Modul Grundlagen der Genetik und Molekularbiologie

Praktikum WS 2009/2010 4 Parallelkurse Di, Mi, Do, Fr 13:30-17:30; KS 4 Biol. II/III

In diesem Skriptum sind die Kursteile in der zeitlichen Kursfolge abgedruckt

Inhaltsverzeichnis
Einfhrung in die Molekulare Genetik (Kurswoche 1 und 2) Anke Becker, Wolfgang Hess, Javier Serrania, Claudia Steglich

S. 02-18

Nachweis einer pflanzlichen DNA durch PCR und Isolierung von RNA aus Pflanzen (Kurswoche 3) Gabor Igloi

S. 19-24

Genetik mit C. elegans (Kurswoche 4) Ralf Baumeister, Ekkehard Schulze, Maren Hertweck, Andreas Eizinger, Enrico Schmidt

S. 25-41

Genetisches Arbeiten mit Drosophila , dem klassischen und modernen tierischen Modellsystem (Kurswoche 5) Karl-Friedrich Fischbach

S. 42-64

Molekulargenetische Untersuchung von Stammzell-Nischen bei Arabidopsis thaliana (Kurswoche 6) Edwin Groot

S. 65-71

Einfhrung in die Molekulare Genetik

Anke Becker, Wolfgang Hess,Javier Serrania, Claudia Steglich Die Methoden der molekularen Genetik haben heute ber die Grenzen der Biologie hinaus Einzug in beinahe alle Bereiche der Naturwissenschaften und der Medizin gefunden und bilden u.a. die Grundlagen der Gentechnik. Zentral fr diese Methoden ist der Umgang mit dem nichtpathogenen Bakterienstamm Escherichia coli K-12 (kurz E. coli K-12). Dieser stellt ein klassisches Untersuchungsobjekt der Genetik dar und ist heute der genetisch am besten verstandene Organismus. Deshalb wurden mit ihm (und werden immer noch) die modernen molekulargenetischen Methoden der Genklonierung und heterologen Genexpression entwickelt. In diesem Praktikumsteil wollen wir grundlegende molekulargenetische Techniken kennenlernen und damit experimentell ein klassisches Untersuchungssystem, das Ihnen schon aus der Vorlesung bestens vertraute lac-(Lactose)-Operon von E. coli, studieren. Methoden der molekularen Genetik: Transformation, Plasmidvektoren und Restriktionsendonukleasen Fr das molekulargenetische Arbeiten spielen neben dem Bakterium E.coli K-12 PlasmidVektoren und Restriktionsenzyme sowie die Transformation eine zentrale Rolle. Als Transformation wird die Aufnahme von nackter DNA durch das Bakterium bezeichnet (benannt nach dem "transformierende Agens" von Griffith; Vorlesung). Hierbei ist die Herkunft der DNA (Verwandtschaft) in erster Nherung ohne Bedeutung. Jede DNA kann aufgenommen werden 1. Obwohl bei der Transformation von E.coli der Mechanismus der Aufnahme der DNA weitgehend ungeklrt ist, stellt sie eine zentrale Technik in der molekularen Genetik dar: Mittels der Transformation werden (rekombinante) Plasmide (s.u.) in das E. coli Bakterium eingeschleust und dort beliebig vermehrt. Plasmide sind kleine, ringfrmige DNA Molekle, die in der E.coli Zelle extrachromosomal vorliegen, also nicht Bestandteil des Chromosoms sind. Sie werden im Bakterium stabil repliziert und dadurch auch stabil weitervererbt und so vermehrt. In der Molekulargenetik werden speziell konstruierte Plasmide, sogenannte Plasmidvektoren, oder kurz Vektoren, verwendet. Die Grundeinheit solcher Vektoren besteht immer aus (1) einer Replikationseinheit, (2) einem Selektionsgen sowie (3) definierten, singulren Schnittstellen fr Restriktionsendonukleasen 2. An diesen Schnittstellen kann der ringfrmig vorliegende Vektor aufgeschnitten werden, um (4) Fragmente fremder DNA einzusetzen. Einen Plasmidvektor kann man sich als eine Struktur vorstellen, die aus einer Reihe von Modulen zusammengesetzt ist. Aus den in den verschiedensten Vektoren vorkommenden Modulen knnen wiederum neue Vektoren zusammengesetzt werden. Das geht so hnlich wie etwa das Konstruieren mit Lego-Bausteinen. Gnstig gelegene Erkennungsstellen fr Restriktionsendonukleasen stellen dabei die potentiellen Steckverbindungen dar. Durch Auswahl der jeweils geeigneten Enzyme ist es mglich, die einzelnen Bausteine aus verschiedenen Plasmiden auszuschneiden, zu isolieren und in neuer Kombination im
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Die Transformation stellt neben der Transduktion und der Konjugation eine der drei Mechanismen fr den natrlichen Austausch von Erbmaterial bei Bakterien dar. Transformation, Transduktion und Konjugation werden deshalb auch als Parasexualmechanismen bezeichnet. Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, welche die DNA sequenzspezifisch schneiden. Das Enzym HpaI z.B. erkennt die Sequenz 5'-GTTAAC und schneidet den DNA-Doppelstrang immer dort, wo diese Sequenz vorkommt, genau in der Mitte zwischen dem letzten T und dem ersten A durch. Das Enzym EcoRI wiederum erkennt die Sequenz 5'-GAATTC und spaltet beide DNA-Strnge jeweils hinter dem G. Das Enzym verursacht also an beiden Enden ein vier Basen herausstehendes 5' -Ende (5-'AATT).

Reagenzglas mittels DNA-Ligase zu verbinden bzw. irgendeine Fremd-DNA in das Plasmid einzusetzen. Solche Module, aus denen ein Plasmid aufgebaut ist, sollen am Plasmid pFDY102 mit dem wir im Praktikum arbeiten, beispielhaft erlutert werden (Abb. 1).

Abb. 1: Vektorstrukturelemente. (A) Schematische Darstellung eines Vektors mit den wichtigsten Vektorelementen. (B) Vektorkarte des in diesem Praktikum verwendeten Vektors pFDY102.

In dem Plasmid pFDY102 gibt es eine Struktur, die mit ori bezeichnet ist. Dieses Modul (1) ist fr die stabile Replikation verantwortlich. Am "ori" (fr "origin of replication"), also an der Replikations-Startstelle beginnt in der Bakterienzelle die Replikation der DNA 3. An den ori anschlieend befindet sich ein weiteres Modul (2), auf dem sich das Gen bla als Selektionsgen befindet. Dieses Gen kodiert fr das Enzym -Lactamase. Die -Lactamase spaltet den Lactam-Ring von Penicillin und seinen Derivaten (z.B. Ampicillin). Bakterien, die dieses Enzym synthetisieren, sind dadurch resistent gegen Penicillin und Ampicillin 4. Die zwei Einheiten ori (fr die stabile Replikation) und das bla-Gen (als Selektivmarker) machen bereits einen Klonierungsvektor aus. Diese insgesamt etwa 2500 bp (Basenpaare) groe Struktur lsst sich durch Transformation in E. coli-Zellen bringen. Wenn nach Transformation von E.coli mit Plasmid-DNA auf Ampicillin-Resistenz selektioniert wird, so werden sich nur diejenigen Zellen vermehren knnen, die das Plasmid erhalten haben. Alle Nachkommen dieser Zellen besitzen ebenfalls das Plasmid, und zwar mit einer Kopienzahl von etwa 60/Zelle. So kann ein einziges DNA-Molekl in krzester Zeit milliardenfach in den E. coli Zellen vermehrt werden. E.coli dient also als lebende Vermehrungsmaschine fr die DNA. Im Plasmid pFDY102 ist neben den minimalen Strukturen dem ori (1) und dem Resistenz-Gen bla (2) noch ein weiteres DNA-Fragment (4) eingefgt. Auf diesem DNA-Fragment befindet sich ein Teil des lac-Operons von E. coli.

Plasmide kommen in groer Vielfalt in der Natur vor. Unser "origin of replication" wurde aus einem natrlich vorkommenden Plasmid, ColE1, mit Restriktionsendonukleasen als DNA-Fragment herausgeschnitten. Das Gen bla wurde aus dem Transposon, Tn3 (siehe Vorlesung), herausgeschnitten und an den ori ligiert.

Das lac-Operon von E. coli Das lac-Operon wurde bereits in der Vorlesung ausfhrlich behandelt und wird hier nur in seinen Grundeinheiten stark vereinfacht wiederholt. Verzichtet wird daher auf die zwei Hilfsoperatoren (O2 und O3) im Operon und deren Rolle, auf die CAP-abhngige Regulation sowie auf die Allolactose und ihre Rolle bei der Induktion des Operons. Prfungsrelevant ist natrlich das Gesamtmodul Genetik/Molekularbiologie. Das Operon kodiert fr die Enzyme, die E. coli fr die Verwertung von Lactose (Milchzucker) als Kohlenstoff- und Energiequelle bentigt. (Die Struktur des -galaktosidischen Zuckers Lactose ist in Abb. 2 gezeigt.) Das lac-Operon (Abb. 3) besteht aus dem Gen lacZ, das fr das Enzym -Galaktosidase (das Lactose-spaltende Enzym) kodiert, dem lacY-Gen, das fr die Permease (ein integrales Membranprotein, das Lactose in die Zelle transportiert) kodiert, sowie einem weiteren Gen, lacA, das fr eine Transacetylase kodiert. Dieses Enzym ist jedoch fr die LactoseVerwertung nicht notwendig. Alle drei Gene werden von einem gemeinsamen Promotor, dem lac-Promotor (P in lacOP), aus abgelesen. Ein Promotor ist die spezifische Aufsprungstelle fr die RNA Polymerase, das transkribierende Enzym. Am Promotor beginnt die Transkription, d.h. das Kopieren der DNA in RNA. Im Falle des lac-Operons wird eine mRNA synthetisiert, die die Information des lacZ-Gens, des lacY-Gens und des lacA-Gens umfasst. Auf dieser mRNA befinden sich wiederum drei Startstellen fr die Translation, das bersetzen der RNA in ein Protein. Es befindet sich jeweils eine spezifische Translations-Startstelle vor dem lacZ Gen, vor dem lacY Gen und vor dem lacA Gen. Von der lac-Operon RNA werden also drei Proteine synthetisiert.

Abb.2: Strukturformel von Lactose, IPTG und ONPG

Abb.3: Struktur des lac-Operons

Regulation des lac-Operons Das lac-Operon wird nicht immer in hohen Raten transkribiert (=abgelesen), sondern nur dann, wenn Lactose vorhanden ist. Die Expression des lac-Operons ist also reguliert. Hierfr verantwortlich ist das Produkt eines weiteren Gens, lacI. Dieses Gen befindet sich oberhalb (stromaufwrts) des lac-Operons, also der Einheit aus lac-Promotor, lacZ-Gen, lacY-Gen und lacA-Gen. Das vom lacI-Gen synthetisierte Protein wird lac-Repressor genannt. In Abwesenheit von Lactose bindet das Repressor-Protein spezifisch an eine DNA-Sequenz im Promotor-Bereich (an den sog. Operator, O in lacOP). Dadurch wird der Promotor blockiert. Die RNA-Polymerase kann nicht mehr auf den Promotor aufspringen, und das Ablesen (die Transkription) der drei Gene des Operons (lacZ, lacY und lacA) ist stark heruntergeschaltet. Man sagt, das lac-Operon ist reprimiert. In Anwesenheit eines -galaktosidischen Zuckers (Induktor) wird der Repressor durch Bindung des Zuckers an das Repressor-Protein in seiner Struktur so verndert, dass der Repressor nun nicht mehr an den Operator binden kann (sog. allosterische Umlagerung der Proteinkonformation). Der Promotor ist jetzt fr die RNA-Polymerase zugnglich, und das lacOperon wird mit hoher Rate exprimiert. Man sagt, das lac-Operon ist induziert. Im Plasmid pFDY102 (unser Beispiel, Abb. 1) schliet sich an das bla-Gen das lacI Gen an, das fr den Repressor des lac-Operons kodiert. Auf das lacI-Gen folgt die Kontroll-Region (lacOP) des lac-Operons mit dem Promotor, P, und dem Operator, O. Daran schliet sich das lacZ-Gen an. Wichtig fr das Experiment!: Die Gene lacY und lacA sind nicht auf dem Plasmid vorhanden.

Experimente
Im Praktikum werden wir aus E. coli-Kulturen DNA des Plasmids pFDY102 isolieren. Dann werden wir mit dieser Plasmid-DNA E. coli Stmme mit unterschiedlichen Genotypen transformieren. Die verwendeten Stmme tragen im Chromosom unterschiedliche Mutationen im lac-Operon. Die Transformanten werden fr einen Komplementations-Test eingesetzt. Wir werden berprfen, bei welchen der Stmme die Mutationen im Chromosom durch das Plasmid komplementiert (= zum Wildtyp-Phnotyp ergnzt) werden, indem Sie die Transformanten auf ihren Lactose-Phnotyp hin analysieren.

Experiment 1.1: Isolieren von Plasmid-DNA Lac-negativen E. coli-Stmmen

und

Komplementation

von

Sie erhalten eine bernachtkultur eines E.coli Stammes, der das Plasmid pFDY102 enthlt. Es werden zwei Prparationen durchgefhrt. A: Die Plasmid-DNA wird aus den Bakterien isoliert (Gentechnik). B: Die chromosomale DNA und die Plasmid DNA werden zusammen isoliert (Avery-Experiment). Versuchsdurchfhrung (siehe Ablaufschema Abb. 4) 1. Zwei Reaktionsgefe mit der Gruppennummer und A bzw. B beschriften. 2. Von der bernachtkultur (kurz Aufschtteln) je 1.5 ml in die Reaktionsgefe berfhren. 3. 2 min. bei 13.000 rpm (rotations per min) in der Eppendorf-Zentrifuge zentrifugieren (die Bakterien werden sedimentiert). 4. Die berstnde abgieen (in das Becherglas am Platz). 5. Die Sedimente von A und B mit Hilfe einer verstellbaren Mikropipette (Pipetman 0-200 l) mit 100 l Lsung I 5 homogen resuspendieren (= durch mehrfaches auf- und abpipettieren). 6. Reaktionsgef A fr 5 min. bei Raumtemperatur inkubieren Reaktionsgef B darf lnger (10 min) bei Raumtemperatur inkubieren. (stehen lassen).

7. Reaktionsgef A erst auf Eis stellen, dann 300 l Lsung II 6 zugeben. Durch mehrmaliges Umdrehen des Rhrchens die Lsung gut mischen, bis sie viskos klar ist. 5 min auf Eis stehen lassen. 8. Zu Reaktionsgef A: 200 l Lsung III 7 zugegeben und dann durch Umdrehen des Rhrchens und auch durch Schnippen mit dem Zeigefinger sehr gut mischen. 9. Zu Reaktionsgef B 500 l Lsung IV 8 zugeben. Durch mehrmaliges Umdrehen des
5

Lsung I: 50 mM Glucose; 25 mM Tris-HCl pH 8.0; 10 mM EDTA und 2 mg/ml Lysozym. EDTA komplexiert 2+ divalente Kationen z.B. Mg . Dadurch wird die uere Membran der Bakterien permeabel. Das aus Hhnereiwei isolierte Enzym Lysozym verdaut die Bakterienzellwand --> Schutz der Hhnereier vor Bakterienbefall. Lsung II: 0,2 M NaOH; 1 % SDS (Natrium-Dodecylsulfat). Das SDS denaturiert Proteine, und die Zellemembran wird aufgelst. Durch das NaOH wird die DNA denaturiert. Lsung III: 3 M Na-Acetat pH 4,8. Die vorher alkalische Lsung wird neutralisiert. Die kleinen Plasmide knnen wieder ihre doppelstrngige Form einnehmen und renaturieren. Die Proteine verklumpen zusammen mit der hochmolekularen, chromosomalen DNA und knnen abzentrifugiert werden Lsung IV: 1 % SDS; 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8,0; 2 mM EDTA. Durch das SDS werden die Membranen aufgelst und die Proteine denaturiert. Die chromosomale DNA wird nicht denaturiert.

Rhrchens die Lsung gut mischen. 10. Reaktionsgef A und B: 5 min. bei Raumtemperatur inkubieren. 11. Reaktionsgef A und B: 6 min. in der Eppendorf-Zentrifuge zentrifugieren. 12. Den berstand von Reaktionsgef A vorsichtig in ein vorbereitetes (und beschriftetes) Reaktionsgef berfhren. Keine Partikel mit berfhren! Von Reaktionsgef B 200 l des berstandes in neues, beschriftetes Reaktionsgef berfhren. 13. Die DNA aus berstand von Reaktionsgef A durch Zugabe von 1 ml Ethanol fllen. Die Lsung muss wieder durch mehrmaliges Umdrehen des Reaktionsgefes sorgfltig (!) gemischt werden. Die DNA aus berstand von Reaktionsgef B durch Zugabe von 0,5 ml Ethanol fllen. Die Lsung vorsichtig (durch mehrmaliges, LANGSAMES Umdrehen des Reaktionsgefes) mischen. In Reaktionsgef A sollte nur eine Trbung feststellbar sein. In Reaktionsgef B entsteht eine kleine weie Flocke. Das ist die mit Ethanol gefllte chromosomale DNA. (B wird nicht weiter bearbeitet.) 14. Reaktionsgef A: fr 5 min. in der Eppendorf-Zentrifuge zentrifugieren. 15. Reaktionsgef A: Den berstand abgieen und Rhrchen auf den Kopf gestellt trocknen lassen. 16. Reaktionsgef A: Zu dem trockenen Sediment (Pellet) 50 l H 2 O zupipettieren. Die Plasmid-DNA wird durch Schnippen des Reaktionsgefes in Lsung gebracht.

