Creacin de una clula bacteriana controlada por un genoma de sntesis qumica Abstracto Se presenta el diseo, la sntesis y el montaje de la pareja

de 1.08 mega-base de Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genoma a partir de la informacin digitalizada secuencia del genoma y su trasplante en un M. capricolum clula receptora para crear nuevas M. mycoides clulas que son controlados slo por el cromosoma sinttico. El ADN slo en las clulas es la secuencia de ADN sinttico diseado, como "marca de agua" y otras secuencias diseadas supresiones de genes y polimorfismos y mutaciones adquiridas durante el proceso de construccin. Las nuevas clulas se espera que las propiedades fenotpicas y son capaces de autoreplicacin continua.

En 1977, Sanger y sus colegas determinaron la secuencia gentica completa del fago X174 ( 1 ), el genoma de ADN primero en ser secuenciado completamente. Dieciocho aos despus, en 1995, nuestro equipo fue capaz de leer la primera secuencia gentica completa de una bacteria auto-replicantes, Haemophilus influenzae ( 2 ). Lectura de la secuencia gentica de una amplia gama de especies ha aumentado de manera exponencial a partir de estos primeros estudios. La posibilidad de digitalizar la informacin rpidamente genmica se ha incrementado en ms de ocho rdenes de magnitud en los ltimos 25 aos ( 3 ). Esfuerzos para entender toda esta informacin genmica han generado numerosos nuevos paradigmas computacionales y experimentales, sin embargo, nuestro conocimiento genmico sigue siendo muy limitado. No existe un sistema celular solo tiene todos los genes comprendidos en trminos de sus funciones biolgicas. Incluso en simples clulas bacterianas, lo que los cromosomas contienen el repertorio gentico entero? Si es as, puede un sistema gentico completo de ser reproducidos por sntesis qumica a partir de slo la secuencia de ADN digitalizado contenidos en una computadora? Nuestro inters en la sntesis de molculas grandes de ADN y los cromosomas surgi a partir de nuestros esfuerzos durante los ltimos 15 aos para construir una clula mnima que contiene slo

los genes esenciales. Esta obra fue inaugurada en 1995, cuando la secuencia del genoma de la Mycoplasma genitalium, una bacteria con el ms pequeo complemento de los genes de cualquier organismo conocido, capaz de crecer en el laboratorio independiente. Ms de 100 de los 485 genes codificadores de protenas de M. genitalium se puede prescindir cuando se encuentra perturbada de uno en uno ( 4 - 6 ). Hemos desarrollado una estrategia para el montaje de piezas de tamao viral para producir molculas grandes de ADN que nos ha permitido reunir una sntesis M. genitalium genoma en cuatro etapas a partir de cassettes de ADN sintetizado qumicamente un promedio de 6 kb de tamao. Esto se logr mediante una combinacin de mtodos in vitro enzimtica y la recombinacin in vivo en Saccharomyces cerevisiae. Todo el genoma sinttico [582.970 pares de bases (pb)] se cultivaba de forma estable como una levadura centromricas plsmido (YCP) ( 7 ). Varios obstculos fueron superados en el trasplante y la expresin de un cromosoma de sntesis qumica en una clula receptora. Tenamos que mejorar los mtodos para la extraccin de los cromosomas intactos de la levadura. Tambin tuvimos que aprender a trasplante de estos genomas en una clula bacteriana receptor de establecer una clula controlada slo por un genoma sinttico. Debido a que M. genitalium tiene una tasa de crecimiento muy lento, que acudi a dos de ms rpido crecimiento especies de micoplasmas, M. mycoides subespecie capri (GM12) como donante, y M. capricolum subespecie capricolum (CK) como receptor. Para establecer las condiciones y procedimientos para el trasplante el genoma sinttico de la levadura, hemos desarrollado mtodos para la clonacin de cromosomas enteros como plsmidos bacterianos centromrica en la levadura, incluyendo un nativo M. mycoides genoma ( 8 , 9 ). Sin embargo, los intentos iniciales para extraer la M. mycoides genoma de la levadura y el trasplante que en M. capricolum no. Hemos descubierto que los micoplasmas donante y el receptor comparten un sistema de restriccin comn. El genoma de los donantes fue metilado en el nativo de M. mycoides clulas y por lo tanto, estaba protegido contra la restriccin durante el trasplante de una clula donante nativos ( 10 ). Sin embargo, los genomas de bacterias cultivadas en la levadura son metilados y por lo tanto no estn protegidas contra el sistema de restriccin nica de la clula receptora. Hemos superado la

