MEDIOS DE CULTIVOS

Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms importantes son aquellos que se basan en:  Segn su estado fsico (consistencia). 1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin. 2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y no se funde por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937, los dividi en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, yagaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos. 3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias  Segn su utilizacin. 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticasa de soja, el agar Columbia, etc. 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos

factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc) El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate). 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. 5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc. 6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos. 7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. 8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad

de las pruebas y reactivos utilizados en el laboratorio de microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) Haciendo pases peridicos de placa a placa, b) Mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) Congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%. 9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.  Atendiendo a su composicin. Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados. 2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. 3) Medios semi-sintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.  Segn su origen: a) Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente. b) Sintticos: son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. c) Semisintticos son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura

AISLAMIENTO BACTERIANO
A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a travs de la obtencin de colonias aisladas. Cada colonia representa una poblacin de microorganismos procedentes de una sola clula, a partir de la cual se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de microorganismo. Para ello se utilizan diferentes tcnicas de aislamiento, basadas en diluir la muestra inicial para obtener colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las clulas en glicerol (10-30%) a -70 C, en Nitrgeno lquido a -173 C, o mediante liofilizacin.  Aislamiento por estra  Aislamientos por dilucin

IDENTIFICACIN MORFOLGICA MACROSCPICA BACTERIANA

Cuando los microorganismos crecen sobre medios slidos crean colonias de clulas en principio provenientes de un individuo originario. Las caractersticas fsicas de las colonias son de gran ayuda en la identificacin. Cada microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma, tamao, textura, olor, brillo, elevacin y borde. El tiempo de incubacin necesario para que aparezcan las colonias tambin puede tener valor en la identificacin.

Superficie

Forma

Borde

ESTERELIDAD Y CONTAMINACIN
El concepto de esterilizacin implica la eliminacin de todas las formas vivas. Segn dicha definicin, estril significa libre de organismos. Otras metodologas, como desinfeccin, pasteurizacin, etc., conllevan una eliminacin parcial de los microorganismos existentes. Mtodos de esterilizacin:  Agentes fsicos a) Calor y Calor seco: flameado, aire caliente (horno Pasteur) y Calor hmedo: vapor saturado (AUTOCLAVE). En el autoclave la esterilizacin se produce mediante vapor de agua a presin. En el autoclave se alcanza una temperatura de 121 C a una presin de 1 atmsfera sobre la presin ambiental.
b)

Filtracin: permite la eliminacin de los microorganismos de un medio lquido, sin la destruccin de estos. Para ello se hace pasar la muestra lquida a travs de un filtro de membrana con tamao de poro inferior al tamao de los microorganismos (0,2-0,45 micras). Los microorganismos quedarn retenidos en el filtro y el fluido obtenido tras la filtracin estar estril. Radiaciones: y Rayos gamma -. Radiaciones ionizantes y Rayos Ultravioleta de escasa penetracin y de utilidad para eliminacin de microorganismos de superficies.  Agentes qumicos: para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plstico) que son termolbiles. Como el xido de etileno y glutaldehdo.

c)

Otros mtodos de eliminacin, si bien parcial, de microorganismos: - calor: ebullicin, pasteurizacin, tindalizacin - agentes qumicos: desinfectantes, antispticos