CONSTRUO E CARACTERIZAO DE UMA BIBLIOTECA GENMICA ENRIQUECIDA EM MICROSSATLITES PARA O APAP (Pellona castelnaeana, PRISTIGASTERIDAE)

Hernndez-Ruz EJ1; Ximenes AM 2; Rodrigues LRR2; Machado V3; Izeni Pires Farias3
Laboratrio de Zoologia, Faculdade de Cincias Biolgicas, Campus Universitrio de Altamira, Universidade Federal do Par,. Rua Jos Porfrio, n 2515, Bairro de So Sebastio CEP: 68372-040 Altamira PA. Universidade Federal do Oeste do Par (UFOPA), Laboratrio de Gentica e Biodiversidade, Campus Tapajs, Instituto de Cincias da Educao. CEP: 68040260 Santarm-PA. Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Departamento de Cincias Biolgicas, Laboratrio de Evoluo e Gentica Animal, Mini Campus ICB, Av. Gen. Rodrigo Octvio Jordo Ramos, 3000 Coroado, Cep 69.077-000, Manaus, AM, Brasil.

RESUMO Para avaliar a estrutura gentica de populaes de apap na bacia Amaznica, desenvolvemos uma biblioteca genmica parcial enriquecida em microssatlites para P. castelnaeana a partir do mtodo de hibridizao seletiva, com sonda biotinilada do tipo (CT)8, conjugadas a contas magnticas revestidas por estreptavidina. Aps a hibridizao, os insertos enriquecidos em sequncias microssatlites foram amplificados via PCR, ligados ao vetor pGEM-T Easy Vector e transformados em bactrias eletrocompetentes Escherichia coli TOP10 por eletroporao. As bactrias transformadas foram plaqueadas em meio slido 2XYT-gar contendo ampicilina + X-gal, e aps crescimento, as colnias com o inserto (brancas) foram transferidas e crescidas em placas de 96 poos em meio liquido com Tartoff-Hobbs Broth/Ampicilina. A placa foi glicerolizada e acondicionadas a -20C. Sequenciamos 95 clones positivos. O programa GRAMENESSRTOOL foi utilizado para rastrear os microssatlites dos clones sequenciados. Obtivemos um total de 24 microssatlites de motivo de repetio dinucleotdeos. Esses microssatlites foram editados e alinhados no software Bioedit, os clones redundantes removidos e os iniciadores desenhados pelo programa Primer 3. Dos 15 iniciadores avaliados trs no foi possvel otimizar e 12 foram otimizados. Os 12 otimizados se apresentam como polimrficos e sero utilizados para posterior genotipagem de populaes naturais dessa espcie. PALAVRAS-CHAVE: Dinucleotdeo; Pellona flavipinnis; Genotipagem.

ABSTRACT To assess the genetic structure of populations of Amazon pellona in the basin of Amazon, we developed a partial genomic library enriched for microsatellites P. castelnaeana from the method of selective hybridization with biotinylated probe type (CT)8, conjugated to streptavidin coated magnetic beads. After hybridization, the inserts enriched in microsatellite sequences were amplified by polymerase chain reaction, linked to the vector pGEM-T Easy Vector and transformed into Escherichia coli TOP10 electro competent bacteria by electroporation. The transformed bacteria were plated on solid medium containing agar-2XYT ampicillin + X-gal, and after growth, the colonies with the uncertain (white) were transferred and grown in 96-well plates in a liquid medium with TartoffHobbs Broth / ampicillin. The plate was glycerolized and placed at -20 C. Sequenced 95 positive clones. GRAMENEssrtool program was used to track the microsatellite clones sequenced. We obtained a total of 24 microsatellite dinucleotide repeat motif. These microsatellites were edited and aligned in BioEdit software, removed redundant clones and primers designed by Primer 3 program. Of the 15 primers evaluated three was not possible to optimize and 12 were optimized. The optimized