barrera de restriccin por metilacin del ADN del donante con metilasas purificada o cruda M. mycoides o M. extractos capricolum, o simplemente interrumpir el sistema de la clula receptora de restriccin ( 8 ). Ahora se han combinado todos nuestros procedimientos previamente establecidos y el informe de sntesis, el montaje, la clonacin y el trasplante con xito de la M. 1.08-MBP mycoides JCVI-syn1.0 genoma, para crear una nueva clula controlada por el genoma sinttico. Diseo sinttica del genoma. Diseo de la M. mycoides JCVIsyn1.0 genoma se basa en las secuencias del genoma altamente preciso terminar de dos cepas de laboratorio de M. mycoides subespecie capri GM12 ( 8 , 9 , 11 ). Uno de ellos fue el donante del genoma utilizado por Lartigue et al. [GenBank CP001621 ] ( 10 ). La otra fue una cepa creada por el trasplante de un genoma que haba sido clonado y de ingeniera en la levadura, YCpMmyc1.1 typeIIIres [GenBank CP001668 ] ( 8 ). Este proyecto dependa fundamentalmente de la exactitud de estas secuencias. Aunque creemos que ambos terminaron M. mycoides secuencias del genoma son fiables, hay 95 sitios en los que difieren. Empezamos a disear el genoma sinttico antes de que ambas secuencias se termin. En consecuencia, la mayora de los cassettes se han diseado y sintetizado sobre la base de la secuencia CP001621 ( 11 ). Cuando se termin, se opt por la secuencia del genoma trasplantado con xito de la levadura (CP001668) como referencia de diseo (excepto que mantiene intacto el gen typeIIIres). Todas las diferencias que aparecieron biolgicamente significativas entre CP001668 y casetes previamente sintetizados fueron corregidos para que coincidan exactamente ( 11 ). Las diferencias de secuencia entre los casetes sintticos y CP001668 que ocurri a los 19 sitios pareca inofensivo y que no fueron corregidos. Estos proporcionan 19 diferencias polimrficas entre nuestro genoma sinttico (JCVI-syn1.0) y el natural (no sinttico) del genoma (YCpMmyc1.1) que hemos clonado en la levadura y su uso como estndar para el trasplante de genoma de la levadura ( 8 ). A fin de diferenciar entre el genoma sinttico y el natural, hemos diseado cuatro secuencias de marca de agua (fig. S1) para reemplazar uno o ms cassettes en las regiones demostrado experimentalmente [1 marcas de agua (1.246 pb) y 2 (1081 pb)] o predecir [las marcas de agua 3 (1.109 pb) y 4 (1222 pb)] para no interferir con la viabilidad celular. Estas secuencias de marca de agua codificar identificadores nicos a la vez que limita su traduccin en pptidos.

