.

La cromatografa de reparto est formada por la cromatografa Lquido-Lquido y la cromatografa unida

qumicamente. Estas tcnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partculas del soporte relleno. En la cromatografa unida qumicamente, la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte. Esta tcnica actualmente es ms usada debido a que la cromatografa lquido-lquido necesita de un recubrimiento peridico de las partculas del soporte debido a la prdida de la fase estacionaria por disolucin en la fase mvil.

Factores que influyen en una separacin por cromatografa en columna. (En cromatografa de adsorcin).
La cantidad de sustancia adsorbida, a temperatura constante, es mayor cuanto mayor es la presin parcial del adsorbato (en el caso de los gases o vapores) o la concentracin (solutos). Es decir, la adsorcin ser tanto ms fcil, cuanto mayor sea el volumen y el peso de las molculas o iones del adsorbato, y cuanto menor sea la temperatura de trabajo.

La purificacin del compuesto depende de limpieza en utensilios, por lo que debern ser lavados con anticipacin con agua desionizada para evitar una contaminacin en cualquier proceso. Tcnicas de separacin cromatografa por elucin, por adsorcin y por desplazamiento. Las tcnicas cromatografas se clasifican a menudo especificando el estado fsico de las dos fases empleadas. En consecuencia, se usan los siguientes trminos: Cromatografa gas-lquido (GLC) Cromatografa gas-slido (GSC) Cromatografa lquido-lquido (LLC) Cromatografa lquido-slido (LSC) Se puede encontrar tambin en la bibliografa el trmino Cromatografa de Reparto Gas-Lquido (GLPC). Sin embargo, a menudo la distincin entre estos modos no es sencilla. Por ejemplo, en cromatografa de gases se puede usar un lquido para modificar una fase estacionaria slida de tipo adsorbente.

Algunas Aplicaciones del uso de Cromatografa en columna son:

*Separaciones de componentes de plantas medicinales. * separaracion de componentes de una sntesis orgnica. * separacin de colorantes. * separacin e identificacin de hioscina y de morfina. * separacin de acido acetico, alcohol cetilico y metil-etil cetona. * separacin e identificacin de los compuestos intermedios de una sntesis orgnica * En la produccin sinttica de acetaminofen, identificacin de la imina de la N-acetilbenzoquinona. * Identificacin de levo-alfa-acido aminoadipico, durante la biosntesis de penicilina. *Identificacin de 8-nitroisoquinolina, durante la sntesis de Ciprofloxacina, un antibitico

Cromatografa por elucin: Procedimiento en el que la fase mvil se pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea cantidad en un tiempo breve. Cromatografa por desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase mvil contiene un compuesto (el desplazante) que es retenido ms fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequea cantidad en un intervalo breve. Cromatografa Frontal: Procedimiento en el que la muestra (lquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatogrfico. No se utiliza ninguna fase mvil adicional. Para la tcnica de cromatografa de adsorcin en columna se emplean columnas verticales de vidrio cerrada en su parte inferior con una llave que permita la regulacin del flujo de la fase mvil. Las columnas se rellenan con un adsorbente, como almina o gel de slice (fase estacionaria), mojado con el disolvente que se vaya a emplear en el proceso cromatogrfico. En la parte superior de la columna se pone la disolucin de la mezcla a separar y a continuacin un depsito que contenga el eluyente (fase mvil) que se va a utilizar en la separacin. Se abre la llave inferior de manera que el eluyente comience a bajar por la columna. En este proceso, los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad, de manera que el proceso de adsorcin-desorcin hace que unos componentes avancen ms rpidamente que otros. El lquido que sale por la parte inferior de la columna se recoge de manera fraccionada. Si los componentes de la mezcla avanzan a muy diferente velocidad se podrn obtener fracciones cromatografas constituidas por un solo componente.

Informacin Adicional
La cromatografa en capa fina es una tcnica para determinar el nmero de componentes de una mezcla y como una prueba preliminar para realizar una cromatografa en columna, entre otros. b) El proceso de cromatografa en columna se controla por cromatografa en capa fina, de tal manera que se puede separar cada componente de la mezcla.

a)

c) La cromatografa en columna se usa para separar grandes cantidades de material: >100mg. El proceso de cromatografa consta de una fase mvil (eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), los cuales dependen de las sustancias que se deseen separar.
La Destilacin: es el mtodo ms frecuentemente utilizado para la purificacin de lquidos. Se utiliza para separar las impurezas de un lquido o a veces para separar dos lquidos diferentes. La destilacin es la operacin de separar, mediante vaporizacin y recondensacin, los distintos componentes lquidos, slidos en lquidos o gases licuados en una mezcla, aprovechando los diferentes puntos de ebullicin de cada una de las sustancias, ya que el punto de ebullicin es una propiedad intrnseca de cada sustancia, es decir, no vara en funcin de la masa o volumen.
El punto de ebullicin de un lquido es la temperatura a la cual su presin de vapor es igual a la presin externa (comienza a ebullir).