Abb. 4: Versuchsdurchfhrung der DNA-Isolierung (Experiment 1.1)

Experiment 1.2: Transformation

Sie erhalten von zwei verschiedenen Lac-negativen E. coli K-12 Stmmen Bakterien-

suspensionen, die vorher von uns fr die Transformation kompetent 9 gemacht wurden: (1) vom E. coli-Stamm CSH50 (lac). In diesem Stamm ist der Bereich des gesamten lac-Operons zusammen mit dem lacI-Gen im Chromosom deletiert. (2) vom E. coli-Stamm BMH71-18 (lacZM15). In diesem Stamm ist das lacZ-Gen (teilweise) deletiert. Das lacY-Gen ist vorhanden. Versuchsdurchfhrung (siehe Ablaufschema Abb. 7) 1. 2. 3. Drei Reaktionsgefe mit der Gruppennummer und 1, 2 bzw. 3 beschriften. Reaktionsgefe auf Eis stellen. Nach folgendem Schema pipettieren (Reaktionsgefe auf dem Eis stehen lassen): Gruppen mit ungerader Gruppennummer (1, 3, 5 ) Reaktionsgef 1 Kompetente Zellen 50 l Stamm BMH71-18 Kompetente Zellen Stamm CSH50 TEN 10 20 l Plasmid-DNA aus Reaktionsgef A Reaktionsgef 2 50 l Reaktionsgef 3 50 l 20 l 5 l 20 l 5 l

Gruppen mit gerader Gruppennummer (2, 4, 6 ) Reaktionsgef 1 Kompetente Zellen Stamm BMH71-18 Kompetente Zellen Stamm CSH50 TEN Plasmid-DNA aus Reaktionsgef A 50 l 20 l Reaktionsgef 2 50 l 20 l 5 l 20 l 5 l Reaktionsgef 3 50 l

Prparation kompetenter Bakterien: Die Bakterien werden in 20 ml LB Medium (Hefeextrakt + Fleischbrhe) 8 bis zu einer Dichte von etwa 2 x 10 Zellen/ml wachsen gelassen. Die Kultur wird auf Eis gestellt. Die folgenden Schritte erfolgen alle eisgekhlt: Die Zellen werden abzentrifugiert, in 10 ml 0,1 M CaCl2 aufgenommen, 20 min. auf Eis stehen gelassen und wieder abzentrifugiert. Dann werden die Zellen in 1 ml 0,1 M CaCl2 aufgenommen. Die Bakterien sind jetzt kompetent fr die Transformation. 10 TEN: 10 mM TRIS-HCL pH 8,0; 0,5 mM EDTA; 50 mM NaCl

4. 5. 6. 7. 8. 9.

Die restliche Kultur kompetenter Zellen auf Eis aufbewahren. Die Transformationsanstze durch vorsichtiges Schnippen der Reaktionsgefe mit dem Zeigefinger mischen und fr 12 min. auf Eis inkubieren. Fr genau 2 min. einen Hitzeschock bei 42 C durchfhren. (Keine langen Wege: vom Eis in den 42C Heizblock und von da gleich wieder aufs Eis!) Weitere 5 min. auf Eis inkubieren. Zu den Transformationsanstzen je 0,5 ml Nhrmedium (LB-Medium) zugeben. Die Anstze fr 20 min. bei 37 C inkubieren. In dieser Zeit wird das auf dem Plasmid kodierte Resistenzgen, bla, exprimiert, die transformierten Zellen werden resistent.

10. Die Transformationsanstze werden selektiv plattiert: (=mglichst gleichmig auf der ganzen Platte mit der Pipette verteilt, ohne den Agar aufzupflgen. Hierzu mssen die verschiedenen Nhragarplatten beschriftet werden. Zunchst den Plattentyp auf den Boden der Platten schreiben. Die Platten sind mit einem Farbcode am Deckel markiert: Grn = Ampicillin (amp), violett=Lactose). Alle Platten mssen auerdem mit der Gruppennummer und auch mit der Nummer des Transformationsansatzes beschriftet werden. Die Transformationsanstze werden nach folgendem Schema plattiert (Abb. 5):

Abb. 5: Plattierschema der Transformationsanstze

Transformationsansatz 1 (ohne Plasmid-DNA, Stamm: ..... ):

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- 100 l auf einer LB amp-Platte ausplattieren. Fr die Bestimmung des Titers (Zellzahl/ml) im Transformationsansatz 1 wird auf LB-Platten ohne Ampicillin plattiert: - einmal 100 l (also 10-1 ml) auf einer LB-Platte ausplattieren. - einmal 10-6 ml (also stark verdnnt) auf einer LB-Platte ausplattieren. Hierzu wird nach unten angegebenem Schema (Abb. 6) eine Verdnnungsreihe in 100 l (also LB-Medium angelegt und von der 10-5-Verdnnung 10-6 ml der ursprnglichen Kultur) ausplattiert. Transformationsansatz 2 (mit Plasmid-DNA, Stamm: ..... ): - 100 l auf einer MacConkey lac amp-Platte ausplattieren. - 100 l auf einer LB amp-Platte ausplattieren. Transformationsansatz 3 (mit Plasmid-DNA, Stamm: ..... ): - 100 l auf einer MacConkey lac amp-Platte ausplattieren. 11. Um den Lac-Phnotyp der nicht transformierten Stmme mit dem der Transformanten vergleichen zu knnen, wird von den auf Eis aufbewahrten kompetenten Zellen auf je eine MacConkey Lac Platte vereinzelt (auf der Platte ausstreichen, dabei wie im Schema (Abb. 6) gezeigt dreimal eine neue Pipette nehmen).

Verdnnungsreihe

Vereinzeln von Bakterien

Abb. 6: Verdnnungsreihe und Vereinzelung von Bakterien

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Abb. 7: Versuchsdurchfhrung der Transformation (Experiment 1.2)

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Auswertung (in der kommenden Kurswoche, machen Sie sich dazu schon einmal Gedanken) 1. Welcher Anteil der kompetenten Zellen wurde mit dem Plasmid pFDY102 erfolgreich transformiert? 2. Was ist der Phnotyp der nicht transformierten Stmme BMH71-18 (lacZM15) und CSH50 (lac) auf MacConkey-Lactose Platten? 3. Was ist deren Genotyp (bzgl. lac) nach Transformation mit dem Plasmid pFDY102? 4. Was ist ihr Phnotyp auf MacConkey-Lactose Platten nach der Transformation?

Experiment 2: Aktivittsbestimmung der -Galaktosidase zur Bestimmung der Transkriptionsgeschwindigkeit

Die mit dem Plasmid pFDY102 transformierten Stmme BMH71-18 und CSH50 sollen daraufhin getestet werden, ob sie das lacZ-Gen exprimieren, ob sie also das Enzym -Galaktosidase synthetisieren. Als Kontrolle wird der Test parallel mit den nicht transformierten Ausgangsstmmen durchgefhrt. Auerdem kann mit diesem Experiment demonstriert werden, dass die Expression des lac-Operons reguliert ist. Wenn die Bakterien in Medium wachsen, das kein -Galaktosid (als Induktor) enthlt, so wird das lac-Operon nur ganz schwach exprimiert. In Medium, das ein -Galaktosid enthlt, wird dagegen die Expression des lac-Operons induziert, und -Galaktosidase kann synthetisiert werden. Wir verwenden IPTG (Isopropyl--DThiogalaktosid, Abb. 2) als Induktor. IPTG ist ein synthetisches Galaktosid, das induzierend wirkt, von den Zellen aber nicht abgebaut werden kann. Der -Galaktosidase-Enzymtest funktioniert im Prinzip folgendermaen: Zellen werden vor und zu bestimmten Zeiten nach der Induktion mit IPTG entnommen. Zu diesen Zellen wird Chloramphenicol gegeben. Chloramphenicol ist ein Antibiotikum, das die Translation (die Proteinsynthese) hemmt. Die Zellen werden durch Zugabe von SDS und Chloroform permeabel gemacht. Zur Bestimmung der -Galakosidase-Aktivitt (die eigentliche Enzym-Aktivittsmessung) wird dann ONPG (Ortho-Nitrophenyl--D-Galaktosid) zugegeben. Die -Galaktosidase katalysiert die Hydrolyse von ONPG zu Galaktose und Nitrophenol. Nitrophenol ist gelb und kann colorimetrisch gemessen werden. Bei einem berschuss an Substrat (hier ONPG) erlaubt dieser Test die quantitative Bestimmung von -Galaktosidase-Enzymaktivitt. Versuchsdurchfhrung (siehe Ablaufschema Abb. 9 und 10) 1. 2 Kulturrhrchen werden mit der Gruppennummer und mit A bzw. B beschriftet. 2. In das Rhrchen A 3 ml M9-Medium (= synthetisches Medium) pipettieren. 3. In das Rhrchen B 6 ml M9-Medium pipettieren. 4. Die Kulturen animpfen, so dass eine leichte Trbung (siehe Dichtevergleich) zu sehen ist: Gruppen mit ungerader Nummer (1, 3, 5 ...): Kultur A: Kultur B: einzelne Kolonien von BMH71-18 auf LB-Platte gewachsen (ohne amp!); einzelne Kolonien von BMH71-18/pFDY102 auf LB amp-Platte gewachsen.

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Gruppen mit gerader Nummer (2, 4, 6 ...): Kultur A: Kultur B: einzelne Kolonien von CSH50 auf LB -Platte gewachsen (ohne amp!); einzelne Kolonien von CSH50/pFDY102 auf LB amp-Platte gewachsen.

Abb. 8: Animpfen der Kulturrhrchen

5. Die Kulturen in das 37 C Wasserbad stellen. 6. ca. 1 h inkubieren, stark schtteln. (In dieser Zeit werden die Ergebnisse vom ersten Kurstag sowie der -Galaktosidase-Test besprochen.) 7. 8 Reagenzglser von 1 bis 8 beschriften. In jedes dieser Rhrchen 1 ml Stopp-Puffer pipettieren. (Stopp-Puffer: 100 g/ml Chloramphenicol in Phosphat-Puffer). 8. Je 0,2 ml IPTG in Reagenzglas 1 und 2 pipettieren. 9. 0,8 ml von Kultur A in Reagenzglas 1 pipettieren. 0,8 ml von Kultur B in Reagenzglas 2 pipettieren. ACHTUNG: Alle Reagenzglser vor und nach Pipettieren immer gut schtteln! 10. Die Kulturen A und B werden nun mit IPTG induziert. Nach verschiedenen Zeiten werden Zellen entnommen, um die Menge der bis zu diesem Zeitpunkt synthetisierten

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-Galaktosidase zu bestimmen: Zeit ! 0 min. 1 min. 2 min 3 min. 5 min. 9 min. ! 20 min. 21 min. Operation 0,4 ml IPTG Lsung zur Kultur A zugeben. INDUKTION 1 ml IPTG Lsung zur Kultur B zugeben. INDUKTION 1 ml der Kultur B entnehmen, in Reagenzglas 3 pipettieren. 1 ml der Kultur B entnehmen, in Reagenzglas 4 pipettieren. 1 ml der Kultur B entnehmen, in Reagenzglas 5 pipettieren. 1 ml der Kultur B entnehmen, in Reagenzglas 6 pipettieren. 1 ml der Kultur A entnehmen, in Reagenzglas 7 pipettieren. 1 ml der Kultur B entnehmen, in Reagenzglas 8 pipettieren.

11. In Reagenzglas 1 bis 8 je 2 Tropfen CHCl 3 (Kursassistent!) und 0,1 ml 0.1% SDS geben. 12. Sofort nach der Zugabe von CHCl 3 sehr gut schtteln!! 13. Im Abstand von 30 Sekunden jeweils 0,4 ml ONPG-Lsung in Reagenzglas 1, 2, 3 usw. geben. (t=0 min. Reagenzglas 1; t=30 sek. Reagenzglas 2; t=1 min. Reagenzglas 3; usw. ...); direkt nach jeder Zugabe schtteln! 14. Rhrchen beobachten 15. Genau 30 min. nach der Zugabe von ONPG wird die Reaktion durch die Zugabe von 0,5 ml 1 M Na 2 CO 3 gestoppt. (Na 2 CO 3 also nach der 30-mintigen Inkubation ebenfalls im 30 sek. Abstand zugeben und schtteln.) 16. Messung der entstandenen Gelbfrbung: Die Gelbfrbung knnte in einem Photometer, das die Licht-Absorption bei einer Wellenlnge von 420 nm misst, bestimmt werden. Im Kurs werden wir die Gelbfrbung mit dem Auge abschtzen. Dazu haben wir eine Verdnnungsreihe vorbereitet, bei der eine Nitrophenol-Lsung in 1:2 Schritten verdnnt wurde, d.h. 2 ml Nitrophenol-Lsung + 2 ml Puffer --> 1/2 so gelb gefrbte Lsung; von dieser Lsung 2 ml + 2 ml Puffer --> 1/4 der Gelbfrbung; usw. ...) Die Merhrchen werden durch Abschtzen mit dem Auge in der Intensitt ihrer Gelbfrbung der entsprechenden Verdnnung zugeordnet. Die Ergebnisse werden notiert: z.B. Reagenzglas 4: gelber, als Verdnnung 6 aber nicht so gelb, wie Verdnnung 5. Die Mepunkte werden in ein Diagramm eingetragen.

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Auswertung Fragen: - Wie lange hat es gedauert, bis die erste funktionelle -Galaktosidase nach der Induktion auftrat? (Verlngerung der Kurve auf das Basisniveau.) - Wie schnell geschieht die Transkription des lacZ-Gens? Notwendige Information fr die Beantwortung: (i) Transkription und Translation sind in Bakterien gekoppelte Prozesse. (ii) Das lacZ-Gen ist 3000 bp lang. (iii) Die Induktion erfolgt sofort nach Zugabe des IPTG.

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Abb. 9: Versuchsdurchfhrung des -Galaktosidase Enzymtest (Experiment 2: Teil 1)

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Abb. 10: Versuchsdurchfhrung des -Galaktosidase Enzymtest (Experiment 2: Teil 2)

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Nachweis einer pflanzlichen DNA durch PCR und Isolierung von RNA aus Pflanzen
Dr. Gabor Igloi igloi@biologie.uni-freiburg.de In diesem Versuch soll 1) mit Hilfe der Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) ein Abschnitt des Genoms einer Pflanze vervielfltigt und 2) gesamt RNA aus Blattmaterial isoliert werden. Beide Produkte (DNA und RNA) werden anschlieend durch Elektrophorese analysiert. Ablauf des Versuchs: Kurze Einleitung Zubereitung des PCR-Ansatzes; PCR-Inkubation (ca. 1 St) Whrend dieser Zeit erfolgt: RNA-Isolierung aus Blattmaterial Zubereitung des Agarosegels Nach Fertigstellung der PCR: Elektrophoreseproben auftragen Elektrophorese (ca. 1 Std) Whrend dieser Zeit: Theorie der Versuche; Auswertung Teil 1 PCR Die systematische Einteilung der Arten und die Erstellung von Stammbumen beruhten in der Vergangenheit im Wesentlichen auf morphologisch/anatomischen Kriterien, die oft subjektiv waren und sich fr ausgestorbene Arten nicht immer eindeutig festlegen lassen. Seit der Entdeckung der DNA-Sequenzierung werden zunehmend Methoden der Molekularbiologie eingesetzt, um die Verwandtschaftsbeziehungen von Lebewesen und ihre Stammesgeschichte zu rekonstruieren. In diesen Tests werden die DNA-Sequenzen und damit auch die Anzahl der Mutationen bestimmter, wenig variabler Genomsegmente bestimmt. Je lnger der letzte gemeinsame Vorfahre zweier Lebewesen zurckliegt, desto strker sollten sich auch die Sequenzen unterscheiden. Hufig werden fr diese Analysen das Gen oder der Bereich um die 16S bzw. 18S ribosomale RNA verwendet. Diese rRNA ist in allen Lebewesen vorhanden und hat sich im Laufe der Evolution kaum verndert.
Vorkommen RibosomUntereinheit 30S-Untereinheit 50S-Untereinheit 40S-Untereinheit 60S-Untereinheit rRNAs ribosomale Proteine

Prokaryonten Eukaryonten

16S rRNA 23 S rRNA, 5S rRNA 18S rRNA 28S rRNA, 5S rRNA, 5,8S rRNA

ca. 20 Proteine ca. 30 Proteine 33 Proteine 49 Proteine

Chloroplasten sind charakteristische Organellen einer grnen Pflanze und enthalten die Komponenten des Photosyntheseaparates. Der Innenraum (Stroma) der Chloroplasten enthlt unter anderem mehrere bis viele identische ringfrmige DNA-Molekle mit ca. 150000 Basen (plastidre DNA = ptDNA), die einige Gene fr Proteine und strukturelle RNAs (rRNA, tRNA) kodieren.

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Fr den Nachweis von pflanzlicher DNA hat sich die PCR von Bereichen der ptDNA als praktisch erwiesen, da somit Strungen und Kontamination durch DNA von Bakterien oder Pilzen (die keine Chloroplasten enthalten) vermieden werden kann. Im Praktikumsversuch soll die Region um das Gen der plastidren 16S rRNA von verschiedenen Pflanzen vervielfltigt werden.
Kurs PCR Produkt tRNA 1 rRNA 1 tRNA 4 tRNA 2 tRNA 3 tRNA 5 rRNA 2 rRNA 3 rRNA 4

ca. 300 bp

Z00028
8862 bp

Mais Chloroplasten rRNA Operon DIE POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR)

Mit der Methode der PolymeraseKettenreaktion (abgekrzt mit PCR fr polymerase chain reaction) ist es mglich, bestimmte Bereiche des Genoms in einem zyklischen Prozess zu vervielfltigen. Im Prinzip ist nur ein einziges DNA-Molekl notwendig, um in der PCR gengend Material fr eine anschlieende Sequenzanalyse zu erhalten. Fr die PCR wird eine DNA-Matrize bentigt, deren Sequenz am 5-und am 3Ende bekannt ist, damit zwei Oligonukleotide oder Primer (synthetische DNA Sequenzen von etwa 20 Basen;) abgeleitet werden knnen. Die PCR ist in drei Schritte gegliedert (s. Abbildung): Denaturierung der doppelstrngigen DNA-Matrize (94C), Annealing (Hybridisierung) (55C) der DNA mit den Primern und Polymerisation (Extension) (72C). Die Polymerisation wird von einer hitzestabiler DNA Polymerase (aus dem thermophilen Thermus aquaticus (Taq)), mit einem Temperaturoptimum von 72C,

