AVALIAO DA VIABILIDADE DAS BACTRIAS LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS E BIFIDUMBACTERIUM BIFIDUM EM QUEIJO MINAS FRESCAL PRODUZIDO A APRTIR DE RETENTATOS.

Tamy Cristina Gonalves de Lima;Andreza Olira;; Eliana Paula Ribeiro Aluna de Iniciao Cientfica da Escola de Engenharia Mau (EEM/CEUN-IMT); Professora Titular da Escola de Engenharia Mau (EEM/CEUN-IMT). Resumo. Este trabalho teve por objetivo avaliar o pH, a textura e a sobrevivncia das bactrias probiticas L. acidophilus e B. bifidum em queijo minas frescal produzido a partir de retentados, obtidos por ultrafiltrao de leite, e a influncia do tipo de acidificao na atividade destas bactrias. Foram avaliadas 03 formas formas de acidificao: adio direta .de de cido ltico (QA) e fermento ltico nas concentraes de 1,0% (QB) e 0,5 % (Q.C) . A viabilidade das bactrias probiticas foi determinada por meio de anlises microbiolgicas realizadas durante o tempo de armazenamento por 30 dias a 5 C. Os resultados obtidos mostraram que a acidificao pelo cido ltico ou pelo fermento ltico no exerceu influncia significativa (p > 0,05) na populao de Lactobacillus acidophillus e de Lactobacillus cremoris mantndo-se a 106 nos 3 queijos durante a vida de prateleira, porm influenciou a populao de Bifidumbacterium bifidum (p < 0,05). Para este microorganismo a populao microbiana manteve-se em 106 no QA, 107 no QB e 108 no QC. Os valores de pH determinados foram 6,5 0,1; 5,3 0,1; e 5,3 0,2 para os queijos QA, QB e QC respectivamente. O tipo de acidificao utilizado influenciou na variao de pH ao longo do armazenamento (p < 0,05) mas no influenciou na textura (p>0,05). Introduo O pas caminha velozmente rumo a um perfil demogrfico cada vez mais envelhecido. ntido o envelhecimento demogrfico visto que a taxa de fecundidade total est decaindo e que os idosos representam 9,1% (14,5milhes). Em 2008, para cada grupo de 100 crianas de 0 a 14 anos existem 24,7 idosos de 65 anos ou mais. Em 2050, o quadro muda e para cada 100 crianas de 0 a 14 anos existiro 172, 7 idosos. (IBGE, 2010). No perodo de 1970 a 2000, o crescimento em pases desenvolvidos foi de 54%, j em pases em desenvolvimento atingiu 123% (ONU, 2010). geralmente no grupo da terceira idade que ocorre um acmulo de casos de enfermidades crnicas. O desenvolvimento de tais enfermidades, associado s mudanas sociais psicolgicas, fisiolgicas e metablicas, inerentes ao processo de envelhecimento, pode contribuir de forma negativa no estado nutricional do idoso (Frank & Soares, 2002; Abreu, 2002; Campos, 2000). A combinao de Lactobacillus acidophilus e Bifidobacteirum bifidum na dieta de idosos com desordem intestinal apresentou resultados positivos. Pode-se notar a restaurao da flora bacteriana e melhoras dos sintomas clnicos. Encontrado em diversos alimentos, o amido a mais importante fonte de carboidratos da dieta. Potencialmente digervel pelas enzimas no trato gastrintestinal, absorvido na forma de glicose no intestino delgado. Apesar disso, quantidade significativa de amido pode escapar a esta digesto, alcanando o clon, onde fermentado pela flora bacteriana. Esta frao, conhecida como amido resistente, tem sido intensamente estudada nos ltimos anos devido aos potenciais benefcios sade humana. (Walter, Silva, Emanuelli, 1995). Na ultrafiltrao de leite a frao proteica e a gordura so retidas, enquanto a lactose, sais minerais, nitrognio no proteico e outros componentes menores so eliminados junto com a gua no permeado. Minerais tais como clcio, magnsio, fsforo esto presentes em duas formas: parcialmente ligados protena do leite e parcialmente em soluo. Durante a ultrafiltrao a forma ligada retida pela membrana e concentrada, enquanto a outra passa

