UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE Gr.T.

POPA IAI FACULTATEA DE FARMACIE

GEORGETA- HERMINA CONEAC

CERCETRI PRIVIND INFLUENA -CICLODEXTRINELOR N VEDEREA OPTIMIZRII PREPARATELOR CU PROPOLIS

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific, Prof.univ.dr. ELIZA GAFIANU

IAI 2009

Teza de doctorat cuprinde: 192 pagini din care: 40 pagini: PARTE GENERAL 152 pagini: PARTE EXPERIMENTAL, care include: 207 figuri 49 tabele 215 indicaii bibliografice lista lucrrilor publicate in extenso: o 3 lucrri publicate n cotaii CNCSIS B+

CUPRINS
ABREVIERI I SIMBOLURI INTRODUCERE I. PARTEA GENERAL 1. PROPOLISUL, COMPONENT ACTIV A UNOR FORME FARMACEUTICE DOZATE SOLIDE PENTRU UZ ORAL 1.1. Proprietile fizice ale propolisului 1.2. Compoziia chimic i standardizarea propolisului 1.2.1. Principalele grupe de substane izolate din propolis 1.2.2. Standardizarea propolisului 1.3. Proprietile farmacologice ale propolisului 1.3.1. Mecanisme de aciune ale flavonoizilor 1.3.2. Aciuni fundamentale ale flavonoizilor i consecinele lor fiziologice 1.4. Propolisul component activ prelucrat n vederea includerii n diverse forme farmaceutice 2. CICLODEXTRINELE I IMPORTANA LOR N FORMULAREA UNOR PREPARATE FARMACEUTICE 2.1. Structura ciclodextrinelor 2.2. Caracteristici fizice i comportamentul ciclodextrinelor i derivailor lor n soluie 2.2.1. Structura cristalelor 2.2.2. Proprietile ciclodextrinelor n soluie 2.3. Proprieti chimice ale ciclodextrinelor 2.3.1. Reactivitatea chimic a ciclodextrinelor 2.3.2. Hidroliza acid 2.3.3. Radioliza 2.4. Toxicitatea ciclodextrinelor 2.5. Compleci de incluziune ai ciclodextrinelor: structur, preparare i caracterizare 2.5.1. Compleci de incluziune ai ciclodextrinelor 2.5.2. Obinerea complecilor de incluziune 2.5.2.1. Condiiile necesare pentru formarea complexului 2.5.2.2. Metode de preparare a complecilor ciclodextrinelor 2.5.2.3. Analiza complecilor ciclodextrinelor 2.6 Aplicaiile ciclodextrinelor n tehnologia farmaceutic 3. COMPRIMATE BUCALE BIOADEZIVE FORM FARMACEUTIC MODERN ADECVAT PENTRU NCORPORAREA PROPOLISULUI 3.1. Calea de administrare 3.2. Concepte de baz ale mucoadeziunii 3.3. Formularea i prepararea comprimatelor bucale bioadezive 3.3.1. Consideraii de formulare 3.3.2. Polimerii mucobioadezivi 3.3.3.Consideraii privind prepararea comprimatelor bucale bioadezive 3.4. Condiii de calitate i controlul comprimatelor bucale bioadezive 3.4.1. Determinri fizico-chimice 3 3 3 4 5 9 10 10 10 14 1

16 16 18 18 20 20 20 20 20 21 21 21 23 23 23 25 26

28 28 29 30 30 30 33 35 35

3.4.2. Determinri farmacotehnice 3.4.3. Determinri microbiologice i biochimice 3.4.5. Evaluarea biodisponibilitii 3.5. Condiionarea i conservarea comprimatelor bucale bioadezive 4. OPTIMIZAREA FORMULRII I TEHNOLOGIEI DE PREPARARE A COMPRIMATELOR MODALITATE DE DEZVOLTARE A COMPRIMATELOR BUCALE BIOADEZIVE 5. ARGUMENTAREA ALEGERII PROPOLISULUI CA MATERIE PRIM N FORMULAREA I PREPARAREA UNOR COMPRIMATE BIOADEZIVE II. PARTEA EXPERIMENTAL 1. CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMIC A SORTURILOR DE PROPOLIS INCLUSE N STUDIU 1.1 Extracia i analiza substanelor active din sorturile de propolis 1.1.1. Materiale i metode 1.1.1.1. Materiale 1.1.1.2. Obinerea extractelor de propolis 1.1.1.3. Condiii de cromatografiere 1.1.1.4. Obinerea curbelor de etalonare 1.1.2. Rezultate i discuii. 1.1.2.1. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele de propolis P1-Timioara 1.1.2.2. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele de propolis P2-Brzava 1.1.2.3. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele de propolis P3-Mini 1.1.3. Concluzii 1.2. Determinarea activitii antioxidante a substanelor active din sorturile de propolis analizate 1.2.1. Materiale i metode 1.2.1.1. Materiale 1.2.1.2. Metode 1.2.2. Rezultate i discuii 1.2.3. Concluzii 1.3. Cercetri privind posibilitatea de standardizare a extractelor de propolis 1.3.1. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele hidroalcoolice de propolis P1-Timioara 1.3.2. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele hidroalcoolice de propolis P2-Brzava 1.3.3. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele hidroalcoolice de propolis P3-Mini 1.3.4. Concluzii 1.4. Evaluarea statistic a rezultatelor obinute la analiza extractelor fluide de propolis 1.4.1. Materiale i metode 1.4.2. Rezultate i discuii 1.4.3. Concluzii 1.5. Prepararea extractului uscat de propolis 1.5.1. Materiale i metode 4

35 36 36 36

37

39

41 41 41 41 45 45 45 55 55 59 63 66 67 67 67 68 69 70 71 71 74 77 80 80 80 81 83 83 83

1.5.1.1. Materiale 1.5.1.2. Metode 1.5.2. Rezultate i discuii 1.5.3. Concluzie 2. OBINEREA I CARACTERIZAREA UNOR COMPLECI DE INCLUZIUNE AI PROPOLISULUI CU -CICLODEXTRINE 2.1. Obinerea complecilor de incluziune ai propolisului cu -ciclodextrina 2.1.1. Materiale i metode 2.1.1.1. Materiale 2.1.1.2. Obinerea complecilor de incluziune 2.1.2. Rezultate i discuii 2.1.3. Concluzii 2.2. Evaluarea calitativ i cantitativ a complecilor de incluziune ai propolisului cu -ciclodextrina 2.2.1. Metoda microscopiei optice 2.2.1.1. Materiale 2.2.1.2. Rezultate i discuii 2.2.2. Metoda microscopiei electronice cu scanare 2.2.2.1. Materiale 2.2.2.2. Rezultate i discuii 2.2.3. Metoda termogravimetric 2.2.3.1. Materiale 2.2.3.2. Rezultate i discuii 2.2.4. Metoda calorimetric de scanare diferenial 2.2.4.1. Materiale i metode 2.2.4.2. Rezultate i discuii 2.2.5. Analiza Karl Fischer 2.2.5.1. Materiale i metode 2.2.5.2. Rezultate i discuii 2.2.6. Determinarea coninutului de bioflavonoide exprimate n crizol al complexului extract fluid de propolis P2 n etanol 60% cu -ciclodextrina 2.2.6.1. Materiale i metode 2.2.6.2. Obinerea soluiei complexului de incluziune P2_bCD n amestec de acetonitril:ap 48:52 2.2.6.3. Condiii de cromatografiere 2.2.6.4. Obinerea curbelor de etalonare 2.2.7. Concluzii 2.3. Obinerea complecilor de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil-ciclodextrina prin metoda coprecipitrii n soluie 2.3.1. Materiale i metode 2.3.1.1. Materiale 2.3.1.2. Obinerea complecilor de incluziune prin metoda coprecipitrii n soluie 2.3.2. Rezultate i discuii 2.3.3. Concluzii 2.4. Evaluarea calitativ i cantitativ a complecilor de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina obinui prin metoda coprecipitrii 2.4.1. Metoda microscopiei electronice cu scanare 2.4.1.1. Materiale 2.4.1.2. Rezultate i discuii 2.4.2. Metoda calorimetric de scanare diferenial 5

83 83 84 84

85 85 85 85 85 86 88 89 89 89 89 91 91 91 93 93 93 102 102 103 112 112 112 114 115 115 115 115 117 120 120 120 120 121 122 122 122 122 122 123

2.4.2.1. Materiale 2.4.2.2. Rezultate i discuii 2.4.3. Concluzii 2.5. Obinerea complecilor de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil-ciclodextrina prin metoda n past 2.5.1. Materiale i metode 2.5.1.1. Materiale 2.5.1.2. Obinerea complecilor de incluziune prin metoda n past 2.5.2. Rezultate i discuii 2.5.3. Concluzie 2.6. Evaluarea calitativ i cantitativ a complecilor de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina obinui prin metoda n past 2.6.1. Metoda microscopiei optice 2.6.1.1. Materiale 2.6.1.2. Rezultate i discuii 2.6.2. Metoda calorimetric de scanare diferenial 2.6.2.1. Materiale 2.6.2.2. Rezultate i discuii 2.6.3. Determinarea coninutului de bioflavonoide exprimate n crizol al complexului extract fluid de propolis P2 n etanol 60% cu 2-hidroxipropil -ciclodextrina 2.6.3.1. Materiale i metode 2.6.3.2. Obinerea soluiei complexului de incluziune P2_HPbCD, n amestec de acetonitril:ap 48:52 2.6.3.5. Rezultate i discuii 2.6.4. Concluzii

123 123 124 125 125 125 125 126 126 126 126 126 126 127 127 127

130 130 130 130 131

3. FORMULAREA, PREPARAREA I CONTROLUL CALITII UNOR 132 COMPRIMATE BUCALE BIOADEZIVE CU PROPOLIS 3.1. Formularea comprimatelor bucale bioadezive cu propolis 132 3.1.1. Materiale i metode 133 3.1.1.1. Materiale 133 3.1.1.2. Metode 133 3.1.2. Rezultate i discuii 136 3.1.3. Concluzii 137 3.2. Prepararea comprimatelor bucale bioadezive cu propolis 138 3.2.1. Materiale i metode 138 3.2.1.1. Materiale 138 3.2.1.2 Metoda 138 3.2.2. Rezultate i discuii 138 3.2.3. Concluzie 138 3.3. Controlul calitii comprimatelor bucale bioadezive obinute 138 3.3.1. Materiale i metode 139 3.3.1.1. Materiale 139 3.3.1.2. Metode 139 3.3.2. Rezultate i discuii 143 3.3.3 Concluzii 153 3.4. Studiul cineticii de eliberare a bioflavonoidelor exprimate n crizol din comprimatele bucale mucoadezive studiate 154 3.4.1. Materiale i metode 154 3.4.2. Rezultate i discuii 155 3.4.3. Concluzii 156 6

4. STUDIUL INFLUENEI UNOR FACTORI DE FORMULARE ASUPRA CARACTERISTICILOR COMPRIMATELOR BUCALE BIOADEZIVE CU PROPOLIS 4.1. Materiale i metode 4.1.1. Proiectarea experimentelor 4.1.2. Proceduri de grupare ierarhic 4.1.3. Proiecia n structuri latente (PLS) 4.2. Rezultate i discuii 4.2.1. Alegerea variabilelor independente i a nivelelor acestora 4.2.2. Alegerea variabilelor dependente (rspunsurilor) 4.2.3. Evaluarea similaritii i selecia variabilelor dependente 4.2.4. Analiza statistic multivariat i obinerea modelelor matematice utiliznd metoda PLS 4.3. Concluzii CONCLUZII GENERALE BIBLIOGRAFIE PUBLICAII

157 157 157 158 158 159 159 162 164 164 177 179 182

ABREVIERI I SIMBOLURI AND = acid dezoxiribonucleic ATP-aza = adenozin trifosfataza Abs= absorbana BDDS = sisteme bioadezive de eliberare a medicamentelor Bias = valoarea medie a rezidualelor c = concentraie CAPE = esterul fenetilic al acidului cafeic CD = ciclodextrina CI = complex de incluziune CMCNa = carboximetilceluloz sodic DER = raportul dintre cantitatea de materie prim i extractul original DMSO = dimetilsulfoxid DPPH = 1,1 difenil 2 picrilhidrazil DSC = calorimetrie de scanare diferenial FR = Farmacopeea Romn GDH = glutamatdehidrogenaza h = nlime HCA = analiza ierarhic a clusterelor HSV = virus herpetic HPC = hidroxipropilceluloz HPLC = cromatografie de lichide de nalt performan HPMC = hidroxipropilmetilceluloz IR = infrarou J/g = joule/gram L = lungime l = lime m = masa mM = milimol MC = metilceluloza mg = miligram mg/cpr = miligram/comprimat mg/g = miligram/gram mg/kg = miligram/kilogram mg/ml = miligram/mililitru min = minut ml = mililitru mm = milimetru MO = microscopie optic nm = nanometri ORL = Oto-Rino-Laringologie PCA = analiza componentelor principale PEG = polietilenglicol PCR = regresia componentelor principale Ph. Eur. = Farmacopeea European PLS = proiecie n structuri latente Q = cvercetol R = rutozid RMN = rezonan magnetic nuclear RMSEP = rdcina ptrat a varianei reziduale totale RP HPLC = cromatografie de lichide de nalt performan cu faz rezervat 8

rpm = rotaii pe minut s = secund SEP = eroarea standard de predicie SDH = succinatdehidrogenaza t = timp TBC = tuberculoza TG DTG = analiz termogravimetric i termodiferenial UV = ultraviolet UV VIS = ultraviolet - vizibil V/V = volum/volum v = volum = armstrong o C = grad Celsius l = microlitru m = micrometru = unghi de contact -CD = beta-ciclodextrina 2 HPCD = 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina

INTRODUCERE Progresul n domeniul medicamentului s-a realizat prin sinteza de noi entiti chimice cu aciune farmacologic, extracia de noi componente din produsele naturale, obinerea unei game variate de excipieni i totodat prin realizarea de noi formulri i tehnologii de preparare inovatoare. n primul caz utilizarea unor substane medicamentoase noi a mbogit arsenalul terapeutic dar a necesitat ridicarea preului de cost prin studiile laborioase necesare s dovedeasc activitatea i sigurana medicamentului. n cel de-al doilea caz tehnologia farmaceutic a evideniat multiple posibiliti de optimizare a eficienei terapeutice a unor substane medicamentoase prin intervenii cu substane auxiliare (polimeri hidrofili, ciclodextrine, lipozomi, tensioactivi), n forme farmaceutice sau sisteme terapeutice, cu indicaii de administrare n vederea realizrii aciunii locale i sistemice [1]. n prezent se remarc o mare similitudine ntre formele farmaceutice clasice (comprimate, comprimate filmate, capsule), modul de formulare, procesele tehnologice i materiile prime utilizate n industria farmaceutic i industria suplimentelor nutritive. Tendina este ca formularea i dezvoltarea unei tehnologii de preparare a medicamentelor sau a suplimentelor nutritive, s se fac pe baza unor studii sistematice de cercetare, aplicnd metode moderne de optimizare cum ar fi proiectarea statistic a experimentelor care implic utilizarea unor programe structurate, ntr-o strategie adecvat de experimentare, respectiv de modelare i de control a procesului de obinere. n contextul acestor preocupri, cercetrile ntreprinse n prezenta lucrare i propun optimizarea preparatelor solide orale cu propolis, astfel nct s se poat cunoate posibilitile de cretere a eficienei terapeutice prin asigurarea eliberrii i absorbiei componentelor active din produsul natural, propolis. Frecvent folosit n tratamentul local al unor afeciuni localizate la nivelul cavitii bucale sau pentru aciunea general a complexului de componente active, propolisul rmne n actualitate ca un produs bioactiv de interes n practica medical. Comprimatele constituie una dintre formele farmaceutice utilizate frecvent pentru ncorporarea propolisului, fiind cel mai adesea destinate tratamentului local al afeciunilor cavitii bucale. n acest context, considerm c studiile ntreprinse n prezenta lucrare sunt de actualitate, deoarece au urmrit optimizarea unei forme farmaceutice cu propolis deja existente, comprimatele, prin realizarea unor comprimate bucale bioadezive, care s asigure o biodisponibilitate superioar comprimatelor convenionale i implicit, obinerea unui efect terapeutic optim. n scopul realizrii unor comprimate bucale bioadezive care prin tehnologia de preparare i modul de administrare s confere calitile specifice acestei forme farmaceutice sau studiat n prima etap trei sorturi de propolis, colectate din zone diferite i prelucrate ca extracte hidroalcoolice. Caracterizarea fizico-chimic a sorturilor de propolis prin cromatografie HPLC a avut n vedere identificarea i determinarea semicantitativ a componentelor active (flavonoide i derivai polifenolici de tip acid cafeic), din extractele respective i determinarea capacitii de scavenger de radicali liberi. n vederea optimizrii biodisponibilitii acestui produs bioactiv i a ncorporrii lui cu uurin n preparatele farmaceutice solide orale (comprimate bioadezive) s-a recurs la extractul uscat care s conin o concentraie de componente active (fitocomplex) convenabil unei terapii eficiente. n acelai scop s-a considerat oportun obinerea unor compleci de incluziune ai propolisului cu ciclodextrine (-ciclodextrina i 2-hidroxipropil--ciclodextrina). Complecii obinui au fost analizai i caracterizai prin metodele specifice descrise n literatur. Aplicnd metode statistice de analiza multivariat a datelor de cromatografie, spectrofotometrie i termogravimetrie s-a evaluat calitatea extractelor de propolis i a incluziunilor cu -ciclodextrina i 2-hidroxipropil--ciclodextrina i s-a realizat o ierarhizare a 10

extractelor i complecilor n funcie de tipul de propolis sau de concentraia de etanol utilizat la extracie. Datorit concentraiei crescute n bioflavonoide exprimate n crizol, s-a selecionat sortul de propolis de Brzava, codificat P2 n extract hidro alcoolic 60 % (V/V) ca materie prim pentru studiile ulterioare. Realizarea unor forme farmaceutice de uz oral cu propolis este orientat spre obinerea unei aciuni locale (n afeciuni bucofaringiene) i generale. Formularea comprimatelor bioadezive cu propolis asigur stabilitatea principiilor active fa de factorii de degradare, o eliberare prelungit a componentelor active necesare tratrii unor afeciuni localizate la nivelul cavitii bucale ct i o aciune sistemic. Realizarea formelor farmaceutice mucoadezive, a necesitat selecionarea unor polimeri care interacioneaz i se leag de mucus prin umectarea cu saliv, adernd la celulele epiteliale ale mucoasei bucale. n acest fel se asigur o remanen crescut i o eliberare prelungit a substanelor active ncorporate [2-8]. Capitolul al treilea este dedicat contribuiilor aduse la realizarea unor comprimate bucale bioadezive cu propolis constituite din amestecuri de diferite proporii de polimeri mucobioadezivi: polimeri ai acidului poliacrilic (Carbopol 971 P NF i Carbopol 981) i un sort de polivinilpirolidona (Kollidon VA 64). Stabilirea formulrilor i prepararea comprimatelor bucale bioadezive a urmrit comparaia ntre compuii de incluziune ai componentelor active din propolis cu ciclodextrina, respectiv cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina i un extract uscat obinut din acelai material natural. Pentru controlul calitii comprimatelor bucale bioadezive obinute s-au efectuat o serie de determinri, nscrise n Ph. Eur. ed. a-VI-a i Suplimentul 2004 al F.R. ed. a-X-a, care se refer la: aspect, culoare, gust, pH, dozare, uniformitatea masei, rezisten, friabilitate, cinetica de dizolvare. De asemenea, s-au efectuat i teste specifice privind capacitatea de mbibare i de adeziune a comprimatelor bucale bioadezive. Capitolul patru este destinat studiului influenei unor factori de formulare asupra caracteristicilor comprimatelor bucale bioadezive cu propolis n vederea alegerii formulrii optime. Rezultatele studiilor experimentale din aceast lucrare conduc la concluzii finale privind: - caracterizarea extractelor apoase, hidroalcoolice i uscat obinute din sorturile de propolis selecionate, precum i a complecilor de incluziune ai unor componente active din extracte cu -ciclodextrina i cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina; - caracterizarea fizico-chimic i farmacotehnic a comprimatelor bucale bioadezive coninnd fie complecii de incluziune menionai mai sus, fie extract uscat de propolis. - optimizarea formulrii comprimatelor bucale bioadezive care a avut n vedere stabilirea unor variabile cum ar fi: concentraia substanelor bioactive, natura excipienilor necesari comprimrii directe i adeziunii comprimatelor de mucoasa bucal.