microsatellites present as polymorphic and be used for subsequent genotyping of natural populations of this species. KEY-WORDS: Dinucleotide; Pellona flavipinnis; Genotyping INTRODUO Pellona flavipinnis e Pellona castelnaeana, regionalmente conhecidas como apap branco e apap amarelo, respectivamente, so espcies importantes na pesca de subsistncia na Amaznia, sendo uma das poucas espcies da famlia Pristigasteridae exploradas comercialmente na Amaznia brasileira (BATISTA; PETRERE, 2003). Considerando que os peixes so a principal fonte de protena na alimentao das populaes amaznicas (FERREIRA et al., 1998) e que segundo Giugliano et al. (1978), este representa cerca de 70% da protena animal consumida, (o consumo tem incrementado de 300 a 800g por dia) com uma mdia per capita de 150,6 g por dia. O pescado alm de ser uma das principais fontes de protenas animais e tambm uma importante fonte de renda em especial para as populaes que vivem prximas a corpos dgua (ARAJO-LIMA; RUFFINO, 2003). Estudos que avaliam aspectos da biologia de espcies populares e de baixo valor no mercado so importantes uma vez que subsidiam planos de manejo e conservao desse recurso para avaliar as variabilidades genticas entre outras variveis. Portanto, nosso objetivo foi avaliar a estrutura gentica da populao de Pellona na regio do meio e baixo rio Amazonas.

MATERIAL E MTODOS As sequncias microssatlites da espcie Pellona castelnaeana foram isoladas com auxlio de oligonucleotdeos marcados com biotina, que se ligam a partculas magnticas revestidas de estreptavidina. O complexo formado (oligonucleotdeo-partcula magntica) hibridiza-se nas fitas simples em regies do DNA genmico fragmentado que apresentam sequncias nucleotdicas complementares. O produto final uma biblioteca enriquecida de microssatlites de sequncias definidas pelo oligonucleotdeo/sonda biotina-marcado. A metodologia usada neste trabalho, uma modificao dos protocolos de Gautschi et al. (2000) e Guillemaund et al. (2000).

RESULTADOS E DISCUSSO 95 clones positivos foram sequenciados atravs do mtodo didesoxiterminal usando o BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), de acordo com as instrues do fabricante, em associao com o analisador automtico de DNA ABI 3130 (Applied Biosystem). Ambos os filamentos do DNA de cada clone foram sequenciados com uso dos iniciadores universal e reverso constituintes do kit. As sequncias foram editadas e alinhadas com auxlio do programa Bioedit (HALL, 1999). O programa GRAMENEssrtool foi utilizado para rastrear os microssatlites dos clones sequenciados.

Obtivemos um total de 24 microssatlites de motivo de repetio dinucleotdeos. Os clones redundantes removidos e os iniciadores desenhados pelo programa Primer 3. Dos 15 iniciadores avaliados, foi possvel otimizar apenas 12, que por sua vez apresentaram, polimorfismo

transespecfico. As temperaturas de anelamento variaram entre 60 e 61 C e as concentraes de MgCl2

entre de 1,5 e 4 mM. Esses iniciadores sero utilizados para posterior genotipagem de populaes

naturais de Pellona.

CONCLUSES O mtodo utilizado foi adequado para a construo de uma biblioteca genmica enriquecida em microssatlites para Pellona. A efetividade dos marcadores desenhados ser avaliada mediante genotipagem. LITERATURA CITADA AJO-LIMA, C.; RUFFINO, M. Migratory Fishes of the Brazilian Amazon. pp 232-302 In: CAROLSFELD J, HARVEY B, ROSS C, BAER, A (eds). Migratory fishes of South America. World Fisheries Trust, Victoria, BC, Canad, 2003. 380 p. BATISTA, V. S.; PETRERE Jr., M. Characterization of the commercial fish production landed at Manaus, Amazonas state, Brazil . Acta amazonica, v. 33, n.1, p. 53-66, 2003. FERREIRA, E. J. G., ZUANON, J. A. S., SANTOS, G.M., Peixes Comerciais do Mdio Amazonas: Regio de Santarm. Edio IBAMA, Braslia, 1998, 211 p. GIULIANO, R., SHRIMPTON, R.; ARKCOLL.,D.B.,GIUGLIANO, L.G.,PETRERE JR., Diagnstico e realidade nutricional do Estado do amazonas. Acta Amaznica, v 8, (Supl. II), p. 1-54. 1978. GAUTSCHI, B., WIDMER, A., KOELLA, J., Isolation and characterization of microsatellite loci in the dice snake (Natrix tessellata). Molecular Ecology, v. 9, p. 2192-2193, 2000. GUILLEMAUND, T., STREIFF, R., SERRO-SANTOS, R., et al., Microsatellite characterization in the rainbow Wrasse Coris julis (Pisces: Labridae). Molecular Ecology v 9, p. 631, 2000. HALL, T. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series v. 41, p. 9598, 1999.