atravs da membrana, de modo que uma concentrao constante mantida na fase aquosa do retentado (Ribeiro, 1996). Utilizando ultrafiltrao possvel preparar queijo minas frescal com caractersticas prprias e coagul-lo diretamente na prpria embalagem (Van Dender, 1995). Alm das vantagens econmicas de alto rendimento, a enformagem do queijo diretamente na embalagem de comercializao propicia uma garantia higinica suplementar ao consumidor, j que elimina os riscos de contaminao associados manipulao, aumentando, assim a vida til do produto em relao aos existentes atualmente (Vieira, 2011). No Brasil, existem algumas empresas produzindo queijo minas frescal utilizando o processo de ultrafiltrao sendo que uma delas produz desde 1988. Com a finalidade de a necessidade dos idosos, o objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade das bactrias probiticas L. acidophillus e B. bifidus, a textura e a variao do pH durante 30 dias de armazenagem a 5 C em um queijo Minas frescal simbitico produzido por ultrafiltrao e enriquecido em zinco e vitaminas E, K e B6. Material e Mtodos O leite integral pasteurizado foi aquecido at 55 C em um pasteurizador Tetra Hoyercom capacidade de 100 L, modelo Mix Complet 100, dotado de agitador e sistemas de aquecimento e resfriamento e em seguida, concentrado em uma unidade de ultrafiltrao Tetra Alcross MF1, com uma membrana mineral tubular de xido de zircnio com suporte de carbono grafite, rea de 0,2 m2 e dimetro dos poros de 0,1 m.O leite foi concentrado at o fator de concentrao volumtrica de 5:1. A temperatura do leite foi mantida a 55 C e os valores da presso de entrada e sada do retentado foram 343 KPa e 264,8 KPa respectivamente, mantendo a presso da transmenbrana constante a 78,4 KPa durante o processamento. O retentato obtido foi aquecido at 68 C por 2 min. e resfriado a 45 C. Em seguida, foi separado em trs partes iguais (QA, QB e QC) para adio dos ingredientes de cada formulao, conforme Tabela 1. A mistura foi realizada com o auxlio de um homegeneizador ULTRA TURRAX e em seguida os queijos foram acondicionados em potes plsticos de 250 Ml com tampa e armazenados a 5 C. Anlises Fsico Qumicas a) Determinao de pH Foram realizadas determinaes de pH em quadruplicadas nos queijos utilizando-se um potencimetro Micronal modelo B374, conforme metodologia descrita por Silva et. al. (1997). b) Determinao da textura A textura foi avaliada por meio dos parmetros de relaxao e ruptura de acordo com Silva et. al (1997), utilizando-se o texturmetro modelo TAXT2 (Texture Profile Analyser Stable Micro Systems) .A coleta de dados foi realizada por meio da utilizao do software XY/ Texture Analyser. O perfil da textura ser realizado segundo a metodologia descrita por Rapacci (1997) e Silva (2002). No teste TPM Ruptura utilizou-se um probe acrlico com 30 mm de dimetro e os valores dos parmetros para distncia que o dispositivo penetra foi de 8 mm a partir da superfcie do queijo, 2,0 mm/s para velocidade, 0,98 N para fora de contato e 300 s para tempo. Para TPA Relaxao utilizou-se um probe acrlico com 30 mm de dimetro e os valores dos parmetros para distncia que o dispositivo penetra foi de 8 mm a partir da superfcie do queijo, 2,0 mm/s para velocidade, 0,98 N para fora de contato e,300 s para tempo,