ELUYENTES MS COMUNES PARA CROMATOGRAFA EN CAPA FINA.

acetona acetato de etilo cido actico ciclohexano cloroformo diclorometano dietil-ter etanol ter de petrleo ter dietlico iso-propanol metanol n-hexano n-pentano t-butil-ter tetracloruro de carbono tolueno

ADSORBENTES MS COMUNES PARA CCF:

Silica gel Celulosa (nativa o micro cristalino) Poliamidas Oxido de aluminio

PARA SELECCIONAR EL ADSORBENTE IDEAL SE DEBE CONSIDERAR:

Polaridad Tamao de partcula (dimetro y rea superficial) Homogeneidad

REVELADORES MS COMUNES PARA EL CCF:

Luz VV Calentar. La introduccin de la placa en vapores de yodo El roci de una solucin de agua /H2SO4 1:1 (dentro de una campana)

FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIN POR CCF

Temperatura Corrientes de aire Limpieza del equipo y del trabajo Pureza de los disolventes.

MATERIAL POR EQUIPO DE 2 ALUMNOS Columna para cromatografa Matraz redondo fondo plano 125 ml T de destilacin Refrigerante p/agua c/mangueras Colector Tapn esmerilado Vaso de pp. de 100 ml Vaso de pp. de 150 ml Vidrio de reloj Agitador de vidrio papel p/cromato-Placas 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 Pipeta de 5 ml Probeta de 25 ml Piseta de 125 ml c/eluyente Esptula Frasco p/cromatografa c/tapa Portaobjetos Embudo de vidrio Tubos capilares Frascos "viales Pinza de tres dedos con nuez Recipiente elctrico para B.M 2 2 1 1 3 6 1 4 8 3 1

SUSTANCIAS Y REACTIVOS
Acido benzoico Azul de metileno Silica gel para columna Acetato de etilo Hexano Sulfato de sodio anhidro Yodo

ESTRUCTURAS, CARACTERISTICAS Y PROPIEDADES de algunas Sustancias o Compuestos.

CIDO BENZOICO * Densidad 1320 kg/m3 * Masa molar 122.12 * Punto de fusin 395 K * Punto de ebullicin 522 K | * Se descompone con Dixido de carbono * Calor de combustin -766 Kcal * Estable bajo condiciones estables * Toxico AZUL DE METILENO * Masa molecular 319.85 g/mol * Densidad 1.757 g/cm3 * Punto de ebullicin (se descompone) * Punto de fusin 100 C * Poco toxico * Poco inflamable * No reactivo * estable

SILICAGEL * Slido blanco inodoro. * Masa molecular: 60.08 g/mol * Densidad: 200-1430 kg/m3 * Temperatura de ebullicin: 2230C * Temperatura de fusin: 1710 C * Insoluble en agua | * Producto no peligroso * Almacenar bien cerrado, seco. * Temperatura de almacenamiento sin limitaciones * No inflamable.

ACETATO DE ETILO * Densidad relativa: 0.9 * Peso molecular: 88.1 g/mol * Punto de ebullicin: 77C * Punto de fusin: -83C * Punto de inflamabilidad 280 K * Punto de ignicin 700 K | * Estable bajo condiciones normales * Irritante HEXANO * Peso molecular: 86.17 g/mol * Punto de ebullicin: 68.7C * Punto de fusin: -95C * Densidad relativa: 0.66 * Punto de inflamacin: -21C * Temperatura de autoignicin: 261C | * Corrosivo, reactivo explosivo toxico ambiental inflamable biolgico. * Infeccioso SULFATO DE SODIO ANHIDRO Na2SO4 PROPIEDADES FSICAS | CARACTERISTICAS CRETIB | * Solubilidad a 33 C 45.3 % * Peso molecular 142.04 g/mol * Punto de fusin C 844 Temperatura de descomposicin 1200 C | * No inflamable * Poco toxico |