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katalysiert. Diese Schritte werden in zahlreichen aufeinanderfolgenden Zyklen alternierend durchlaufen. Das PCR-Produkt ist eine doppelstrngige DNA mit einer Kettenlnge, die durch die Position der Primer an der DNA-Matrize definiert ist. Obwohl der beschriebene Vorgang von gereinigter DNA ausgeht, ist es auch mglich Bakterien oder andere Zellen direkt in die Reaktion einzusetzen. Dadurch ergibt sich die Mglichkeit eine groe Zahl von Proben schnell fr die Anwesenheit von bestimmten, durch die Wahl der Primer definierten, DNA Sequenzen zu berprfen. Ein zustzlicher Schritt, Erhitzen auf 98 C fr 5 Minuten, wird der PCR vorgeschaltet um die DNA aus den Zellen freizusetzen. Dieser Schritt kann jedoch in das PCR-Program integriert werden. DER NACHWEIS Der Nachweis einer Amplifikation erfolgt blicherweise ber eine gel-elektrophoretische Grentrennung der DNA. Fr kurze PCR-Produkte nimmt man Polyacrylamid; bei einer Lnge von mehr als 200 Basenpaaren gibt Agarose eine bessere Auftrennung. In beiden Fllen wandern die negativ geladenen Nukleinsuren in Richtung Anode und werden durch den Siebeffekt des Trgers (Polyacrylamid bzw. Agarose) nach Gre aufgetrennt. Die Fragmente werden durch eine anschlieende Frbung erkannt. DNA ist im ElektrophoreseGel unsichtbar. Deswegen muss eine Anfrbung stattfinden. Ethidiumbromid wird hier als Farbstoff eingesetzt. Dieses Reagenz interkaliert in doppelstrngigen Bereichen der DNA und kann durch UV Bestrahlung zur Fluoreszenz angeregt werden. Die Nachweisgrenze liegt bei ca. 50ng pro Bande. DER ANSATZ Als Quelle fr die DNA dient der Botanische Garten ! Jede Gruppe soll von zwei verschiedenen (mglichst identifizierbare) Pflanzen ein Blatt pflcken. Es ist darauf zu achten, dass (trotz der Jahreszeit) mglichst junge oder dnne, nicht fleischige Bltter gesammelt werden. Nadelgehlze und Kakteen sind zu vermeiden. Im Kursraum legen Sie das Blatt auf eine Petrischale und schneiden mit einem Skalpell ein Quadrat von nicht mehr als 2 mm x 2 mm Gre aus dem Blatt. Das Blattstck wird in ein Eppendorf Htchen, welches 20 l der Lsung Dilution Buffer enthlt, berfhrt. Bearbeiten Sie die Blattprobe mit einer Pipettenspitze durch Druck an die Wand vom Gef bis die Lsung eine leichte grne Farbe entwickelt. Zentrifugieren Sie die Lsung fr 2 Min. bei 10 000 rpm. 5 l vom berstand wird in einem frischen Eppendorfgef mit 5l Wasser verdnnt. Die Komponenten der PCR werden in 0.2-ml Reaktionsgefen zusammpipettiert. Dabei ist zu beachten: A. Die Reaktionsgefe sind, wegen der Hitzebertragung, sehr dnnwandig. Sie drfen nicht seitlich erdrckt werden. Beim Schlieen vom Deckel nicht zu energisch zupacken. B. Da aber kleine Volumina pipettiert werden (vorsichtig und genau), muss die erfolgreiche Zugabe optisch berprft werden, in dem das Reaktionsgef in einer Hand gehalten wird, whrend mit der anderen die Pipette bettigt wird. C. Fr jeden Pipettierungsschritt eine neue Spitze nehmen um Kontaminierung von den Komponenten zu vermeiden. Es werden drei PCR Anstze durchgefhrt: 1. Pflanze 1 2. Pflanze 2 3. Negative Kontrolle, ohne Zugabe von DNA

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Pipettierungs-Schema: in der folgenden Reihenfolge werden zugegeben: Komponente 1 PCR Puffer (P) (enthlt auch 10l dNTPs) Primer-Gemisch (PG) 4l Wasser 4l Blatt Extrakt 1 l DNA Polymerase (E) 1l 2 10l 4l 4l 1 l 1l 3 10l 4l 5l 1l

Der PCR Puffer enthlt: 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 1.5mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und TTP Die Gefe werden geschlossen und in das PCR-Gert gestellt. Dabei ist zu beachten, dass die Position der Gefe im PCR-Block in der ausgelegten Tabelle eingetragen wird1. Der PCR-Block ist so programmiert, dass folgende Zyklen ablaufen: 5 Min. 98C; 1 Zyklus 94C 15 Sek., 60C 20 Sek., 72C 20 Sek.; 30 Zyklen Nach Abschluss der PCR-Reaktion werden 10 l blauer Farbstoff (Xylencyanol/Bromphenol Blau in Glyzerin) dazu gemischt und 20l der Anstze, jeweils getrennt, in eine Tasche des 0.8% Agarosegels, das bereits in der Pufferkammer liegt, aufgetragen (s. unten). Teil 2 RNA Isolierung aus Pflanzen Das Genom einer Pflanze kann fr manche Anwendungen untersucht werden, ohne die DNA reinigen zu mssen (z.B. Teil 1). RNA hingegen kann man nicht direkt ber PCR amplifizieren. Die Zellen enthalten eine Vielzahl von verschiedenen RNA Spezies, die strukturelle oder funktionelle (u.a. rRNA, tRNA, mRNA, microRNA) Aufgaben erfllen. Um z.B. die Expression der Gene (d. H. die bertragung der Information von DNA zu RNA) zu verfolgen oder zu quantifizieren, ist es oft unerlsslich RNA aus den Organismen zu isolieren. Die Gewinnung von RNA bentigt groe Sorgfalt, weil vor allem mRNAs instabil und sehr anfllig gegen ubiquitre RNasen sind. Etablierte Protokolle verfolgen eine Strategie in der zunchst das zerkleinerte Material (Blatt) in einem Lyse-Puffer, deren Zusammensetzung den Zellaufschluss und die Inaktivierung der endogenen RNasen gewhrleistet, aufgenommen wird. Danach erfolgt eine selektive Bindung der RNA an eine Silikat-Matrize, wodurch die restlichen Bestandteile der Zelle weitgehend entfernt werden. Nach Waschvorgngen wird die RNA von der Membrane gelst. Die Qualittskontrolle erfolgt ber eine Gelelektrophorese.

DER ANSATZ Bltter der Schwertbohne (Canavalia ensiformis) wurden bereits geerntet, in flssigem Stickstoff gemrsert und in Lysepuffer bei -20C gelagert. Eine Portion (ca. 100 mg Blattmaterial) wird benutzt fr die RNA-Reinigung:

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1. 2.

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21.

Die Blattsuspension wird 1 Min. abzentrifugiert. Setzen Sie die blaue Filtereinheit in ein leeres 2ml Reaktionsgef und berfhren Sie mit einer Pipette vorsichtig den berstand aus Schritt 1 in den Filter. Zentrifugieren, 2 Min. Der Durchfluss wird weiter bearbeitet. Geben Sie das gleiche Volumen 70% Ethanol zur filtrierten Lsung und mischen Sie durch mehrmaliges Pipettieren. Setzen Sie die rote Filtereinheit in ein leeres 2 ml Reaktionsgef und berfhren Sie die Lsung aus 4. in den Filter. Zentrifugieren, 2 Min. Die RNA befindet sich am Filter; der Durchfluss kann entsorgt werden. Setzen Sie die rote Filtereinheit in ein leeres 2 ml Reaktionsgef. Zum Filter wird mit 500 l Waschlsung HS gegeben. Zentrifugieren, 1 Min. Setzen Sie die rote Filtereinheit in ein leeres 2 ml Reaktionsgef. Zum Filter wird mit 650 l Waschlsung LS gegeben. Zentrifugieren, 1 Min. Setzen Sie die rote Filtereinheit in ein leeres 2 ml Reaktionsgef. Zum Filter wird mit 650 l Waschlsung LS gegeben. Zentrifugieren, 1 Min. Setzen Sie die rote Filtereinheit in ein leeres 2 ml Reaktionsgef. Zentrifugieren, 2 Min. um restliche Lsung zu entfernen. Setzen Sie die rote Filtereinheit in ein leeres 1,5 ml Reaktionsgef. Pipettieren Sie vorsichtig 50 l RNAse-freies Wasser auf die Membrane und lassen Sie das Wasser 2 Min einwirken. Zentrifugieren, 1 Min. Die RNA befindet sich im Reaktionsgef.

Zu 10 l der RNA Lsung in einem neuen Reaktionsgef wird 10 l blauer Farbstoff (Xylencyanol/Bromphenol Blau in Glyzerin) gemischt und die 20l in eine Tasche des 0.8% Agarosegels, das bereits in der Pufferkammer liegt, aufgetragen (s. unten). RNAsen ? RNAsen (RNA-spezifische Nukleasen) sind allgegenwrtig und knnen eine RNAPrparation schnell zerstren. Zur Demonstration pipettieren Sie 10 l von der gereinigten

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RNA in ein neues Reaktionsgef. Berhren Sie mit einer Pipettenspitze Ihre (eigene) Zunge und stellen Sie diese Spitze in die RNA Lsung fr 5 Minuten. Danach entfernen Sie die Spitze und mischen 10 l blauen Farbstoff zur Lsung. Die 20l werden in eine Tasche des 0.8% Agarosegels, das bereits in der Pufferkammer liegt, aufgetragen (s. unten). Teil 3 AGAROSE GEL-ELEKTROPHORESE Es wird ein 1 % Agarosegel vorbereitet. Agarose (ein wasserlsliches Polysaccharid) wurde bereits im Puffer aufgekocht, um eine klare 1 % Lsung herzustellen. Der Farbstoff Ethidiumbromid, der zum Nachweis von der DNA notwendig ist, wurde bereits zur Agaroselsung zugefhrt. ACHTUNG !! ETHIDIUMBROMID IST STARK KARZINOGEN. GELE NUR MIT HANDSCHUHEN ANFASSEN. Diese Lsung bildet unterhalb etwa 30C ein weiches Gel, das als elektrophoretisches Trennmedium dient. Die heie Agaroselsung wird in entsprechenden Mengen bei 50C aufbewahrt, um ein vorzeitiges Gelieren zu vermeiden. Das Gel wird folgender Weise hergestellt: Die Plexiglas U-Form wird an beiden Enden mit Tesa-Band fest zugeklebt und der Kamm, dessen Zhne die Vertiefungen fr die Proben bilden werden, etwa 1 cm von einem Ende ber die Plexiglas Seiten angelegt (s. Abbildung).

Tesa-Band

(auf beide Enden) ca. 1 cm

Diese Giekammer wird nun mglichst waagerecht auf den Tisch gelegt und eine Portion (40 ml) Agarose aus dem 50C-Wasserbad schnell, aber vorsichtig, eingegossen. Nach 20 Minuten ist das Gel fest: das Tesa-Band und der Kamm werden vorsichtig entfernt. Das Gel wird mit dem Rahmen in die Elektrophoresekammer eingelegt und mit Puffer berdeckt. Darauf achten, dass die Nummer vom Rahmen notiert wird. Der Puffer (Natriumborat) sichert einen konstanten pH-Wert (8.3) whrend der Elektrophorese. Die folgenden Proben werden aufgetragen: 1. 20 l eines Gemischs von 10 l PCR Probe 1+ 10 l blauer Farbstoff 2. 20 l eines Gemischs von 10 l PCR Probe 2+ 10 l blauer Farbstoff 3. 20 l eines Gemischs von 10 l PCR Probe 3+ 10 l blauer Farbstoff 4. 20 l eines Gemischs von 10 l RNA+ 10 l blauer Farbstoff 5. 20 l eines Gemischs von 10 l RNA nach Zungenkontakt + 10 l blauer Farbstoff 6. Von einem DNA Grenmarker, der bereits mit Farbstoff angesetzt ist (rotes Eppi), wird 10 l aufgetragen. Der Grenmarker besteht aus einem Restriktionsfragmentgemisch mit 80,102, 174, 257/267, 298, 434/458, 587 bp. Die Proben sollen mindestens 0,5 Stunde bei ca. 100 mA laufen, um eine mglichst gute Auftrennung der Fragmente zu erhalten. Zur Auswertung werden die Ergebnisse fotografisch bei kurzwelliger UV-Bestrahlung festgehalten.

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Genetik mit C. elegans

Ralf Baumeister, Ekkehard Schulze, Kathrin Thedieck, Andreas Eizinger, Enrico Schmidt

Inhalt 1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.5.1. 3.5.2. 3.6. 3.6.1. 3.6.2. Die Etablierung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem Die Biologie von C. elegans Natrlicher Lebenszyklus C. elegans als Laborzucht ............................................. Anatomie ................................................................................................... Genetische Nomenklatur ........................................................................... Experimente .............................................................................................. Kennenlernen von Wildtyp C. elegans ....................................................... Unterscheidung verschiedener larvaler Stadien ......................................... Erkennung von Mnnchen ......................................................................... Mutanten mit morphologischen Defekten................................................... Mutanten mit mechanosensorischen Defekten .......................................... Berhrungs-Sensitivitts-Test (Mechanosensation assay) ...................... Nasenberhrungs-Test (Nose touch assay) ............................................ Auswertung zweier Kreuzungsexperimente ............................................... Auswertung der F1-Generation.................................................................. Auswertung der F2-Generation ........................................................................... 26 26 26 27 28 32 32 32 33 35 36 37 38 39 39 40
41

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1. Einleitung: Die Etablierung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem

Die Etablierung von C. elegans als Modellsystem fr fundamentale biologische Forschung begann 1963 mit den Bemhungen von Sydney Brenner, einem Molekularbiologen am Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, England. Die auerordentlichen Erfolge, die zu diesem Zeitpunkt bei der Untersuchung der molekularen Grundlagen von biologischen Prozessen in Bakterien erzielt worden waren, veranlassten Brenner zu der Annahme, dass hnliche Anstze auch in komplexeren Organismen mglich sind. Um dieses Problem anzugehen suchte Brenner nach einem Organismus, der in hnlicher Weise zu untersuchen sei wie Bakterien oder Viren. Er entschied sich fr die Nematodenart C. elegans. Nematoden haben eine kurze Lebensspanne, produzieren durch sexuelle Reproduktion eine groe Anzahl von Nachkommen und knnen sehr leicht in einem Labor kultiviert werden. Die sexuelle Fortpflanzung erfolgt durch Selbstbefruchtung in den Hermaphroditen oder durch Geschlechtsverkehr mit Mnnchen, was das System fr genetische Studien auerordentlich ntzlich macht. Die Selbstbefruchtung erlaubt die Produktion und Zucht genetisch identischer Linien. Zudem sind Nematoden hochdifferenzierte Organismen, die aus weniger als 1000 Zellen bestehen, was die Untersuchung der Funktion, Entwicklung und Differenzierung einzelner Zellen erlaubt. Wie Brenner vor 40 Jahren vorgeschlagen hatte, wurden alle Zellen und ihre Zellstammbume in C. elegans identifiziert. Zudem wurden zahlreiche Gene entdeckt, die an der Entwicklung und Differenzierung von Zellstammbumen beteiligt sind. 2002 erhielt Sydney Brenner den Nobelpreis in Physiologie und Medizin zusammen mit John Sulston und Robert Horvitz fr ihre Entdeckung von Genen in C. elegans, die an der Organentwicklung und dem programmierten Zelltod beteiligt sind. 2. Die Biologie von C. elegans 2.1. Natrlicher Lebenszyklus

C. elegans gehrt zu den Nematoden oder Rundwrmern. Zu den Nematoden gehren sowohl freilebende wie auch parasitre Arten. Neben dem Studium fundamentaler biologischer Vorgnge hat das Verstndnis der C. elegans Biologie auch eine wichtige konomische und medizinische Bedeutung. Etwa 50% der Weltbevlkerung ist mit parasitischen Nematoden infiziert und parasitische Pflanzennematoden verursachen einen wirtschaftlichen Schaden von etwa 80 Milliarden Dollar jhrlich. Die Gre der Nematoden reicht von 1mm bis 35cm Lnge. C. elegans ist ein im Erdreich lebender Wurm mit einer Gre von ca. 1mm. Die Lebensstrategie von C. elegans ist an die Lebensbedingungen angepasst, die bezglich der Futter- und Wasserverfgbarkeit und Temperatur stark variieren knnen. Eine erwachsene Wurmpopulation besteht hauptschlich aus Hermaphroditen mit einem Anteil an Mnnchen von ca. 0.1%. Selbstbefruchtete Hermaphroditen produzieren etwa 300 Nachkommen, whrend die durch Mnnchen befruchteten Hermaphroditen bis zu 1000 Nachkommen produzieren knnen.

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Unter optimalen Laborbedingungen ist die durchschnittliche Lebenserwartung von C. elegans 2 bis 3 Wochen. Bei 25C betrgt die Embryogenese (vom Zeitpunkt der Eibefruchtung bis zum Schlpfen der Nachkommen) 14h. Die Postembryonale Entwicklung durchluft in 35 Stunden vier Larvenstadien (L1-L4).

Abbildung 1. Lebenszyklus von C. elegans bei 22 C. Die Angabe in blau zeigt das Zeitintervall im jeweiligen Entwicklungsabschnitt. Die Lnge des Tieres ist beim jeweiligen Stadium in m angegeben.

Bei limitierter Nahrungsverfgbarkeit bilden sich nach der zweiten Larvalhutung sogenannte Dauerlarven, die keine Nahrung aufnehmen. Sie zeigen neben strukturellen und metabolischen Vernderungen auch nderungen im Verhalten die zu einer deutlich erhhten Lebensspanne fhren. Im Rahmen der verlngerten Lebenserwartung wird der Zustand solange aufrechterhalten bis sich die Lebensbedingungen gebessert haben. Bei normaler Futterverfgbarkeit nehmen Dauerlarven Nahrung zu sich und entwickeln sich zu L4-Larven weiter. 2.2. C. elegans als Laborzucht

Fr Laborexperimente wird der C. elegans Stamm mit der Bezeichnung Bristol N2 verwendet (oder kurz nur: N2). Auch andere Stmme werden in Abhngigkeit der experimentellen Anforderungen verwendet. Beispielsweise zeigt der Bergerac Stamm eine erhhte Mutationsrate, die durch das Tc1 Transposon verursacht wird. Der Hawaii Stamm CB4856 unterscheidet sich von N2 durch eine groe Anzahl von Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotid polymorphisms oder SNPs), was die genetische Kartierung von Mutationen erleichtert.

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Die Laborzucht von C. elegans ist einfach und kostengnstig. Die Tiere werden typischerweise auf Petrischalen mit E. coli als Futterquelle gezchtet. C. elegans kann auch in groen Mengen in Flssigkultur gezchtet werden. Wurmstmme knnen als gefrorene Kulturen in flssigem Stickstoff fr unbestimmte Zeit konserviert werden, was die Kulturstrategien und Kosten fr eine hohe Anzahl von Mutanten dramatisch reduziert.

Abbildung 2. Anatomie eines adulten C. elegans Hermaphroditen. A. Differentielle Interferenz Kontrast Mikroskopie (DIK bzw. engl. DIC) Aufnahme eines adulten Wurmes. Grenstandard 0.1mm. B. Schematische Darstellung eines Wurmes.

2.3.