Tabela 1: Ingredientes utilizados na elaborao dos queijos QA, QB e QC. Ingredientes Retentado Sal (NaCl) Coalho Cloreto de clcio Zinco (20% de pureza) Vitamina B6 (100% de pureza) Vitamina E (50% de pureza) Vitamina K (5% de pureza) Hi-Maize-260 cido ltico Fermento lctico Lactobacillus acidophilus LA-5 Bifidobacterium Bb-12 Anlises Microbiolgicas Foram determinadas as contagens de Lactobacillus acdophillus , bifidumbacterium bifidum e Lactobacillus cremoris (Danisco) nos queijos A (QA), B (QB) e C (QC), durante a vida de prateleira (1,9,14 ,21 e 28 dias) a 5 C. Foram coletadas pores de 10 g coletadas assepticamente, com uma esptula esterilizada, em cada embalagem e homogeneizadas em 90 mL de soluo salina 0,1% (diluio 10-1 ) no homogeneizador Stomacher 400. A partir desta diluio foram realizadas diluies decimais para ter uma contagem mnina ma placa de petri de 30 colnias pelo contador eletrnico (Phoenix CP600). Contagem de Lactobacillus acidophilus A enumerao Lactobacillus acidophilus foi feita em duplicata de acordo com as diluies adequadas. A determinao de colnias foi realizada pelo plaqueamento por superfcie, inoculando 0,1 mL, com auxlio de uma ala de Drigaulski, em placas de Petri com o meio de cultura MRS (De Man, Rogosa e Sharpe) gar. As placas, em duplicata, foram incubadas em jarras de anaerobiose, contendo o gerador de anaerobiose Anaerogen (Oxid) a 43 C por 72 horas em estufa (Fanen 002 Cb) como descreve Jurkiewicz, (1999). A confirmao das colnias realizou-se em observao microscpica da morfologia. Contagem de Bifidumbacterim bifidum A enumerao de Bifidumbacterim bifidum foi feita em duplicata de acordo com as diluies adequadas. Inoculou-se 0,1 mL das respectivas diluies pelo mtodo de plaquemento por profundidade e adicionou-se o meio de cultura MRS (De Man, Rogosa e Sharpe) gar com as solues de 5% de A,10 % de B e 5% de C. As placas, em duplicata, foram incubadas em jarras de anaerobiose, contendo o gerador de anaerobiose Anaerogen (Oxid) a 37 C por 72 horas em estufa (Fanen 002 Cb) conforme descrito por Franco et. al., (1996). A confirmao das colnias realizou-se em observao microscpica da morfologia. Solues A, B e C para MRS: Soluo A Soluo do antibitico Dicolixina Sigma D-9016 (American Generics Lab. Syntofarma), 100 mg/L, esterilizada por filtrao em menbrana 0,45 mm. Soluo B Soluo de cloreto de ltio (Lab. Synth), 2 g para cada 18 mL de gua destilada, esterilizada por filtrao em membrana de 0,45 mm. Soluo C - Soluo de L-Cistena (Casa Americana), 100 g/L, esterilizada por filtrao em menbrana 0,45 mm. Queijo A (QA)% 100 1,2 0,007 0,005 0,045 0,0012 0,0000132 0,0096 3 0,025 109 UFC.g-1 109 UFC.g-1 Queijo B (QB)% 100 1,2 0,007 0,005 0,045 0,0012 0,0000132 0,0096 3 1,0 109 UFC.g-1 109 UFC.g-1 Queijo C (QC)% 100 1,2 0,007 0,005 0,045 0,0012 0,0000132 0,0096 3 0,5 109 UFC.g-1 109 UFC.g-1

Contagem de Lactobacillus cremoris A enumerao de Lactobacillus cremoris foi feita em duplicata de acordo com as diluies adequadas. Utilizou-se o mtodo de plaqueamento por profundidade mais a sobrecamada e inoculou-se 0,1 mL das respectivas diluies e adicionou-se o meio de cultura PCA (Plate Count Agar), posteriormente, adicionou-se uma subcamada. As placas, em duplicata, foram incubadas a 32C durante 72 horas em estufa (Fanen 002CB) conforme descreve Franco et. al., (1996). A confirmao das colnias realizou-se em observao microscpica da morfologia, Planejamento experimental Foi utilizado o delineamento de blocos completos com 3 fatores e 3 repeties. Os resultados obtidos foram analisados por anlise de varincia (ANOVA) por meio da utilizao do software MINITAB 15. As mdias dos valores foram comparadas usando o teste de Tukey (Sokal And Rohlf, 1979) ao nvel de significncia de 5%. Resultados e Discusso Os resultados obtidos na determinao da populao de Lactobacillus acidophilus nos queijos A, B e C durante a vida de prateleira so apresentados na figura 1.
9 8,5 8 Log UFC/g 7,5 7 6,5 6 5,5 5 1 9 14 Tempo (dias) 21 28 QA QB QC

Figura 1: Representao grfica do comportamento do Lactobacillus acidophillus durante a vida de prateleira nos queijos A (acidificao direta), B (1,0% cido lctico) e C (0,5% cido lctico). Observa-se que o comportamento microbiano praticamente constante em Q.A e Q.C na ordem de 106, porm h reduo de dois ciclos logaritmos em Q.B, na primeira contagem para o tempo 14. Os resultados obtidos na anlise de varincia mostraram que no existe diferena significativa (p> 0,05) entre os queijos em funo do tempo, portanto, a adio de cido ltico ou de fermento ltico em concentraes diferentes no influenciou no desenvolvimento do Lactobacillus acidophilus.