Tabla S1 muestra las diferencias entre el genoma sinttico y natural de esta norma. La figura muestra S2 un mapa de la M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma. Cassette y montaje intermedio lmites, marcas de agua, deleciones, inserciones, y los genes de la M. mycoides JCVI syn1.0 se muestran en la fig. S2, y la secuencia del clon trasplantado micoplasma sMmYCp235-1 se ha presentado al GenBank (adhesin CP002027 ). Estrategia sinttica genoma de montaje. Los cartuchos fueron diseados por lo general 1080 pb con 80 pares de bases se superpone a los cassettes adyacentes ( 11 ). Ellos fueron producidos por la asamblea de los oligonucletidos de sntesis qumica por Blue Heron (Seattle, Washington). Cada cinta se ha sintetizado de forma individual y la secuencia verificada por el fabricante. Para ayudar en el proceso de construccin, cassettes de ADN y productos intermedios de la Asamblea fueron diseados para contener no me los sitios de restriccin en sus extremos y se recombinan en presencia de elementos del vector para permitir el crecimiento y la seleccin de la levadura ( 7 , 11 ). Una estrategia jerrquica fue diseado para ensamblar el genoma en tres etapas de la transformacin y la recombinacin homloga en la levadura de 1078 al 1-kb cassettes ( Fig. 1. ) ( 12 , 13 ).  

Fig. 1 El montaje de un sinttico M. mycoides genoma de la levadura. Un sinttico M. mycoides genoma fue montado a partir de 1078 cintas de ADN se superponen en tres pasos. En la primera etapa, de 1080 pb cassettes (flechas de color naranja), producido a partir de la superposicin de oligonucletidos sintticos, se recombinan en grupos de 10 para producir 109 ~ 10 kb asambleas (flechas azules). Estos se recombinan luego en grupos de 10 para producir

11 ~ 100 kb asambleas (flechas verdes). En la etapa final de la asamblea, los 11 fragmentos se recombinan en el genoma completo (crculo rojo). Con la excepcin de dos construcciones que fueron integradas enzimticamente juntos in vitro ( 27 ) (flechas blancas), las asambleas se llevaron a cabo in vivo de recombinacin homloga en levaduras. Las principales variaciones del genoma naturales se muestran como crculos de color amarillo. Se trata de cuatro regiones con marca de agua (WM1 a WM4), una regin de 4 kb que se elimin intencionalmente (94D), y elementos para el crecimiento de la levadura y el trasplante de genoma. Adems, hay 20 lugares con polimorfismos de nucletido (asteriscos). Coordenadas del genoma estn en relacin con el primer nucletido del M. naturales mycoides secuencia. La secuencia diseada es 1.077.947 pares de bases. Las ubicaciones de las que Asc y BssH sitios de restriccin II se muestran. Casetes 1 y 800-810 fueron innecesarios y retirado de la estrategia de montaje ( 11 ). Cassette 2 depsitos se superpone 1104, y el cassette de 799 coincidencias cinta 811.

Asamblea de 10 kb intermedios sintticos. En la primera etapa, cassettes y un vector se recombinan en la levadura y se transfieren a la Escherichia coli ( 11 ). ADN del plsmido se aisl despus de cada E. clones coli y digerido para la deteccin de las clulas que contienen un vector con un ensamblado de 10 kb de insercin. Un xito de 10 kb de montaje se representa ( la fig. 2A ). En general, por lo menos un 10 kb fragmento montado se podra obtener mediante el cribado 10 clones de levadura. Sin embargo, la tasa de xito vara de 10 a 100%. Todos los productos intermedios de la primera etapa fueron secuenciados. Diecinueve de los 111 conjuntos contena errores. Clones suplentes fueron seleccionados, la secuencia verificada, y pas a la etapa de la prxima asamblea ( 11 ).