11

Argumentarea cercetrii Pn n prezent, n literatura autohton de specialitate nu au fost publicate studii referitoare la optimizarea formelor farmaceutice solide bucofaringiene cu propolis deja existente sau la dezvoltarea unor forme farmaceutice bucofaringiene moderne cu propolis, n scopul mbuntirii biodisponibilitii acestui produs natural. Prin urmare, realizarea unor comprimate bucale mucoadezive cu propolis este oportun, pentru c acest produs bioactiv a rmas n actualitate, fiind frecvent utilizat n tratamentul unor afeciuni localizate la nivelul cavitii bucale. Partea experimental, care cuprinde contribuiile proprii, st la baza realizrii unor obiective prestabilite, referitoare la optimizarea biodisponibilitii bucofaringiene a propolisului att prin administrarea sa sub form de comprimate bucale mucoadezive, ct i prin complexare cu ciclodextrine. n plus, includerea propolisului n ciclodextrine reprezint o potenial modalitate de a transformarea materialul vegetal ntr-o pulbere microcristalin stabil, nehigroscopic, uor de prelucrat sub form de comprimate. n consecin, studiile efectuate n cadrul tezei de doctorat au fost orientate n direcia dezvoltrii unor comprimate bucale mucoadezive coninnd compleci de incluziune ai componentelor active din propolis cu -ciclodextrine, n scopul evalurii influenei ciclodextrinelor asupra proprietilor tehnologice i biofarmaceutice ale propolisului. Obiectivele tezei de doctorat Studiile efectuate n cadrul tezei de doctorat au fost orientate n urmtoarele direcii principale: o caracterizarea fizico-chimic a trei sorturi de propolis, de provenien diferit; o obinerea i caracterizarea unor compleci de incluziune ai propolisului cu ciclodextrine (-ciclodextrina i 2-hidroxipropil--ciclodextrina); o dezvoltarea de comprimate bucale mucoadezive coninnd compleci ai propolisului cu -ciclodextrine. Caracterizarea fizico-chimic a celor trei sorturi de propolis, n special determinarea semicantitativ, a stat la baza seleciei sortului cel mai adecvat pentru realizarea complecilor de incluziune cu -ciclodextrine. Caracterizarea complecilor de incluziune obinui s-a efectuat prin metodele convenionale, indicate n normativele oficiale i n literatura de specialitate. Comprimatele bucale mucoadezive au fost caracterizate n ceea ce privete parametrii caracteristici fizico-chimici i farmacotehnici. De asemenea, s-a studiat influena unor factori de formulare asupra caracteristicilor comprimatelor bucale bioadezive cu propolis obinute.

PARTEA GENERAL Prima parte a tezei de doctorat este structurat n cinci capitole: Capitolul 1 n care sunt prezentate proprietile fizice, compoziia chimic i standardizarea propolisului, proprietile farmacologice ale acestuia precum i formele prelucrate din propolis incluse n diverse preparate farmaceutice. Capitolul 2 cuprinde date despre ciclodextrine i importana lor n formularea unor preparate farmaceutice. Capitolul 3 prezint date referitoare la comprimatele bucale bioadezive ca form modern adecvat pentru ncorporarea propolisului i anume consideraiile de formulare, preparare, condiiile de calitate i controlul comprimatelor bucale bioadezive. Capitolul 4 prezint noiuni referitoare la utilizarea unor programe de proiectare experimental, de modelare asistat de calculator, dar i a unor tehnici de optimizare statistic n domeniul cercetrii farmaceutice, care permit studiul influenei unor factori de formulare asupra caracteristicilor de calitate ale unui preparat farmaceutic.

12

Capitolul 5 conine argumentele care au stat la baza alegerii propolisului ca i materie prim pentru obinerea componentelor active a unor comprimate bucale bioadezive. PARTEA EXPERIMENTAL Partea a doua a tezei de doctorat, cuprinznd contribuiile proprii, este structurat n patru capitole, ale cror teme de cercetare au fost: caracterizarea fizico-chimic a sorturilor de propolis (trei locaii diferite din zona de vest a Romniei) incluse n studiu; obinerea i caracterizarea unor compleci de incluziune ai propolisului cu ciclodextrine (-ciclodextrina i 2- hidroxipropil- -ciclodextrina); formularea, prepararea i controlul calitii unor comprimate bucale bioadezive cu propolis; studiul influenei unor factori de formulare asupra caracteristicilor comprimatelor bucale bioadezive cu propolis. CAPITOLUL 1 CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMIC A SORTURILOR DE PROPOLIS INCLUSE N STUDIU Obiectivele acestei etape de studiu au fost: - selectarea materialului vegetal (propolis) din zone i surse diferite; - alegerea solventului de extracie i utilizarea lui n diferite concentraii; - adoptarea unei metode de extracie adecvate; - determinarea coninutului n principii active din extractele de propolis; - determinarea activitii antioxidante a substanelor identificate n probele de propolis. 1.1. Extracia i analiza substanelor active din sorturile de propolis Scopul acestui studiu a fost obinerea unui extract de propolis cu o compoziie n principii active reproductibil n anumite limite. S-a considerat c o astfel de compoziie ofer posibilitatea administrrii extractului de propolis ntr-o cantitate care conine o concentraie controlat de principii active (flavonoide i derivai polifenolici de tip acid cafeic) i, totodat, asigur o eficien terapeutic maxim, lipsa efectelor adverse i permite individualizarea tratamentului. 1.1.1. Materiale i metode n vederea extraciei i analizei cantitative a substanelor active din propolis, s-au utilizat trei probe din acest produs natural, colectate n luna septembrie anul 2006 din zona de vest a Romniei, de la o stupin alpin, avnd arboret constituit majoritar din rinoase i de la dou stupine de lunc cu vegetaie bogat n plante melifere de cmpie cum sunt teiul, plopul, salcmul. n figura 1 sunt redate zonele de provenien a materiei prime.

Figura 1. Localizarea geografic a zonelor de provenien a probelor de propolis. 13

Sorturile de propolis au fost codificate P1-Timioara, P2-Brzava i P3-Mini avnd caracteristicile organoleptice redate n tabelul I. Tabelul I. Proprietile organoleptice ale sorturilor de propolis achiziionate n 2006, utilizate la obinerea extractelor.
Proveniena i proprietile fizice studiate Sorturile de propolis studiate Propolis de Timioara Propolis de Brzava Propolis de Mini (P1 -Timioara) (P2- Brzava) (P3-Mini) Timioara, 2006, din Brzava, 2006, din Mini, 2006, din regiune cu vegetaie regiune alpin cu regiune cu vegetaie bogat n tei, salcm, vegetaie de bogat n tei, salcm, plop, plante melifere de rinoase, fag, brad, plop, plante melifere de cmpie molid cmpie Mas solid, eterogen, Mas solid, Mas solid, eterogen, rinoas eterogen, rinoas rinoas Brun nchis cafeniu cu Brun nchis cafeniu Brun nchis cafeniu cu reflexe de galben verzui reflexe de galben verzui Acrior, aromat, aderent Acrior, aromat, Acrior, aromat, de mucoas aderent de mucoas aderent de mucoas Aromat caracteristic (a Aromat, caracteristic Aromat caracteristic (a vanilin), amestecat cu de rinos vanilin), amestecat cu mirosul de miere, cear mirosul de miere, cear Vscoas, lipicioas, care Vscoas, lipicioas, Vscoas, lipicioas, la malaxare las urme pe care la malaxare las care la malaxare las hrtia de filtru urme pe hrtia de urme pe hrtia de filtru filtru Aprute n mod Aprute n mod Aprute n mod accidental (achii de accidental (achii de accidental (achii de lemn, fragmente de corp lemn, fragmente de lemn, fragmente de de albin) corp de albin) corp de albin)

Provenien

Aspect Culoare Gust Miros

Consisten

Impuriti

n figura 2 este prezentat aspectul macroscopic al probelor de propolis analizate.

Figura 2. Aspectul macroscopic al probelor de propolis analizate. Din fiecare sort de propolis s-au preparat cte patru extracte, utiliznd n acest scop: ap distilat [9, 10], etanol 96 % (V/V) (p.a., Chimopar, Bucureti, Romnia), etanol 60 % (V/V), 14

 etanol 20 % (V/V), concentraiile alcoolice fiind exprimate n procente V/V, avnd n vedere faptul c Suplimentul din 2006 al F.R. ed. a- X-a prevede, la monografia Coninutul n etanol i tabele alcoolmetrice (capitolul Metode farmacotehnice), exprimarea concentraiei n etanol prin titrul volumic. n acest fel, pentru fiecare sort de propolis am obinut cte patru tipuri de extracte, a cror codificare o redm n tabelul II Pentru toate, raportul drog/extract a fost de 1:20 g/ml. Tabelul II. Codificarea extractelor de propolis. Tipul extractului Apos Alcoolic (etanol 20 % V/V) Alcoolic (etanol 60 % V/V) Alcoolic (etanol 96 % V/V) Codificarea pentru sortul de propolis P1-Timioara P2-Brzava P3-Mini P1-H2O P2-H2O P3-H2O P1-20 P2-20 P3-20 P1-60 P2-60 P3-60 P1-96 P2-96 P3-96

Extractele de propolis care ajung pe piaa farmaceutic, se prepar de regul cu un DER de 5 sau 10 g propolis la 100 ml preparat, concentraiile alcoolului folosit ca solvent variind n majoritatea cazurilor ntre 60 i 82 %V/V. Datorit faptului c n cazul unui DER de 10 % g/ml, reziduul rmas dup extracie nu este epuizat de principii active, procedeul este neeconomic. Din acest motiv, n acest studiu am optat pentru un DER= 5:100. Extractele astfel obinute au fost analizate prin cromatografie lichid de nalt performan. Pentru analizele cromatografice s-au utilizat solveni de puritate avansat pentru HPLC. n extractele apoase i hidroalcoolice obinute din cele trei sorturi de propolis ne-am propus s identificm flavonoidele menionate de literatur ca fiind existente n propolis i anume: flavonolii (cvercetol i kemferol), flavonele (apigenol, acacetol i crizol) i flavanona (pinocembrol). De asemenea, am urmrit prezena n sorturile de propolis analizate a rutozidei (dei aceasta nu este menionat de literatur ca fiind component a propolisului) i a acidului cafeic din categoria acizilor polifenolcarboxilici. Obinerea curbelor de etalonare Pentru determinarea semicantitativ a substanelor active din propolis (flavonoide i derivai polifenolici de tip acid cafeic) s-au realizat soluii de concentraii cunoscute pentru: cvercetol, apigenol, kemferol, acacetol, crizol, pinocembrol, rutozid i acid cafeic. n figura 3 este redat cromatograma HPLC a celor 8 etaloane utilizate n studiu.

Figura 3. Cromatograma HPLC a tuturor etaloanelor. n cazul tuturor etaloanelor se constat reproductibilitatea timpilor de retenie i mrimea ariei la diferite concentraii. 15

Tabelul III prezint timpii de retenie a celor 8 etaloane utilizate. Tabelul III. Timpii de retenie ai substanelor etalon.
Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 Substana etalon Cvercetol Apigenol Kemferol Acacetol Crizol Pinocembrol Rutozid Acid cafeic Timpul de retenie (min) 13,10 15,40 16,80 34,00 34,10 36,40 6,70-7,00 10,34

1.1.2. Rezultate i discuii 1.1.2.1. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele de propolis P1-Timioara Pe baza curbelor de etalonare pentru flavonoidele etalon disponibile i acidul cafeic sau putut doza unii dintre aceti compui, n extractul apos i n cele trei extracte hidroalcoolice. n tabelul IV sunt prezentate rezultatele determinrii semicantitative a substanelor active identificate n sortul de propolis P1-Timioara n cazul utilizrii apei i etanolului 20%, 60% i 96% (V/V) ca solvent de extracie. Tabelul IV. Identificarea i determinarea semicantitativ a substanelor active de tip flavonoidic i a acidului cafeic din extractele de propolis P1-Timioara.
Nr 1 2 3 4 Tipul extractului Apos Etanolic 20% Etanolic 60% Etanolic 96% Cod P1_H2O P1_20 P1_60 P1_96 Cvercetol Apigenol Kemferol (mg/g) (mg/g) (mg/g) 0,130 0,298 1,256 8,704 0 0,289 2,721 6,989 0 0,222 1,330 1,601 Crizol (mg/g) 0 0,955 19,921 17,191 Rutozid (mg/g) 0,300 1,082 4,983 8,878 Acid cafeic (mg/g) 0,100 2,560 1,179 3,899

Se observ o cretere a concentraiei compuilor mai lipofili (apigenol, kemferol, crizol), n comparaie cu cvercetolul (n extractul etanolic 60%) i acidul cafeic pe msur ce crete concentraia alcoolic. Coninutul n flavonoide totale (cvercetol, apigenol, kemferol, crizol i rutozid) determinat prin cromatografie HPLC n extractele apos i hidroalcoolice (20, 60 i 96%) din sortul de propolis P1-Timioara este redat n figura 4.

Continutul in flavonoide totale in sortul P1 (mg/100 g)

4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

Rutozida Crizol Kemferol Apigenol Cvercetol

P1_H2O

P1_20

P1_60

P1_96

Figura 4. Coninutul n flavonoide totale determinate prin HPLC n extractele obinute din sortul de propolis P1-Tm. 16

1.1.2.2. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele de propolis P2-Brzava n cazul extractelor de propolis P2-Brzava i P3-Mini, identificrile i determinrile semicantitative ale principiilor active pentru care au fost disponibile etaloane, au fost similare celor pentru sortul P1-Timioara. Extractele obinute au fost analizate prin cromatografie HPLC obinndu-se cromatogramele prezentate n figura 5.

(a)

(b)

(c)

(d)

Figura 5. Cromatogramele HPLC ale extractelor de propolis P2-B n ap (a) n etanol 20% (b), n etanol 60% (c) i n etanol 96% (d).

Tabelul V conine rezultatele determinrii semicantitative a substanelor active din sortul de propolis P2-Brzava n cazul utilizrii apei i a alcoolului de concentraie 20%, 60% i 96% (V/V) ca mediu de extracie. i n cazul sortului de propolis P2-Brzava creterea concentraiei alcoolice (etanol 60% i 96% v/v) conduce la creterea proporiei de substane active lipofile.
Tabelul V. Identificarea i determinarea semicantitativ a substanelor active de tip flavonoidic i a acidului cafeic din extractele de propolis P2-Brzava.
Nr 1 2 3 4 Tipul extractului Apos Etanolic 20% Etanolic 60% Etanolic 96% Cod P2_H2O P2_20 P2_60 P2_96 Cvercetol (mg/g) 2,100 0,505 3,095 0,897 Apigenol (mg/g) 0 0 4,512 1,754 Kemferol (mg/g) 0 0 3,198 1,023 Crizol (mg/g) 0,600 0,698 22,308 9,874 Rutozid (mg/g) 1,700 0,513 4,713 2,945 Acid cafeic (mg/g) 0 2,597 5,601 1,984

Cantitatea total de flavonoide exprimat n miligrame (cvercetol, apigenol, kemferol, crizol i rutozid), din extractele apos i hidroalcoolice (20, 60 i 96%) pe baz de propolis P2-Brzava determinat prin HPLC din 100 grame propolis este redat n figura 6.
Continutul in flavonoide totale din sortul P2 (mg/100 g)
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 P2_H2O P2_20 P2_60 P2_96 Rutozida Crizol Kemferol Apigenol Cvercetol

Figura 6. Coninutul n flavonoide totale determinate prin HPLC n extractele obinute. 17

1.1.2.3. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele de propolis P3-Mini n extractele de propolis P3-Mini s-a urmrit dozarea principiilor active ca i n cazul celor preparate din sorturile de propolis P1-Tm i P2-B. Tabelul VI cuprinde rezultatele determinrii semicantitative a substanelor active din sortul de propolis P3-Mini n cazul utilizrii etanolului 20%, 60% i 96 % (V/V) ca mediu de extracie. Tabelul VI. Identificarea i determinarea semicantitativ a substanelor active de tip flavonoidic i a acidului cafeic din extractele de propolis P3-Mini.
Nr
1 2 3 4

Tipul extractului Apos Etanolic 20% Etanolic 60% Etanolic 96%

Cod P3_H2O P3_20 P3_60 P3_96

Cvercetol Apigenol Kemferol (mg/g) (mg/g) (mg/g) 0,900

0,449 3,951 5,617

Crizol (mg/g) 0,200

0,360 15,125 14,585

Rutozid (mg/g) 0,700

1,883 3,657 4,105

0,300
0,370 7,117 2,080

0
0 0 1,089

Acid cafeic (mg/g) 0

0 19,365 3,046

Cantitatea total de flavonoide exprimat n miligrame (cvercetol, apigenol, kemferol, crizol i rutozid), din extractele apos i hidroalcoolice (20, 60 i 96 %) pe baz de propolis P3-Mini determinat prin HPLC din 100 grame propolis este redat n figura 7.