YODO | PROPIEDADES FSICAS | CARACTERISTICAS CRETIB | * Peso molecular: 257.81 g/mol * Punto de ebullicin: 184C * Punto de fusin: 114C * Densidad: 4.94 Kg/m3 * Solubilidad: ligeramente soluble en agua | * Altamente inflamable * Estable en condiciones normales * Txico * Punto de inflamacin 11 C * Temperatura de autoignicin 385 C

Los eluyentes utilizados en esta prctica: acetato de etilo, n-hexano, metanol

PROCEDIMIENTO

EXPERIMENTO 1. PURIFICACIN DE CIDO BENZOICO Se le proporcionar una mezcla slida de cido benzoico contaminado con azul de metileno, los cuales se separan por cromatografa en columna. Para empacar la columna sujtela en el soporte con las pinzas. Si la llave es de vidrio, engrsela ligeramente y mantenga la posicin de cerrado. Introduzca hasta el fondo un pequeo pedazo de algodn ayudndose con la varilla de vidrio, agregue 8 mL de eluyente (acetato de etilo) y presione suavemente el algodn para que quede bien colocado y sin burbujas (Nota 1). Prepare una suspensin de.l0 g de gel de slice para columna en 40 mL de eluyente y agite por 5 min (para eliminar las burbujas de aire). A travs del embudo de vidrio vierta la suspensin en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme. Abra la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar la gel de slice sin disolvente (Nota 2). En un vaso de precipitado de 100 mL disuelva 0.4 q de la mezcla problema con la mnima cantidad de eluyente (4 o 5 mL), ayudndose con el agitador, virtala con cuidado para que quede distribuida uniformemente encima de la superficie de la gel de slice. Abra la llave para colectar el disolvente y que se adsorba la muestra aplicada (cuidando que no se seque la columna). Colecte fracciones (eluatos) de 6 mL en los frascos viales y verifique la separacin haciendo cromatoplacas (Notas 3 y 4) de cada una de las fracciones usando una muestra testigo como se indica en la figura 1. Eluya las cromatoplacas en mezcla de hexano-acetato de etilo (2:1) y observe en cuales fracciones hay presencia del compuesto separado (Figura 1). En cada cromatoplaca observe el cambio de la coloracin de la mancha del producto principal (a menor concentracin menor intensidad de color).

La elucin y separacin termina en el momento en el que ya no se observa en la cromatoplaca presencia del producto separado. En un matraz rena las fracciones que contienen producto. Para recuperar la sustancia: destile el exceso de disolvente utilizando una destilacin simple, calentando el matraz en un bao mara (Nota 5), deje en el matraz un residuo de 5 mL aproximadamente y virtalo en un vidrio de reloj o en un vaso, para que termine de evaporarse en la campana. Pese el producto recuperado y calcule el rendimiento.

Notas: 1.)Otra opcin para preparar la columna es, agregando 10 mL de eluyente indicado y despus colocar en el fondo de la columna un pedazo de algodn o fibra de vidrio ayudndose con la varilla de vidrio presionando suavemente sin apretar el algodn. 2) Mantenga siempre el nivel del eluyente 0.5 cm por arriba del nivel del adsorbente. 3) Para preparar las cromatoplacas se introducen 2 portaobjetos juntos, limpios y secos en una suspensin de silica gel al 35% en acetato de etilo. 4) Para aplicar las muestras a la cromatoplaca utilice los capilares, los que previamente deben ser estirados en la flama del mechero con el fin de que tengan el dimetro adecuado. 5) Para recuperar un slido disuelto en un disolvente, siempre se destila el disolvente calentando en un bao-mara.

Figura 1. Seguimiento de la separacin por cromatografa en capa fina

RUTA CRTICA:
Esta prctica comienza pesando un compuesto x (azul de metileno y acido benzoico), en las balanzas analticas, en tanto el montaje de la Columna de SilicaGel, con todas las precauciones antes descritas, se disuelve para facilitar el paso ante la columna, y rellenando constantemente para observar el flujo de a sustancia y as hasta conseguir 10ml en cada frasco, el 1 y 2 se regresaron para evitar que fuera puro solvente antes de que haya asentado el compuesto, posteriormente se hicieron cromatoplacas, de muestra de cada frasco con mezcla original y acido benzoico, con el motivo de identificar en que Frascos haba la posibilidad de acido benzoico. Posteriormente los frascos con alta posibilidad se sometieron a un proceso de destilacin simple, controlando la temperatura al punto de ebullicin del acido benzoico, se dejo a que se evaporara el liquido, formando pequeos cristales alargados en el recipiente, se obtuvo el compuesto para ser pesado y reportado.