 Anlisis de los intermedios de montaje. (A) Yo no hago doble y SBF anlisis de restriccin de la digestin de la asamblea 341-350 purificada de E. coli. Estas enzimas de restriccin liberacin de los fragmentos del vector (5,5 y 3,4 kb) de la insercin de 10 kb. Inserto de ADN fue separado del vector de ADN en un 0,8% E-gel (Invitrogen). M indica la escalera del ADN de 1 kb (New England Biolabs; NEB). (B) Anlisis de la asamblea 501-600 purificada de la levadura. Los crculos de 105 kb (100 kb insertar ms de 5 kb vector) fueron separados de los cromosomas lineales de ADN de levadura en un 1% en gel de agarosa mediante la aplicacin de 4,5 V / cm durante 3 horas. S indica que el BAC-Tracker superenrollado del ADN escalera (Epicentro). (C) No me anlisis de restriccin, la digestin de los 11 ~ 100 kb asambleas purificada de la levadura. Estos fragmentos de ADN fueron analizadas por FIGE en un 1% en gel de agarosa. El tamao de insercin esperados para cada asamblea se indica. indica la escalera lambda (NEB). (D) Anlisis de los 11 conjuntos agrupados se muestra en (C) atrapando siguientes topolgica del ADN circular y no me la digestin. Una cuadragsima parte del ADN utilizado para transformar la levadura se representa. El combinado de 10 kb asambleas y sus respectivos vectores de clonacin se transformaron en la levadura como para producir por encima de 100 kb intermedios de montaje ( 11 ). Nuestros resultados indican que estos productos no puede ser mantenido de forma estable en E. coli, el ADN recombinado que tuvo que ser extrada de la levadura. Polimerasa Reaccin en cadena (PCR) se realiz en los clones de levaduras seleccionadas (fig. S3 y S2 tabla). Debido a que cada 10 kb de montaje intermedio fue representado por un par de primers en este anlisis, la presencia de

todos los amplicones sugerira un ensamblado de 100 kb intermedio. En general, el 25% o ms de los clones seleccionados que figuran todos los amplicones esperados para un conjunto completo. Uno de estos clones fue seleccionado para una mayor. ADN plsmido circular fue extrado y tamao en un gel de agarosa junto con un marcador superenrollado. El xito de la segunda etapa de las asambleas con la secuencia del vector son ~ 105 kb de longitud ( Fig.. 2B ). Cuando todos los amplicones se produjeron despus de PCR mltiple, una asamblea de la segunda etapa intermedia de la medida correcta se produce por lo general. En algunos casos, sin embargo, pequeas deleciones ocurrido. En otros casos, varios fragmentos de 10 kb se reunieron, lo que produjo un mayor de la segunda etapa de montaje intermedio. Afortunadamente, estas diferencias podran ser fcilmente detectados en un gel de agarosa antes de ensamblar el genoma completo. Ensamblaje del genoma completo. En preparacin para la fase final del montaje, fue necesario aislar cantidades de microgramos de cada uno de los 11 conjuntos de la segunda etapa ( 11 ). Como se inform ( 14 ), los plsmidos circulares del tamao de nuestra segunda etapa de las asambleas puedan ser aislados de esferoplastos hongos despus de un procedimiento de lisis alcalina. A fin de purificar la 11 Asamblea intermedios, que fueron tratados con exonucleasa y pasa a travs de una columna de intercambio aninico. Una pequea fraccin del total de ADN plsmido (1 / 100) fue digerido con Not I y analizados por electroforesis en gel de campo-inversin (FIGE) ( Fig.. 2C ). Este mtodo produce aproximadamente 1 g de cada conjunto por cada 400 ml de cultivo de levadura (~ 10 11 clulas). El mtodo anterior no elimina por completo todo el ADN cromosmico lineares de la levadura, que se encontr podra disminuir sustancialmente la transformacin de la levadura y la eficiencia de montaje. Para enriquecer an ms a los 11 intermediarios de montaje circular, ~ 200 muestras ng de cada asamblea se agruparon y se mezcla con agarosa fundida. A medida que la agarosa se solidifica, el hilo a travs de las fibras y topolgicamente "trampa" circular de ADN ( 15 ). Lineales de ADN no interceptados se pueden separar del enchufe de agarosa por electroforesis, enriqueciendo as las molculas circulares atrapados. Los 11 intermediarios circular asamblea fueron digeridos con Not I para que los insertos podran ser liberados. Posteriormente, los fragmentos fueron extrados de la clavija de agarosa, analizados por