Anatomie

Wie alle Nematoden hat C. elegans einen unsegmentierten, zylindrischen Krper, der zu den Enden hin verjngt. Die Krperwand besteht aus einer widerstandsfhigen KollagenKutikula. Unter der Kutikula befindet sich die Hypodermis gefolgt von den Muskeln und Nervenzellen. Die flssigkeitsgefllte Krperhhle (Pseudocoel genannt) trennt die Krperwand von den inneren Organen. Die Krperform wird durch den hydrostatischen Druck im Pseudocoel aufrechterhalten. Frisch geschlpfte L1-Larven bestehen aus 558 Zellen. Zustzliche Zellteilungen der somatischen Zellen whrend der 4 Larvenstadien fhren zu einer Erhhung der Zellzahl auf 959 bei adulten Hermaphroditen und 1031 bei adulten Mnnchen. Die Linie der somatischen Zellen ist hchst invariant. Diese Invarianz kombiniert mit der Visualisierung mittels Differentieller Interferenz Kontrast Mikroskopie (DIC) ermglichte die Erstellung des kompletten Zelllinienstammbaumes von C. elegans. Trotz der geringen Gesamtzellzahl zeigt C. elegans einen erstaunlich hohen Grad an Differenzierung. Viele physiologische Funktionen aus dem Sugersystem besitzen Analoge in C. elegans.

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Die Haut (Hypodermis) Die Wurmhaut oder Hypodermis ist ein Epithel das unter der Kutikula liegt. Hypodermale Zellen sezernieren die Kutikula, stellen Substrate fr die Zell- und Axonmigration bereit und dienen als Speicher fr Lipide und andere Molekle. Die Hypodermis ist an der Phagozytose apoptotischer Zellen beteiligt und besitzt auch eine osmoregulatorische Funktion. Die meisten hypodermalen Zellen besitzen mehrere Zellkerne (Synzytium). Muskulatur C. elegans ist ein hervorragender Organismus um die Physiologie, Struktur, Molekularbiologie und die Entwicklung von Muskelzellen zu studieren. Der Wurm besitzt einige leicht zu beobachtende Eigenschaften, welche die Suche nach Genen, die an der Entwicklung oder Funktion der Muskelzellen beteiligt sind, erleichtern. Auch Mutationen, welche schwere Bewegungsdefekte verursachen, knnen untersucht werden, denn fr die Befruchtung der Hermaphroditen ist die Beweglichkeit der Tiere nicht notwendig. C. elegans besitzt sowohl gestreifte wie auch nichtgestreifte Muskulatur. Die gestreiften Krperwandmuskelzellen sind deutlich in der berzahl. Diese sind longitudinal entlang der Krperwand angeordnet und sind fr die Lokomotion der Tiere verantwortlich. Nichtgestreifte Muskeln sind mit dem Pharynx, Darm, Anus und bei Hermaphroditen mit dem Uterus, der Gonadenwand und der Vulva assoziiert. Diese Muskelzellen sind fr das Pumpen des Pharynx, die Darmentleerung, Ovulation, Fertilisation und Eiablage verantwortlich. Einige nichtgestreifte Muskelzellen befinden sich auch in der Schwanzregion der Mnnchen, die fr die Befruchtung der Hermaphroditen bentigt werden.

Abbildung 3. Schematischer Aufbau der Muskulatur von C. elegans

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Das Nervensystem Das Nervensystem besteht aus 302 Neuronen and 56 Glia- und Sttzzellen. Mnnchen haben 381 Nervenzellen und 92 Glia- und Sttzzellen. Durch serielle Rekonstruktion aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte John White das gesamte Nervensystem mit allen Verbindungen im Detail kartieren (White et al., 1986). Das Nervensystem von C. elegans wird generell in das Pharynx- und Zentralnervensystem unterteilt. Zwanzig Neuronen innervieren und regulieren die Aktivitt des Pharynx. Sie sind durch zwei Interneurone mit dem ZNS verbunden. Neuronale Auslufer sind in Bndeln angeordnet, die entlang der Krperachse als longitudinale Fasern oder zirkulre Kommissuren verlaufen. Die ventralen und dorsalen Nervenstrnge entspringen dem um den Pharynx angeordneten Nervenring und sind ber Interneurone miteinander verbunden. Die dorsalen Nervenstrnge bestehen hauptschlich aus den Axonen der ventralen Motorneuronen, die ber die Kommissuren dorsal geleitet werden. Sensorische Organe, die auf Chemikalien, Temperatur, mechanische Krafteinwirkung und Osmolaritt reagieren, sind hauptschlich in der Kopf- und Schwanzregion angeordnet (siehe auch weiter unten bei dem Versuch 3.5). Eine wichtige Eigenschaft des Nervensystems von C. elegans ist, das nur drei der 302 Neuronen fr das berleben unter Laborbedingungen notwendig sind, nmlich CANL, CANR und M4. Die CAN (canal associated neurons) Zellen verlaufen entlang des exkretorischen Kanals und knnten eine wichtige Rolle in der systemischen Regulation des Salz- und Wasserhaushaltes spielen. M4 ist ein Pharynxneuron, das die Peristaltik des Pharynx und somit die Nahrungszufuhr reguliert. Die Tatsache, dass die meisten Nervenzellen fr das berleben unter Laborbedingungen nicht bentigt werden, ist ein groer Vorteil fr die Untersuchung der Funktionen des Nervensystems (z.B. mit Hilfe von Mutageneseexperimenten). Der Verdauungstrakt Der Verdauungstrakt von C. elegans besteht aus dem Pharynx, dem Darm und dem Rektum. Der Pharynx von C. elegans ist ein Muskelorgan, das kontinuierlich Futter in das Pharynxlumen pumpt, es zerkleinert und in den Darm weiterleitet. Der Pharynx besteht aus Muskel-, Nerven-, Epithel- und Drsenzellen.

Abbildung 4. Darstellung des Pharynx als schematische Zeichnung (oben) und als DIC Bild (unten)

30

Der Darm besteht aus 20 Epithelzellen mit apikalen Mikrovilli. Die intestinalen Epithelzellen sezernieren Verdauungsenzyme und absorbieren Nhrstoffe. Das Rektum besteht aus fnf Epithelzellen und in Verbindung mit weiteren Muskelzellen reguliert es die Defkation. Das Reproduktionssystem Die Gonade der adulten Hermaphroditen besteht aus zwei U-frmigen Schluchen, die ber die Spermathek mit einem gemeinsamen Uterus verbunden sind. Die Gonaden sind von Epithelzellen umgeben, die man als sheath cells bezeichnet. Die distalen Regionen eines jeden Gonadenarmes enthalten die Keimbahnzellkerne, die sich spter zu Spermien oder Oozyten entwickeln. Jeder Zellkern ist umgeben von Zytoplasma und einer unvollstndigen Zellmembran. Die Population an Keimbahnzellkernen wird durch Mitose aufrechterhalten, die in der distalen Spitze der Gonade stattfindet. Als Keimzelle wandern die Zellkerne anschlieend entlang des Gonadenarmes und beenden ihren mitotischen Zellzyklus bevor die Meiose beginnen kann. Die Bildung der intakten Keimzellmembran (Zellularisierung) findet im proximalen Teil des Gonadenarmes statt. Whrend des vierten Larvenstadiums werden ungefhr 150 Spermatiden pro Gonadenarm gebildet, die als reife Spermien in der Spermathek gelagert werden. Im adulten Wurm entstehen die fertigen Oozyten, die im proximalen Teil des Gonadenarmes angeordnet sind. Die Oozyten verweilen in der Diakinese der Prophase I bis sie den proximalen Teil des Gonadenarms erreicht haben. In der spten Phase der Oogenese durchluft die Oozyte, welche sich in direkter Nachbarschaft zur Spermathek befindet eine meiotische Reifung. 5-6 Minuten nach Beginn der Reifung ovuliert die Oozyte in die Spermathek, wo diese fertilisiert wird. Die meiotische Teilung wird im Uterus vollendet wo unmittelbar die Embryogenese beginnt. In einem reifen Hermaphroditen findet alle 20-40 Minuten eine Ovulation statt. Nichtverpaarte Hermaphroditen produzieren unter standardisierten Laborbedingungen somit etwa 300 Nachkommen ber einen Zeitraum von 3 Tagen.

Abbildung 5. Das Reproduktionssystem von C. elegans

31

2.4.

Genetische Nomenklatur

In C. elegans werden die Gene nach folgenden Regeln benannt: Jeder Genname besteht aus einer Buchstabenabkrzung (in der Regel drei Buchstaben, seit kurzem sind auch vier Buchstaben zugelassen), einem Minuszeichen, und einer Zahl (alles kursiv). Die Buchstabenabkrzung gibt im Allgemeinen einen Hinweis auf den Phnotyp (z.B. lon fr long, also lngere Tiere als Wildtyp). Gene, die denselben Phnotyp hervorrufen, werden durchnummeriert. Die Zahl gibt also einen Hinweis, wie viele Gene mit diesem Phnotyp schon identifiziert wurden (z.B.: lon-4). Eine rmische Zahl (I, II, III, IV oder V; bzw ein X fr das X-Chromosom) hinter dem Gen kennzeichnet das Chromosom, auf dem das Gen liegt. Fr jedes Gen knnen unabhngig mehrere Allele isoliert werden. Jede unabhngig isolierte Mutation bekommt eine Allelbezeichnung (zwei kleine Buchsataben, die auf das Labor hinweisen und eine fortlaufende Nummer; alles kursiv); also z.B. ok1024. Jedes Labor kennzeichnet die selbst hergestellten Stmme (also auch z.B. die Stmme, die aus einer Kreuzung mit anderen mutanten Stmmen hervorgegangen sind) mit einer fortlaufenden Nummerierung. Auch hier ist die 2-3 Buchstabenabkrzung ein Hinweis, in welchem Labor der Stamm entstanden ist; z.B.: BA17 (Grobuchstaben, nicht-kursiv). - Beispiel: Gen: his-24 Allel: ok1024 Stamm: EC109 Chromosom: I-V oder X: X Zusammen: EC109: his-24 (ok1024) X 3. Experimente: 3.1. Kennenlernen von Wildtyp C. elegans

Ziel: Mit diesem Experiment sollen Sie sich mit dem Wildtyp von Caenorhabditis elegans vertraut machen. Mit Hilfe des Stereomikroskops knnen einige wichtige Gewebe unterschieden werden. Material: Sie bekommen kleine Petrischalen auf denen Wildtyp Tiere verschiedener Stadien enthalten sind. Aufgabe: Versuchen Sie den Aufbau und die wichtigsten Gewebe adulter Tiere zu erkennen. Auf der Platte werden adulte Hermaphroditen und Larven verschiedenen Alters sein. Die adulten Hermaphroditen erkennen Sie an der Gre (es sind die grten Tiere auf der Platte). Auerdem werden Sie erkennen, dass die adulten Hermaphroditen bereits Eier in sich tragen.

Abbildung 6. bersicht der wichtigsten Organe eines adulten C. elegans Hermaphroditen

32

In der grten Vergrerung lassen sich weitere Details der adulten Tiere erkennen. Am anterioren Ende befindet sich der Pharynx (Schlund). Die Mundffnung ist von radialen Muskeln umgeben, deren Pumpbewegung bereits im Stereomikroskop zu sehen ist. Ebenfalls zu erkennen sind die zwei runden Verbreiterungen des Pharynx. Am hinteren Ende des Pharynx befinden sich zahnhnliche Strukturen (engl.: grinder; ist mit diesem Mikroskop nicht zu sehen), die das Futter zerkleinern und in den Darm weiterbefrdern. Anschlieend an den Pharynx ist der Darm zu sehen. Er erscheint deutlich dunkler als andere Gewebe (zumindest solange die Tiere genug Futter zur Verfgung haben). Der Darm zieht sich durch den ganzen Krper, je nach Krperabschnitt mehr auf der dorsalen oder ventralen Seite. In der Krpermitte befindet sich an der ventralen Seite die Vulva, die in den adulten Tieren nicht mehr zu erkennen ist. In den L4 Larvenstadien dient die sich entwickelnde Vulva als einfachstes Erkennungsmerkmal fr Hermaphroditen dieses Stadiums (dazu spter mehr). Anterior und posterior der Vulva befindet sich der Uterus, der zwei oder mehr Eier beinhalten kann. Vom Uterus erstreckt sich in beide Richtungen die Keimbahn (Gonade). Jeder Gonadenarm erstreckt sich U-frmig, wobei sich der distale Teil in der Krpermitte (oder sogar darber hinaus) befinden kann.

3.2.

Unterscheidung verschiedener larvaler Stadien

Ziel: Mit diesem Experiment sollen Sie sich mit den verschiedenen Larvenstadien von C. elegans vertraut machen. Material: Benutzen Sie dafr die gleichen, kleinen Petrischalen auf denen Sie gerade die adulten Tiere beobachtet haben. Aufgabe: Versuchen Sie die verschiedenen Larvenstadien an Hand der Abbildung zu erkennen. Auf der Platte sollten Tieren aller Stadien vorhanden sein. Nachdem Sie die adulten Tiere schon unterscheiden knnen, suchen Sie jngere und kleinere Tiere. Larven des ersten Stadiums (L1) sind unwesentlich grer als Eier. Sie lassen sich nur in der grten Vergrerung des Stereomikroskops erkennen.

33

Abbildung 7. Die Abbildung zeigt die verschiedenen Larvenstadien von C. elegans. Der untere Teil der Abbildung zeigt schematisch das wichtigste Erkennungsmerkmal zwischen L3- und L4-Larven. Im L4-Stadium ist in der Krpermitte auf der ventralen Seite die beginnende Invagination der Vulvazellen zu sehen.

Etwas grer und dunkler erscheinen die Larven des zweiten und dritten Larvenstadiums (L2, L3). Im Rahmen unseres Kurses ist es allerdings nicht wichtig, diese Stadien eindeutig voneinander zu unterscheiden. Wichtig ist allerdings das Erkennen des L4 Stadiums. Hermaphroditen im vierten Larvenstadium werden fr genetische Experimente (Kreuzungen) bentigt. Wie schon vorher erwhnt, entwickelt sich in diesem Stadium das Eiablageorgan, die Vulva. In L3 und L4 Tieren ist in der Krpermitte (ventral) ein hellerer Abschnitt zu erkennen. Nur in den L4 Tieren ist allerdings eine zustzliche Struktur in Form einer Invagination (Einstlpung) zu erkennen (siehe Abbildung 7).

34

3.3.

Erkennung von Mnnchen

Ziel: In diesem Experiment sollen Sie lernen Mnnchen von C. elegans zu erkennen. Das Erkennen und Isolieren von Mnnchen ist wichtig fr das Ansetzen von Kreuzungen. Material: Sie bekommen kleine Petrischalen auf denen Wildtyp Tiere oder Tiere einer Mutante (him-8) enthalten sind. Auf diesen Platten sollten sich neben den Hermaphroditen auch Mnnchen befinden. Aufgabe: Versuchen Sie durch Beobachtung die Mnnchen auf diesen Platten zu finden. Die Morphologie der Mnnchen unterscheidet sich von den Hermaphroditen (siehe Abbildung). Die Mnnchen besitzen eine einarmige Gonade. Am Schwanz des Mnnchens befindet sich das Kopulationsorgan, das in Form eines Fchers zu sehen ist. Die adulten Mnnchen sind etwas dnner als gleichaltrige Hermaphroditen.

Abbildung 8. Anatomie eines C. elegans Mnnchens mit Ausschnitten von DIC Aufnahmen (B, C-E) und einer schematischen bersicht (A).

C. elegans ist ein protandrischer Hermaphrodit (zuerst Spermatogenese, dann Oogenese) mit 5 Autosomen und zwei X-Chromosomen (Genotyp XX). Mnnchen (Genotyp XO) entstehen whrend der Meiose durch Nondisjunktion (Nichttrennung der X-Chromosomen) mit einer Hufigkeit von etwa 0.2%. Da sich auch Hermaphroditen auf der Platte befinden, werden Sie auch das Paarungsverhalten beobachten knnen. Dabei erkennt das Mnnchen mit den sensorischen Neuronen im Schwanz ein anderes Tier. Mit dem Schwanz wird danach das Tier abgetastet, wobei das Mnnchen erkennt, ob es sich dabei um einen Hermaphroditen handelt. Hat das Mnnchen die Vulva eines Hermaphroditen gefunden kommt es zur Kopulation. Die dabei bertragenen Spermien werden in der Spermathek gesammelt und fr die Befruchtung der Oozyten verwendet (bevorzugt gegenber der eigenen Spermien).

35

3.4.

Mutanten mit morphologischen Defekten

Ziel: Kennenlernen verschiedener Mutanten von C. elegans Material: Sie bekommen kleine Petrischalen auf denen homozygot mutante Tiere verschiedener Stadien enthalten sind. Die Platten werden verschiedene Bezeichnungen enthalten, die sie in der Tabelle den entsprechenden Mutationen zuordnen sollen. Aufgabe: Versuchen Sie durch Beobachtung die morphologischen Vernderungen der Mutanten im Vergleich zu den Wildtyp Tieren zu erkennen. Die Mutationen knnen zu Grenunterschieden fhren, aber auch zu Vernderungen im Verhalten (z.B. im Bezug auf die Fortbewegung, die Reaktion auf leichte oder strkere Berhrungen, oder die Reaktion auf Umwelteinflsse wie Futter oder Chemikalien). In C. elegans werden Mutanten mit einer Abkrzung aus drei Buchstaben und einer Zahl gekennzeichnet, wobei die Buchstaben in Zusammenhang mit dem Phnotyp oder der molekularen Ursache der Mutation stehen. So werden z.B. Mutanten, die sich nicht mehr normal bewegen knnen, als Unc bezeichnet (fr: uncoordinated). Hier eine kleine Tabelle mit den hufigsten Bezeichnungen: Kurzbezeichnung: Unc steht fr: uncoordinated Phnotyp: Bewegung eingeschrnkt (keine Bewegung mglich, nur vorwrts oder rckwrts, nur nach links, zusammenzucken oder zittern, ..) kurz und dick kurz aber dnner als Dpy um 50% lnger als Wildtyp Probleme mit der Eiablage (keine Vulva vorhanden, fehlende Innervierung der Vulva, Muskeldefekt, .) in den Nachkommen eines Hermaphroditen sind viele Mnnchen (normal sind 0.2%; bei den Him knnen es auch 30% Mnnchen sein) Probleme der mechanosensorischen Neuronen Fehler in dem Zellstammbaum (kann verschiedene Gewebe betreffen und daher ganz unterschiedliche Phnotypen hervorrufen)

Dpy Sma Lon Egl

dumpy small long egg laying defective

Him

high incidence of males

Mec Lin

mechanosensory abnormality lineage defective

Die Platten, die Sie bekommen, sind mit einem Buchstaben gekennzeichnet. Vergleichen Sie den Phnotyp der Tiere mit der Beschreibung der Mutanten in der folgenden Tabelle und versuchen Sie eine Zuordnung.