Os resultados obtidos na determinao da populao de Bifidumbacterium bifidum nos queijos A, B e C durante a vida de prateleira apresentado na figura 2. Ao observar o comportamento do Bifidumbacterium bifidum, observa-se que h reduo de 2 ciclos logaritmos entre os queijos, ou seja, a mdia de contagem de colnias do queijo A foi de 106, j o queijo B de 107 e o queijo C em 108, ou seja, nos queijos B e C houve maior desenvolvimento do B. bifidus. Os resultados da anlise de varincia mostraram que existe diferena significativa (p < 0,05) entre os queijos e em funo do tempo. A acidez dos queijos B e C influenciaram no desenvolvimento do crescimento do B.ifidumbacterium bifidum. Estes resultados mostram que houve uma maior sobrevivncia destas bactrias nos queijos com menor valor de pH e este comportamento pode ser atribudo presena do fermento lctico.

10 9,5 9 8,5 Log UFC/g 8 7,5 7 6,5 6 5,5 5 1 9 14 Tempo (dias) 21 28 QA QB QC

Figura 2: Representao grfica do comportamento do Bifidumbacterium bifidum durante a vida de prateleira nos queijos A (acidificao direta), B (1,0% cido lctico) e C (0,5% cido lctico). O Lactobacillus cremoris (fermento ltico) apresentou um comportamento constante na ordem de 108 nas concentraes de 1% em Q.B e de 0,5% em Q.C. Aplicou-se ANOVA e o resultado foi que P = 0, 369, por ser maior que 0,05 no h diferena significativa entre os queijos e tambm no existe diferena significativa em funo do tempo a um nvel de significncia de 5%. Estes resultados mostram que a concentrao de bactrias adicionada (0,5% ou 1,0%) no interferiu na populao vivel de Lactobacillus cremoris ao longo da vida de prateleira. Os resultados obtidos nas determinaes microbiolgicas so apresentados na Tabela 2. Os mesmos mostram a quantidade de Lactobacillus acidophilus, Bifidumbacterim bifidum e Lactobacillus cremoris o nos queijos A, B e C ao longo do tempo de armazenagem a 5 C por 28 dias.

Tabela 2: Resultados obtidos nas determinaes microbiolgicas realizadas nos queijos QA (cido lctico), QB (1,0 % de fermento ltico) e QC (0,5% de fermento ltico). Determinao QA cido Ltico 1,15E+06a 4,10E+06a --QB 1% Fermento Ltico 1,74E+06a 2,37E+07b 1,52E+08a QC 0,5% Fermento Ltico 3,35E+06a 3,51E+08c 3,51E+08a

L.A(UFC/g) B.B. (UFC/g) L.C(UFC/g)

Onde: letras iguais na mesma linha indicam que no existe diferena significativa ao nvel de 5% Os resultados obtidos concordam com os de Miguel (2009). O autor verificou que em sorvete de iogurte a base de soja e yacon, o mesmo teve melhor desenvolvimento em pH cido entre 3 e 4. Essa resistncia pode ser dada por apresentarem um citoplasma com capacidade tamponante. No pH controle, (6-7) o desenvolvimento foi baixo. Observa-se que no queijo a, cujo pH ajustado com cido ltico, o desenvolvimento de Lactobacillus acidophilus e do Bifidumbacterium bifidum foi menor. Para resistir s condies do trato gastrintestinal as culturas probiticas devem apresentar tolerncia as condies cidas do estmago. O pH timo do Lactobacillus acidophilus 4,5 e o crescimento inibidoo em pH=6. J para Lactobacillus cremoris o pH timo 5,5-6,0 e do B Bifidumbacterium bifidum 6,0. A produo de componentes metablicos como cido ltico pelas bactrias ao longo a vida de prateleira acidifica o queijo. Pode-se dizer que o queijo B e C em que se adicionou o fermento ltico intensificou-se a protelise, portanto os queijos apresentaram o valor de pH menor. Esperava-se que o QB (1,0% de fermento ltico) apresenta-se pH maior, porm a adio de 1,0 % ou 0,5% no foi significativa. A reduo da cultura de Lactobacillus acidophilus de 109UFC/g para 106 UFC/g no QA, QB e QC dada pelo valor de pH dos queijos que se aproxima do pH de inibio. O Bifidumbacterium bifidum e Lactobacillus cremoris apresentaram bom desenvolvimento no QB e QC devido ao fato de se encontrarem em um meio cujo valor de pH prximo do pH timo. No queijo B, com 1,0% de fermento o Bifidumbacterium bifidum sofreu duas redues decimais e o Lactobacillus cremoris uma, j em C, ambos sofreram somente uma reduo decimal durante a vida de prateleira. O pH de Q.A pode ter inibido o desenvolvimento de Bifidumbacterium bifidum, visto que o mesmo sensvel aos valores. Para ser um alimento probitico, a legislao considera 108 UFC/g no mnimo, portanto a adio do fermento ltico permite que os queijos B e C sejam considerados probiticos. J Vieira et. al (2011) em um estudo sobre a sobrevivncia de L. acidiphilus e B. Bacterium em sobremesa lctea, concluiu que o tempo interferia no nmero de cepas de L. acidiphilus , porm a adio de amido resistente no. J para o B. Bacterium tem-se a mesma concluso, que h variao do nmero de colnias em funo do tempo. Crittenden et. al (2000) determinou a sensibilidade do crescimento do gnero Bifidus, em um iogurte simbitico enriquecido com amido modificado e verificou que o no houve mais crescimento do microorganismo em pH com valor 4,5. pH e Textura O valor do pH foi medido de acordo com a vida de prateleira nos 3 queijos e os valores esto representados a Tabela 3. Os resultados representados nessa determinao fsico-qumica demonstra que o tipo e a concentrao de acidificante influncia no valor de