Continutul in flavonoide totale in sortul P3 (mg/100 g)

3000

Rutozida Crizol Kemferol Apigenol Cvercetol

2500

2000

1500

1000

500

0 P3_H2O P3_20 P3_60 P3_96

Figura 7. Coninutul n flavonoide totale determinate prin HPLC n extractele obinute din sortul de propolis P3-M. 1.1.3. Concluzii n urma studiilor efectuate privind extracia i determinarea semicantitativ a componentelor active din sorturile de propolis studiate se pot formula urmtoarele concluzii principale: Se remarc creterea concentraiilor de flavonoide lipofile extrase din probele de propolis, odat cu creterea coninutului n etanol a amestecurilor hidroalcoolice utilizate ca solveni. Cele trei probe de propolis analizate au dovedit o variabilitate mare a compoziiei chimice, fapt care subliniaz lipsa de uniformitate a materiei prime naturale. Proba P1-Timioara prezint un coninut maxim de crizol (1992,10 mg %) n extractul cu etanol 60%, urmat de extractul alcoolic 96% (1719,1 mg %). Comparativ cu P1-Tm, proba de propolis P2-Brzava, are un coninut n crizol mai mare n extractul alcoolic 60% (2230,8 mg %), n timp ce n amestec hidroalcoolic 96% a fost decelat o concentraie mai mic (987,4 mg %).

18

n proba de propolis P3-Mini componenta flavonoidic predominant s-a dovedit a fi crizolul extras n etanol 60% (1512,5 mg %) urmat de extractul alcoolic 96% (1458,5 mg/ 100 g propolis). n proba P3-Mini componenta majoritar este reprezentat de acidul cafeic decelat n extractul etanolic 60% n cantitate de 1936,5 mg/ 100 g propolis. Avnd n vedere faptul c flavonoidele i acidul cafeic, urmrite n acest studiu, fac parte integrant dintr-un fitocomplex, care probabil difer substanial n funcie de provenien (n cadrul cruia raporturile ntre componente sunt altele), constatm c nu ntotdeauna aceleai componentele sunt extrase la fel n etanol de aceeai concentraie. Din analiza realizat, rezult c solventul cel mai convenabil pentru prelucrarea propolisului este etanolul 60%. Urmrirea compuilor de interes prin cromatografie de lichide de nalt presiune, n faz invers, a condus la nregistrarea unor timpi de retenie sczui pentru compuii mai polari i relativ mari n cazul flavonoidelor lipofile.

1.2. Determinarea activitii antioxidante a substanelor active din sorturile de propolis analizate Evidenierea activitii antioxidante a substanelor active din sorturile de propolis analizate a constituit un alt obiectiv al acestui studiu, avnd n vedere faptul c pe baza rezultatelor obinute se poate selecta sortul de propolis de cea mai bun calitate biologic, n vederea obinerii unor forme farmaceutice cum ar fi comprimatele bucale bioadezive. Determinarea capacitii de scavenger de radicali liberi Activitatea de scavenger de radicali liberi a fost evaluat prin msurarea capacitii de neutralizare a radicalului difenilpicrilhidrazil (DPPH), respectiv de transformare a acestuia n forma sa redus, de ctre extractele de propolis analizate. 1.2.1. Materiale i metode 1.2.1.1. Materiale S-au utilizat extractele apoase i hidroalcoolice (20%, 60% i 96%) de propolis preparate anterior, precum i soluii ale acestor extracte diluate progresiv n proporie de 1:10, 1:100, 1: 1000. 1.2.1.2. Metode Principiul metodei. Metoda se bazeaz pe msurarea abilitii de reducere a antioxidanilor legai de radicalul stabil DPPH. Datorit perechii de electroni neparticipani ai celor doi atomi de azot, el absoarbe puternic la 517 nm, soluia sa avnd culoare violet nchis. Prin reacia cu un scavenger de radicali liberi, soluia radicalului DPPH i modific culoarea din violet n galben pal datorit formrii difenilpicrilhidrazinei (DPPH-H), compus cu absorban redus la 517 nm. Ca urmare, potenialul de scavenger de radicali liberi poate fi apreciat prin msurarea reducerii absorbanei la 517 nm, dup un anumit interval de timp de la adugarea extractului la soluia de DPPH, fapt evideniat prin virajul culorii amestecului de reacie de la violet la galben. Extractele lichide de propolis au fost supuse analizei spectrofotometrice, bazat pe monitorizarea reaciei dintre DPPH, flavonoide i acid cafeic. Pe baza acestor determinri, pentru evaluarea activitii antioxidante, s-a calculat absorbana relativ (A%) conform formulei (1): A%(t ) = A517 nm (t ) 100 (1)

A517 nm (t = 0 )

n care A517 (t) este absorbana soluiei de DPPH la timpul t (dup 5 minute de la adugarea soluiei de testat), iar A517 (t=0) este absorbana iniial, corespunztoare soluiei martor (format doar din soluie DPPH i etanol 96% V/V). 19

Pentru calculul activitii de scavenger de radicali liberi DPPH, exprimat procentual s-a folosit urmtoarea formul de calcul (2): Ainitial A final (2) % activitate de scavenger = 100 Ainitial Prin urmare, din formulele (1) i (2) se obine relaia (3):

% activitate de scavenger =100 A%(t ) (3)

Cu ct A% (t) este mai mic, cu att activitatea antioxidant a probei studiate este mai mare. Mod de lucru. Msurarea absorbanei DPPH-ului se poate face fa de metanol, propanol sau etanol ca martor. n acest studiu, am efectuat citirea absorbanei soluiei de DPPH 1mM fa de alcool 96% V/V ca martor. Absorbana soluiei de DPPH trebuie s varieze n intervalul 0,95 1,05, n caz contrar absorbana se ajusteaz la aceast valoare prin adugare de alcool sau DPPH. Pentru determinarea propriu-zis a activitii de scavenger de radicali liberi a extractelor s-a procedat astfel: n cuva pentru prob a spectrofotometrului s-au introdus 0,2 ml soluie DPPH 1mM i s-a msurat absorbana acestuia fa de etanol 96% V/V. Apoi s-a adugat 0,2 ml extract de propolis i s-a agitat cu o baghet din material plastic timp, de 15 secunde. Dup 5 minute s-a nceput nregistrarea absorbanei amestecului de reacie la lungimea de und de 517 nm. Amestecul de reacie conine etanol, DPPH 1mM i probele de testat. Pentru determinarea capacitii de scavenger de radicali liberi s-a lucrat n paralel fa de martorul pozitiv cvercetol (soluie etanolic 0,5 mg/ml) i n aceleai condiii cu extractele. 1.2.2. Rezultate i discuii Activitatea antioxidant (de scavenger de radicali liberi DPPH) a extractelor s-a determinat att pentru extractele primare, ct i pentru extracte diluate i este reprezentat grafic n figura 8.
100 90 % Activitate scavengerr 80 70 60 50 40 30 20 10 0 nediluat dilutie 1:10 dilutie 1:100 dilutie 1:1000 Cvercetol P1_H2O P1_20 P1_60 P1_96 P2_H2O P2_20 P2_60 P2_96 P3_H2O P3_20 P3_60 P3_96

Concentratie (mg/ml)

Figura 8. Activitatea de scavenger a extractelor apoase i hidroalcoolice obinute din sorturile de propolis P1, P2, P3 i a cvercetolului. 1.2.3. Concluzii Datorit prezenei substanelor active cu grupri hidroxilice fenolice predispuse la oxidare (n special flavonoide i derivai polifenolici de tipul acidului cafeic), extractele de propolis analizate prezint activitate antioxidant, evideniat prin metoda DPPH. Diferenele privind aceast caracteristic sunt determinate de concentraia etanolului din mediul de extracie. Pe baza acestor considerente, se poate realiza o ierarhizare a extractelor de propolis cu activitate de scavenger de radicali liberi DPPH important astfel: - activitate antioxidant slab: mai mic de 75% - activitate antioxidant bun: ntre 75-90% 20

- activitate antioxidant foarte bun: mai mare de 90%. Cea mai bun activitate antioxidant a fost nregistrat pentru extractul fluid de propolis P2-Brzava n alcool 60%, valoarea acesteia fiind de 92,40. 1.3. Cercetri privind posibilitatea de standardizare a extractelor de propolis Este cunoscut variabilitatea larg a concentraiei principiilor active n aceeai arj de propolis comercial. Chiar dac produsul natural achiziionat provine de la aceeai prisac i se prezint sub forma unei materii prime rezinoase, mrunite, nu nseamn, c acesta are o compoziie chimic unitar, deoarece este obinut de la stupi diferii, fapt ce conduce la variaii mari ale calitii i gradului de impurificare. Pe baza acestor considerente putem afirma c diferenele vor fi semnificativ mai mari n cazul n care materia prim provine de la diverse prisci. Obiectivul acestui studiu a fost urmrirea variabilitii concentraiei componentelor active n sorturile de propolis analizate. 1.3.1. Materiale i metode Din fiecare sort de propolis s-au prelevat cte trei mostre cu aspect macroscopic ct mai diferit i apoi, din fiecare mostr s-au preparat trei tipuri de extracte hidroalcoolice (cte unul n etanol 20%, unul n etanol 60% i un al treilea n etanol 96%), la DER 5:100 (g/ml). Prin urmare, din fiecare sort de propolis (P1-Timioara, P2-Brzava i P3-Mini) s-au obinut 9 extracte hidroalcoolice, care au fost analizate prin HPLC privind coninutul n principii active: cvercetol, apigenol, kemferol, crizol, rutozid i acid cafeic. Materialele i aparatura necesare preparrii i analizei extractelor, inclusiv condiiile de cromatografiere, au fost similare celor utilizate pentru Extracia i analiza substanelor active din sorturile de propolis. 1.3.2. Rezultate i discuii Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele hidroalcoolice de propolis P1-Timioara n tabelul VII sunt redate rezultatele obinute n urma analizei HPLC a extractelor hidroalcoolice din sortul de propolis P1-Timioara. Tabelul VII. Identificarea i determinarea semicantitativ a flavonoidelor i a acidului cafeic din extractele de propolis P1-Timioara n etanol 20%, 60% i 96% V/V.
Nr. 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Cod P1_20 varianta 1 P1_20 varianta 2 P1_20 varianta 3 P1_60 varianta 1 P1_60 varianta 2 P1_60 varianta 3 P1_96 varianta 1 P1_96 varianta 2 P1_96 varianta 3 Cvercetol (mg/g) 0,298 1,128 0,469 1,357 2,500 1,256 2,280 8,704 1,665 Apigenol (mg/g) 0,289 0,773 0,213 8,132 5,047 2,721 6,323 6,989 1,617 Kemferol (mg/g) 0,222 0,137 0,164 3,544 1,430 1,330 2,923 1,601 1,601 Crizol (mg/g) 0,955 0,638 1,030 39,789 18,392 19,921 30,223 17,191 12,089 Rutozid (mg/g) 1,082 2,096 1,601 1,709 45,400 4,983 10,590 8,878 5,078 Acid cafeic (mg/g) 2,560 6,223 0,316 1,745 5,476 1,179 1,947 3,899 1,517

Extractele de propolis P1-Tm n EtOH 20 % V/V

Extractele de propolis P1-Tm n EtOH 60 % V/V

Extractele de propolis P1-Tm n EtOH 96 % V/V

n toate cazurile, independent de faptul c s-a utilizat aceeai concentraie etanolic i aceeai cantitate de propolis prelucrat, s-a constatat apariia unor diferene de concentraii pentru acelai compus bioactiv, care pot fi explicate prin neuniformitatea materiei prime, care constituie aceeai arj de propolis. Cantitatea de principii active extrase variaz direct proporional cu creterea concentraiei alcoolice. 21

Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele hidroalcoolice de propolis P2-Brzava Principiile active identificate i dozate semicantitativ din extractele analizate coninnd propolis P2-Brzava sunt nscrise n tabelul VIII. Tabelul VIII. Identificarea i determinarea semicantitativ a flavonoidelor i a acidului cafeic din extractele de propolis P2-Brzava n etanol 20%, 60% i 96% V/V.
Nr. Cod Cvercetol (mg/g) 0,386 1,324 0,505 2,743 3,095 0,731 1,092 3,053 0,897 Apigenol (mg/g) 0 0 0 3,518 4,512 1,995 4,120 5,318 1,754 Kemferol (mg/g) 0 0 0 4,034 3,198 0,939 0,715 2,588 1,023 Crizol (mg/g) 0,621 0 0,698 38,488 22,308 12,908 0 11,265 9,874 Rutozid (mg/g) 0,836 0,496 0,513 1,424 4,713 10,205 2,019 15,390 2,945 Acid cafeic (mg/g) 1,566 1,619 2,597 1,548 5,601 7,645 4,996 4,504 1,984

Extractele de propolis P2-B n EtOH 20 % V/V

1 2 3 1 2 3 1 2 3 P2_20 varianta 1 P2_20 varianta 2 P2_20 varianta 3 P2_60 varianta 1 P2_60 varianta 2 P2_60 varianta 3 P2_96 varianta 1 P2_96 varianta 2 P2_96 varianta 3

Extractele de propolis P2-B n EtOH 60 % V/V

Extractele de propolis P2-B n EtOH 96 % V/V

Din determinarea semicantitativ se observ c principiile bioactive extrase i identificate prin HPLC n acelai solvent variaz semnificativ n cazul celor trei variante (codificate 1, 2 sau 3). Aceast variabilitate semnificativ a unei componente active, n acelai tip de extract, provenind de la aceeai mostr de propolis, poate fi explicat prin neuniformitatea materiei prime. Concentraia alcoolic cea mai adecvat pentru extracie s-a dovedit a fi cea de 60% iar componenta majoritar extras a fost crizolul. Determinarea coninutului n flavonoide i acid cafeic din extractele hidroalcoolice de propolis P3-Mini Rezultatele obinute prin analiza HPLC a extractelor hidroalcoolice de propolis P3Mini sunt prezentate n tabelul IX. Tabelul IX. Identificarea i determinarea semicantitativ a flavonoidelor i a acidului cafeic din extractele de propolis P3-Mini n etanol 20%, 60% i 96% V/V.
Nr. Cod Cvercetol (mg/g) 0,468 1,784 0,449 11,008 3,951 11,355 6,111 9,362 5,617 Apigenol (mg/g) 0,332 0,349 0,370 10,339 7,117 3,455 9,614 11,140 2,080 Kemferol (mg/g) 0 0 0 0 0 1,531 3,755 0 1,089 Crizol (mg/g) 0,643 0 0,360 38,205 15,125 24,633 38,869 14,858 14,585 Rutozid (mg/g) 1,641 1,830 1,883 2,823 3,657 7,233 8,895 37,184 4,105 Acid cafeic (mg/g) 0 0 0 14,751 19,365 0 9,369 0 3,046

Extractele de propolis P3-M n EtOH 20 % V/V

1 2 3 1 2 3 1 2 3 P3_20 varianta 1 P3_20 varianta 2 P3_20 varianta 3 P3_60 varianta 1 P3_60 varianta 2 P3_60 varianta 3 P3_96 varianta 1 P3_96 varianta 2 P3_96 varianta 3

Extractele de propolis P3-M n EtOH 60 % V/V

Extractele de propolis P3-M n EtOH 96 % V/V

i n acest caz se remarc variabilitatea concentraiei n acelai compus bioactiv, care este atribuit neuniformitii materiei prime. De asemenea, concentraia alcoolic convenabil pentru extracie este cea de 60%, iar componenta flavonoidic majoritar este crizolul. 22

Analiznd cele trei variante din extractele etanolice (20%, 60% i 96%) ale fiecrui sort de propolis, se constat c, pentru a se obine un anumit tip de extract de propolis, ntreaga arj trebuie prelucrat odat i supus unei determinri cantitative care surprinde totalitatea derivailor flavonici. Prin urmare, n final, dintr-o multitudine de loturi de extracte de acelai tip s-ar putea obine, prin amestecarea lor, un extract final care va avea un anumit coninut n astfel de compui. O alt modalitate ar fi standardizarea extractelor n crizol, component principal al extractelor n alcool 60%, acesta fiind foarte bine reprezentat din punct de vedere cantitativ. Valorile concentraiei crizolului, determinate n cele trei variante de extract obinute cu etanol 60% din propolis de Timioara, Brzava i Mini sunt transpuse grafic n figura 9.
Conc. crizol in propolis (%, m/m) 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
va r1 va r3 va r1 va r2 va r2 va r3 va r1 va r2 va r3

P1 P2 P3

_6 0

_6 0

_6 0

_6 0

_6 0

_6 0

_6 0 P3

P1

P1

P1

P2

P2

P2

_6 0

Figura 9. Coninutul n crizol (g/100 g propolis) determinat prin HPLC n extractele obinute din propolis de Timioara (P1), Brzava (P2) i Mini (P3) cu etanol 60%. Comparnd valorile obinute constatm diferene extrem de importante n ceea ce privete crizolul determinat n propolis cu ajutorul tehnicii HPLC. Singura concluzie este aceea c productorul poate prevedea n fia tehnic un coninut minim de crizol extractibil n etanol 60%, i anume de 1 g/100 g propolis. n acest mod s-ar limita obinerea unor extracte cu cantitate redus de crizol prin prelucrarea unui material vegetal de proast calitate, i totodat ar permite obinerea unor extracte aduse la un anumit titru n crizol. 1.3.3. Concluzii n cele trei variante din fiecare extract hidroalcoolic 20%, 60% i 96% preparate din sorturile de propolis (P1-Tm, P2-B i P3-M) s-a obinut o variabilitate semnificativ a concentraiei n fiecare component activ, din aceeai cantitate de propolis prelucrat n acelai tip de etanol. Variabilitatea concentraiei ntr-un compus bioactiv din acelai tip de extract, este atribuit neuniformitii materiei prime. Concentraia alcoolic favorabil extraciei unor cantiti satisfctoare de principii active este cea de 60% V/V. Componenta flavonoidic, care predomin cantitativ n sorturile de propolis analizate este reprezentat de crizol. Prin prelucrarea ntregii arje de propolis, care surprinde totalitatea derivailor flavonici, se pot obine extracte aduse la un anumit titru n component majoritar (crizol). 1.4. Evaluarea statistic a rezultatelor obinute la analiza extractelor fluide de propolis n vederea caracterizrii sorturilor de propolis analizate i a extractelor hidroalcoolice obinute am aplicat analiza multivariat, care presupune utilizarea unui grup de metode statistico-matematice cu ajutorul crora se pot cerceta simultan legturile de asociere existente ntre mai mult de dou variabile. 23

P3

P3

_6 0

1.4.1. Materiale i metode Ca materiale s-au utilizat descriptorii analizai (datele HPLC, randamente i viteze de reacie a DPPH) i pachetul software Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., USA), iar metoda aplicat a fost analiza componentelor principale (PCA). 1.4.2. Rezultate i discuii Analiza multivariat a datelor de cromatografie HPLC pentru extractele de propolis (P1-Tm, P2-B, P3-M) a permis o clasificare a extractelor n funcie de tipul de propolis, calitatea acestuia sau de concentraia de etanol utilizat la extracie. Astfel, probele se grupeaz destul de bine att n funcie de temperatura de extracie, ct i de concentraia etanolului utilizat la extracie, similare din acest punct de vedere fiind extractele n etanol 60% i 96% (figura 10 a i b).