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Mutanten: unc-119: Das Protein UNC-119 ist in allen Nervenzellen exprimiert. UNC-119 ist wichtig fr die Entwicklung des Nervensystems. Dazu gehren auch die Verzweigungen der Axone und die Bndelungen (fasciculations). Defekte in UNC-119 fhren zu Strungen der normalen Bewegung, der Chemo- und Mechanorezeption (dazu mehr im nchsten Abschnitt) und der Nahrungsaufnahme. dpy-20: Das Protein DPY-20 besitzt zwei Zinkfingerdomnen, die sequenzspezifischen Kontakt mit den groen Furchen der DNA herstellen knnen (z.B. bei Transkriptionsfaktoren). Die Lokalisation von DPY-20 ist noch nicht bekannt. dpy-20 Mutanten besitzen eine krzere Krperform und erscheinen deshalb auch etwas dicker. rol-6: ROL-6 ist ein Kollagen, welches mit dem menschlichen Kettenvorluferprotein Kollagen-Alpha-1(III) verwandt ist. Es wird in der Epidermis exprimiert. Defekte in ROL-6 fhren zu einer Bewegungsstrung, bei der sich die mutanten Wrmer immer um die eigene Achse drehen (rollen). him-8: Wie oben in der Tabelle fr Him-Mutanten schon erwhnt, fhren auch Defekte in HIM-8 zu einer deutlich hheren Anzahl von Mnnchen in der Nachkommenschaft als das bei Wildtyp Tieren zu beobachten ist. HIM-8 besitzt ebenfalls zwei Zinkfingerdomnen. HIM-8 ist wichtig fr die Paarung der homologen XChromosomen whrend der Meiose. In him-8 Mutanten kommt es daher hufiger zu einem Verlust eines X-Chromosoms. Nach der Befruchtung entsteht so ein XO Tier (Mnnchen). 3.5. Mutanten mit mechanosensorischen Defekten Mutanten testen, die Defekte in den

Ziel: In diesem Experiment sollen Sie mechanosensorischen Nervenzellen besitzen.

Material: Sie bekommen kleine Petrischalen auf denen Wildtyp Tiere oder Mutanten in den folgenden Gene enthalten sind: mec-3(e1338), osm-6(p811), che-3(e1378). Auerdem bentigen wir fr dieses Experiment sogenannte Wimpernpicks, die wir selbst herstellen werden. Aufgabe: In diesem Experiment werden wir Unterschiede im Verhalten testen, das durch direkten Kontakt mit dem Tier ausgelst wird. Einfhrung: Das mechanosensorische Nervensystem von C. elegans Die 302 Nervenzellen im erwachsenen Tier ermglichen durchaus komplexe Verhaltenweisen. C. elegans besitzt verschiedene primitive Sinnesorgane, die als Mechano, Thermo- und Chemorezeptoren fungieren. Mit Hilfe der Laser-Mikrochirurgie konnten einzelne Neuronen oder Neuronengruppen bestimmten Rezeptoren zugeordnet werden. Die an den unterschiedlichen Rezeptoren beteiligten Gene wurden mit Hilfe genetischer Screens und darauffolgender Verhaltensstudien identifiziert. Das somatosensorische System von C. mechanosensorischer Neuronen (siehe Abb. X): elegans besteht aus 3 Klassen

I. Die Neuronen ALM, AVM, PLM und PVM besitzen sensorische Endigungen aus 15Protofilament Mikrotubuli und werden als Mikrotubuli Berhrungssinneszellen bezeichnet. ALM und AVM sind mechanosensorische Neuronen im anterioren, PLM und PVM im posterioren Bereich des Wurmes.

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II. Die Neuronen ASH, FLP und OLQ besitzen mit Cilien besetzte sensorische Endigungen und sind fr den Fluchtreflex des Wurmes verantwortlich, welcher durch die Berhrung der Nase ausgelst wird. III. PVD hat undifferenzierte sensorische Endigungen und ist nur bei sehr starken mechanischen Stimuli involviert.

Abbildung 9. Das somatosensorische System von C. elegans und seine drei Klassen von mechanosensorischen Neuronen (Kaplan & Horvitz, 1993).

Herstellung eines Wimpernpicks: Nehmen Sie eine Wimper und kleben diese mit einem kleinen Tesastreifen die Wimper an das Ende einer Glas-Pasteurpipette, so dass mindestens die Hlfte der Wimper frei ist.

3.5.1.

Test 1: Berhrungs-Sensitivitts-Test (Mechanosensation assay) Nach Chalfie & Sulston, Dev Biol, 1981

Material: NGM Wurmplatten beimpft mit E. coli OP50 Wimper an einer Pasteurpipette Stmme: 1) N2 (Bristol) als Wildtyp 2) mec-3(e1338) bung: Testen Sie 10 adulte Wrmer beider Stmme mit Hilfe einer Wimper auf Berhrungssensitivitt. Dazu berhren Sie mit der Spitze der Wimper 10 Mal alternierend die anteriore und posteriore Hlfte des Tieres. Wiederholen Sie dies mit 9 weiteren Tieren von jedem Stamm.

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Reagiert ein Tier nach jeder anterioren Berhrung mit einer Rckwrtsbewegung und nach jeder posterioren Berhrung mit einer Vorwrtsbewegung, wird dieses Ergebnis als 100% Reaktion gewertet. Werten Sie beide Stmme aus. 3.5.2. Test 2: Nasenberhrungs-Test (Nose touch assay) Nach Kaplan & Horvitz, PNAS, 1993

Material: NGM Wurmplatten beimpft mit E. coli OP50 Wimper an einer Pasteurpipette Stmme: 1) N2 (Bristol) als Wildtyp 2) osm-6(p811) 3) che-3(e1378) bung: Testen Sie 10 adulte Wrmer von jedem Stamm mit Hilfe einer Wimper auf die Reaktion einer Nasenberhrung. Dazu halten Sie die Wimper flach (waagerecht) vor ein sich vorwrts bewegendes Tier und verursachen somit eine Nasen-Kollision. Testen Sie jedes der 10 Tiere 10-mal hintereinander. Reagiert ein Tier 10 Mal in Folge mit einer Ausweich- oder Rckwrtsbewegung, wird dieses Ergebnis als 100% Reaktion gewertet. Werten Sie alle drei Stmme aus. 3.6. Auswertung zweier Kreuzungsexperimente

Ziel: Durch die Auswertung zweier Kreuzungsexperimente stellen wir allgemeine Gesetze und Prinzipien der Genetik mit unserem Modellorganismus dar. Nachvollziehbar sind im Einzelnen: - die 1. Mendelsche Regel (Uniformitt der F1) - die 2. Mendelsche Regel (Verteilung der Merkmale in der F2) - Geschlechtsgebundene Vererbung - die Begriffe Phnotyp und Genotyp - Kopplung von Merkmalen - Selbstbefruchtung und Fremdbefruchtung bei C. elegans, einem protandrischen Zwitter - Bestimmung des formalgenetischen Abstandes zweier Merkmale durch Messung der Rekombinationsfrequenz in der Einheit cM (Zentimorgan) - die genetische Nomenklatur von C. elegans: wie werden Kreuzungen und Genotypen korrekt dargestellt Das erste der beiden Kreuzungsexperimente (A) verwendet zwei ungekoppelte rezessive Mutationen, whrend das zweite (B) die gekoppelte Vererbung zweier rezessiver Merkmale darstellt. In beiden Kreuzungen werden homozygote Doppelmutanten mit dem Phnotyp Dpy (dumpy fr kurz und dick) und dem Phnotyp Unc (uncoordinated, also bewegungsdefekte Tiere) als Ausgangsmaterial eingesetzt. Dieses Ausgangsmaterial nennen wir P0, denn es bezeichnet die parentale Generation. In unserem Experiment erhalten wir eine erste filiale Generation (F1) durch Verpaaren der doppelmutanten Hermaphroditen mit Mnnchen des Wildtyps. Der Genotyp der P0 ist fr Kreuzung A dpy-11 unc-7, fr Kreuzung B ist er dpy-11; unc-42. In beiden Experimenten werden hybride Tiere der F1 vereinzelt. Durch Selbstbefruchtung entsteht dann die filiale Generation 2 (F2).

39

3.6.1.

Auswertung der F1-Generation (getrennt fr Kreuzung A und Kreuzung B durchzufhren)

1.) Zhlen Sie die Tiere der F1 mit dem doppelten Phnotyp dumpy uncoordinated getrennt nach Geschlechtern. Wie ist das Verhltnis der Geschlechter dieser Phnotypen? 2.) Zhlen Sie die Tiere mit dem wildtypischen Phnotyp nach den beiden Geschlechtern getrennt. Wie ist das Verhltnis der Geschlechter dieser Phnotypen? 3.) Zhlen Sie die Tiere der F1 mit dem einfachen Phnotyp dumpy getrennt nach Geschlechtern. Wie ist das Verhltnis der Geschlechter dieser Phnotypen? 4.) Zhlen Sie die Tiere der F1 mit dem einfachen Phnotyp uncoordinated getrennt nach Geschlechtern. Wie ist das Verhltnis der Geschlechter dieser Phnotypen? 5.) Bestimmen Sie aus den nun vorliegenden Zahlen das prozentuale Verhltnis der Geschlechter der F1 ohne Bercksichtigung der in 1.) untersuchten Tiere mit dem doppelten Phnotyp. 6.) Bestimmen Sie aus den vorliegenden Zahlen das prozentuale Verhltnis der in 1.) ermittelten Tiere zur Gesamtzahl der F1. Welche Bedeutung hat diese Zahl?

A) dpy-11; unc-7 Hermaphroditen Mnnchen wt dpy-11 unc-7

B) dpy-11 unc-42 Hermaphroditen Mnnchen wt dpy-11 unc-42

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3.6.2.

Auswertung der F2-Generation (getrennt fr Kreuzung A und Kreuzung B durchzufhren)

1.) Bestimmen Sie das Verhltnis der Phnotypen fr die nicht-gekoppelte Vererbung (A) und die gekoppelte Vererbung (B). A) wt Hermaphroditen Mnnchen B) wt Hermaphroditen Mnnchen dpy-11 unc-42 dpy-11 unc-42 dpy-11; unc-7 dpy-11 unc-7

2.) Bestimmen Sie fr (B) aus der Frequenz der Rekombinationsereignisse den formalen genetischen Abstand von dpy-11 und unc-42. 1 cM (Zentimorgan) entspricht einem Prozent Rekombination pro Meiose.

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Genetisches Arbeiten mit Drosophila, dem klassischen und modernen Modellsystem fr Genetik und Entwicklungsbiologie
K.-F. Fischbach

Aktuelle Version immer hier: http://filab.biologie.uni-freiburg.de --> Lehre-Button)

Dichaete

curled

vestigial

Fliegengehirn

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Vorbemerkung: Tipps zum Lesen dieses Skriptums............................. ................. .....44 1 Allgemeine Grundlagen ......................................................................................................................... 44 1.1 Der Karyotyp von Drosophila und genetische Geschlechtsbestimmung ..................................... 44 1.2 Die Riesenchromosomen................................................................. 46 1.3 Einige molekulare Charakteristika des Drosophila Genoms ......................................................... 47 1.3.1 Hochrepetitive Sequenzen .............................................................................................................. 48 1.3.2 Lokalisierte mittelrepetitive Sequenzen und springende Gene .................................................. 48 1.3.3 Singulre Sequenzen ....................................................................................................................... 51 1.4 Die klassische Trickkiste der Drosophila Genetik .......................................................................... 51 1.4.1 Mutagenesen .................................................................................................................................... 51 1.4.1.1 EMS als Beispiel fr ein chemisches Mutagen .......................................................................... 51 1.4.1.2 Rntgenstrahlung ......................................................................................................................... 52 1.4.1.3. Hybrid Dysgenese ('Natrliche' Mutagenese) ........................................................................... 52 1.4.2 Mutantenselektion ........................................................................................................................... 54 1.4.2.1. Mutantensuche auf dem X-Chromosom (vitale Allele) ............................................................. 54 1.4.2.2 Mutantensuche auf dem X-Chromosom (letale Allele) .............................................................. 55

Inhaltsverzeichnis

1.5. Zelltypspezifische Genexpression..................................................................................57 1.5.1 Die "Enhancer-Trap"-Methode ........................................................................................................ 57 1.5.2. Gezielte Expression von klonierten Genen mit dem Gal4/UAS-System .................................... 57 1.6 Das Nervensystem von Drosophila ................................................................................................... 59 Praktische Arbeiten im Kurs .................................................................................................................... 60 Aufgabe 1........60 Aufgabe 2.....61 Aufgabe 3.....62 Aufgabe 4........63

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Vorbemerkung: Tipps zum Lesen dieses Skriptums Das biologische Vorwissen der Erstsemester ist erfahrungsgem abhngig von der schulischen Fcherwahl, dem Lehrplan, dem individuellen Lehrer und den individuellen Fhigkeiten und Neigungen. Obwohl versucht wurde, dieses Skriptum selbsterklrend zu schreiben, gibt es keinen Text, der vllig ohne Vorwissen auskommt und deshalb knnen Begriffe auftauchen, die im Text nicht hinreichend erklrt sind. In diesen Fllen empfehle ich die Verwendung des Internets. Die meisten biologischen Begriffsdefinitionen knnen z. B. auf Wikipedia nachgeschlagen werden: http://de.wikipedia.org

1 Allgemeine Grundlagen 1.1 Der Karyotyp von Drosophila und genetische Geschlechtsbestimmung Das Genom von Drosophila melanogaster ist bersichtlich, da der einfache Chromosomensatz nur vier Chromosomen enthlt. In der Metaphase hat der Karyotyp folgendes Aussehen: Abb.1 Diploide Karyoptypen von Drosophila melanogaster (Metaphasechromosomen)

X und Y sind die Gonosomen (Geschlechtschromosomen), 2, 3 und 4 die Autosomen. Das Zentromer als Ansatzpunkt der Kernteilungsspindel ist bei dem X-Chromosom endstndig (akrozentrisch) und bei den Autosomen 2 und 3 mittelstndig (metazentrisch). Diese Chromosomen bestehen also aus einem linken (L) und einem rechten (R) Arm. Das akrozentrische vierte Chromosom ist sehr klein und enthlt nur wenig genetische Information. Die Funktion des Y-Chromosoms ist vor allem in der Gewhrleistung einer reibungslosen Meiose whrend der Spermatogenese zu suchen. XO Individuen sind normal lebensfhige Mnnchen, aber steril. Die genetische Geschlechtsbestimmung bei Drosophila folgt der Regel, dass alle Individuen, bei denen das Zahlenverhltnis der X-Chromosomen zum Autosomensatz 1 ist, den weiblichen Phnotyp ausprgen, whrend ein Verhltnis 0,5 den mnnlichen Phno typ zur Folge hat. Hauptschlich beteiligt an der Genkaskade sind die Gene sex lethal (sxl ), daughterless (da), transformer (tra ), doublesex (dsx ) und fruitless (fru). sxl ist auch an der Regulation der Dosage-Kompensation beteiligt. Nach der Befruchtung wird das Verhltnis X/A gemessen. Drei X-chromosomale Faktoren werden ins Verhltnis zu drei autosomalen gesetzt. Das Verhltnis entscheidet, ob das Schaltergen sxl aktiviert wird oder nicht: Die X-chromosomalen Aktivatoren des sxl-Gens sind die Faktoren Runt, Sisterless-A und Sisterless-B (auch als Scute bezeichnet). Diese Genprodukte binden an den sxl Promotor und induzieren die Transkription von sxl in Weibchen.

44

Die autosomalen Proteine Daughterless, Deadpan und Extramachrochaete reprimieren sxl. Bei nur einem X und einem bergewicht dieser Repressoren bleibt sxl ausgeschaltet und es entwickeln sich Mnnchen. Das in Weibchen hergestellte sxl Genprodukt, das Sex-lethal Protein, ist ein Splei-Enzym. Gespleit wird transformer mRNA und dadurch aktiviert. Das Transformer-Protein ist ebenfalls ein Spleifaktor und fhrt zum sexspezifisches Spleien der mRNAs des dsx Gens sowie des fru Gens in Weibchen. Die Genprodukte von dsx und fru sind Transkriptionsfaktoren. Aufgrund des spezifischen Spleiens ihrer mRNAs liegen Mnnchen M F M F und Weibchen-spezifische Transkriptionsfaktoren vor (DSX / DSX und Fru / Fru ; wobei M = male und F = female bedeuten).

Genetische Geschlechtsbestimmung bei Drosophila

Abb.2 Rosa: Kausalkette zum weiblichen Phnotyp. Blau: Kausalkette zum mnnlichen Phnotyp. Weitere Erklrungen im vorstehenden Text. Tra2 ist ein konstitutives Protein, welches einen Dimer mit dem aktiven tra-Genprodukt bildet. DSX und Fru sind die jeweils sexspezifisch vorliegenden Transkriptionsfaktoren, die die geschlechtsspezische Differenzierung des somatischen (DSX) oder des verhaltensbiologischen (Fru) Phnotyps initiieren, wobei Fru im wesentlichen innerhalb des Nervensystems wirkt. Gentechnisch lassen sich uerlich zu Weichen differenzierte Tiere mit M mnnlichem Verhalten herstellen (durch erzwungene Expression des Fru Transkriptionsfaktors).

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1.2 Die Riesenchromosomen

Der Erfolg der Drosophila Genetik ist verknpft mit der Existenz der Riesenchromosomen in den Zellen der Speicheldrse. Diese stellen eine Sonderanpassung an die hohe Stoffwechselaktivitt sekretorischer Zellen dar, welche eine Verstrkung der Genaktivitt erforderlich macht. Die Riesenchromosomen entstehen durch eine Serie von 10-12 Endomitosen, das sind Verdopplungen des Chromatidbestandes ohne nachfolgende Kern- und Zellteilung. Die Tochterchromatiden bleiben zusammen und bilden mit den homologen Chromatiden die polytnen "Riesenchromosomen", die also ber 2000 DNA-Doppelhelices und die dazugehrigen Proteine enthalten.

Abb.3 Schematische Darstellung des prinziellen Aufbaus eines Riesenchromosoms von Drosophila melanogaster. Die Autosomen und das X-Chromosom beim Weibchen bestehen aus den vervielfltigten Chromatiden vter- und mtterlicherseits. Die Querbanden entsprechen dem unterschiedlichen DNA-Gehalt entlang der Lngsachse eines Riesenchromosoms (Grad der Kondensierung unterscheidet sich). Puffs sind die Orte aktiver Genexpression.

Die Zentromerregionen aller Riesenchromosomen sind im Chromozentrum vereint. Hier sind hochrepetitive DNA-Sequenzen und auch der Nukleolenbildungsort nachweisbar. Das charakteristischste und im Lichtmikroskop gut sichtbare Merkmal der Riesenchromosomen ist ihre Bnderung. Die unregelmige Struktur der Banden erlaubt die exakte Identifizierung kleinster Chromosomenabschnitte. Die Riesenchromosomen erlauben somit die Erstellung einer physikalischen Genkarte, die mit der Rekombinationsgenkarte verglichen werden kann. Auf dem X-Chromosom und den Armen der Autosomen 2 und 3 werden je 20 physikalische Abschnitte unterschieden. Autosom 4 enthlt 2 Abschnitte. Alle Riesenchromosomen werden zusammengenommen damit in 102 physikalische Einheiten aufgeteilt. Jede Einheit ist in die Abschnitte A-F unterteilt. Die einzelnen Banden in diesen Abschnitten sind durchnummeriert.