RESULTADOS:
10 Fracciones (eluatos) de 10 ml cada una. Cromatoplacas con rastro de cido benzoico Eluatos con Coloracion 5,6,7,8,9,11,12 Cromatoplacas 3,4,5,9,10 Masa inicial de la mezcla cido benzoico y Azul de metileno= 0.4g Masa obtenida: 0.33g Rendimiento= 0.33g/0.4g X 100 =82.5 %

ANLISIS DE RESULTADOS:
Las cromatoplacas se hicieron con acido benzoico, mezcla (muestra original) y muestra de cada frasco. Con el objetivo de comparar si suba el acido benzoico y la muestra, podemos concluir que es acido benzoico. Debido a que los eluatos 1 y 2 se regresaron a la columna, por si en el acomodo de la columna saliera solo eluyente ya que todava no haba presencia de que bajase el compuesto (mancha). Por lo que la cromatoplaca 3 se observa una ligera aparicin correspondiente al frasco 5 de los eluatos de nuestra cromatografa en columna, de lo que deducimos que tardo en bajar el compuesto, del 3 al 5 en las cromatoplacas se aprecia un incremento en la mancha, asegurando que contenan mas acido benzoico. En los frascos 9 y 10 sucedi lo mismo, por lo que nos dice que en 6, 7, 8, bajo el azul de metileno, por otra parte despus del frasco 5 en los eluatos se apreciaba una tonalidad rosa suave, pasando a tonalidades azul por el 7 y por ultimo rosa ms suave en el 12. Nos confirmo la aparicin de azul de metileno Cabe mencionar que en la columna se observo una mancha azul desplazndose por la misma. El mtodo era de observar una lnea casi recta, pero en nuestro caso la mancha se observo a desplazarse exactamente hasta el eluato 5 y como se menciono antes el 1 y 2 se re depositaron a la columna se tomaron para la destilacin todos los eluatos obtenidas por medio de la cromatografa en columna, manteniendo la temperatura entre 65 y 70, al destilar el eluyente y evaporarlo totalmente se dejo en reposo y se peso la masa del acido benzoico(sustancia problema), y se obtuvo el rendimiento del 82.5% consideramos que fue un porcentaje aceptable debido a que el peso de nuestra muestra inicial adems de contener acido benzoico tambin contena azul de metileno y no se precis con el porciento de cada compuesto. La prctica se realizo con todas las medidas para evitar contaminacin alguna, Hasta el detalle de conseguir frascos viales con tapn y no de rosca debido al color mbar, dificultndose el color de la muestra. No hubo problemas hasta tratar de quitar un tapn en donde por la herramienta o el tapn se contaminaron nuestras muestras, donde se observan cristales definidos con grumos de color verde, el resultado debi de ser cristalino blanquizco o amarillento. Por lo que se debe considerar como factor, para evitar una contaminacin en prximas practicas. Es importante saber preparar una cromatoplaca ya que esto puede afectar nuestros resultados, hay que tener cuidado de que la placa este bien limpia y de no contaminar con nuestros dedos, hay que verificar que la fase

estacionaria, en este caso la silica gel, este puesto adecuadamente sin burbujas y de manera homognea, ya que esto puede afectar en el recorrido de nuestra muestra y del eluyente. Para la cmara eluyente es importante que despus de haber ingresado la cromatoplaca ya no la muevas de lugar, ya que esto podra hacer que el eluyente no suba de la manera adecuada al igual que la muestra, provocando que nuestra mancha se vea de manera deforme y no se vean datos concisos.

CONCLUSION:
Se observ por medio de esta prctica los factores que influyen en una cromatografa en columna, los cuales son: polaridad del eluyente, peso molecular de la sustancia, la purificacin y las condiciones seguras para extraer. Aprendimos a relacionar las dos tipos de cromatografas vistas, cromatografa en capa fina y cromatografa en columna, para la separacin de una mezcla de sustancias (columna), as como Identificar un compuesto (capafina) y de la purificacin de una sustancia (destilacin). Concluimos que la cromatografa en columna nos proporciona una manera sencilla de separar elementos coloridos de una mezcla, en nuestro caso separamos azul de metileno de cido benzoico. El cido benzoico, se eluy debido a que tiene una polaridad similar a la del acetato de etilo (eluyente) esto nos habla de la fuerte interaccin intermolecular que tendr el eluyente con el cido benzoico; en lo que respecta al colorante (azul de metileno) se adsorbi en la fase estacionaria porque tiene un peso molecular relativamente grande.

BIBLIOGRAFA
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