(a)

(b): imagine mrit

Figura 10. Graficul scorurilor n cazul analizei PCA a datelor de cuantificare HPLC a extractelor de propolis P1-Tm, P2-B, P3-M n EtOH 20%, 60% i 96%, la cald i la rece. 1.4.3. Concluzii n urma aplicrii metodei de analiz multivariat asupra datelor de cromatografie HPLC pentru extractele de propolis (P1-Tm, P2-B, P3-M) s-a realizat o ierarhizare a extractelor n funcie de tipul de propolis, temperatura la care s-a preparat extractul i concentraia de etanol utilizat la extracie. Responsabile pentru clasificarea n probe extrase la rece i la cald sunt concentraiile de rutozid i crizol. 1.5. Prepararea extractului uscat de propolis EP2_60 Deoarece este o mas eterogen rinoas, propolisul nu poate fi utilizat ca atare la obinerea unor comprimate bucale bioadezive, fiind necesar obinerea unui extract uscat plecnd de o form extractiv fluid. 1.5.1. Materiale i metode Obinerea extractului uscat de propolis (codificat EP2_60) s-a realizat pornind de la extractul de propolis fluid (P2_60) care s-a absorbit pe o pulbere inert (amidon), n raport de 1 : 1,5, s-a uscat, s-a pulverizat i s-a adus la o concentraie constant de principii active. 1.5.2. Rezultate i discuii Extractul uscat de propolis se prezint sub forma unei pulberi granuloase cu aspect uniform, care se pulverizeaz uor, de culoare galben, cu miros caracteristic aromat, slab higroscopic. Dup uscarea la etuv, la 105oC, timp de trei ore, dintr-un gram de extract de propolis, s-au obinut 0,96 g extract uscat. Pierderea prin uscare a amestecului de amidon i extract concentrat de propolis fiind de 4%, extractul uscat obinut corespunde prevederilor F.R. ed. aX-a, Suplimentul 2006 (cel mult 5,0 %) [11]. Concentraiile componentelor active din extractul uscat de propolis (EP2_60), determinate pe baza rezultatelor analizei HPLC a extractului fluid de propolis (P2_60), au fost urmtoarele:

24

cvercetol apigenol kemferol crizol rutozid total flavonoide acid cafeic

99 mg/100 g EP 143 mg/100 g EP 102 mg/100 g EP 711 mg/100 g EP 150 mg/100 g EP ~1221 mg/100 g extract uscat de propolis (~1,22 %) 179 mg/100 g EP

1.5.3. Concluzie Extractul uscat de propolis obinut corespunde prevederilor Suplimentului 2006 al F.R. ed. a-X-a (Extracta) din punct de vedere granulometric, al pierderii prin uscare i are un coninut de 0,711% bioflavonoide exprimate n crizol.

CAPITOLUL 2 OBINEREA I CARACTERIZAREA UNOR COMPLECI DE INCLUZIUNE AI PROPOLISULUI CU -CICLODEXTRINE Obiectivele acestei etape a studiului au fost urmtoarele: - obinerea unor compleci de incluziune ai propolisului cu -ciclodextrina i cu 2hidroxipropil- -ciclodextrina; - caracterizarea complecilor obinui. 2.1. Obinerea complecilor de incluziune ai propolisului cu -ciclodextrina 2.1.1. Materiale i metode Pentru obinerea complecilor de incluziune extract de propolis/-ciclodextrin s-au utilizat extractele fluide hidroalcoolice din sortul de propolis P1-Tm, P2-B i P3-M obinute cu etanol 20%, 60% i respectiv 96%, iar pentru complexare s-a utilizat -ciclodextrina de puritate analitic i etanol 96% v/v. Complecii de incluziune ai componentelor active din extractele de propolis cu ciclodextrina s-au obinut prin complexare n soluie, aplicnd metoda coprecipitrii [12]. 2.1.2. Rezultate i discuii Complecii de incluziune ai componentelor active din extractele de propolis cu ciclodextrina, obinui prin metoda coprecipitrii n soluie, s-au prezentat sub form de pulberi amorfe, de culoare galben, cu gust i miros aromat, caracteristic de propolis. n urma experimentelor de complexare a componentelor active din extractele alcoolice de propolis (P1-Tm, P2-B i P3-M) n -ciclodextrin, s-a constatat n toate cazurile o cretere a randamentelor de complexare-separare pe msur ce crete concentraia de etanol din amestecul hidroalcoolic utilizat pentru extracie (figura 11).
R n d (P1 , , 3, % ) = f (c , EtO H , % v/ v) 2 R n d (P1 ,%) = 68.78 07 + 0. 08 4 8* x R n d (P2 ,%) = 61.63 09 + 0. 18 3 5* x R nd (P3, %) = 61 .8 62 +0 .19 86 *x 84 82 80 78 76 74 72 70 68 66 64 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 c EtO H (%,v /v ) R n d ( P1 , %) R n d ( P2 , %) R n d ( P3 , %) c EtO H (%,v /v ):R n d (P1, %): r 2 = 0.8 81 5 c EtO H (%,v /v ):R n d (P2, %): r = 0.9 67 4 c EtO H (%,v /v ):R n d (P3, %): r = 0.8 45 3
2 2

Figura 11. Variaia randamentului total de complexare-separare n cazul complexrii extractelor de propolis P1-Tm, P2-B i P3-M n -ciclodextrin. 25

2.1.3. Concluzii Randamentele de obinere ale complecilor de incluziune extracte fluide de propolis/ -ciclodextrin variaz direct proporional cu creterea concentraiei etanolului utilizat la extracie, fapt ce demonstreaz o concentrare a substanelor active n complex n cazul utilizrii ca mediu de extracie a etanolului 60% i 96%, care permite extracia n special a compuilor mai puin polari, ce interacioneaz mult mai bine cu cavitatea ciclodextrinei, deci conduce la o ncapsulare mai eficient. Creterea a fost aproximativ liniar n toate cazurile i semnificativ n cazul probelor de propolis P2-Brzava i P3-Mini. 2.2. Evaluarea calitativ i cantitativ a complecilor de incluziune ai propolisului cu -ciclodextrina 2.2.1. Materiale i metode Complecii de incluziune ai propolisului cu -ciclodextrina, obinui n etapa de studiu anterioar, au fost analizai calitativ prin urmtoarele metode: - microscopie optic, pentru determinarea morfologiei lor n diferite intervale de mrire a acestora; s-a utilizat un microscop optic, model Nikon Eclipse E8000, cuplat cu aparat digital de achiziie a imaginilor NIKON Coolpix E4500, cu posibilitate de mrire ntre 40-600 de ori (firma Nikon); - microscopie electronic cu scanare, n vederea unei evaluri mai bune a morfologiei cristalelor i a dimensiunilor aproximative ale acestora; s-a efectuat cu ajutorul unui microscop electronic cu scanare, model JEOL JSM 5510-LV (firma Jeol); - termogravimetrie diferenial (TG-DTG), care furnizeaz date cantitative privind pierderea de mas odat cu creterea temperaturii i permite determinarea faptului dac substana oaspete sufer anumite modificri naintea degradrii termice a ciclodextrinei (250 300 C); analiza a fost efectuat cu un analizor TG 209 (firma NETZSCH), sub atmosfer de azot, n condiii dinamice (temperatur de 20 550 C i o vitez de nclzire de 10 C/min); - microcalorimetrie diferenial, care nregistreaz efectele termice care nsoesc modificarea structurii unei probe; s-a efectuat cu ajutorul unui calorimetru DSC, model 204 (firma Netzsch), dotat cu programul specific DSC Netzsch 204 Acquisition Soft/2000 pentru achiziia datelor i cu programul Netzsch Proteus-Thermal Analysis versiunea 4.0 /2000 pentru prelucrarea datelor. Determinarea coninutului de bioflavonoide exprimate n crizol, prin metoda HPLC, sa efectuat numai n cazul complexului de incluziune extract fluid de propolis P2 n etanol 60%/-ciclodextrina, deoarece extractul fluid P2_60 a avut cea mai mare concentraie de bioflavonoide exprimate n crizol (22,308 mg/g propolis), iar randamentul de obinere al complexului de incluziune al acestui extract cu -ciclodextrina a fost ridicat (~72%). 2.2.2. Rezultate i discuii Analiza prin microscopie optic Morfologia complecilor de incluziune obinui din extract de propolis P1 cu soluii etanol ap i -ciclodextrin a fost n general rombic, cu dimensiuni mai mari n cazul extractului n etanol 60% v/v, respectiv cu dimensiuni mai mici n cazul extractului n etanol 96% v/v (figura 12 a, b i c). Morfologia cristalelor obinute cu etanol 96% v/v nu este evident n cazul microscopiei optice, necesitnd analiza prin microscopie electronic.

(a)

(b)

(c)

Figura 12. Imaginea de microscopie optic (mrire de 200 de ori) a complecilor de incluziune Extract P1-Tm n: EtOH 20%/CD (a), EtOH 60%/CD (b) i EtOH 96%/CD (c). 26

n cazul complecilor de incluziune obinui cu extracte de propolis P2-B s-au obinut dimensiuni mai mari ale particulelor, cele n etanol 20% v/v fiind paralelipipedice, iar cele n alcool 60% au prezentat o morfologie romboedric (figura 13 a i b).

(a)

(b)

Figura 13. Imaginea de microscopie optic a complecilor de incluziune Extract P2-B n: etanol 20%/CD (mrire de 400 de ori) (a) i n etanol 60%/CD (mrire de 200 de ori) (b). i n cazul complecilor de incluziune obinui prin complexarea componentelor active din extractele de propolis P3-Mini n -ciclodextrin s-a observat aceeai variaie a morfologiei, n funcie de concentraia de etanol utilizat pentru extracie i anume: cristale paralelipipedice pentru extractul n etanol 20% i rombice pentru extractele efectuate cu etanol 60% respectiv 96% (figura 14 a, b i c).

(a)

(b)

(c)

Figura 14. Imaginea de microscopie optic a complecilor de incluziune Extract P3-M n: etanol 20%/CD ( mrire de 400 de ori) (a) etanol 60%/CD (mrire de 200 de ori) (b), etanol 96%/CD (mrire de 200 de ori) (c). Analiza prin microscopie electronic cu scanare Analiza prin microscopie electronic cu scanare (SEM) a complecilor de incluziune ai extractelor de propolis/-ciclodextrin a relevat morfologia paralelipipedic n cazul extractului obinut cu etanol 20%, respectiv romboedric n cazul incluziunilor ciclodextrinei cu extractul hidroalcoolic 96% . n cazul complexului de incluziune ale componentelor active din extractul de propolis P1-Timioara n etanol 20%/-ciclodextrin, s-au observat dimensiuni mai mari ale cristalelor (de ordinul sute de nanometri-micrometri, figura 15 a), comparativ cu cele ale particulelor obinute cu extract de propolis P1-Tm n etanol 96%/ -ciclodextrin care au fost de mrimi submicronice (sute de nanometri, figura 15 b).

(a)

(b)

Figura 15. Imaginea de microscopie electronic cu scanare (mrire de 2400 de ori) a complecilor de incluziune Extract P1-Tm n: etanol 20%/CD (a) i etanol 96%/CD (b). 27

n cazul incluziunilor extractelor hidroalcoolice de propolis P2- Brzava n ciclodextrin s-a observat aceeai morfologie a cristalelor (dei nu cu o uniformitate prea ridicat): paralelipipedice n cazul extractelor n etanol 20% V/V (figura 16 a), respectiv romboedrice n cazul extractelor n alcool 96% V/V (figura 16 b).

(a)

(b)

Figura 16. Imaginea de microscopie electronic cu scanare (SEM) a complecilor de incluziune Extract P2-Brzava n etanol 20% /CD (mrire de 600 de ori) (a) i n etanol 96% /CD (mrire de 2400 de ori) (b). n cazul incluziunilor extractelor hidroalcoolice de propolis P3-Mini cu ciclodextrina, s-a observat o morfologie paralelipipedic a cristalelor pentru cele preparate cu etanol 20% (figura 17a) respectiv romboedric n cazul extractelor n etanol 96% (figura 17b).

(a)

(b)

Figura 17. Imaginea de microscopie electronic cu scanare a complecilor de incluziune Extract P3-Mini n: etanol 20% / CD (mrire de 600 de ori) (a) i n etanol 96% / CD (mrire de 2400 de ori) (b). Analiza prin termogravimetrie diferenial (TG-DTG) A indicat faptul c exist o diferen semnificativ ntre profilurile complecilor obinui i cele ale materialelor iniiale (extract fluid i -ciclodextrin). Astfel, n cazul incluziunilor obinute prin complexarea extractelor de propolis n -ciclodextrin analizele TG-DTG au indicat n general o pierdere de mas cuprins ntre 5 10,5% pentru prima parte a termogramei (20 100 C), respectiv ntre 1,5 3% pentru intervalul 100 250 C. Figurile 18 i 19 prezint termogramele nregistrate pentru complexul obinut cu extractul etanolic 60% de propolis P2-Brzava.

Figura 18. Termograma TG-DTG a complexului Extract P2-B n EtOH60%/CD (20-520 C).

28

Figura 19. Termograma TG-DTG a complexului Extract P2-B n EtOH60%/CD (20-225 C).

Analiza prin microcalorimetrie diferenial A evideniat faptul c exist un procent de componente active din propolis ncapsulate n ciclodextrin, care sunt eliberate la temperaturi mai nalte (peste 150 C), ns o proporie nsemnat de ap (i foarte probabil i etanol utilizat n procesul de complexare) rmne n complex. n cazul incluziunilor -ciclodextrinei cu extractele de propolis n etanol 60% i 96%, concentraia substanelor active (flavonoide i derivai polifenolici de tip acid cafeic) este mai nsemnat, faptul fiind evideniat de prezena unui semnal larg, cu efect energetic endoterm mai redus comparativ cu efectul datorat eliberrii moleculelor de ap (i probabil de etanol). Acest semnal a fost evideniat, mai mult sau mai puin, n toate probele ce conin extract de propolis n etanol 60% sau 96% i se datoreaz eliberrii compuilor activi din complex, aprnd n domeniul de temperatur 160 250 C, cu un efect endoterm cuprins ntre 20 95 J/g (figurile 20 i 21).

Figura 20. Termograma DSC pentru complexul de incluziune Extract de propolis P2-B la cald n etanol 60% / -ciclodextrin (P2bCD_60).

Figura 21. Termograma DSC pentru complexul de incluziune Extract de propolis P2-B la rece n etanol 60% / -ciclodextrin (2A60C1-bCD).

29

Determinarea coninutului de bioflavonoide exprimate n crizol al complexului extract fluid de propolis P2 n etanol 60% cu -ciclodextrina n figura 22 este prezentat cromatograma HPLC a soluiei complexului de incluziune P2_bCD.