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Chromosom X 2L 2R 3L 3R 4

physikalische Einheiten 1-20 21-40 41-60 61-80 81-100 101-102

Die genetische Angabe 19F4 besagt z.B., dass die 4. Bande in dem Abschnitt F der Einheit 19 auf dem X-Chromosom gemeint ist. Das Y-Chromosom liegt nicht polytn vor, ihm werden deshalb keine Abschnitte auf den Riesenchromosomen zugewiesen Gleiches gilt auch fr heterochromatische Bereiche der anderen Chromosomen. So ist z.B. fast die gesamte zentromernahe Hlfte des metaphasischen X-Chromosoms (s. Abb.1) im Riesenchromosom nicht erkennbar (Beachte: Die Speicheldrsenchromosomen sind aktive Interphase-Stadien). Chromosomenmutationen sind z.T. an den Riesenchromosomen im Lichtmikroskop sichtbar. Deletionen fhren zum Fehlen spezifischer Banden, Inversionen zu einer nderung ihrer Reihenfolge. Bei Translokationen ist erkennbar, dass Chromosomenbruchstcke an ein anderes Chromosom angehngt worden sind. Typische Muster ergeben sich besonders in heterozygoten Situationen. 1 Morgan entspricht einer 1%igen Wahrscheinlichkeit fr ein Crossover (eine Rekombination) zwischen zwei Genen. Der Rekombinationsabstand (in Morgans gemessen) kann verwendet werden, um die lineare Anordnung der Gene auf dem Chromosom zu bestimmen. Die so erstellte Rekombinationsgenkarte und die physikalische Genkarte stimmen in der linearen Reihenfolge der Gene berein, aber nicht in Bezug auf die einzelnen Abstnde zwischen den Genen. Offensichtlich gibt es Bereiche auf den Chromosomen, in denen ein Crossover nur hchst selten erfolgt (also sind alle Gene dieser Region eng gekoppelt), und andere Bereiche, in denen Crossover hufig sind (mit entsprechender Entkopplung der dort lokalisierten Gene). Die Spitze des X-Chromosoms (distal zum Zentromer) ist ein Beispiel fr eine Crossover-arme Region. Alle in 1A-F lokalisierten Gene fallen in der Rekombinationsgenkarte im Startpunkt bei 0,0 ME (Morgan Einheiten) zusammen.

1.3 Einige molekulare Charakteristika des Drosophila Genoms

Das haploide Genom von Drosophila melanogaster hat eine Lnge von 165 Millionen Basenpaaren. Das Genom ist vollstndig sequenziert und beherbergt etwa 13700 Gene, der Mensch hat gerade mal etwas mehr als die doppelte Anzahl, wobei es zu fast jedem Drosophilagen ein (oder mehrere) homologe Gene beim Menschen gibt.

Hier knnen die bekannten Drosophila Sequenzdaten abgerufen werden: http://www.fruitfly.org/ <-----Drosophila spezifische Sequenz-Datenbank http://flybase.bio.indiana.edu/ <-----allgemeine Drosophila-Datenbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ <-----(fast) alles umfassende biologische Datenbank

47

Nicht alle Bereiche des Genoms sind von vergleichbarer Bedeutung fr den Organismus.

1.3.1 Hochrepetitive Sequenzen

Der DNA-Gehalt eukaryontischer Genome schwankt dramatisch. Dies liegt im wesentlichen an dem hohen, variablen Anteil repetitiver DNA. Bei den hoch repetitiven Sequenzen handelt es sich nach heutiger Einschtzung um "DNA-Abfall", der bei diversen Rekombinationsprozessen anfllt. Eine funktionelle Bedeutung fr die Entwicklung eines Organismus wird dieser DNA zunehmend aberkannt, weil substantielle Deletionen keinen Einflu auf den Phnotyp ausben. Mglicherweise spielt der Gehalt hochrepetitiver Sequenzen jedoch bei der sexuellen Isolation von Populationen und damit bei der Artbildung eine Rolle. Hochrepetitive DNA ist in heterochromatischen Bereichen der Chromosomen anzutreffen, die nur inselartig transkribierte Bereiche enthalten. Bei Drosophila melanogaster sind vier Sequenzen an der hochrepetitiven DNA mindestens zu 75% beteiligt: 1. 5'-AATAT-3' 2. 5'-AAGAG-3' 3. 5'-AATAACATAG-3' 4. Eine repetitive Einheit aus 359 bp

1.3.2 Lokalisierte mittelrepetitive Sequenzen und springende Gene

Die Histongene und z.B. die Gene der rRNA liegen an bestimmten Positionen auf den Chromosomen in mehreren Kopien vor (local repeats). Diese mittelrepetitiven Sequenzen mit eindeutiger biologischer Funktion sind von nomadischen Sequenzen zu unterscheiden, die im gesamten Genom verteilt an variablen Positionen auftauchen knnen. Diese nomadischen Sequenzen oder "Springenden Gene" knnen einen betrchtlichen Bruchteil des Gesamtgenoms ausmachen (s. Abb.4). Obwohl sie vor allem im Euchromatin vorkommen und transkribiert werden knnen, ist eine funktionelle Bedeutung fr den organismischen Phnotyp meistens zweifelhaft. Das erklrt ihre hohe Variabilitt von Tierstamm zu Tierstamm, aber auch den drastisch unterschiedlichen Gehalt des Genoms an solchen Sequenzen bei nahverwandten Arten (s.u.). Drosophila simulans hat z.B. wesentlich weniger nomadische Sequenzen als Drosophila melanogaster, obwohl die Komplexitt des Phnotyps natrlich die gleiche ist wie bei Drosophila melanogaster. Bei Drosophila melanogaster sind mehrere Familien springender Gene unterschiedlicher Komplexitt bekannt. Die Charakteristika von einigen sei hier kurz erwhnt. Die copia Familie (z.B. copia, mdg1, roo ,17.6 etc.; Sonderfall gypsy) Die Zahl der Kopien/Genom ist je nach Element 10-100. Familienmerkmale sind zwei lange terminale Repeats (LTR), die aus einem zentralen direkten Repeat (DR) bestehen, das von zwei invertierten Repeats (IR) flankiert wird. Bei copia ist das DR 276 bp lang und die IR haben17 bp. Die LTRs umschlieen ein Insert von 5-9 kb Lnge. Copia-hnliche Elemente zeigen Verwandtschaft zu ins Genom integrierten Retroviren der Vertebraten und knnen ausgehend von den LTRs transkribiert werden. Gypsy kann sogar als echter Retrovirus bezeichnet werden, denn es kodiert fr ein Hllprotein und kann in manchen Drosophilastmmen infektise Viruspartikel bilden. Gypsy integriert bevorzugt in die Sequenz TACATA, whrend 17.6 in die TATA-Box springt.

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Abb.4 Drosophila melanogaster und Drosophila simulans unterscheiden sich quantitative weder in der Menge ihrer single copy DNA noch im Heterochromatiin oder den lokalen Repeats. Sie unterscheiden sich aber erheblich in der Anzahl nomadischer DNA-Sequenzen. Schon allein daraus ist abzulesen, dass die nomadischen Sequenzen fr die Entwicklung eines Organismus keine Information enthalten. Sie ist verzichtbar.

Infektion extrazellulr intrazellulr

R U5

RNA

U3 R

Reverse Transkription U3 R U5 DNA U3 R U5

Integration U3' R U5 Wirt Transkription R U5 RNA U3 R U3 R U5' Wirt

Retrotransposons

einige Retrotransposons bilden intrazellulr v irus-hnliche Partikel (z.B. copia)

Retroviren (z.B. gypsy)

Kapselprotein

gag-Proteine Ribonucleoproteinkomplex

nur Retrov iren

Abb.5 Vergleich der Lebenszyklen von Retroviren und Retrotransposons. Der Hauptunterschied zwischen den Lebenszyklen liegt darin, dass die Retroviren extrazellulr in einer Dauerform berleben und neue Zellen infizieren knnen. Retrotransposons existieren ausschlielich intrazellulr und werden deshalb nur vertikal, von einer Zellgeneration an die nchste vererbt. Die RNA von Retrotransposons und Retroviren besitzt an ihren Enden direkte Repeats (R). Das 5'-Ende ist zudem durch die U5-Sequenz und das 3'Ende durch U3 ausgezeichnet. Die RNA enthlt im typischen Fall einen einzigen langen offenen Leserahmen, der fr ein Polyprotein codiert, das posttranslational in Proteine unterschiedlicher Funktion zerlegt wird. Retrotransposons und Retroviren gemeinsam ist die Reverse Transkriptase. Die hierdurch an der RNAMatrize hergestellte doppelstrngige DNA kann linear, aber auch zirkularisiert vorliegen. Wahrscheinlich wird die lineare Form ins Wirtsgenom

49

integriert. Dort ist die Retro-DNA durch kurze direkte Repeats der Wirts-DNA eingerahmt (senkrechte schwarze Balken). Die langen terminalen direkten Repeats (LTR), die den offenen Leserahmen der Retro-DNA umschlieen und ihrerseits an ihren Enden kurze invertierte Repeats (Pfeilspitzen) aufweisen, setzen sich aus U3, R und U5 zusammen. Im linken LTR ist U3' und im rechten LTR ist U5' im Vergleich zu U3 und U5 um wenige Basen verkrzt. Durch die intensive Transkription der Retro-DNA entstehen nun viele RNAMolekle, von denen wenige aufs neue ins Genom integrieren knnen (intrazellulrer Zyklus, auf den die Retrotransposons beschrnkt sind). Die meisten RNA-Molekle werden in Partikel abgepackt. Die Hlle wird aus den gruppenspezifischen Antigenen (gagProteinen), fr die Retrotransposons wie Retroviren entsprechende Gene tragen, gebildet. Nur Retroviren jedoch codieren auch fr ein Kapselprotein, dass die extrazellulre Bestndigkeit der Viruspartikel sicherstellt und die Infektion neuer Zellen ermglicht. Die P-Elemente P-Elemente haben sehr kurze IRs von 31 bp an ihren Enden. Ihnen kommt eine besonders groe experimentelle Bedeutung bei Drosophila zu. Sie existieren nicht in allen Drosophila melanogaster Wildtypstmmen, deshalb kann an ihnen das Phnomen der zygotischen Induktion studiert werden. Gelangen P-Elemente ber das Spermium in eine P-Element freie Eizelle (M-Zytotyp), dann werden sie mobilisiert und knnen ihre genomische Position verndern. Hierauf beruht das Prinzip der P-Element Mutagenese (Hybrid Dysgenese, s. Kapitel Mutagenese). Darberhinaus dienen modifizierte P-Elemente als Vektoren beim Transformieren der Keimbahn von Drosophila melanogaster (nheres hierzu im Kurs).
Kompletter P-Faktor

Exon 0 85-442

Exon 1 501-1168

Exon 2 1222-1947

Exon 3 2138-2706

2907

Intron 0-1

Intron 1-2

Intron 2-3

In der kurzen mRNA der Keimbahn sind alle drei Introns gespleit

langer

87 kD Protein der Keimbahn (Transposase)

In der langen somatischen mRNA ist Intron 2-3 enthalten

kurzer

66 kD somatisches Protein (Inhibitor)

Abb.6 Ein kompletter P-Faktor besitzt 4 Exons (0-3). Das Spleien der Introns 0-1, 1-2 und 2-3 fhrt in der Keimbahn zu einem langen offenen Leseraster (open reading frame, ORF) und zu der Produktion eines Proteins mit 87 kD. Dieses Protein hat Transposase-Aktivitt. Da das Spleien von Intron 2-3 in somatischen Zellen nicht funktioniert, wird hier der ORF im Intron 2-3 gestoppt und nur ein verkrztes, langlebiges Protein von 66 kD Lnge hergestellt. Dieses Protein akkumuliert mit der Zeit auch in der Keimbahn von P-Stmmen und ist fr die Inhibition der Transposition im P-Cytotyp verantwortlich.

Die etwa 3kb langen P-Elemente werden transkribiert. Sie codieren fr ihre eigene Transposase (5 Exons). Ein langlebiger Repressor, der offensichtlich mit der Transposase kompetitiert und mit ihr teilweise baugleich ist (die ersten 3 Exons), akkumuliert in P-Element haltigen Keimbahnen und fhrt so nach einigen Generationen zu einer weitgehenden Stabilisierung des Genoms (P-Zytotyp).

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1.3.3 Singulre Sequenzen

Die euchromatischen Genomregionen bestehen bei Drosophila melanogaster zu rund 80% aus sogenannter "single copy" DNA (90 mb). Die fr den Organismus relevante genetische Information ist innerhalb dieser 90 mb lokalisiert. Hierin finden sich etwa 13700 Gene, die offensichtlich hinreichend sind, um einen so komplexen flugfhigen Organismus entstehen zu lassen. Erst die moderne Entwicklungsgenetik hat gelehrt, wie die Gene die epigentischen Spielregeln gestalten, die den Entwicklungsprozess steuern.

1.4 Die klassische Trickkiste der Drosophila Genetik

100 Jahre weltweite Drosophila Forschung hat ein riesiges Reservoir genetischer Methoden ausgearbeitet, ohne die genetisches Arbeiten in der heutigen Form mit Drosophila nicht mglich wre. Wir werden sehen, dass besonders die Existenz von Spezialstmmen genetisches Arbeiten mit Drosophila erleichtert. hnlich wie in der Bakteriengenetik knnen diese Produkte weltweiter Arbeit als Werkzeuge genetischer Forschung fungieren.

1.4.1 Mutagenesen
Am Anfang genetischer Arbeiten steht die Isolierung von Mutanten. Diese treten spontan recht selten auf, weshalb man die Mutationshufigkeit knstlich erhht (induzierte Mutationen). Dies kann durch Rntgenstrahlung, durch Verfttern von Mutagenen oder durch besondere Kreuzungsanstze erreicht werden. In der Praxis ist es sehr wichtig, welche Methode benutzt wird. Zum einen knnen hierdurch die relativen Hufigkeiten der Mutationsarten (z.B. Transitionen, Translokationen, Deletionen, Insertionen) gezielt beeinflut werden, zum anderen ist es heute mglich, schon bei der Mutagenese das mutierte Gen so zu markieren, dass es spter einer molekulargenetischen Analyse gut zugnglich ist.

1.4.1.1 EMS als Beispiel fr ein chemisches Mutagen

Das am hufigsten benutzte Mutagen ist EMS = Ethylmethansulfonat, ein alkylierendes Reagenz: CH3-CH2-O-SO2-CH3 EMS kann folgende Effekte haben: a) Alkylierung des Sauerstoffs in der 6. Position in Guanin bewirkt Paarung mit Thymin. Daraus folgt eine Transition GC -> AT. b) Alkylierung von Thymin und Paarung mit Guanin. Daraus folgt Transition TA -> CG. c) Alkylierung des Stickstoffs in Position 7 von Guanin. Daraufhin lst sich die Base von der Deoxyribose (Depurination). Die Lcke kann in der nchsten Replikationsrunde mit einer beliebigen Base gefllt werden (Transitionen und Transversionen) oder die Lcke kann bersprungen werden -> Rastermutation.

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d) Indirekte Mutationswirkung durch Strung der DNA-Reparatursysteme. In der Laborpraxis hat sich gezeigt, dass EMS hauptschlich als Agens zur Erzeugung von Punktmutationen angesehen werden kann (Prozesse a und b). Beachtet werden mu, dass die Verftterung von EMS sehr hohe Mutationshufigkeiten hervorruft, bei 0.025 M Konzentration tragen die groen Chromosomen 2 und 3 etwa zu 60% letale Treffer, das kleinere XChromosom zu etwa 30%. Das bedeutet, dass nach der Selektion eines interessanten Phnotyps untersucht werden mu, ob nicht etwa eine Mehrfachmutation vorliegt. Eine sehr wichte Eigenschaft von EMS (die mit der Erzeugung von Punktmutationen in Zusammenhang steht) ist, dass etwa 5-10% der erzeugten Mutationen temperatursensitiv sind.

1.4.1.2 Rntgenstrahlung
Eine Mutagenese mit Rntgenstrahlen ist dann sinnvoll, wenn das Schwergewicht nicht auf Punktmutationen, sondern auf chromosomale Rearrangements (Deletionen, Inversionen, Translokationen) gelegt werden soll. Normalerweise reichen 3000-4000 rad fr ein Mutagenese Experiment. Hiermit werden 3-4 Tage alte Mnnchen bestrahlt. Hhere Dosen sind kontraproduktiv, da Sterilitt hervorgerufen wird.

1.4.1.3. Hybrid Dysgenese ('Natrliche' Mutagenese)

Herkmmliche Mutagenese-Methoden haben meist den Nachteil, dass der Mutationsort selbst nach genauer Rekombinations- und Deletionskartierung auf molekularem Niveau schwer festzulegen ist. Hier ist die Methode der Markierung des mutierten Gens mit einem Transposon eine elegante Lsung. Hufig haben sogenannte Spontanmutationen die Transposition mobiler DNA-Elemente als Grundlage. Bei Drosophila sind eine groe Zahl von Familien springender Gene bekannt. Hierzu gehren copia-, I-, hobo- und P-Elemente. Besonders die letzte Familie ist fr uns von Interesse (s. Abb.6). Kreuzungen zwischen Stmmen, die P-Elemente enthalten (PStmme), und solchen, die keine P-Elemente enthalten (M-Stmme), erzeugen eine hohe Frequenz mutierter Nachkommen, und zwar immer dann, wenn ein P-Mnnchen mit einem M-Weibchen gekreuzt wird. Dieser Vorgang wird Hybrid Dysgenese genannt. Der maternale Effekt deutet daraufhin, dass den M-Eiern ein Faktor fehlt, der normalerweise die Transposition der P-Elemente verhindert. Intakte P-Elemente bestehen aus einer 2.9 kB langen DNA mit invertierten Repeats (31 B) an ihren Enden. Sie codieren fr eine Transposase, die ihre Transposition katalysiert, und auch fr einen langlebigen Inhibitor, der dem entgegenwirkt. Der Inhibitor ist ein 66 kD Protein, das in Somazellen ausschlielich gebildet wird (so dass Transposition nur in der Keimbahn ablaufen kann). Das relativ stabile Verhalten der P-Elemente in P-Stmmen lt sich so erklren, dass hier gengend Inhibitor akkumuliert ist, um die Transposition zu verhindern (P-Zytotyp). Bei der Befruchtung eines M-Eis durch ein P-Spermium wird jedoch kein Inhibitor vorgefunden (M-Zytotyp). Die Produktion der Transposase lst ein Springen der P-Elemente aus, die Insertion eines Elementes innerhalb von Genen verursacht Mutationen. Erst nach einigen Generationen ist wieder gengend Inhibitor angesammelt, um den Genotyp zu stabilisieren.