FIGE ( Fig.. 2D ), y se transforma en esferoplastos de levadura ( 11 ). En esta tercera y ltima fase de montaje, una secuencia de vectores adicionales que no era necesario debido a los elementos de la clonacin de la levadura ya estaban presentes en la asamblea 811-900. Para la deteccin de un genoma completo, PCR mltiple se llev a cabo con 11 pares de iniciadores, diseados para abarcar cada una de las 11 uniones de 100 kb de montaje (tabla S3). De 48 colonias seleccionadas, el ADN extrado de un clon (sMmYCp235) producido en los 11 amplicones. PCR del control positivo de tipo salvaje (YCpMmyc1.1) produjo un conjunto indistinguibles de 11 amplicones ( Fig. 3A ). Para demostrar an ms el montaje completo de un sinttico M. mycoides genoma, el ADN intacto fue aislado de la levadura en los enchufes de agarosa y se someti a dos anlisis de restriccin: Asc I y II BssH ( 11 ). Debido a que estos sitios de restriccin estn presentes en tres de las cuatro secuencias de marca de agua, la eleccin de la digestin produce patrones de restriccin que son distintas de la de los naturales de M. mycoides genoma ( Figs. 1 y 3B ). El clon sMmYCp235 producido el patrn de restriccin esperado para un genoma sinttico completamente ensamblado ( Fig.. 3C ). Sinttica del genoma del trasplante. Agarosa enchufes adicionales utilizados en el anlisis sobre gel ( Fig.. 3C ) tambin se utilizaron en el genoma de los experimentos de trasplante ( 11 ). Intacta M. sinttico mycoides genoma del clon de levadura sMmYCp235 fueron trasplantadas en restriccin-menos M. capricolum clulas receptor, tal como se describe ( 8 ). Los resultados fueron anotados por la seleccin para el crecimiento de colonias de color azul en el medio SP4 contiene tetraciclina y X-gal a 37 C. Genomas aislados de este clon de levadura produce 5 a 15 resistentes a la tetraciclina colonias azules por plug agarosa, un nmero comparable a la producida por el control YCpMmyc1.1. La recuperacin de las colonias en todos los experimentos de trasplante depende de la presencia de M. capricolum clulas receptoras y una M. mycoides genoma. Genoma de montaje semi-sintticos y el trasplante. Para ayudar a probar la funcionalidad de cada segmento de 100 kb sinttico, semisinttico genomas se construyeron y se trasplanta. Mediante la mezcla de piezas naturales con las sintticas, la construccin exitosa de cada uno sinttico de 100 kb de montaje puede ser verificada sin necesidad de secuencia de estos

intermediarios. Hemos clonado 11 superposicin naturales de 100 kb asambleas en la levadura utilizando un mtodo descrito previamente ( 16 ). En 11 reacciones en paralelo, las clulas de levadura se cotransformed con fragmentada M. mycoides de ADN genmico (YCpMmyc 1.1) con un promedio de aproximadamente 100 kb de longitud y un vector amplificado por PCR diseado para superponer los extremos de los insertos de 100 kb. Para mantener la solapa apropiada para que los fragmentos naturales y sintticos podran ser recombinado, los vectores de la PCR-amplificacin se produce a travs de cartillas con los mismos 40 pares de bases se superpone utilizado para clonar las asambleas sinttico de 100 kb. Los genomas semisinttico que se construyeron comprendida entre 2 y 10 de los 11 100 kb subconjuntos de sntesis ( Tabla 1 ). La produccin de colonias viables producidos despus del trasplante confirm que la fraccin de cada genoma sinttico no contiene mutaciones letales. Slo uno de los subconjuntos de 100 kb, 811900, no era viable. En un principio, un error que contienen 811-820 clon fue utilizado para producir un genoma sinttico que no transplante. Esto era de esperarse debido a que el error fue un par de eliminacin de una sola base que crea un marco de lectura en dnaA, un gen esencial para la replicacin de los cromosomas. Que antes desconocamos de esta mutacin. Mediante el uso de una estrategia de construccin del genoma semisintticos, que identific como la fuente de 811-900 para los experimentos de trasplante no sinttico. Por lo tanto, comenzamos a montar sin errores 811-900 asamblea, que se utiliz para producir la cepa de levadura sMmYCp235. El genoma dnaA mutado difiere slo en un nucletido en el genoma sinttico en sMmYCp235. Este genoma sirvi como control negativo en nuestros experimentos de trasplante. La mutacin dnaA tambin fue reparada en el nivel 811-900 de la ingeniera del genoma de la levadura ( 17 ). A reparar 811-900 asamblea fue utilizado en un montaje de la etapa final de producir un clon de levadura con un genoma reparado. Este clon de levadura se llama sMmYCP142 y podra ser trasplantado. Una lista completa de los genomas que han sido ensambladas a partir de 11 piezas y se trasplanta con xito se presenta en la Tabla 1 . Caracterizacin de los trasplantes de sntesis. Para distinguir con rapidez los trasplantes sinttico a partir de M. capricolum o M. naturales mycoides, dos se realizaron anlisis. En primer lugar, cuatro pares de cebadores que son especficos para cada una de las cuatro marcas de agua se han diseado de tal manera que