Figura 22. Cromatograma HPLC a soluiei de complex P2_bCD. Utiliznd valoarea ariei corespunztoare crizolului (1271,1 uniti de arie) i ecuaia curbei de etalonare construit pentru crizolul etalon, s-a calculat concentraia acestuia n complexul de incluziune P2_bCD; valorarea obinut a fost de 1,27%. 2.2.3. Concluzii n urma evalurii morfologiei incluziunilor extract de propolis/-ciclodextrin prin microscopie optic i microscopie electronic cu scanare s-au desprins urmtoarele concluzii: Morfologia incluziunilor este paralelipipedic n cazul utilizrii la complexare a extractelor cu etanol 20%, respectiv romboedric n cazul celor obinute cu alcool 96% (pentru toate cele trei tipuri de propolis P1-Tm, P2-B i P3-M ncapsulat; cu o uniformitate mai mic n cazul sortului P2-B i P3-M). Dimensiunile complecilor de incluziune sunt mai mari n cazul extractului n etanol 20% (de ordinul sutelor de nanometri-micrometri), comparativ cu dimensiunile complecilor obinui cu extract de propolis P1-Timioara n etanol 96%, care a prezentat dimensiuni submicronice. Din analizele termogravimetrice ale complecilor de incluziune obinui se pot concluziona urmtoarele: S-a remarcat o diferen semnificativ ntre profilurile complecilor de incluziune i cele ale materialelor iniiale. n cazul complecilor de incluziune ai -ciclodextrinei cu extractele de propolis, analizele TG-DTG au indicat o pierdere de mas cuprins ntre 5 10,5% pentru prima parte a termogramei (20 100 C), respectiv ntre 1,5 3% pentru intervalul 100 250 C. Incluziunile -ciclodextrinei cu extractele de propolis P1-Mini, sufer o pierdere de mas de 5,2 9,4% n intervalul 20 100 C, respectiv 1,6%, 2,9%, 2,1% pentru intervalul 100 225C, pierderi de mas corespunztoare extractelor n etanol 20%, 60% i 96%. De asemenea se observ c exist o diferena semnificativ ntre pierderea de mas din cazul extractului n alcool 20% (1,6%), comparativ cu cele din cazul extractelor de concentraie etanolic mai ridicat, (optimul a fost de 2,9% pentru extractul n alcool 60%). Analiza TG DTG privind pierderea de mas n intervalul 100 225 C indic faptul c incluziunile -ciclodextrinei cu extracte etanolice de propolis P2-Brzava se comport similar cu cele ale extractului de propolis P1-Timioara, ns diferenele sunt mai puin semnificative, astfel c n cazul incluziunilor -CD cu extractul n alcool 20% pierderea de mas n acest interval este de doar 1,5%, iar pentru celelalte dou cazuri aceasta este destul de apropiat (~2,2%). 30

 n cazul complecilor -ciclodextrinei cu extracte de propolis P3-Mini, aceast dependen nu mai este aa de evident (pierderile de mas pe intervalul 100 225C au fost de 2,4%, 1,7% i 2,2% pentru complecii obinui cu extractele de propolis P3-M n etanol 20%, 60% i, respectiv, 96%). Analiza de calorimetrie de scanare diferenial a evideniat urmtoarele: Componentele din propolis ncapsulate n ciclodextrin sunt eliberate la temperaturi peste 150 C, iar o proporie nsemnat de ap i de etanol utilizat n procesul de complexare rmne n complex. Concentraia componentelor active analizate este mai mare n cazul incluziunilor ciclodextrinei cu extracte de propolis P1-Tm, P2-B, P3-M preparate cu etanol mai concentrat (60% i 96%), fapt evideniat de prezena unui semnal larg (situat n domeniul de temperatur 160 250 C) i cu efect energetic endoterm mai redus (cuprins ntre 20 95 J/g,) n comparaie cu efectul datorat eliberrii moleculelor de ap i de etanol. Analiza DSC a complecilor de incluziune a -ciclodextrinei cu extractele de propolis la rece, n ap sau etanol 20%, nu evideniaz eliberarea principiilor active din sorturile de propolis, chiar dac acestea exist n extract, deoarece nu s-a observat apariia semnalelor la peste 160 C. Aceasta se explic prin faptul c biocompuii extrai din propolis n alcool 20% sunt prea hidrofili i voluminoi, nct nu permit ncapsularea n ciclodextrin. n cazul complecilor obinui cu extracte de propolis, la rece, n etanol de concentraie ridicat (60% i 96%), semnalul corespunztor eliberrii componentelor active urmrite din propolis apare n toate cazurile n domeniul 160-250 C, cu un efect energetic endoterm n intervalul 23-130 J/g. Utilizarea unor volume de solvent de extracie mai mici, determin apariia unui efect energetic mai mare, comparativ cu cazul volumelor mai mari unde, probabil, compuii sunt n concentraie mai mic. Prin urmare, raportul substane active: ciclodextrin este mai mic, iar fora motrice n cazul ncapsulrii este, de asemenea, mai mic. Coninutul de bioflavonoide exprimate n crizol al complexului de incluziune extract fluid de propolis P2 n etanol 60% cu -ciclodextrina a fost de 1,27%, valoare calculat pe baza rezultatelor analizei HPLC a complexului. Dintre complecii de incluziune ai -ciclodextrinei cu extractele fluide de propolis a fost selecionat n vederea preparrii comprimatelor bucale bioadezive complexul realizat cu extractul fluid de propolis P2_60, datorit calitii sale superioare n ceea ce privete coninutul n bioflavonoide exprimate n crizol i parametrii caracteristici complexrii. 2.4. Obinerea complecilor de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil-ciclodextrina prin metoda n past Datorit faptului c la prepararea complecilor de incluziune ai componentelor active din extractul de propolis P1-Tm_60 cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina prin metoda coprecipitrii n soluie s-a constatat c randamentul de obinere a complecilor a fost sczut i nu s-a dispus de o cantitate suficient pentru analizele corespunztoare, s-a recurs la obinerea acestora prin metoda n past. Obiectivele acestei etape de studiu au fost obinerea complecilor de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina i analiza complecilor obinui. 2.4.1. Materiale i metode n acest studiu s-au folosit: extractele de propolis P1-Tm_60, P2-B_60 i P3-M_60 (obinute n experimentele anterioare); 2-Hidroxipropil--ciclodextrina (CycloLab). Complecii de incluziune extract de propolis P1-Tm_60, P2-B_60, P3_60/2HPbCD sau obinut prin metoda n past. 2.4.2. Rezultate i discuii Complecii de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina, obinui prin metoda n past, au avut aspectul unei pulberi amorfe, de culoare galben, cu gust i miros aromat, caracteristic de propolis. 31

Obinerea complecilor de incluziune extract de propolis/2HPbCD prin metoda n past s-a realizat cu randamente masice de 97-98%, pierderile fiind, n principal, datorate tehnologiei de lucru (obinerea pastei la cald n mojar, triturare cu rcire lent timp de o or, uscare la rece i n final retriturare). Dei metoda prin cristalizare din soluie conduce la produse uor caracterizabile din punct de vedere fizico-chimic, randamentul obinut n acest caz a fost prea sczut pentru a putea fi luat n considerare; prin urmare cea mai potrivit metod de obinere a complecilor 2HPbCD cu extract din propolis este cea n past. 2.4.3. Concluzie Prepararea complecilor de incluziune extracte de propolis/2HPbCD prin metoda n past este mai eficient ca metod de complexare comparativ cu metoda coprecipitrii n soluie, deoarece randamentele de obinere a complecilor au fost mai mari (97- 98%). 2.5. Evaluarea calitativ i cantitativ a complecilor de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina obinui prin metoda n past 2.5.1. Materiale i metode Complecii de incluziune ai propolisului cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina obinui prin metoda n past, au fost analizai din punct de vedere calitativ prin metoda microscopiei optice i prin metoda calorimetric de scanare diferenial, n condiiile descrise n subcapitolul 2.2.1. Determinarea coninutului de bioflavonoide exprimate n crizol, prin metoda HPLC, sa efectuat numai n cazul complexului de incluziune extract fluid de propolis P2 n etanol 60%/2-hidroxipropil--ciclodextrina, din motivele prezentate n subcapitolul 2.2.1. 2.5.2. Rezultate i discuii Analiza prin microscopie optic Analiza prin microscopie optic a complecilor de incluziune obinui n urma complexrii extractului hidroalcoolic (60%) de propolis din sorturile P1, P2 i P3 cu 2HPbCD a indicat n toate cazurile produse cristaline (dar nu foarte bine formate) cu forme paralelipipedice de dimensiuni de ordinul micrometrilor (figura 23 a, b i c).

(a)

(b)

(c)

Figura 23. Imaginea de microscopie optic (mrire de 400 de ori) a complexului de incluziune (obinut prin metoda n past) extract de propolis P1_60 / 2HPbCD (a), P2_60 / 2HPbCD (b) i P3_60 / 2HPbCD (c).

Analiza prin calorimetrie de scanare diferenial n cazul complexului 2HPbCD cu extract de propolis P2_60, pierderea prin deshidratare pn la ~135-140 C a fost de 676 J/g, iar disocierea complexului de incluziune a fost de ~76 J/g (pe intervalul de 150-280 C) (figurile 24 i 25).

32

DSC /(mW/mg) exo

[1]

0.5

0 Area: -675.8 J/g Peak: 155.0 C -0.5 Area: -75.24 J/g

-1.0 Peak: 290.0 C Peak: 93.0 C 50 100 150 200 250 300 T emperature /C 350 400 450

Figura 24. Termograma DSC a complexului Extract de propolis P2_60 / 2HPbCD pe ntreg domeniul de analiz.

DSC /(mW/mg) exo -0.20 -0.30 -0.40 -0.50 -0.60 -0.70 -0.80 -0.90

[1]

Area: -675.8 J/g Peak: 155.0 C

Area: -75.24 J/g

Peak: 290.0 C

50

100

150

200

250 300 Temperature /C

350

400

450

Figura 25. Termograma DSC a complexului Extract de propolis P2_60 / 2HPbCD pe domeniul de analiz reprezentativ pentru ncapsularea molecular. Determinarea coninutului de bioflavonoide exprimate n crizol al complexului extract fluid de propolis P2 n etanol 60% cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina n figura 26 este prezentat cromatograma HPLC a soluiei complexului de incluziune P2_HPbCD.

Figura 26. Cromatograma HPLC a soluiei de complex P2_HPbCD. Utiliznd valoarea ariei corespunztoare crizolului (932,8 uniti de arie) i ecuaia curbei de etalonare construit pentru crizolul etalon, s-a calculat concentraia acestuia n complexul de incluziune P2_HPbCD; valorarea obinut a fost de 0,937 %. 33

2.5.3. Concluzii Datele furnizate de microscopia optic au condus la concluzia c complecii de incluziune ai componentelor active din extractele de propolis n 2HPbCD se prezint sub forma unor produse cristaline cu forme paralelipipedice avnd dimensiuni de ordinul micrometrilor. Analiza DSC a indicat faptul c extractul de propolis P1_60 complexat n 2HPbCD prezint concentraii relativ reduse de substane active din propolis comparativ cu incluziunile extract de propolis P2_60 i P3_60/ 2HPbCD. Calorimetria de scanare diferenial confirm faptul c complexul 2HPbCD cu extract de propolis P2_60 este cel corespunztor pentru prelucrarea farmaceutic, deoarece prezint un coninut mult mai redus de ap de cristalizare n complexul final comparativ cu incluziunea extract de propolis P3_60/ 2HPbCD i o incluziune molecular a componentelor active mult mai eficient. Coninutul de bioflavonoide exprimate n crizol al complexului de incluziune extract fluid de propolis P2 n etanol 60% cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina a fost de 0,937 %, valoare calculat pe baza rezultatelor analizei HPLC a complexului. Dintre complecii de incluziune ai 2-hidroxipropil--ciclodextrinei cu extractele fluide de propolis a fost selecionat n vederea preparrii comprimatelor bucale bioadezive complexul realizat prin metoda n past cu extractul fluid de propolis P2_60, datorit calitii sale superioare n ceea ce privete coninutul n bioflavonoide exprimate n crizol i parametrii caracteristici complexrii.

CAPITOLUL 3 FORMULAREA, PREPARAREA I CONTROLUL CALITII UNOR COMPRIMATE BUCALE BIOADEZIVE CU PROPOLIS 3.1. Formularea comprimatelor bucale bioadezive cu propolis ncorporarea formelor prelucrate ale propolisului (extract uscat i compleci de incluziune cu -ciclodextrine) n comprimate bucale mucoadezive ofer posibilitatea administrrii acestor forme prelucrate n asociere cu diferii excipieni (carbomeri, polivinilpirolidon, sorbitol, stearat de magneziu etc.) folosii i la obinerea formelor farmaceutice solide bucale convenionale, asigurnd astfel proprieti bioadezive adecvate i o eliberare prelungit a principiilor active, ceea ce conduce la mbuntirea efectului terapeutic [13-19]. 3.1.1. Materiale i metode Stabilirea coninutului de component activ/comprimat Coninutul de component activ din formularea comprimatelor bucale bioadezive studiate, s-a stabilit astfel nct s fie echivalent, n ceea ce privete concentraia bioflavonoidelor exprimate n crizol, cu 50 mg propolis (tabelul X). Tabelul X. Cantitile componentelor active/comprimat i coninutul n flavonoide al acestora, echivalent cu 50 mg propolis.
Componenta activ (cod) Extract de propolis uscat (EP2_60) Complex extract de propolis P2 n etanol 60% / -ciclodextrin (P2_bCD) Complex extract de propolis P2 n etanol 60% / 2-hidroxipropil--ciclodextrin (P2_HPbCD) Coninutul n bioflavonoide exprimate n crizol (%) 0,711 1,27 0,94 Cantitatea de component activ/comprimat de 0,250 g (g) 0,157 0,088 0,119

34

Stabilirea formulelor de preparare a comprimatelor pe baz de propolis studiate Pentru fiecare dintre cele trei componente active s-au realizat cte trei formulri de comprimate, n care s-a meninut constant concentraia de Kollidon VA 64 (15,2%), concentraia sorturilor de Carbopol (4%) i cea de lubrifiant, stearat de magneziu (0,8%). n aceste formulri, cele dou sorturi de carbopol s-au utilizat singure sau asociate n raport de 1:1, iar concentraia sorbitolului, folosit ca diluant i edulcorant, a prezentat variaii n funcie de proporiile celorlalte componente. Cantitatea de polimeri se ncadreaz n procentele (30-50%) recomandate. Compoziia celor 9 formulri de comprimate bucale bioadezive studiate (F1-F9) este prezentat n tabelul XI. Tabelul XI. Compoziia formulrilor de comprimate bucale bioadezive studiate. Componente Extract uscat EP2_60 Complex P2_bCD Complex P2_HPbCD Kollidon VA 64 Carbopol 971 P NF Carbopol 981 Sorbitol Stearat de magneziu Total/comprimat (mg) Cantitatea (n mg i %) F4 F5 F6 F7 88 35,2 38 15,2 10 4 112 44,8 2 0,8 250 88 35,2 38 15,2 10 4 112 44,8 2 0,8 250 88 35,2 38 15,2 5 2 5 2 112 44,8 2 0,8 250 119 47,6 38 15,2 10 4 81 32,4 2 0,8 250

F1 157 62,8 38 15,2 10 4 43 17,2 2 0,8 250

F2 157 62,8 38 15,2 10 4 43 17,2 2 0,8 250

F3 157 62,8 38 15,2 5 2 5 2 43 17,2 2 0,8 250

F8 119 47,6 38 15,2 10 4 81 32,4 2 0,8 250

F9 119 47,6 38 15,2 5 2 5 2 81 32,4 2 0,8 250

Analiza proprietilor amestecului de pulberi n vederea comprimrii directe, amestecul de componente pulverulente al fiecrei formulri a fost caracterizat n ceea ce privete gradul de finee i proprietile de curgere, utiliznd: site farmaceutice (sita nr. 355 i sita nr. 180, F.R. X, Supliment 2001); dispozitiv mecanic adaptat pentru micri verticale n vederea tasrii pulberilor; balan electronic de precizie (Partner WPS 200); amestector cubic (tip Erweka). 3.1.2. Rezultate i discuii Stabilirea formulelor de preparare a comprimatelor pe baz de propolis studiate n figura 27 este reprezentat variaia procentual a coninutului tuturor componentelor utilizate la prepararea celor nou formulri.

35

100%

Conc. componentei (% m/m) ))

80% Stearat de magneziu Sorbitol 60% Carbopol 981 Carbopol 971 P NF 40% Kollidon VA 64 Complex P2_HPbCD Complex P2_bCD 20% Extract uscat EP2_60

0% F1 F2 F3 F4 F5

Formularea

F6

F7

F8

F9

Figura 27. Variaia coninutului (n %) componentelor n cele trei serii de formulri de comprimate bucale bioadezive studiate. Determinarea gradului de finee al amestecului de pulberi Rezultatele obinute au evideniat c amestecurile de pulberi analizate au trecut n totalitate (cazul formulrilor F2, F3, F5, F7, F8 i F9) sau n proporie de peste 99% (cazul formulrilor F1, F4 i F6) prin sita nr. 355 i n proporie de cel mult 38,5% prin sita nr.180. Aceste rezultate se ncadreaz n prevederile Suplimentului 2001 al F.R. X (Clasificarea granulometric a pulberilor prin cernere), astfel nct, din punct de vedere al gradului de finee, toate amestecurile de pulberi analizate au fost pulberi moderat de fine. Caracterizarea curgerii amestecului de pulberi n urma acestei determinri s-a constatat c toate amestecurile de pulberi analizate prezint o curgere bun, avnd valori ale indicelui Haussner mai mici dect 1,25 [20-23]. Pe baza valorilor indicelui Carr, capacitatea de curgere a amestecurilor de pulberi examinate a fost: excelent n cazul formulrilor F4 i F6; bun n cazul formulrilor F1,F3 i F7; satisfctoare n cazul formulrilor F2, F5, F8 i F9. 3.1.3. Concluzii Au fost realizate 9 formulri de comprimate, cte 3 pentru fiecare component activ obinut din sortul de propolis P2-Brzava (extract uscat, complex incluziune extract fluid de propolis P2 n etanol 60% cu -ciclodextrina i complex incluziune extract fluid de propolis P2 n etanol 60% cu 2-hidroxipropil -ciclodextrina). Fiind comprimate experimentale, concentraia de component activ a fost n conformitate cu preparatele farmaceutice dozate solide existente pe pia, adic echivalent n ceea ce privete concentraia bioflavonoidelor exprimate n crizol, cu cea din 50 mg propolis. ns, n formulri s-au utilizat doi polimeri hidrofili din grupa carbomerilor, Carbopol 971 P NF i Carbopol 981, singuri sau asociai n raport de 1:1; n toate formulrile, concentraia de carbomer a fost de 4%. S-au ales aceti polimeri hidrofili, deoarece prezint proprieti bioadezive excelente, avantajoase n cazul aplicrii comprimatelor pe mucoasa bucal. n ceea ce privete gradul de finee, amestecurile de pulberi destinate comprimrii corespund unor pulberi moderat de fine. Dei, dintre amestecurile de pulberi destinate comprimrii, doar dou au prezentat o curgere excelent, s-a considerat, pe baza valorilor indicilor Haussner i Carr obinute, c sunt adecvate pentru comprimarea direct.