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Tabelle 1 Diese Tabelle zeigt das Verhalten der Filialgeneration 1 (F1) aus den vier mglichen Kreuzungen von P oder M Weibchen mit P oder M Mnnchen an.

P-Stmme enthalten normalerweise nicht nur intakte, sondern auch viele defekte P-Elemente. Diese enthalten nur Fragmente der 2.9 kB DNA und sind nicht in der Lage, selbst fr die Transposase zu codieren. Wenn sie ihre invertierten Repeats erhalten haben, knnen sie jedoch durch Transposase mobilisiert werden. Von groem diagnostischem Wert fr die Frage, ob ein P- oder M-Stamm vorliegt, ist die Tatsache, dass in einer dysgenetischen Kreuzung die F1-Generation bei hohen Temperaturen (>230C) steril ist. Die F1-Sterilitt liegt an einer Entwicklungsstrung der Gonaden bei hohen Temperaturen.

Abb.7 F1-Sterilitt als diagnostischer Test auf P oder M Zytotyp. Wenn die Weibchen P-Elemente besitzen, sind Kreuzungen immer fertil.

Der Nutzen der P-Element Mutagenese ist in der Markierung der mutierten Gene mit einer schon bekannten DNA-Sequenz zu sehen (primre P-Element Mutagenese). Hiervon ausgehend knnen die Gene leicht kloniert werden. Die P-Elemente knnen, besonders wenn nicht durch Kreuzen mit P-Weibchen dafr gesorgt wird, dass mglichst bald der P-Zytotyp erreicht wird, auch wieder herausspringen. Hierbei kann das P-Element przise oder ungenau ausgeschnitten werden (sekundre PElement Mutagenese). Umgebaute P-Elemente werden in Drosophila als Vektoren verwendet, um beliebige klonierte Gene in die Keimbahn von Drosophila einzuschleusen.

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1.4.2. Mutantenselektion
Mutagenesen werden meist an Drosophila-Mnnchen durchgefhrt. Zwar fhren whrend der Spermatogenese die Mutagene auf allen Chromosomen zu Mutationen, in vielen Fllen gilt das Interesse jedoch zunchst nur einem einzigen Chromosom, auf das dann gezielt selektiert wird. Am einfachsten ist die Isolierung von X-chromosomalen Mutationen.

1.4.2.1. Mutantensuche auf dem X-Chromosom (vitale Allele)

Wrden die mutagenisierten Mnnchen mit normalen Weibchen gekreuzt, wren die (meist) rezessiven Mutationen in der F1-Generation unsichtbar. Deshalb verwendet man sogenannte attached-X Weibchen als Paarungspartner, die neben zwei verklebten X-Chromosomen ein Y-Chromosom besitzen. Das Prinzip einer attached-X Kreuzung ist im folgenden Schema dargestellt. In dem angegebenen Beispiel tragen die verklebten X-Chromosomen noch die rezessiven Marker y und w . Alle Shne mutagenisierter Mnnchen mit att-X Weibchen haben ein mutagenisiertes X' des Vaters erhalten. Diese X' sind aber wahrscheinlich alle verschieden mutiert; deshalb mu ein zweiter att-X Klonierungsschritt angehngt werden (falls fr innere, nur histologisch zugngliche Merkmale selektiert werden soll). Alle Shne (F2) dieser zweiten Kreuzung tragen das X'-Chromosom des fr die Weiterzucht benutzten F1-Mnnchens. Ein Teil der F2-Mnnchen kann fr die histologische Mutantensuche abgezweigt werden, der andere Teil dient der Stammerhaltung (siehe Abb.8).

Abb.8 Der Spezialeffekt einer att-X Kreuzung besteht darin, dass das X Chromosom des Vaters an alle Shne weitergegeben wird. Damit kann das vterliche X

vermehrt (d.h. kloniert) werden (s. auch nachfolgendes Schema zur Mutagenese).

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Abb.9 Die Isolierung struktureller Gehirnmutanten erfordert zwei aufeinanderfolgende attX-Kreuzungen. Das Mutagen ist nur whrend der Spermatogenese der Vter der ersten Generation wirksam. Die Kreuzung einzelner F1-Shne mit attX-Weibchen dient der Herstellung von Mnnchen mit identischen X-Chromosomen. Ein Teil kann der Histologie geopfert werden.

Die obige Vorgehensweise wird auch angewandt, wenn die mutagenisierten Mnnchen die F1-Generation einer dysgenetischen Kreuzung darstellen. Allerdings mu in diesem Fall dafr gesorgt sein, dass die attX-Weibchen den P-Zytotyp aufweisen, damit das P-Element nicht weiterwandert . Die dargestellte Methodik erlaubt die Identifizierung von strukturellen Gehirnmutanten, mit deren Hilfe dann Informationen ber Entwicklungsprozesse sowie ber Gehirnfunktionen (Verhalten) gewonnen werden knnen (s. Abb.14).

1.4.2.2. Mutantensuche auf dem X-Chromosom (letale Allele)

Die beschriebene Methode kann auch fr die Suche nach Gehirnmutanten bentzt werden. Sie fhrt zur Entdeckung derjenigen Teilmenge der Gene auf dem X-Chromosom, die die Gehirnentwicklung oder die Gehirnfunktion beeinflussen. Eine wichtige Frage ist, ob diese Gene nur fr das Gehirn Bedeutung haben oder auch anderswo im Organismus bentigt werden. Das genaue phnotypische Studium der Mutanten ist hier allein nicht ausreichend. Die in 1.4.2.1 beschriebene Methode selektiert fr vitale Allele auch lebensnotwendiger Gene. Diese schwachen Allele knnten eine lokalisierte, gehirnspezifische Wirkung des Genproduktes vortuschen. Um zu testen, ob von einem Gen auch letale Allele zu erhalten sind, drfen die mutagenisierten Mnnchen nicht mit att-X Weibchen gekreuzt werden (die hemizygoten Shne wrden ja absterben). Stattdessen werden sie mit Weibchen gekreuzt, die ein BalancerChromosom enthalten. Balancerchromosomen enthalten mehrere Inversionen, wodurch effektiv Rekombination verhindert wird. Sie werden also immer dann eingesetzt, wenn ein anderes Chromosom mglichst unverndert weiter vererbt werden soll. Gute autosomale Balancer tragen eine dominante Mutation zur Erkennung im heterozygoten Zustand einen rezessiven Letalmarker, und andere rezessive Marker. Gute X-chromosomale Balancer sollten den

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rezessiven Letalmarker durch eine rezessive, weibliche Sterilitt bewirkende Mutation ersetzt haben (damit hemizygote Mnnchen leben knnen), jedoch homozygot einen gravierenden Entwicklungsnachteil bewirken. Ein X-chromosomales Balancerchromosom ist z.B. FM7 ( F = First = X-Chromosom, M7 = 7 "multiple" inversions). Dieses X-Chromosom trgt multiple Inversionen, die effektiv Rekombination verhindern, die dominante Bar Mutation, die Schlitzugigkeit hervorruft, und die rezessiven Marker white (Augenfarbe) und forked (gegabelte Borsten). Die erste Eigenschaft erlaubt die Vererbung mutierter X-Chromosomen als Ganzes, da kein Stckaustausch mit dem FM7 Paarungspartner stattfindet. Die dominante Mutation und die rezessiven Marker erlauben die Unterscheidung des hetero- und homozygoten FM7 Zustandes. Im folgenden ist zunchst das Prinzip von FM7-Kreuzungen (s. Abb.10) und dann der Einsatz des Balancers bei der Selektion X-chromosomaler Letalallele dargestellt. Wenn aus dieser Kreuzung keine X*/Y Mnnchen hervorgehen, ist das X*-Chromosom offensichtlich letal. Es wird ein X*/FM7 x FM7/Y Stamm zur heterozygoten Weiterzucht etabliert. Durch Rekombinationskreuzungen oder durch Komplementationstests mit Deletionsstmmen mu noch untersucht werden, ob die Letalfunktion und das test -Allel auf dem X*-Chromosom identisch sind oder ob eine Doppelmutation vorliegt. Es besteht auch immer die Mglichkeit, dass die Letalitt der Mnnchen von einer Deletion hervorgerufen ist, die das interessante Gen, aber zustzlich auch noch andere Gene abdeckt.

Abb.10 Mit FM7 oder anderen Balancerchromosomen knnen Letalmutationen untersucht werden. Es gibt dann als Imagines nur FM7-Mnnchen und heterozygote FM7/X'-Weibchen. Die Wirkung der Letalmutation kann an Entwicklungsstadien der X'Y Individuen untersucht werden.

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1.5. Zelltypspezifische Genexpression

Den klassischen Genetikern hatte bereits das Studium der Riesenchromosomen (Kapitel 1.2) gezeigt, dass die Expression von Genen hochgradig reguliert ist, d.h. keineswegs werden in allen Zellen zu jeder Zeit alle Gene exprimiert. Im Gegenteil, verschiedene Zelltypen, der Differenzierungsgrad einer Zelle, sind ber die Expression spezifischer Stze von Genen definiert. Auch die Dynamik der Entwicklungsprozesse lt sich meist ber die Dynamik von Genregulation erklren. Hier ist nicht der Ort, um auf Genregulationsmechanismen im Detail einzugehen, aber folgendes Grundwissen sollte vorausgesetzt werden knnen: Jedes Gen umfasst nicht nur kodierende, sondern auch regulative Sequenzen. Diese sind der kodierenden Region auf dem kodierenden Strang der DNA meist in 5-Richtung vorgelagert und umfassen den Promotor und hiermit zusammenwirkende regulative Sequencen. So sind z. B. Enhancerelemente Bindestellen fr Transkriptionsfaktoren, deren kombinatorisches Zusammenwirken die zelltypspezifischen Expressionsmuster der Gene bewerkstelligen. Die Spezifitt von Enhancern wurde erstmals durch die Enhancer-Trap Methode in Drosophila sichtbar gemacht.

1.5.1. Die Enhancer-Trap Methode: Sichtbarmachung spezifischer Genexpression mit Reportergenen

Optimale Reportergene sind solche Gene, die ein Genprodukt herstellen, welches mit zellulren Funktionen nicht interferiert, das aber ber Antikrper oder ber seine enzymatische Aktivitt leicht nachweisbar ist. Ein solches Gen ist das bakterielle lacZ-Gen, das fr -Galaktosidase kodiert. Dieses Enzym spaltet normalerweise Lactose in Galactose und Glucose. Verwendet man das knstliche farblose Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-3indolyl--D-Galaktosid) entsteht durch die enzymatische Reaktion ein intensiv blaues Produkt. Die erstmals von Walter Gehring aus Basel bei Drosophila angewandte "Enhancer Trap"-Methode besteht darin, das lacZ-Gen zusammen mit einem sehr schwachen Promotor an zuflligen Stellen im Genom von Drosophila zu integrieren. Nur wenn der Insertionsort des Vektors zufllig in der Nhe eines Enhancers kommt, der die Transkription ankurbelte, wird das Reportergen exprimiert und X-Gal in diesen Zellen zum blauen Farbstoff umgebaut. Diese Enhancer Trap-Methode feierte groe Erfolge und fhrte allen die Spezifitt und die Vielfalt von Genexpressionsmustern vor Augen.

1.5.2. Gezielte Expression von klonierten Genen mit dem Gal4/UASSystem

Unverzichtbares Hilfsmittel der Entwicklungsgenetik sind inzwischen Methoden zur gezielten Expression geklonter Gene in spezifischen Zelltypen und Geweben geworden. Bei Drosophila wurde die sogenannte Gal4/UAS-Technik zuerst zur Routinemethode entwickelt. Gal4 ist ein Transkriptionsfaktor der Hefe, der dort spezifisch solche Gene aktivieren kann, die eine sogenannte Upper Activating Sequence (UAS) in der 5-Region der codierenden Gensequenz besitzen. Beide Komponenten kommen normalerweise in Drosophila nicht vor, weshalb sich dieses System hervorragend eignet, um ein Zweikomponenten-Expressionssystem fr beliebige klonierte Gene aufzubauen.

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Abb.11 Schematische Darstellung der ektopischen Genexpression mit dem GAL4/UAS-System. Zwei transformierte Fliegen, von denen eine das gal4-Gen unter der Transkriptionskontrolle eines Drosophila-Enhancers exprimiert, und die andere das zu exprimierende Gen mit dem Hefe UASEnhancer besitzt, werden miteinander gekreuzt. In der F1-Generation exprimieren alle Zellen, in denen sich GAL4 anhuft, das Gen X.

Das Gal4-Gen sowie die UAS-Sequenz vor einem beliebigen klonierten Gen X stehen in unterschiedlichen transformanten Drosophilastmmen zur Verfgung und werden mit einander gekreuzt. Erst in der F1-Generation gibt es eine Wirkung: der Gal4Transkriptionsfaktor aktiviert in den Zelltypen, in denen er exprimiert wird, das Gen X. Gen X kann ein einfaches Reportergen sein, dessen Expression die Zellen, die Gal4 exprimieren, sichtbar macht, oder Gen X kann fr ein toxisches Produkt kodieren, welches die gal4 exprimierenden Zellen abttet oder Gen X kann ein beliebiges Effektorgen sein, dessen Wirkung man in den gal4 exprimierenden Zelltypen testen mchte. Den Drosophilisten stehen inzwischen groe Kataloge spezifischer Gal4- und UAS-Stmme zur Verfgung. Der groe Vorteil des Zweikomponenten-Systems wird dann deutlich, wenn bedacht wird, dass durch die Kombination von 1000 Gal4-Stmmen und 1000 UAS-Stmmen bereits 1 Million Experimente mglich sind. Letztlich ist durch einfache Kreuzungen und Analyse der F1-Generationen die Expression beliebiger Gene in definierten Zelltypen mglich. Die Zelltypspezifitt des Gal4-Stamms kann das Ergebnis eines Enhancer-Traps sein oder das gezielte Ergebnis der Verwendung eines bekannten Promoters.

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1.6. Das Nervensystem von Drosophila

Drosophilaembryonen bilden ein Strickleiternervensystem aus, d.h. die bilateralsymmetrisch verteilten segmentalen Ganglien sind in der Lngsachse ber Konnektive und innerhalb der Segmente ber Kommissuren verbunden. In den Konnektiven und Kommisuren verlaufen die Axone der Nervenzellen. Schon im Embryo ist dieses Grundmuster jedoch im Kopfbereich kaum noch erkenntlich, da hier die Ganglien von Segmenten oberhalb und unterhalb des Schlundes zum Gehirn verschmolzen sind. Auch im Bereich des Bauchmarks erfhrt die ursprngliche Strickleiter eine starke Kondensierung, so dass in Larven das ventrale Nervensystem als ventraler Zapfen vorliegt. Das Gehirn besteht in den Larvenstadien aus zwei Halbkugeln, die jeweils peripher auch die Anlagen fr die optischen Loben enthalten, in den die Retinulazellen aus der Augenimaginalscheibe einwachsen. Whrend der Metamorhose zum flugfhigen Insekt erfhrt das Gehirn dramatische Umbauten. Die Gestaltsnderungen des ZNS sind in der folgenden Abbildung skizziert:

A. Bauchansicht

B. Seitenansicht

Abb.12 Embryonales Strickleiternervensystem

A. Farbinvertiert

B. Auflicht Abb. 13 ZNS der Larve (schrg seitliche Ansicht: Gehirnhemisphren links, Bauchmark rechts). A. Farbinvertiert wie in B Auflicht Prparation.

Abb.14 Adultes Gehirn Vorderansicht. Lateral sind die Corneae der Komplexaugen sichtbar. Der Kopf ist mit Gehirn ausgefllt!

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Abb.15 Neurogenetischer Ansatz: Durch den Vergleich der Entwicklung wildtypischer und mutierter Gehirne wird Information ber Entwicklungsprozesse und die Rolle der mutierten Gene hierbei gewonnen. Der Funktionsvergleich wildtypischer und mutierter Gehirne kann zudem genutzt werden, um Wissen ber Gehirnfunktionen zu erwerben.

2 Praktische Arbeiten im Kurs

Aufgabe 1. Frbung des larvalen Gehirns mit der bakteriellen -Galaktosidase
Spezielle Vorbemerkung: Aus technischen Grnden muss mit diesem Versuch begonnen werden, da er eine zweistndige Inkubationszeit der prparierten Gehirne beinhaltet. Um den Tierverbrauch zu senken, wollen wir nicht nur die Gehirne studieren, sondern den gleichen Larven auch die Speicheldrsen entnehmen. Diese mssen feucht auf den dafr vorgesehenen Objektrgern aufbewahrt werden, bis dass dieser Versuch Nr.2 besprochen worden ist!! Ziel von Versuch 1: Demonstration der Ntzlichkeit transformanter Fliegenstmme, insbesondere hier: Sichtbarmachung spezifischer Genexpression im ZNS von Drosophila. Tiermaterial: Larven des Enhancerstamms MBEnh-lacZ (MB = Mushroom Body = Pilzkrper; Enh = Enhancer; lacZ = Gen fr -Galactosidase aus E. coli). Die lacZ-Frbung der Gehirne dieser transformanten Fliegenlarven (s. Abb. 13) ist auf die Pilzkrper beschrnkt, wichtige paarige Strukturen im Fliegengehirn, die u.a. fr Lernprozesse und Sexualverhalten von Bedeutung sind (s. Wikipedia).

Ttigkeiten: Prparation und Frbung von Larvengehirnen

- Kleine, runde Petrischale in die mit Eis bedeckte quadratische Petrischale stellen

- PBS-Pufferlsung in die kleine Schale fllen. Der Boden soll gut bedeckt sein. - L3-Larven in PBS tauchen - Mit der Pinzette die Larve in der Krpermitte packen - Mit der anderen Pinzette die Larve an den schwarzen Mundwerkzeugen packen und den Kopfteil vom Krper wegziehen. (Hierzu wird ein Film gezeigt). - Gehirn und Speicheldrsen freiprparieren. (Hierzu wird ein Film gezeigt). - Zur spteren Frbung werden die Speicheldrsen auf einen Objekttrger mit einem Tropfen PBS berfhrt (sie drfen nicht austrocknen)! - 100l PBS in Eppenddorf-Gef (Eppi) vorlegen

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- Gehirn mit Zapfen (kurz Gehirn genannt, s. Abb.13) mit Eppendorf-Pipette (Vol. 3l) aufsaugen und in Eppi berfhren. Um hierbei das Ankleben der Gehirne an der Pipettenwand zu verhindern, die Pipette vorher einmal ohne Gehirne vollziehen und wieder leeren. Dabei die Pipette in PBS eintauchen und im Gegenlicht beobachten, dass das Gehirn nicht an Pipettenwand kleben bleibt
- Mindestens 3 Gehirne in PBS-Eppi sammeln, da erfahrungsgem viele Gehirne verloren gehen. - Gehirne absinken lassen und PBS vorsichtig mit Eppenddorf-Pipette absaugen - 90l Frbepuffer zugeben - 10l 2% X-Gal-Lsg. dazugeben - bei 37C ca. 2 Stunden inkubieren Nicht vergessen: Eppi beschriften!! Unter dem Bino oder Mikroskop kann die Blaufrbung des Gehirns in der lacZ-Linie beobachtet werden. Mit dem konfokalen Mikroskop aufgenomme Bilder vom Drosophilagehirn werden ergnzend in einer PowerPoint-Prsentation gezeigt.