pH, pois pela anlise de varincia, obteve-se p < 0,05. Portanto, h diferena significativa entre os queijos e existe diferena significativa em funo do tempo em nvel de significncia de 5%. Os resultados obtidos nas determinaes fsico-qumicas so apresentados na Tabela 3. Esses resultados mostram que o tipo e a concentrao do acidificante influenciaram significativamente (p < 0,05) nos valores de pH e de acidez. Sendo que o cido lctico manteve o pH e o fermento ltico diminuiu, como era esperado. As quantidades de 1,0 % e 0,5% no apresentaram diferena significativa no valor do pH. A adio do amido modificado no interfere no valor. Tabela 3: Resultados obtidos nas determinaes fsico-qumicas realizadas nos queijos QA (cido lctico), QB (1,0% de fermento ltico) e QC (0,5% de fermento ltico). Determinao pH QA cido Ltico 6,470,1a QB 1% Fermento Ltico 5,330,1b QC 0,5% Fermento Ltico 5,330,2b

Onde: letras iguais na mesma linha indicam que no existe diferena significativa ao nvel de 5%. Vieira (2011) na viabilizao de L. acidophilus e B. bacterium em sobremesa lctea, observou que a adio de amido modificado no influncia o valor de pH. A reduo dada pelo cido ltico, resultante da fermentao da lactose. Miguel (2009) tambm observou essa variao em funo do tempo. Os resultados obtidos nas determinaes de textura mostram que o tipo e a concentrao do acidificante no influenciaram significativamente (p < 0,05) nos valores de relaxao nem ruptura. Portanto, a adio de amido modificado e diferentes fermentos no interferem significamente em relao aos queijos e em funo do tempo. A adio de amido modificado e de diferentes concentraes de fermento lctico no interfere na textura. Esperava-se que quanto mais cido, mais mole, portanto menor fora de ruptura, visto que quanto maior a acidificao, maior a produo de enzima proteolticas, as quais quebram a estrutura do queijo. Vieira (2011) determinaram que a adio de amido modificado em sobremesa lctea influenciava no valor de textura(N/mm) e isto pode ser atribudo formao de uma rede mais forte devido presena das duas gomas e de uma maior concentrao de amido resistente, o qual aumentou a reteno de gua na rede. Concluso A acidificao dos queijos produzidos por ultrafiltrao e enriquecido com vutaminas E, K e B6(DSM), O mineral Zn(DSM) e amido resiste (Novelose National Starch), por meio de cido ltico ou fermento ltico nas concentraes de 1,0% e 0,5% no interfere siginificamente no desenvolvimento de Lactobacillus acidophillus de Lactobacillus cremoris porm interfere no desenvolvimento de Bifidumbacterium bifidum, a nvel de significncia de 5%. A adio de 0,5% de fermento lctico permitiu uma maior sobrevivncia do Bifidumbacterium bifidum. A adio de amido modificado e de diferentes concentraes de fermento lctico no influenciou significativamente na textura. A adio de fermento lctico resultou em maior reduo de pH no queijo ao longo do seu tempo de armazenamento.

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