producen cuatro amplicones en una sola reaccin de PCR multiplex (tabla S4). Los cuatro amplicones fueron producidos por los trasplantes generados a partir de sMmYCp235, pero no YCpMmyc1.1 ( fig. 4A ). En segundo lugar, el anlisis de gel con Asc I y II BssH, se ha descrito anteriormente ( Fig.. 3C ), se realiz. El patrn de restriccin obtenido fue consistente con un trasplante de un sinttico producido a partir de M. mycoides genoma ( Fig.. 4B ). Un trasplante de un solo origen en el genoma sinttico sMmYCp235 fue secuenciado. Nos referimos a esta cepa como M. mycoides JCVI-syn1.0. La secuencia de juego con el diseo original, con la excepcin de los polimorfismos conocidos, ocho nuevos polimorfismos de nucletido nico, una E. coli transposn insercin, y una duplicacin de 85 pb (tabla S1). La insercin del transposn coincide exactamente con el tamao y la secuencia de IS1, un transposn en E. coli. Es probable que la infeccin IS1 10 kb subconjunto despus de su transferencia a la E. coli. La insercin IS1 est flanqueado por repeticiones directas de M. mycoides secuencia, lo que sugiere que fue insertado por un mecanismo de transposicin. La duplicacin de 85 pb es el resultado de un evento no homlogos unin del extremo, que no se ha detectado en nuestro anlisis de la secuencia en la etapa de 10 kb. Estas dos inserciones interrumpir dos genes que son, evidentemente, no son esenciales. No se encontr ninguna secuencia en el genoma sinttico que podra ser identificado como perteneciente a M. capricolum. Esto indica que hubo una sustitucin completa de la M. capricolum genoma de nuestro genoma sinttico durante el proceso de trasplante. Las clulas con slo el genoma sinttico se auto-replicantes y capaces de crecimiento logartmico. De exploracin y micrografas electrnicas de transmisin (EM) de M. mycoides JCVI-syn1.0 clulas muestran clulas pequeas, ovoides, rodeado por una membrana citoplasmtica ( Fig. 5., C y F ). El anlisis protemico de M. mycoides JCVI-syn1.0 y el control de tipo salvaje (YCpMmyc1.1) por electroforesis en gel bidimensional revel patrones casi idnticos de manchas de protenas (fig. S4) que difieren de los publicados por M. capricolum ( 10 ). Catorce genes se han eliminado o alterado en el M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma, sin embargo, la tasa de aparicin de colonias en placas de agar y la morfologa de las colonias son similares (comprese con la Fig. 5, A y B. ). Lo hicimos observar ligeras diferencias en las tasas de crecimiento en un cambio de color ensayo unidad, con el JCVI-