36

3.2. Prepararea comprimatelor bucale bioadezive cu propolis Pentru obinerea celor 9 formulri de comprimate, amestecurile de pulberi formulate i caracterizate n subcapitolul 3.1., dup cntrire, cernere i amestecare/omogenizare au fost comprimate direct, cu ajutorul unei maini de comprimat cu excentric Korsch EK0 monopost, cu dou matrie, utiliznd poansoane cu diametrul de 9 mm i fee plane, aplicnd o presiune de comprimare de 8-10kN. 3.3. Controlul calitii comprimatelor bucale bioadezive obinute 3.3.1. Materiale i metode Calitatea comprimatelor bucale bioadezive pe baz de propolis a fost evaluat prin determinri fizico-chimice (examenul caracterelor macroscopice: aspect, gust, miros, culoare; determinarea caracterelor dimensionale diametru i grosime; determinarea pH-ului; dozarea; determinarea capacitii de mbibare) i farmacotehnice (uniformitatea masei; uniformitatea coninutului; rezistena mecanic la rupere i la abraziune-friabilitatea; evaluarea bioadezivitii; testul de dizolvare) [23]. Determinarea uniformitii masei comprimatelor s-a efectuat conform prevederilor F.R. X, Supliment 2004 [24], utiliznd o balan electronic de precizie model WPS 200 (firma Partner). Determinarea caracterelor dimensionale (diametru i grosime) s-au msurat automat, folosind un dispozitiv modern PTB, model 311E (firma Pharma Test). Determinarea pH-ului s-a efectuat poteniometric, conform F.R, cu ajutorul unui pHmetru portabil Sension, model 51935-00 (firma Hach). Dozarea bioflavonoidelor exprimate n crizol s-a efectuat conform prevederilor F.R. X, aplicnd metoda HPLC, n aceleai condiii de cromatografiere descrise la caracterizarea componentelor active (cap. 1). Determinarea rezistenei mecanice a comprimatelor s-a efectuat cu ajutorul aparatului PTB 311E, folosit i pentru determinarea diametrului i grosimii. Determinarea friabilitii s-a realizat cu ajutorul unui friabilator EF-2 (firma Electrolab). Determinarea capacitii de mbibare s-a efectuat folosind aparatul de testare a dizolvrii comprimatelor, model SR8 PLUS cu staie de testare DISOETTE 2 II 27-6A (firma Hanson Research). Determinarea capacitii de adeziune a comprimatelor s-a realizat cu ajutorul unui dispozitiv experimental, prevzut cu o balan analitic mecanic model WA-21 (Polskie Zakady Mechaniki Precyzyjnej, Polonia), adaptat pentru evaluarea capacitii de adeziune a comprimatelor. Testul de dizolvare s-a efectuat conform prevederilor oficiale (F.R. X, Dizolvare), cu ajutorul unui sistem automat de testare a dizolvrii, model SR8 PLUS cu staie de testare DISOETTE 2 II 27-6A (firma Hanson Research), care funcioneaz pe baza principiului descris n farmacopei pentru aparatul cu palet (aparatul nr. 2), termostatat, n condiii nonsink [25-27]. Probele prelevate n timpul testului de dizolvare au fost supuse procedurii de dozare, care s-a efectuat spectrofotometric n UV, la 337 nm, folosind un spectrofotometru UV-VIS model M501 (firma Camspec), dotat cu programul UV-Vis Analyst, versiunea 4.67. 3.3.2. Rezultate i discuii Examenul caracterelor macroscopice (aspect, gust, miros, culoare) a evideniat forma de discuri i aspectul uniform al comprimatelor, suprafaa plan i margini intacte; gust dulce aromat; miros caracteristic (de propolis); culoare galben pai i pigmentri de culoare galben-brun, omogen repartizate n mas. Determinarea uniformitii masei comprimatelor a relevat faptul c abaterea procentual fa de masa medie a variat ntre 1,49 i 1,59, comprimatele bucale bioadezive studiate corespunznd prevederilor oficiale referitoare la uniformitatea masei.

37

Determinarea caracterelor dimensionale (diametru i grosime) Valorile medii ale celor doi parametri dimensionali (diametru i grosime) ai comprimatelor evaluate sunt indicate n tabelul XII. Tabelul XII. Caracterele dimensionale i farmacotehnice ale comprimatelor studiate.
Formularea F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 Diametrul mediu (mm) 9,03 9,02 9,03 8,99 8,99 9,00 9,00 9,00 9,01 Grosimea medie (mm) 4,45 4,23 4,16 4,05 4,04 4,05 4,07 4,14 4,06 Rezistena mecanic medie (N) 130,4 127,5 20,9 14,1 12,4 40,9 16,7 20,9 98,1 Friabilitatea % 1,0 1,0 0,8 1,0 1,0 0,5 1,0 0,3 1,0

Comparnd grosimea medie a comprimatelor analizate pentru cele 9 formulri, se observ c n cazul formulrilor coninnd compleci de incluziune ai ciclodextrinelor (F4F9), valorile acestui parametru au fost mai mici dect n cazul formulrilor cu extract uscat de propolis, evideniind efectul favorabil al ciclodextrinelor asupra compresibilitii amestecurilor de pulberi respective. Determinarea pH-ului comprimatelor bucale bioadezive a condus la observaia c valorile acestui parametru se ncadreaz n normativele n vigoare, fiind n limitele pH-ului fiziologic (5,8-7,6). Dozarea bioflavonoidelor exprimate n crizol a condus la obinerea rezultatelor indicate n tabelul XIII. Tabelul XIII. Rezultatele analizei HPLC pentru determinarea coninutului de bioflavonoide, exprimate n crizol/comprimat.
Nr. crt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Masa de pulbere luat n lucru (g) 2,623 2,795 2,853 3,005 2,840 2,796 2,764 2,791 2,971 Arie crizol prob 468 495 517,5 553 533 530 520 504 527 Cantitate crizol declarat (mg/compr.) 1,115 1,115 1,115 1,115 1,115 1,115 1,115 1,115 1,115 Cantitate crizol determinat (mg/compr.) 1,1131 1,1107 1,1155 1,1130 1,1128 1,1139 1,1104 1,1083 1,1092 Procentul de crizol regsit (%) 99,820 99,614 100,052 99,833 99,799 99,904 99,591 99,403 99,485

Formularea F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9

Valorile procentului de regsire, obinute pentru comprimatele analizate, arat faptul c toate formulrile corespund prevederilor F.R. X (Compressi.Tabulettae) n ceea ce privete coninutul declarat n component activ pe comprimat, deoarece abaterile procentuale se ncadreaz n limitele admise. Determinarea rezistenei mecanice a comprimatelor Influena unor variabile de formulare (sortul de carbomer, prezena ciclodextrinelor) asupra grosimii i rezistenei mecanice a comprimatelor studiate este redat n figura 28.

38

Rezistenta mecanica medie compr. (N) m

5 Grosime medie compr. (mm) m 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7

Seria 1 Seria 2 Seria 3

140 120 100 80 60 40 20 0

Seria 1 Seria 2 Seria 3

F8

F9

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

Formularea

Formularea

(a) (b) Figura 28. Variaia grosimii (a) i rezistenei mecanice (b) a comprimatelor bucale bioadezive studiate n funcie de variabilele de formulare. n cazul formulrilor seriei 1, coninnd ca i component activ extract uscat de propolis, se constat c prezena Carbopolului 971 P NF (formularea F1) sau a Carbopolului 981 (formularea F2) conduce la comprimate cu o rezisten mecanic mare; n schimb, asocierea celor doi carbomeri n aceeai formulare (F3) determin o scdere semnificativ a rezistenei mecanice. n seria 2 de formulri, coninnd ca i component activ complexul ciclodextrinic P2_bCD, asocierea celor doi carbomeri conduce la comprimate cu rezisten mecanic superioar celei corespunztoare formulrilor preparate cu un singur sort de Carbopol (F4 i F5), pentru care valorile acestui parametru au fost foarte apropiate. Formulrile seriei 3, coninnd complexul ciclodextrinic P2_HPbCD, s-au comportat n mod asemntor celor din seria 2, dei valorile rezistenei mecanice au fost uor mai crescute. Din analiza comparativ a celor 3 serii, se observ c dintre formulrile coninnd un singur carbomer, cele pe baz de extract uscat de propolis (F1 i F2) au prezentat cele mai mari valori ale rezistenei mecanice, n timp ce valorile acestui parametru pentru formulrile pe baz de complex ciclodextrinic P2_HPbCD (F7 i F8) i P2_bCD (F4 i F5) au reprezentat doar 15%, respectiv 10% din primele. n cazul asocierii celor doi carbomeri, rezistena mecanic a formulrilor din serii a variat n ordinea F9 > F6 > F3, fapt ce poate fi datorat prezenei ciclodextrinelor n formulri. Determinarea friabilitii Rezultatele testului de friabilitate efectuat pentru cele 9 formulri au evideniat urmtoarele aspecte: - rezistena la abraziune nu depinde n mod special de componena formulrii, ci mai degrab de dimensiunea cristalelor fiecrei pulberi luate n lucru; - diferena de cristalinitate determin creterea friabilitii astfel coninutul de pulberi foarte fine, cum sunt cele de carbopol determin o mbuntire a friabilitii, fapt observat n cazul formulrilor cu coninut crescut de pulberi fine (F3, F6 i F8); - prezena extractului uscat de propolis i a complexelor ciclodextrinice P2_bCD i P2_HPbCD alturi de cei doi carbopoli determin o mbuntire a rezistenei la friabilitate a comprimatelor cazul formulrilor F3 i F6; - prezena alturi de cei doi carbopoli a complexului ciclodextrinic P2_HPbCD determin o friabilitate crescut a comprimatelor; - n toate cazurile, friabilitatea nu depete limita maxim admis (1%), indicnd o rezisten satisfctoare a comprimatelor analizate. Determinarea capacitii de mbibare Variaia i evoluia factorului de mbibare n funcie de timp sunt reprezentate grafic n figura 29.

39

Factor de imbibare (%m/m)))

120 100 80 60 40 20 0 5 10 15 20 25 30 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9

Timp (min)

Figura 29. Variaia factorului de mbibare n timp. Este cunoscut faptul c factorul de mbibare depinde de hidrofilia formulrii testate, deci de capacitatea excipienilor i a componentei active de a lega apa. Analiza valorilor factorului de mbibare pentru comprimatele cu extract uscat de propolis permite evaluarea influenei carbomerilor asupra acestui parametru, astfel: cea mai bun mbibare o prezint formularea F3, n care cei doi polimeri hidrofili sunt asociai, n timp ce formularea F2 a prezentat cel mai mic factor de mbibare, datorit prezenei Carbopolului 981. Toate cele 3 formulri au absorbit o cantitate mare de ap n primele 20 minute, timp n care are loc hidratarea total a polimerilor prin ptrunderea apei n spaiile interstiiale dintre particule, iar ulterior s-a nregistrat o cretere mai lent a masei comprimatelor. Spre deosebire de comprimatele cu extract de propolis, n formulrile cu concentraii mari de compleci de incluziune cu ciclodextrine (F4-F9), aciunea carbomerilor asupra capacitii de mbibare s-a diminuat, influen decisiv avnd ciclodextrinele. Astfel, n seria formulrilor cu complex P2_bCD, se constat c -ciclodextrina determin scderea factorului de mbibare, ns asocierea complexului cu carbopol 971 P NF (F4 i F6) mrete hidrofilia comprimatelor, chiar i n prezena Carbopolului 981 (F6). n cazul formulrii F6, comprimatele au absorbit o cantitate mare de ap n primele 15 min, apoi creterea masei a fost mult mai lent. Formularea F4 a prezentat o cretere exponenial a masei n timp, fiind caracterizat de o mbibare progresiv, n timp ce factorul de mbibare al formulrii F5 a variat aproape liniar. n seria formulrilor cu complex P2_HPbCD, s-au nregistrat valori mai mari ale factorului de mbibare dect cele obinute pentru primele dou serii, fiind evident influena 2-hidroxipropil--ciclodextrinei, manifestat prin creterea hidrofiliei comprimatelor. Formulrile F7 i F9 au prezentat n timp o cretere exponenial a masei, datorit mbibrii progresive. Spre deosebire de acestea, formularea F8 a absorbit o cantitate mare de ap n primele 20 min, dup care masa comprimatelor s-a meninut constant. Determinarea capacitii de adeziune a comprimatelor n figura 30 este redat, sub form de histograme, variaia capacitii de adeziune in vitro a formulrilor de comprimate bucale bioadezive studiate, reflectat de valorile forei de detaare in vitro. Din analiza valorilor forei de detaare obinute n primele 10 minute pentru comprimatele testate, se observ diferene datorate variabilelor de formulare, astfel: - formulrile din prima serie (F1, F2 i F3) au prezentat, n general, o capacitate de adeziune slab, ns uor mai crescut n cazul formulrii F1, care conine Carbopol 971 P NF; de asemenea, se constat c asocierea celor doi carbomeri (formularea F3) nu mbuntete bioadezivitatea comprimatelor cu extract uscat de propolis; - n seria formulrilor coninnd complexul P2_bCD, s-a observat o capacitate de adeziune mai mare dect a comprimatelor din seria precedent numai n cazul formulrii F4, n care este prezent Carbopolul 971 P NF; celelalte formulri ale acestei serii (F5 i F6) au prezentat valori ale forei de detaare apropiate de cele ale 40

formulrilor omoloage din prima serie (F2 i F3). Aceste rezultate evideniaz faptul c -ciclodextrina mrete capacitatea de adeziune doar n asociere cu Carbopolul 971 P NF (formularea F4 comparativ cu F1), deoarece n cazul asocierii cu Carbopol 981 (formulrile F5 i F6), efectul su este diminuat de prezena acestui sort de carbomer, care scade bioadezivitatea comprimatelor. pentru comprimatele seriei 3, mai hidrofile datorit prezenei 2-hidroxipropil- ciclodextrinei n concentraie crescut, valorile forei de detaare au fost mai mari dect pentru celelalte dou serii, cu excepia formulrii F8, n compoziia creia intr Carbopolul 981.
0,045 0,040

Forta de detasare (N))

0,035 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 F1

10 min 20 min 30 min

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

Formularea

Figura 30. Influena formulrii i a timpului de hidratare asupra forei de detaare in vitro n formulrile de comprimate bucale bioadezive analizate. Fora de detaare a crescut cu creterea timpului de mbibare de la 10 minute la 20 de minute n toate formulrile, un efect mai evident observndu-se la formulrile F9 i F7 care conin complexul P2_HPbCD alturi de Carbopolul 971. Prelungirea timpului de mbibare la 30 de minute a avut ca rezultat reducerea capacitii de adeziune in vitro la toate formulrile. Testul de dizolvare Rezultatele testului de dizolvare in vitro efectuat pentru formulrile de comprimate F1F9 sunt prezentate n tabelul XIV. Tabelul XIV. Cantitatea de bioflavonoide exprimate n crizol (% m/m) cedate in vitro din comprimatele analizate n cadrul testului de dizolvare.
Timp (min) 15 30 45 60 120 180 240 Cantitatea de bioflavonoide exprimate n crizol (% m/m) cedate in vitro din formularea F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 4,93 3,06 1,67 0,93 0,91 1,055 0,04 3,80 4,80 11,52 6,94 3,61 2,38 1,28 1,758 7,65 7,95 6,09 28,86 11,65 7,75 4,80 2,20 2,837 10,70 10,11 8,81 40,64 17,76 10,61 8,61 2,25 3,249 16,66 20,16 10,94 63,65 26,22 16,35 10,88 4,52 4,764 28,53 27,84 12,97 69,06 42,58 21,95 11,87 7,09 7,632 39,79 40,43 16,55 74,32 49,32 30,25 14,68 8,97 8,730 47,44 43,23 18,58

Influena ciclodextrinelor i a sortului de carbomer asupra profilului de dizolvare a bioflavonoidelor exprimate n crizol, coninute n componentele active din comprimatele bucale bioadezive, este redat n figura 31.

41

90,00
Bioflv.cedate expr.in crizol (% m/m) )

75,00 60,00 45,00 30,00 15,00 0,00 15

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9

30

45

60 Timp (min)

120

180

240

Figura 31. Profilul cinetic cumulativ de cedare a bioflavonoidelor exprimate n crizol, din formulrile F1-F9. Analiza influenei ciclodextrinelor asupra profilului de dizolvare s-a efectuat prin compararea rezultatelor obinute pentru formulrile a cror compoziie a fost similar n ceea ce privete tipul i concentraia carbomerului, adic: F1, F4, F7; F2, F5, F8; F3, F6 i F9. Astfel, s-a observat c din formularea F1 (fr ciclodextrine) crizolul s-a cedat n proporie de 74,32% dup 4 ore, profilul cumulativ de cedare fiind superior celorlalte dou formulri, F4 i F7, care conin - respectiv 2-hidroxipropil--ciclodextrin. Dintre acestea, formularea F7 a prezentat un profil de cedare superior formulrii F4, datorit capacitii mai mari de solubilizare a 2-hidroxipropil--ciclodextrinei, care este mai hidrofil dect -ciclodextrina. Ciclodextrinele au avut efecte asemntoare i n cazul celorlalte dou serii de formulri comparate (F2, F5, F8; F3, F6 i F9). Pentru a analiza influena sortului de carbomer asupra cedrii bioflavonoidelor din comprimatele studiate, s-au comparat profilele de dizolvare ale formulrilor cu aceeai component activ, adic: F1, F2 i F3; F4, F5 i F6; F7, F8 i F9. S-a observat c profilul de cedare al formulrilor pe baz de Carbopol 971 PNF (F1 i F4) a fost superior profilului formulrilor pe baz de Carbopol 981 (F2 i F5), procentul de crizol cedat fiind de aproximativ 1,5 ori mai mare; totui, pentru formulrile F7 i F8, diferena ntre profilele de dizolvare a fost redus, fapt ce poate fi explicat prin efectul compensator favorabil asupra cedrii, exercitat de 2-hidroxipropil--ciclodextrin. Asocierea celor doi carbomeri n raport de 1:1 (formulrile F3, F6 i F9), a determinat reducerea procentului de crizol cedat (de aproximativ 2 ori), evideniindu-se i n aceste cazuri influena nefavorabil a Carbopolului 981 asupra cedrii bioflavonoidelor din comprimatele analizate. Carbopolul 971 PNF exercit un efect favorabil asupra profilului de dizolvare al tuturor formulrilor, deoarece, fa de Carbopolul 981, are o capacitate de mbibare mai mare, fiind un homopolimer care formeaz o structur gelic, slab reticulat. 3.3.3. Concluzii Pe baza rezultatelor obinute n urma controlului calitii comprimatelor bucale bioadezive se pot trasa urmtoarele concluzii: - comprimatele bucale bioadezive obinute au prezentat caractere macroscopice (aspect, gust, miros, culoare) i dimensionale (diametru i grosime) corespunztoare; - masa medie, abaterea masei individuale i pH-ul comprimatelor bucale bioadezive obinute conform celor nou formulri se ncadreaz n normativele aflate n vigoare. - rezistena mecanic a comprimatelor a prezentat valori medii i mici, cu diferene datorate, n principal, componentei active i sortului de carbopol din formulare; astfel, rezistena mecanic a formulrilor pe baz de Carbopol 971 sau Carbopol 981, coninnd extract uscat de propolis a fost cea mai mare, iar comprimatele coninnd 42