Aufgabe 2. Riesenchromosomen
Ziel von Versuch 2: Kennenlernen der Riesenchromosomen als Spezialanpassung sekretorischer Zellen. Demonstration der Sichtbarmachung spezifischer Genexpression und von Chromosomenmutationen mit Hilfe der Riesenchromosomen. Material: Sie untersuchen die larvalen Riesenchromosomen aus den Speicheldrsen des zuvor prparierten lacZ-Stammes. Auf der Ebene der Riesenchromosomen kann dieser Stamm als "wildtypisch" angesehen werden. Mglichst die in Versuch 1 isolierten Speicheldrsen verwenden, falls diese nicht eingetrocknet sind, ansonsten ist die Neuprparation der Speicheldrsen (Schritt 1 unten) unvermeidlich. Ttigkeiten: 1. Auf einem sauberen Objekttrger Speicheldrsen aus Drosophila-Larven entsprechend den Anweisungen des Kursleiters aus Larven herausprparieren, freilegen und die brigen Larventeile entfernen; dabei ebenso wie bei den folgenden Prparationsschritten darauf achten, dass die Speicheldrsen nicht austrocknen. 2. Auf die freigelegten Speicheldrsen 1-2 Tropfen Karmin-Essigsure geben und 10 min einwirken lassen. 3. berschssige Karmin-Essigsure bis auf einen kleinen, die Speicheldrsen einschlieenden Rest mit Filtrierpapierstreifen absaugen, dann sofort OrceinEssigsure-Milchsure auf das Prparat geben; nach 10 min Deckglas auflegen und vorsichtig, aber krftig andrcken.

4. Mikroskopische Untersuchung der Riesenchromosomen mit Skizze des X-Chromosoms (dessen spezielle Form wird an der Tafel angezeigt). Lassen Sie sich beim Mikroskopieren Zeit. Tauschen Sie mit Nachbargruppen Ihre besten Prparate.

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Fragen und Aufgaben: - Wie knnten Sie an den Riesenchromosomen erkennen, ob sie ein mnnliches oder weibliches Tier prpariert haben? - Lokalisieren Sie markante Puffs, den Nukleolus, und das Chromozentrum.

Aufgabe 3. Studium von Balancerstmmen

Ziel des Versuchs: Kennenlernen wichtiger adulter Phnotypen, von Balancer Chromosomen und die Unterscheidung der Geschlechter bei adulten Fliegen. Besprechung des Einsatzes von Att-X Stmmen. Tiermaterial: Sie erhalten Fliegen eines attX- und eines eines FM7-Stammes. - Beschreiben sie detailliert die jeweils vorgefundenen Phnotypen. Werten Sie eine gengend groe Stichprobe aus, um statistisch gesicherte Schlsse ziehen zu knnen. Erstellen Sie sich Schemata fr die Auswertung: attX-Stamm
Rote Augenfarbe Weisse Augenfarbe

Mnnchen

Weibchen

Bei dem ausgeteilten Fliegenstamm sind die Weibchen weiugig und die Mnnchen rotugig. Beachten Sie, dass Weibchen einen gestreiften Hinterleib besitzen, whrend die etwas kleineren Mnnchen Geschlechtskmme an den Tarsen der Vorderbeine aufweisen und im letzten Drittel des Hinterleibes schwarz gefrbt sind (siehe Titelblatt). Die Geschlechtskmme der Mnnchen sind dasjenige Merkmal, welches Sie bei der folgenden Auswertung des FM7-Stammes zur Geschlechtsbestimmung verwenden sollten, denn dort gibt es sowohl wei als (vielleicht) auch rotugige Mnnchen.

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FM7-Stamm

Die dominante Bar-Mutation bewirkt nierenfrmige Augen. Dies ist besonders bei hemizygoten Mnnchen ausgeprgt, aber auch heterozygot Bar-ugige Weibchen haben keine runden Augen, sondern deutlich gekerbte Augen (entgegen dem Schema der Abb.10 ist die Kerbe jedoch anterior ausgeprgt!). Komplexauge: rot/Bar Mnnchen Komplexauge: rot/normal Komplexauge: wei/Bar Komplexauge: wei/normal

Weibchen

- In welchem Verhltnis treten die Geschlechter und die mutanten Merkmale auf? - Welche Merkmale treten nur gemeinsam auf? - Wofr werden die einzelnen Stmme bentzt?

Aufgabe 4. Monohybrider Erbgang

Ziel der Aufgabe: Anwendung vorhandenen Wissens auf X-chromosomale Erbgnge. Bitte fhren Sie folgende Kreuzungen auf dem Papier durch: Kreuzung A: reinerbige weiugige Weibchen mit rotugigen Mnnchen Kreuzung B: reinerbig rotugige Weibchen mit weiugigen Mnnchen (die rezessive Mutation w - fr Weiugigkeit ist X-chromosomal) Kreuzung A: Parentale Genotypen: Genotypen der mglichen Gameten: Genotypen der F1-Generation: Phnotypen in der F1: deren Gameten: Genotypen der F2-Generation: Phnotypen:

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Kreuzung B: Parentale Genotypen: Genotypen der mglichen Gameten: Genotypen der F1-Generation: Phnotypen in der F1: deren Gameten: Genotypen der F2-Generation: Phnotypen: - Wie unterscheiden sich die reziproken Kreuzungen in der F1, in der F2? - Welche der Mendelschen Regeln haben Sie gerade getestet? - Sind die quantitativen Abweichungen von den erwarteten Zahlenverhltnissen nur statistischer Natur? - Worauf wrden Sie schlieen, wenn ein Phnotyp zu selten auftritt?

Zum Abschluss einige Webadressen zum Selbststudium:

Biologie Freiburg: Fischbach Labor: Flybrain: Berkeley Genomeproject Flybase Flybase (Europe): FlyMove ZUM Internet e.V. http://www.biologie.uni-freiburg.de/ http://filab.biologie.uni-freiburg.de http://www.flybrain.org http://www.fruitfly.org/index.html http://flybase.bio.indiana.edu/ http://fly.ebi.ac.uk:7081/ http://www.flymove.de http://zum.de ---> Biologieportal anwhlen

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Molekulargenetische Untersuchung von Stammzell-Nischen bei Arabidopsis thaliana

Prof. Thomas Laux und Dr. Edwin Groot Molekulare Genetik und Biotechnologie der Pflanzen
E-Mail: edwin.groot@biologie.uni-freiburg.de www.biologie.uni-freiburg.de/LauxLab/

Einleitung
Stammzellen sind pluripotente, relativ undifferenzierte Zellen, die differenzierende Tochterzellen produzieren und sich zum anderen selbst erneuern. Bei Tieren haben sie die Aufgaben, "sich verbrauchende" Gewebe, wie z.B. Epidermis, Blutzellen oder Keimzellen, zu regenerieren. Wegen der Mglichkeit, verletztes Gewebe, wie z.B. Muskeln oder selbst Nervengewebe, zu ersetzen, besitzen Stammzellen groe Bedeutung in der medizinische Forschung. Die Funktionen der Stammzellen in den Meristemen der Pflanzen gehen sogar noch weiter: sie produzieren die Zellen, aus denen vollstndige neue Organe wie Bltter und Blten entstehen. Die Stammzellen der Pflanzen haben eine groe Bedeutung fr die Biotechnologie, da sie die asexuelle Regeneration von Pflanzenspezies erlauben, bei denen herkmmliche Regenerationstechniken nicht mglich sind, und da sie erlauben Gre, Wachstum und Statur einer Pflanze zu beeinflussen. Wie wird der undifferenzierte Status der Stammzellen aufrechterhalten, und wie wird die Gre einer Stammzellpopulation reguliert? Eine allgemeine Hypothese ist, dass sich Stammzellen in bestimmten Nischen des Krpers befinden, in die die Nachbargewebe Signale abgeben, welche die Differenzierung unterdrcken. Bislang gelang jedoch der Nachweis eines solchen Mechanismus nur in wenigen Fllen wie z.B. im Spromeristem von Arabidopsis thaliana:

Arabidopsis Keimling: In den Meristemen Wachstumspole befinden Stammzell-Populationen

der sich

Arabidopsis Spromeristem Die Stammzellen befinden sich an der Spitze des Spromeristems (dunkelgrauer Bereich). PZ, Periphere Zone; RZ, Rippenmeristem; L1L3: Zellschichten des Spromeristems. Das WUSCHEL (WUS)-Gen wird direkt unterhalb der Stammzellen exprimiert, in dem sogenannten Organisierendem Zentrum (OZ, hellgrauer Bereich).

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Experimente
Achtung! Bitte behandeln Sie alle Pflanzen pfleglich, da diese an den anderen Kurstagen wieder verwendet werden mssen! Experiment 1: Charakterisierung von Spromeristem-Mutanten
Sie haben sich zum Ziel gesetzt, die Regulation von Stammzellen bei Pflanzen zu untersuchen und haben dazu mehrere Kandidaten fr Mutanten des Spromeristems isoliert, die Sie nun genauer charakterisieren wollen. Sie erhalten 4 Tpfe mit etwa 10 Tage alten Arabidopsis thaliana Keimlingen:
Beschriftung WT wus-1 (wuschel): zll -3 (zwille): stm-5 (shootmeristemless) Bemerkungen Nachkommen einer wildtypischen Pflanze Nachkommen einer heterozygoten wus/WUS Pflanze Nachkommen einer homozygoten zll/zll Pflanze Nachkommen einer heterozygoten stm/STM Pflanze

Anmerkungen zur Gen-Nomenklatur: Fr jeden Modellorganismus haben die Genetiker ihre Eigenheiten bei der Nomenklatur. Fr Arabidopsis gelten folgende Regeln: mutante Allele werden immer klein und kursiv angegeben und erhalten eine fortlaufende Nummer, um sie eindeutig zu kennzeichnen (z.B.wus-1), Wildtyp-Allele schreibt man kursiv mit Grobuchstaben (WUS ) oder kurz mit einem +. Meint man das Protein, so schreibt man groe und normale Buchstaben (WUS).

+/- +/-

+
+ -

+/+ -/-/- +/+/- +/+ +/+ +/+/- -/-

+ -

+/+ +/+/-/-

+/-

Arabidopsis ist selbstbestubend . Dargestellt ist die Kombination der Gameten, die bei Selbstung einer Pflanze eintritt, die heterozygot fr eine Mutation ist.

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Aufgaben: 1) Untersuchen Sie die mutanten Defekte. Dazu zeichnen sie bitte sorgfltig (!) fr jeden Topf jeden Keimlingstyp, der darin vorkommt einmal ab. Beginnen Sie mit WT, dann fahren Sie mit wus und zll und stm fort. 2) Notieren Sie per Strichliste, wie oft jeder Keimlingstyp in jedem Tpfchen vorkommt. 3) Fassen Sie ihre Ergebnisse mit den Nachbarn in ihrer Bankreihe zusammen.

Beantworten Sie bitte folgende Fragen: 1) Welche Phnotypen sehen Sie? 2) Wie oft treten diese auf? 3) Welcher Phnotyp ist der einer Mutante? 4) Wie werden die Mutationen vererbt (rezessiv/dominant)? 5) Entwickeln Sie auf Grund Ihrer Ergebnisse ein Modell fr die Rolle der betroffenen Gene.

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Experiment 2: Genetische Interaktionen der Gene

Bei Entwicklungsprozessen wirken Genprodukte in Netzwerken, die man durch Analyse von Doppelmutanten aufklren kann. Hierbei zeigt sich, ob die untersuchten Gene unabhngig voneinander wirken (Additivitt) oder ob die Wirkung eines Gens A fr die Wirkung eines Gens B notwendig ist (Epistasie). Besonders aussagekrftig sind dabei Doppelmutanten-Analysen, bei denen die untersuchten Einzelmutanten zueinander antagonistische Phnotypen zeigen. Verhlt sich hier der Phnotyp einer Mutation epistatisch gegenber dem Phnotyp der anderen Mutation, so kann man przise Hypothesen ber die Wirkung der Gene aufstellen (siehe dazu Schema unten)

Additiver Phnotyp (Merkmale beider Einzelmutanten)

Epistasie (Doppelmutante sieht aus wie eine der Einzelmutanten)

Keine Interaktion A B A B

Interaktion A B

Additiver Phnotyp Positive Wirkung: hnlicher Phnotyp der Einzelmutanten Repressive Wirkung: Entgegengesetzter Phnotyp der Einzelmutanten

Doppelmutante sieht aus wie: b a

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Durchfhrung Sie wollen untersuchen, ob das Gen A mit anderen bereits bekannten Genen zusammenwirkt. Dazu haben Sie a Mutanten mit einer weiteren Mutante b gekreuzt. Im Versuch sollen Sie nun die Phnotypen der Einzelmutanten und der Doppelmutanten untersuchen und daraus ein Modell fr die genetischen Interaktion ableiten. Sie erhalten drei Tpfe mit Keimlingen:
Beschriftung a b ab Bemerkungen Einzelmutante in Locus A Einzelmutante in Locus B Doppelmutante

Untersuchen sie die Tpfe in dieser Reihenfolge.

Aufgaben: 1) Untersuchen sie die bitte die mutanten Defekte. Zeichnen Sie bitte sorgfltig jeden Pflanzentyp einmal ab. 2) Notieren Sie, wie oft jeder Typ in den Tpfen vorkommt. 3) Fassen Sie ihre Ergebnisse mit denen ihrer Bankreihe zusammen. Beantworten Sie bitte folgende Fragen: 1) Welche mutanten Defekte sehen sie? Wie unterscheiden sich a und b Pflanzen? Gehen die Defekte in hnliche oder in unterschiedliche Richtungen? 2) Welcher Anteil der Pflanzen zeigt den jeweiligen Phnotyp? 3) Wie sieht die Doppelmutante aus? 4) Wie wirken die beiden Gene zueinander (anhand des Schemas auf die vorherige Seite)?

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Experiment 3: Expression des WOX5::GUS-Reportergens in Wurzelmeristemen

Die Wurzelmeristem ist im Vergleich zum Spromeristem ein Stammzellsystem mit einem sehr regelmigen Aufbau. Im Mittelpunkt des Wurzelmeristems befinden sich die vier Zellen des Ruhenden Zentrums (RZ), die teilungsinaktiv sind.
Stele Endodermis Cortex Epidermis laterale Wurzelhaube

Ruhendes Zentrum (quiescent centre)

Columella

Um das Ruhezentrum herum gruppieren sich die Stammzellen, die nach stereotypen Zellteilungen die verschiedenen Gewebe der Wurzel hervorbringen. Zerstrt man eine einzelne Zelle des RZ durch Laserablation, so geht der Stammzell-Status der direkt benachbarten Initial-Zelle verloren. Deshalb geht man davon aus, dass vom RZ Signale ausgehen, die die benachbarten Stammzellen kontollieren. Der Aufbau der Stammzellnische im Wurzelmeristem ist deshalb hnlich der im apikalen Spromeristem.

Um zu untersuchen ob beide Stammzellnischen einen gemeinsamen Ursprung in der Evolution haben, suchen wir nach konservierten genetischen Mechanismen bei der Stammzellregulation. Dazu wurden Arabidopsis-Datenbanken nach Genen abgesucht, die homologe DNASequenzen zum WUSCHEL (WUS) -Gen aufweisen. Ein solches WUS verwandtes Gen ist das WOX5 Gen. Um zu berprfen ob das WOX5 Gen eine Funktion bei der Stammzellregulation in der Wurzel haben knnte, wollen wir die Expression von WOX5 untersuchen.

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Durchfhrung
In diesem Experiment werden transgene Pflanzen analysiert, bei denen der WOX5Promotor transkriptionell an GUS cDNA fusioniert ist (Schreibweise: WOX5::GUS. Sprechweise:GUS unter Kontrolle des WOX5 Promotors) . GUS (-Glucuronidase) ist ein Reporterprotein, dessen Vorhandensein in Zellen sich durch Blaufrbung mit dem Substrat X-Gluc nachweisen lsst. Die Reporter-Konstrukte knnen somit als Zellmarker verwendet werden.

Frbung auf GUS-Aktivitt

Es werden Agarplatten mit 5-8 Tage alten Keimlingen ausgeteilt, die das WOX5::GUS Transgen tragen.

Pro Zweiergruppe:
Zupfen Sie mit der Pinzette vorsichtig etwa 10 Keimlinge von den Medienplatten. Geben sie diese in ein 2ml Eppi mit 200 l GUS-Frbepuffer, zu dem bereits X-Gluc auf 2 mM Endkonzentration gegeben wurde. Markieren Sie die Eppis deutlich mit ihren Initialen, damit Sie sie spter wiederfinden. (optional: Proben in der SpeedVac evakuieren, so dass sich das Gewebe mit der Frbelsung voll saugt und die Keimlinge nach unten sinken). ca 2-3 h lichtgeschtzt bei 37 C inkubieren. Keimlingswurzeln unter dem Mikroskop betrachten: Legen Sie dazu einen Tropfen 50% Glycerin auf einem Objekttrger vor und bringen sie vorsichtig Keimlinge mit einer Pinzette in den Tropfen ein. Legen Sie mglichst luftblasenfrei ein Deckglas darauf.

Material:
GUS-Frbepuffer: 100 mM NaPO 4 , pH 7.2 0,2% Triton X-100 5 mM Kaliumhexacyanoferrat 5 mM Kaliumhexacyanoferrit Auswertung: 1) Wo findet sich Blaufrbung? Bitte zeichnen sie sie die Wurzel nach Betrachtung der Frbung unter dem Mikroskop? 2) Zeigen alle Wurzeln, die sie gefrbt haben, Blaufrbung? Wenn nicht: welche Erklrung wrde sich dafr finden ? 3) Was schlieen Sie aus Ihren Ergebnissen fr die Konservierung molekulare Mechanismen und die Evolution der Stammzellnischen in Pflanzen? X-Gluc Stammlsung ist 50 mM.

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