syn1.0 trasplantes de crecimiento ligeramente ms rpido que la cepa de control MmcyYCp1.1 (fig. S6). Discusin. En 1995, la norma de calidad para la secuenciacin fue considerado como un error por cada 10.000 pares de bases, y la secuenciacin de un genoma microbiano requiere meses. Hoy en da, la precisin es mucho mayor. Cobertura del genoma de 30 a 50 no es inusual, y la secuencia slo requiere unos pocos das. Sin embargo, la obtencin de un genoma libre de errores que podran ser trasplantados a una clula receptora para crear una nueva clula controlada slo por el genoma sinttico fue complicada y requiere muchas medidas de control de calidad. Nuestro xito se vio frustrado por varias semanas por una delecin de un solo par de bases en el dnaA gen esencial. Una base equivocada de ms de 1 milln en un gen esencial prestado el genoma inactiva, mientras que las inserciones y deleciones importantes del genoma en las partes esenciales del genoma no tuvo ningn efecto observable sobre la viabilidad. La demostracin de que nuestro genoma sinttico da lugar a los trasplantes con las caractersticas de la M. mycoides clulas implica que la secuencia de ADN en el que se basa es lo suficientemente precisa para especificar una clula viva con las propiedades adecuadas. Nuestra aproximacin genmica sinttica se encuentra en agudo contraste con otros enfoques diferentes a la ingeniera del genoma que modifican los genomas naturales mediante la introduccin de mltiples inserciones, sustituciones o eliminaciones ( 18 - 22 ). Este trabajo ofrece una prueba de principio para la produccin de las clulas basadas en el ordenador de diseo secuencias del genoma. La secuenciacin del ADN de un genoma celular permite el almacenamiento de las instrucciones genticas para la vida como un archivo digital. El genoma sinttico se describe aqu slo ha limitado las modificaciones de la forma natural M. mycoides genoma. Sin embargo, el enfoque que hemos desarrollado debe ser aplicable a la sntesis y el trasplante de genomas ms novedosa medida que avanza el genoma de diseo ( 23 ). Nos referimos a una clula controlada por un genoma ensamblado de piezas de sntesis qumica de ADN como una "clula sinttica", a pesar de que el citoplasma de la clula receptora no es sinttico. Efectos fenotpicos del citoplasma receptor se diluyen con recambio de protenas y las clulas que transportan slo al replicar el genoma transplantado. Despus del trasplante y la replicacin en una placa para formar una colonia (> 30 divisiones o> 10 dilucin de 9 veces),

la progenie no contendr las molculas de protenas que estaban presentes en la clula receptora original ( 10 , 24 ). Esto se demostr anteriormente cuando describi por primera vez el genoma del trasplante ( 10 ). Las propiedades de las clulas controladas por el genoma ensamblado se espera que sea el mismo que si toda la celda se haba producido de manera sinttica (el software de ADN construye su propio hardware). La capacidad de producir clulas sintticas hace que sea esencial para los investigadores hacer construcciones sintticas de ADN y las clulas que claramente marca de agua de su trabajo para distinguirla de la de origen natural de ADN y las clulas. Tenemos una marca de agua del cromosoma sinttico en esto y nuestro estudio anterior ( 7 ). Si los mtodos descritos aqu se puede generalizar, el diseo, la sntesis, el montaje y el trasplante de cromosomas sintticos ya no ser un obstculo para el progreso de la biologa sinttica. Esperamos que el costo de la sntesis de ADN se siga lo que ha sucedido con la secuenciacin del ADN y que continuaran descendiendo de manera exponencial. Reducir los costos de sntesis junto con la automatizacin permitir a las aplicaciones generales de la genmica sinttica. Hemos estado conduciendo la discusin tica sobre la vida sinttica desde las primeras etapas de este trabajo ( 25 , 26 ). Como sntesis ampliar las aplicaciones genmicas, esperamos que este trabajo seguir planteando cuestiones filosficas que tienen amplias repercusiones sociales y ticas. Le recomendamos el discurso continu.