compleci de incluziune i cei doi carbomeri asociai au prezentat rezistenele mecanice cele mai mari din seria respectiv (seria 2 i 3), dar de dou ori mai mici dect comprimatele din prima serie. - n toate cazurile, friabilitatea s-a ncadrat n limitele impuse de normativele n vigoare, cele mai bune rezultate obinndu-se pentru formulrile F3, F6 i F8. - valorile procentului de regsire, obinute pentru comprimatele analizate, arat faptul c toate formulrile corespund prevederilor F.R. X (Compressi.Tabulettae) n ceea ce privete coninutul declarat n component activ pe comprimat. - capacitatea de mbibare cea mai bun s-a nregistrat pentru formularea F8, coninnd complexul P2_HPbCD, iar cea mai slab n cazul formulrii F5 cu complex P2_bCD. - capacitatea de adeziune a comprimatelor analizate a crescut cu creterea timpului de mbibare de la 10 minute la 20 de minute pentru toate formulrile; acest efect a fost mai evident n cazul formulrilor F9 i F7, care conin complexul P2_HPbCD alturi de Carbopolul 971 PNF. Rezultatele obinute n urma studiului de cedare in vitro a componentelor active din cele 9 formulri, au indicat faptul c prezena sortului de carbomer 971 PNF confer cele mai bune caracteristici de cedare, iar ciclodextrinele diminueaz procentul de substane cedate, acest efect fiind mai puin evident n cazul 2-hidroxipropil--ciclodextrinei. 3.4. Studiul cineticii de eliberare a bioflavonoidelor exprimate n crizol din comprimatele bucale mucoadezive studiate Analiza cineticii de eliberare a substanelor medicamentoase dintr-o form farmaceutic prezint o importan deosebit pentru caracterizarea proprietilor farmacotehnice i biofarmaceutice ale preparatului respectiv. Obiectivul acestui studiu a fost gsirea modelului cinetic reprezentativ pentru fiecare dintre formulrile analizate, innd seama de factorii de formulare care pot influena eliberarea substanelor active din comprimatele bucale mucoadezive. 3.4.1. Materiale i metode Datele supuse fitrii Datorit faptului c rezultatele testului de dizolvare in vitro au artat existena unor diferene n ceea ce privete profilul de eliberare a componentelor active, s-a considerat necesar analiza cineticii de cedare prin fitarea datelor experimentale, obinute pentru fiecare formulare, cu ajutorul unor modele matematice utilizate n studiul cedrii substanelor medicamentoase din comprimate mucoadezive. Datele supuse fitrii au fost cele obinute n urma studiului de cedare in vitro din cele 9 formulri, prezentate n tabelul XIV i figura 31. Modelele matematice selectate pentru studiul cineticii de cedare n vederea fitrii datelor experimentale obinute n studiul de cedare in vitro, s-au ales trei modele matematice plauzibile: modelul de cedare de ordinul nti, modelul Higuchi i modelul Peppas [28-35]. Ecuaiile corespunztoare modelelor menionate sunt urmtoarele: - modelul de cedare de ordinul nti % cedat = 100(1 e k t ) - modelul Higuchi % cedat = 100 k t 0,5 % cedat = 100 k t n - modelul Peppas n care k este constanta de cedare (exprimat n ore-1), t este timpul de cedare (n ore), iar n este ordinul aparent al procesului de cedare. Fitarea datelor Fitarea datelor s-a realizat prin regresie neliniar, folosind programul Matlab 7.01. Ca i criteriu de selecie a modelului care descrie cu cea mai mare fidelitate profilul de cedare al fiecrei formulri studiate, s-a utilizat indicele Akaike (AIC). Cu ct valoarea acestui indice

43

este mai mic, cu att este mai mare gradul de fitare a datelor experimentale cu modelul selectat. 3.4.2. Rezultate i discuii Rezultatele obinute la fitarea datelor pe cele trei modele experimentale sunt prezentate n tabelul XV. Tabelul XV. Valorile indicelui Akaike pentru modelele matematice utilizate n evaluarea cineticii de cedare pentru fiecare formulare studiat Formularea F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 Media AIC Model cedare ordin I 732,07 759,24 107,90 38,17 10,44 11,49 287,55 265,28 71,05 253,69 Model Higuchi 969,29 643,47 218,44 66,97 19,51 20,85 645,24 566,80 118,83 363,27 Model Peppas 303,81 13,42 5,29 8,69 0,15 0,14 13,31 20,39 0,70 40,66

Analiznd valorile indicelui Akaike, s-a constatat c, pentru toate formulrile studiate, indicele minim s-a obinut n cazul modelului Peppas. Prin urmare, cinetica cedrii componentelor active din comprimatele bucale mucoadezive studiate, se produce n toate cazurile conform modelului Peppas. Acest rezultat a fost previzibil, deoarece modelul Peppas descrie eliberarea substanelor active din sisteme matriceale polimerice, iar comprimatele bucale bioadezive studiate sunt sisteme matriceale gonflabile (care se mbib i se umfl) n mediul de cedare apos. Avnd n vedere buna fitare a datelor experimentale cu acest model, sau calculat pentru fiecare formulare studiat, parametrii caracteristici ai modelului Peppas (tabelul XVI). Tabelul XVI. Valorile parametrilor ecuaiilor modelului matematic Peppas pentru fiecare formulare studiat Formularea F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 k 0,268 0,141 0,081 0,050 0,026 0,031 0,149 0,147 0,096 n 0,979 0,992 1,012 0,958 0,851 0,760 0,927 0,896 0,496

n funcie de mrimea parametrului n din ecuaia acestui model, s-a definit tipul de mecanism de eliberare a substanei medicamentoase din comprimatele bucale studiate, care fac parte din categoria sistemelor polimerice cilindrice (tabelul XVII). Din tabelul XVII se observ c valorile parametrului n sunt apropiate n cazul formulrilor F1, F2, F3, F4 i F7 (domeniul 0,927-1,012) i al formulrilor F5 i F8, dar difer semnificativ de acestea n cazul formulrilor F6 i F9, care conin Carbopol 971 PNF asociat cu Carbopol 981. Pentru formulrile F1, F2, F3, F4, F7 i F8 valorile parametrului n sunt mai 44

mari dect 0,89, indicnd faptul c eliberarea componentelor active din comprimatele bucale respective se realizeaz printr-un proces de transport de tip super caz II, adic este datorat efectului combinat al difuziei substanelor active i relaxrii/dizolvrii polimerilor hidrofili (Carbopol 971 PNF i Carbopol 981). De asemenea, acest mecanism explic etapa iniial lent a eliberrii, cnd, datorit hidratrii insuficiente a polimerului, relaxarea lanurilor sale este incomplet, ceea ce conduce la crearea unei reele de canale/pori prin care substanele active nu pot difuza liber. Dup hidratarea complet a carbomerului, consecutiv cu relaxarea lanurilor marginale (aflate n contact cu mediul lichid) ncepe i dizolvarea principiilor active. n schimb, pentru formulrile F5, F6 i F9 valorile lui n sunt cuprinse ntre 0,45-0,89, ceea ce sugereaz faptul c mecanismul care conduce la eliberarea componentelor active din aceste formulri este cel de difuzie non-Fickian (difuzia substanelor active n matria hidratat i relaxarea polimerului). Tabelul XVII. Interpretarea mecanismului de eliberare din sisteme polimerice cilindrice n funcie de valorile exponentului n din ecuaia modelului Peppas. Exponentul de cedare (n) 0,45 n 0,45 < n < 0,89 n = 0,89 n > 0,89 Mecanismul de transport al substanei medicamentoase difuzie Fickian transport non-Fickian transport de tip caz II (relaxaional) transport de tip super caz II Viteza n funcie de timp t-0,5 tn-1 eliberare de ordinul zero tn-1

Valorile parametrului k au fost cuprinse ntre 0,026-0,268 (tabelul XVII); n cazul formulrilor F4, F5, F6 (coninnd complexul de incluziune cu -ciclodextrina) i al formulrilor F7, F8, F9 (coninnd complexul de incluziune cu 2-hidroxipropil-ciclodextrina) valorile lui k au fost apropiate, n timp ce pentru formulrile F1, F2 i F3 (cu extract uscat de propolis) parametrul k a avut valori diferite. n fiecare serie, cele mai mari valori k s-au obinut pentru formularea pe baz de Carbopol 971 PNF, care prezint capacitate de mbibare i umflare mai mare dect Carbopolul 981. 3.4.3. Concluzii Rezultatele acestui studiu au demonstrat capacitatea celor doi carbomeri utilizai n formulri (Carbopol 971 PNF i Carbopol 981) de a prelungi eliberarea componentelor active ncorporate ca atare sau sub forma complecilor de incluziune cu ciclodextrine. De asemenea, aceti polimeri, alturi de ciclodextrine au fost responsabili de diferenele semnificative privind mecanismul de eliberare a crizolului din formulri: transport de tip super caz II din formulrile F1, F2, F3, F4, F7 i F8 (n > 0,89) i non-Fickian (controlat de difuzie) din formulrile F5, F6 i F9 (0,45 < n < 0,89).

45

CAPITOLUL 4 STUDIUL INFLUENEI UNOR FACTORI DE FORMULARE ASUPRA CARACTERISTICILOR COMPRIMATELOR BUCALE BIOADEZIVE CU PROPOLIS Aceast etap a studiului a avut urmtoarele obiective: - elucidarea influenei concentraiei carbomerilor (Carbopol 971 P NF i Carbopol 981) asupra unor caractere ale comprimatelor bucale bioadezive studiate; - elucidarea influenei coninutului n ciclodextrin i a solubilitii acestora asupra eliberrii bioflavonoidelor exprimate n crizol din comprimatele bucale bioadezive studiate. 4.1. Materiale i metode Pentru obinerea unor rezultate ct mai valide s-a pus la punct un plan experimental cu ajutorul unui program informatic de optimizare (pentru analiza statistic multivariat i modelare s-a utilizat metoda analizei clusterelor HCA implementat n pachetul Statistica 6.0 - StatSoft, Inc., USA). Fitarea datelor s-a fcut utiliznd metoda proiectrii n structuri latente (PLS). Alegerea variabilelor independente i a nivelelor acestora Pentru obinerea comprimatelor bucale bioadezive cu extract uscat de propolis (EP2_60) sau complex al propolisului cu -ciclodextrin (P2_bCD), respectiv 2hidroxipropil--ciclodextrin (P2_HPbCD) s-au utilizat urmtorii excipieni: polimeri hidrofili (Carbopol 971 i 981, Kollidon VA 64), cu rol de bioadezivi i eliberare prelungit a substanelor bioactive; sorbitol cu rol n compresibilitate; stearat de magneziu ca agent antifricional. Pe lng prezena ciclodextrinelor n formulrile F4, F5, F6, F7, F8 i F9 s-a considerat a fi important i concentraia celor doi carbomeri Carbopolul 971 PNF i respectiv Carbopolul 981care ntrzie cedarea crizolului din comprimatele bucale bioadezive. Variabilele independente utilizate n analiz sunt indicate n tabelul VIII. Tabelul XVIII. Variabile independente utilizate n design-ul i optimizarea obinerii formulrilor de comprimate bucale bioadezive.
Factori X1: Concentraie Carbopol 971 PNF (%) X2: Concentraie Carbopol 981 (%) X3: Produsul dintre coninutul de ciclodextrin (inciden) i solubilitate (-) 0 0 0 Nivele (+/-) (+) 4 4 40

Alegerea variabilelor dependente (rspunsurilor) Ca variabile dependente s-au luat n considerare i msurat densitile amestecurilor de pulberi (pulberea netasat i pulberea tasat) din cele nou formulri, care s-au supus ulterior comprimrii, respectiv a mrimilor derivate din acestea: raportul Haussner i indicele Carr; rezistena mecanic medie, grosimea, diametrul mediu, friabilitatea medie a comprimatelor, procentul de mbibare a acestora n timp, concentraia de bioflavonoide cedate, exprimate n crizol la diverse intervale de timp, fora de detaare (N) n funcie de timpul de hidratare, pHul comprimatelor, procentul de crizol regsit (tabelul XIX).

46

Tabelul XIX. Variabile dependente (rspunsuri) utilizate n design-ul i optimizarea obinerii formulrilor F1-F9 de comprimate bucale bioadezive.
Nr. crt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Cod variabil Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 Y11 Y12 Y13 Y14 Y15 Y16 Y17 Y18 Y19 Y20 Y21 Y22 Y23 Y24 Y25 Y26 Descriere Densitatea pulberii netasate (g/cm3) Densitatea pulberii tasate (g/cm3) Raportul Haussner Indicele Carr (%) Rezistena mecanic medie (N) Grosimea medie (mm) Diametrul mediu (mm) Friabilitatea medie (%) Factorul de mbibare 5' (%) Factorul de mbibare 10' (%) Factorul de mbibare 15' (%) Factorul de mbibare 20' (%) Factorul de mbibare 25' (%) Factorul de mbibare 30' (%) Conc. Bioflv. cedate, exprimate n crizol, (%), dup 15 min Conc. Bioflv. cedate, exprimate n crizol, (%), dup 30 min Conc. Bioflv. cedate, exprimate n crizol, (%), dup 45 min Conc. Bioflv. cedate, exprimate n crizol, (%), dup 60 min Conc. Bioflv. cedate, exprimate n crizol, (%), dup 120 min Conc. Bioflv. cedate exprimate n crizol, (%), dup 180 min Conc. Bioflv. cedate exprimate n crizol, (%), dup 240 min Fora de detaare (N) n funcie de timpul de hidratare (la 10 min) Fora de detaare (N) n funcie de timpul de hidratare (la 20 min) Fora de detaare (N) n funcie de timpul de hidratare (la 30 min) Valoarea pH pentru comprimat Procent de crizol regsit (%)

Matricea rezultatelor pentru formulrile F1-F9 de comprimate bucale bioadezive obinute este prezentat n tabelul XX, pentru toate cele 26 variabile dependente. Tabelul XX. Matricea rezultatelor. Cod Y1 1,0309 1,0204 1,0526 1,0101 0,9803 0,9900 0,9615 0,9174 0,9523 Y2 1,2195 1,2500 1,2500 1,1764 1,1904 1,1627 1,1494 1,1370 1,1764 Y3 1,182 1,225 1,187 1,164 1,214 1,175 1,195 1,238 1,235 Y4 15,46 18,36 15,79 14,14 17,64 14,80 16,34 19,40 19,04 Y5 130,4 127,5 20,9 14,1 12,4 40,9 16,7 20,9 98,1 Y6 4,45 4,23 4,16 4,05 4,04 4,05 4,07 4,14 4,06 Y7 9,03 9,02 9,03 8,99 8,99 9,00 9,00 9,00 9,01 Y8 1,0 1,0 0,8 1,0 1,0 0,5 1,0 0,3 1,0 Y9 16,00 14,81 30,00 24,00 8,00 11,53 14,81 60,86 48,27

F1
F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9

47

Tabelul XX. Matricea rezultatelor (continuare). Cod

F1
F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9

Y10 32,00 40,74 80,00 36,84 13,79 34,61 48,14 86,95 58,62

Y11 56,00 48,14 84,00 47,36 17,24 73,07 66,66 95,65 68,96

Y12 64,00 62,96 88,00 63,15 20,68 80,76 70,37 100,00 68,96

Y13 80,00 77,77 92,00 84,21 27,58 84,61 85,18 100,00 75,86

Y14 84,00 88,88 96,00 94,73 34,48 88,46 92,59 100,00 93,10

Y15 4,93 3,06 1,67 0,93 0,91 1,06 0,04 3,80 4,80

Y16 11,52 6,94 3,61 2,38 1,28 1,76 7,65 7,95 6,09

Y17 28,86 11,65 7,75 4,80 2,20 2,84 10,70 10,11 8,81

Y18 40,64 17,76 10,61 8,61 2,25 3,25 16,66 20,16 10,94

Tabelul XX. Matricea rezultatelor (continuare). Cod

F1
F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9

Y19 63,65 26,22 16,35 10,88 4,52 4,76 28,53 27,84 12,97

Y20 32,00 40,74 80,00 36,84 13,79 34,61 48,14 86,95 58,62

Y21 56,00 48,14 84,00 47,36 17,24 73,07 66,66 95,65 68,96

Y22 64,00 62,96 88,00 63,15 20,68 80,76 70,37 100,00 68,96

Y23 80,00 77,77 92,00 84,21 27,58 84,61 85,18 100,00 75,86

Y24 84,00 88,88 96,00 94,73 34,48 88,46 92,59 100,00 93,10

Y25 4,93 3,06 1,67 0,93 0,91 1,06 0,04 3,80 4,80

Y26 11,52 6,94 3,61 2,38 1,28 1,76 7,65 7,95 6,09

4.2. Concluzii n urma analizei statistice i regresionale n cazul formulrilor farmaceutice coninnd forma prelucrat din propolis (extract uscat de propolis, complex de incluziune cu ciclodextrina respectiv cu 2- hidroxipropil--ciclodextrina) se pot contura urmtoarele concluzii principale: Variabilele dependente cu importan semnificativ n condiionarea i eliberarea controlat a compuilor bioactivi de tip flavonoidic exprimai n crizol din formulrile farmaceutice pe baz de propolis prezint similariti/disimilariti semnificative; Utiliznd proceduri de grupare ierarhic, se pot distinge patru seturi disimilare de variabile: un set din seria densitilor i indicilor derivai (Haussner i Carr), altul din seria procentelor de mbibare, al treilea din seria concentraiilor de cedare a bioflavonoidelor exprimate n crizol i a patra variabil corespunztoare rezistenei mecanice; Modelele regresionale de tip PLS1 au condus la rezultate semnificative n special n cazul utilizrii variabilelor ce in de densitatea amestecurilor de pulberi supuse comprimrii i capacitatea de mbibare a comprimatelor bucale bioadezive n prima perioad de timp, dar i n cazul utilizrii variabilelor legate de concentraiile de crizol cedat i capacitatea de bioadeziune a comprimatelor corespunztoare formulrilor farmaceutice studiate; Modelele regresionale de tip PLS2 au indicat o importan mare n modelare pentru variabilele dependente legate n special de indicele Haussner (densitile pentru formulrile tasate/netasate), capacitatea de mbibare iniial i concentraia de cedare a bioflavonoidelor exprimate n crizol, respectiv fora de detaare la timpi mari. Majoritatea analizelor regresionale au prezentat importan semnificativ n cazul 48

variabilelor independente care reprezint procentul de carbomeri i, n special, incidena ciclodextrinelor (ajustat cu hidrosolubilitatea). S-a observat astfel c cea mai potrivite formulare de comprimate bucale bioadezive pe baz de propolis cu posibilitate de eliberare controlat a bioflavonoidelor exprimate n crizol este F7, urmat de formulrile F8 i F9, care conin ca i component activ complexul de incluziune al extractului fluid de propolis P2_60 cu 2 hidroxipropil- ciclodextrina.

CONCLUZII GENERALE n realizarea acestei lucrri am urmrit fundametarea tiinific a utilizrii n terapeutic a unui produs de origine natural, propolisul, datorit coninutului bogat n principii active care i confer caliti deosebite. Obiectivele generale ale tezei de doctorat au urmrit optimizarea unei forme farmaceutice convenionale cu propolis, prin obinerea unor comprimate bucale bioadezive, care s asigure o biodisponibilitate superioar comprimatelor convenionale i implicit, obinerea unui efect terapeutic optim. n prezenta lucrare s-au studiat posibilitile de preparare a unor forme prelucrate din propolis (extract uscat, compleci de incluziune cu ciclodextrina i cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina) care s optimizeze biodisponibilitatea acestuia, s prezinte avantaje tehnologice la prelucrarea farmaceutic i s constituie componenta activ a comprimatelor bucale bioadezive. Partea general este structurat n cinci capitole i sistematizeaz informaiile din literatura de specialitate referitoare la propolis, ciclodextrinele i importana lor n formularea unor preparate farmaceutice, comprimatele bucale bioadezive, tehnici de optimizare a formulrilor farmaceutice i motivaia alegerii propolisului ca materie prim n vederea obinerii componentelor active ale comprimatelor bucale mucoadezive. Contribuiile proprii au fost structurate n patru capitole din care se pot formula urmtoarele concluzii: O prim direcie de cercetare a constituit-o caracterizarea fizico- chimic a trei sorturi de propolis selectate din zone i surse diferite, alegerea unui solvent i a unei metode de extracie adecvate, determinarea semicantitativ prin analiz HPLC a principiilor active ale extractelor obinute i determinarea activitii antioxidante a acestora. Rezultatul acestor studii arat c etanolul 60% (V/V) a fost solventul cel mai adecvat pentru o extracie eficient a bioflavonoidelor din propolis comparativ cu celelalte concentraii de solvent 20%, 96% i extractul apos. Proporia de substane de natur lipofil, cum sunt componentele flavonoidice, crete la concentraii alcoolice ridicate. n soluii etanolice, crizolul a fost componenta activ majoritar n toate cele trei sorturi analizate. Cea mai mare cantitate de crizol a fost decelat n extractul hidroalcoolic 60% din proba de propolis P2-Brzava (2230,8 mg %). n ceea ce privete activitatea antioxidant a extractelor analizate, aceasta este direct proporional cu cantitatea de componente active extras, fiind cea mai bun n cazul extractelor hidroalcoolice. Cea de-a doua direcie a cercetrilor a constat n obinerea unor compleci de incluziune ai propolisului cu -ciclodextrina respectiv cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina i caracterizarea acestora. Obinerea complecilor de incluziune ai propolisului cu ciclodextrinele a urmrit n principal influena -ciclodextrinelor asupra componentelor active din propolis n vederea optimizrii preparatelor cu propolis. Prin obinerea complecilor de incluziune au fost mbuntite proprietile mecanice ale propolisului (de curgere), se asigur protecie mpotriva modificrilor care pot surveni sub aciunea luminii, cldurii (oxidare, volatilizare), crete solubilitatea componentelor active. De asemenea, sunt mbuntite proprietile tehnologice, propolisul inclus n ciclodextrine ncorporndu-se mult mai uor n formele farmaceutice solide. Complecii de incluziune au fost obinui prin metoda 49

coprecipitrii n soluie respectiv metoda n past (n cazul 2-hidroxipropil--ciclodextrinei). Prepararea complecilor de incluziune extracte de propolis/2HPbCD prin metoda n past sa dovedit a fi o metod de complexare mai eficient dect coprecipitarea n soluie, fapt indicat de randamentele mari de complexare obinute n primul caz. Randamentele de obinere a incluziunilor extract de propolis/ -ciclodextrin respectiv 2-hidroxipropil--ciclodextrin cresc direct proporional cu concentraiile etanolului utilizat la extracie. Acest fapt demonstreaz o concentrare a componentelor active n complex n cazul utilizrii ca mediu de extracie a etanolului 60% i 96%, care permite extracia n special a compuilor lipofili, ce interacioneaz mult mai bine cu cavitatea ciclodextrinei. Compuii de incluziune obinui au fost supui unor analize ca: microscopie optic, microscopie electronic cu scanare, analiz termogravimetric, microcalorimetrie diferenial, analiza Karl Fischer. n urma studiului s-a confirmat obinerea compuilor de incluziune prin evidenierea interaciunilor care au loc ntre molecula gazd de -ciclodextrin respectiv 2-hidroxipropil--ciclodextrin i moleculele oaspete reprezentate de componentele active din extractele hidroalcoolice de propolis obinute. Prin obinerea complecilor de incluziune cu ciclodextrinele utilizate n studiu s-a remarcat o influen favorabil a acestora asupra proprietilor mecanice ale propolisului, acestea fiind utilizate ulterior n formularea i prepararea unor comprimate bucale bioadezive. Selectarea complecilor de incluziune n vederea ncorporrii lor n comprimate s-a efectuat n funcie de concentraia crizolului n extractele hidroalcoolice i de randamentul de obinere a complecilor. Astfel, au fost selectai complecii obinui din extractul hidroalcoolic 60% de propolis P2-Brzava i anume: complexul de incluziune extract de propolis P2 n EtOH60%/-ciclodextrin i complexul de incluziune extract de propolis P2 n EtOH60% /2-hidroxipropil -ciclodextrin. Studiile din capitolul trei al prii experimentale au avut ca obiectiv formularea, prepararea i controlul calitii unor comprimate bucale bioadezive cu propolis (sub form de extract uscat sau de compleci de incluziune cu ciclodextrine), utiliznd ca polimeri hidrofili doi carbomeri (Carbopol 971 PNF i Carbopol 981). Pe baza rezultatelor obinute n urma controlului calitii comprimatelor bucale bioadezive se pot formula urmtoarele concluzii: - comprimatele bucale bioadezive obinute au prezentat caractere macroscopice (aspect, gust, miros, culoare) i dimensionale (diametru i grosime) corespunztoare; - masa medie, abaterea masei individuale i pH-ul comprimatelor bucale bioadezive obinute conform celor nou formulri se ncadreaz n normativele aflate n vigoare. - rezistena mecanic a comprimatelor a prezentat valori medii i mici, cu diferene datorate, n principal, componentei active i sortului de carbopol din formulare; astfel, rezistena mecanic a formulrilor pe baz de Carbopol 971 sau Carbopol 981, coninnd extract uscat de propolis a fost cea mai mare, iar comprimatele coninnd compleci de incluziune i cei doi carbomeri asociai au prezentat rezistenele mecanice cele mai mari din seria respectiv (seria 2 i 3), dar de dou ori mai mici dect comprimatele din prima serie. - n toate cazurile, friabilitatea s-a ncadrat n limitele impuse de normativele n vigoare, cele mai bune rezultate obinndu-se pentru formulrile F3, F6 i F8. - valorile procentului de regsire, obinute pentru comprimatele analizate, arat faptul c toate formulrile corespund prevederilor F.R. X (Compressi.Tabulettae) n ceea ce privete coninutul declarat n component activ pe comprimat. - capacitatea de mbibare cea mai bun s-a nregistrat pentru formularea F8, coninnd complexul P2_HPbCD, iar cea mai slab n cazul formulrii F5 cu complex P2_bCD.

50

capacitatea de adeziune a comprimatelor analizate a crescut cu creterea timpului de mbibare de la 10 minute la 20 de minute pentru toate formulrile; acest efect a fost mai evident n cazul formulrilor F9 i F7, care conin complexul P2_HPbCD alturi de Carbopolul 971 PNF. Rezultatele obinute n urma studiului de cedare in vitro a componentelor active din cele 9 formulri, au indicat faptul c prezena sortului de carbomer 971 PNF confer cele mai bune caracteristici de cedare, iar ciclodextrinele diminueaz procentul de substane cedate, acest efect fiind mai puin evident n cazul 2-hidroxipropil--ciclodextrinei. Studiul cineticii de eliberare a bioflavonoidelor exprimate n crizol din comprimatele bucale mucoadezive studiate a demonstrat capacitatea celor doi carbomeri utilizai n formulri (Carbopol 971 PNF i Carbopol 981) de a prelungi eliberarea componentelor active ncorporate ca atare sau sub forma complecilor de incluziune cu ciclodextrine. De asemenea, aceti polimeri, alturi de ciclodextrine au fost responsabili de diferenele semnificative privind mecanismul de eliberare a crizolului din formulri: transport de tip super caz II din formulrile F1, F2, F3, F4, F7 i F8 (n > 0,89) i non-Fickian (controlat de difuzie) din formulrile F5, F6 i F9 (0,45 < n < 0,89). Capitolul 4 al prii experimentale a urmrit analiza influenei factorilor de formulare asupra caracteristicilor comprimatelor obinute, avnd ca obiective elucidarea influenei concentraiei carbopolilor asupra unor caractere ale comprimatelor bucale bioadezive studiate i a coninutului n ciclodextrin precum i a solubilitii acestora asupra eliberrii principiilor active. Pentru obinerea unor rezultate ct mai valide s-a pus la punct un plan experimental cu ajutorul unui program informatic de optimizare. n cadrul analizei statistice i regresionale a formulrilor farmaceutice coninnd forma prelucrat din propolis (extract uscat de propolis, complex de incluziune cu ciclodextrina respectiv cu 2-hidroxipropil--ciclodextrina) se aleg variabilele dependente cu importan semnificativ n condiionarea i eliberarea controlat a substanelor active din comprimatele analizate. Variabilele dependente prezint similariti/disimilariti semnificative grupate n patru seturi disimilare (seria densitilor i indicilor derivai, seria procentelor de mbibare, seria concentraiilor de crizol cedat i seria rezistenei mecanice) Modelele regresionale de tip PLS1 au condus la rezultate semnificative n special n cazul utilizrii variabilelor ce in de densitatea amestecurilor de pulberi supuse comprimrii i capacitatea de mbibare a comprimatelor bucale bioadezive n prima perioad de timp, dar i n cazul utilizrii variabilelor legate de concentraiile de crizol cedat i capacitatea de bioadeziune a comprimatelor corespunztoare formulrilor farmaceutice studiate; Modelele regresionale de tip PLS2 au indicat o importan mare n modelare pentru variabilele dependente legate n special de indicele Haussner (densitile pentru formulrile tasate/netasate), capacitatea de mbibare iniial i concentraia de cedare a bioflavonoidelor exprimate n crizol, respectiv fora de detaare la timpi mari. Majoritatea analizelor regresionale au prezentat importan semnificativ n cazul variabilelor independente care reprezint procentul de carbomeri i, n special, incidena ciclodextrinelor (ajustat cu hidrosolubilitatea). Din analiza statistic i regresional rezult c formularea de comprimate bucale bioadezive F7 care conine complex Extract de propolis P2/HPbCD, cu posibilitate de eliberare controlat a compuilor activi coninui este cea mai potrivit fiind urmat de formulrile F8 i F9.

51

BIBLIOGRAFIE SELECTIV [1] Falson- Rieg F, Faivre V, Pirot F. Nouvelles formes mdicamenteuses. Paris: Lavoisier; 2004. p. 1-69. [2] Burgalassi S, Panichi L, Saettone MF, Jacobsen J, Rassing MR. Development and in vitro/ vivo testing of muchoadeshive buccal patches release benzydamine and lidocaine. Int J Pharm. 1996; 13: 1-7. [3] Betageri GV, Deshmukh DV, Gupta RB. Oral sustained-release bioadhesive tablet formulation didanosine. Drug Dev Ind Pharm. 2001; 27: 129-136. [4] Ryden L, Edman P. Effectof polymersand mycrosferes on the nasal absorbtion of insulin in ratio. Int J Pharm. 1992; 83: 1-10. [5] Kast CE, Valenta C, Leopold M, Bernkop-Schnrch A. Design and in vitro evaluation of a novel bioadhesive vaginal drug delivery system for clotrimazole. J Control Rel. 2002; 81: 347-354. [6] Robinsun JR, Mlynek GM. Bioadhesive and phase-change polymers for ocular drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 1995; 16: 45-50. [7] Dash AK, Gong Z, Miller DW, Huai-Yan H, Laforet JP. Development of a rectal nicotin delivery system for the treatment of ulcerative colitis. Int J Pharm. 1999; 190: 21-34. [8] Nagai T. Topical mucosal adhesive dosage forms. Med Res Rev. 1986; 6 (2): 227-242. [9] *** Farmacopeea Romn ediia a X a. Bucureti: Editura Medical; 1993. [10] ***Farmacopeea Romn ediia a X a, Supliment 2001. Bucureti: Editura Medical; 2002. [11] ***Farmacopeea Romn ediia a X a, Supliment 2006. Bucureti: Editura Medical. 2006. [12] Coneac G, Gafianu E, Hdrug NG, Hdrug DI, Rivi A, Bandur G et al. Propolis extract/-cyclodextrin nanoparticles: synthesis, physico-chemical, and multivariate analyses. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. 2008; 14(1): 58 70. [13] Popovici I, Lupuleasa D. Tehnologie Farmaceutic. Volumul 2. Iai: Ed. Polirom. 2008.p 206-208, 1020-1053. [14] Ashwinkumar C J,1 Bruce J A, Moji C A. Development and in vivo evaluation of buccal tablets prepared using danazolsulfobutylether 7 b-cyclodextrin (SBE 7) complexes. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2002; 7(91): 1659-1668. [15] Lewis S, Subramanian G, Pandey S, Udupa N. Design, evaluation and pharmacokinetic study of mucoadhesive buccal tablets of nicotine for smoking cessation. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2006; 68(6): 829-831. [16] Madgulkar A, Kadam S, Pokharkar V. Development of buccal adhesive tablet with prolonged antifungal activity: Optimization and ex vivo deposition studies. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2009; 71(3): 209-294. [17] Perioli L, Ambrogi V, Rubini D, Giovagnoli S, Ricci M, Blasi P et al. Novel mucoadhesive buccal formulation containing metronidazole for the treatment of periodontal disease. Journal of Controlled Release. 2004; 95: 521 533. [18] Taham M, Hncu L, Lupuleasa D. Dezvoltarea i evaluarea n vitro a tabletelor cu carvedilol. Craiova Medical. 2003; 3(9): 259- 265. [19] Salamat-Miller N, Chittchang M, Johnston PT. The use of muchoadhesive polymers in bucal drug delivery. Adv Drug Delivery Reviews. 2005; 57: 1666-169. [20] Leucua SE. Tehnologie Farmaceutic Industrial.Ed. Dacia Cluj Napoca; 2001. p. 401-421. [21] Tomu I, Huian R, Husu D, Leucua SE. Utilizarea planurilor experimentale pentru studiul proprietilor de curgere ale unor pulberi. Farmacia. 2005; 53(2): 24-33. [22] Gnl N, Ogan-Hascicek C, Baykara T. The consolidation and compressibility properties of some novel directly compressible ffiller-binders. Acta Poloniae Pharmaceutica Drug Research. 2000; 57: 311-317. 52

[23] Popovici I, Lupuleasa D. Tehnologie Farmaceutic. Volumul 3. Iai: Ed. Polirom. 2008. p 206-208, 450-451. [24] ***Farmacopeea Romn ediia a X a, Supliment 2004. Bucureti: Editura Medical; 2004. [25] *** European Pharmacopoeia 6th Edition. Council of Europe Strasbourg 2007. [26] *** Brithish Pharmacopoeia 2009. The Stationery office, Londra, 2008. [27] ***United States Pharmacopoeia 30 National Formulary 25. United States Pharmacopoeial Convention Incorporated, 2006. [28] Leucua SE. Biofarmacie i farmacocinetic. Cluj-Napoca: Editura Dacia; 2002. p. 140165. [29] Avachat A, Kotwal V. Design and evaluation of matrix-based controlled release tablets of diclofenac sodium and chondroitin sulphate. AAPS PharmSciTech. 2007; 8(4): E1-E6. [30] Peppas NA. Analysis of Fickian and non-Fickian drug matrix tablets with respect to the compression force release from polymers. Pharm Acta Helv. 1985; 60:110111. [31] Pop A, Vlase L, Leucuta SE. Pharmacokineti stdudy of felodipine after single oral dose of slow release formulations in healthy volunteers. Farmacia. 2008; 5: 474-482. [32] Korsmeyer RW, Gurny R, Doelker E et al. Mechanism of solute release from porous hydromatrices and other factors may be responsible. Int J Pharm. 1983; 15:2535. [33] Dash S, Murthy NP, Nath L, Chowdhury P. Kinetic modeling on drug release from controlled drug delivery systems. Acta Poloniae Pharmaceutica Drug Research. 2010; 67 (3): 217-223. [34] Prasacu I, Mircioiu C, Sandulovici I. Enache F.Release of metoprolol from solid dosage forms. choice and validation of theoretical model. Farmacia. 2009; 1: 89- 98. [35] Sriamornsak P, Sungthongjeen S. Modification of theophylline release with alginate gel formed in hard capsules. AAPS PharmSciTech. 2007; 8(3): E1-E8.

53

LISTA LUCRRILOR PUBLICATE DIN TEMATICA TEZEI DE DOCTORAT LUCRRI PUBLICATE IN EXTENSO - reviste CNCSIS B+ 1. Coneac G, Gafianu E, Hdrug NG, Hdrug DI, Rivi A, Prvu D. Quercetin and rutin/ 2-hydroxypropiyl--cyclodextrin nanoparticles: obtaining, characterization and antioxidant activity. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies, TPA Timioara. 2009; 15(3): 441 448. 2. Coneac G, Gafianu E, Hdrug DI, Hdrug NG, Pnzaru IA, Bandur G et al. Flavonoid contents of propolis from the west side of Romania and correlation with the antioxidant activity. Chem Bull Politehnica Univ Timioara. 2008; 53 (67); 1-2: 56 60. 3. Coneac G, Gafianu E, Hdrug NG, Hdrug DI, Rivi A, Bandur G et al. Propolis extract/-cyclodextrin nanoparticles: synthesis, physico-chemical, and multivariate analyses. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies, TPA Timioara . 2008; 14(1): 58 70.

54