VISIN MODERNA DE LA HEMOSTASIA: NUEVO MODELO DE COAGULACIN

CURSO DE FORMACIN CONTINUADA A DISTANCIA 2011-2012

TALLER DEL LABORATORIO CLNICO N 2

I.S.S.N.- 1988-7469 Ttulo: Taller del Laboratorio Clnico Editor: Asociacin Espaola de Biopatologa Mdica Maquetacin: AEBM Fecha de Distribucin: diciembre de 2011

Visin moderna de la hemostasia: nuevo modelo de coagulacin

Eva Menndez Alonso.- Residente de Bioqumica Clnica, Shaila Rubio Arias.- Residente de Anlisis Clnicos, M Teresa Snchez Calvin.- FEA de Anlisis Clnicos. Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid.

1. INTRODUCCIN La hemostasia permite que la sangre circule libremente por los vasos sanguneos y cuando existe una lesin, inicia una serie de mecanismos fisiolgicos que conducen a la formacin del trombo hemosttico, a reparar el dao y finalmente disolver el cogulo representando el cese fisiolgico de la hemorragia. El sistema de coagulacin junto a los mecanismos de retroalimentacin asegura la eficacia hemosttica, mientras que el sistema fibrinoltico acta como regulador del sistema de la coagulacin, eliminando la fibrina no necesaria para la hemostasia. La hemostasia siempre depende del equilibrio entre ambos sistemas, este equilibrio es perfecto en las personas sanas. Si hay un dficit de los factores de coagulacin o si el potencial fibrinoltico sobrepasa el de coagulacin, se producir una hemorragia. Al contrario, si el potencial de coagulacin sobrepasa al fibrinoltico o se produce una disminucin de los factores de inhibicin de la coagulacin se producir una trombosis. Las superficies celulares, plaquetas, clulas endoteliales, fibroblastos y monocitos principalmente, juegan un papel muy importante dentro de la coagulacin sangunea. Desempean dos acciones bsicas en la hemostasia. Por una parte proporcionan los factores esenciales que normalmente no estn presentes en el plasma y por otra 584

proveen una superficie para el ensamblaje de los complejos enzima-cofactor y su interaccin con los sustratos para formar el cogulo de fibrina. El sistema de la hemostasia se divide en dos mecanismos de respuesta principales: la hemostasia primaria, donde se lleva a cabo fundamentalmente la interaccin entre el endotelio y la plaqueta; y la hemostasia secundaria o coagulacin donde participan los factores de coagulacin que interaccionan sobre una superficie cataltica para formar una red de fibrina y posteriormente formar el cogulo sanguneo (1). 2. HEMOSTASIA PRIMARIA Tiene lugar a los pocos segundos de producirse una lesin vascular. La interaccin de las plaquetas y la pared vascular juegan un papel esencial para detener la salida de la sangre en capilares, arteriolas pequeas y vnulas. Las plaquetas son participantes esenciales en el proceso de la hemostasia primaria. Son pequeas clulas discoides anucleadas, procedentes de la

fragmentacin del megacariocito. A pesar de carecer de ncleo, estas clulas contienen muchos componentes estructurales, metablicos y de sealizacin propios de las clulas nucleadas. Incluso debido a su participacin en diversos procesos fisiolgicos y su accesibilidad, han servido como modelo de estudio en biologa molecular. Las plaquetas, que normalmente circulan en forma inactiva, se adhieren a la pared del vaso daado, segregando el contenido de sus grnulos e interaccionando con otras plaquetas, formando la base del tapn hemosttico. Por otro lado, las plaquetas participan en la activacin del sistema de la coagulacin proporcionando la superficie sobre la cual se van a ensamblar los complejos que intervienen en esta fase (2). 585

La formacin del tapn hemosttico se produce por una serie de mecanismos: Adhesin de la plaqueta al subendotelio vascular daado (interviene el factor Von Willebrand) Agregacin plaquetaria primaria al activarse el receptor glucoproteico IIb/IIIa y permitir as la unin de las plaquetas Liberacin de compuestos intraplaquetarios que provocan agregacin

secundaria de nuevas plaquetas al tapn hemosttico Consolidacin y retraccin del cogulo Formacin del tapn hemosttico definitivo con la formacin del polmero de fibrina Detencin de la hemorragia (1)

3. COAGULACIN O HEMOSTASIA SECUNDARIA En esta fase se produce la interaccin entre s de las protenas plasmticas o factores de coagulacin que se activan en una serie compleja de reacciones que culminarn con la formacin del cogulo de fibrina. La fibrina formar una malla definitiva que reforzar al tapn hemosttico inicial, formndose un cogulo o trombo definitivo. Intervienen en el proceso varias protenas procoagulantes (factores de coagulacin) y protenas anticoagulantes (las ms importantes son antitrombina III, protena C y protena S) que regulan y controlan el proceso de coagulacin evitando una coagulacin generalizada. Aunque la descripcin del mecanismo de la coagulacin se divide en diferentes fases, todas ellas guardan relacin entre si. Las plaquetas activadas van a acelerar el proceso de la coagulacin y a su vez los productos de la coagulacin van a inducir la activacin de las plaquetas. 586

3.1 FACTORES DE COAGULACIN Los factores plasmticos de la coagulacin son protenas procoagulantes (su nomenclatura es internacional). Se denominan utilizando nmeros romanos, asignados en el orden en el que fueron descubiertos (no existe factor VI). A algunos factores plasmticos no se les ha asignado un nmero romano, como son la precalicrena, calicrena, y el quiningeno de alto peso molecular (CAPM). Los fosfolpidos plaquetarios no estn incluidos en esta clasificacin. Todas las protenas y componentes celulares involucrados en el proceso de coagulacin circulan en plasma de forma inactiva en condiciones fisiolgicas normales. Durante el proceso de la coagulacin sern activados y entonces se representan con el sufijo a despus del nmero romano. Se pueden englobar en dos grandes grupos: Factores dependientes de vitamina K La sntesis de los factores de la coagulacin se realiza, principalmente, en el hgado y en el endotelio vascular. Requieren vitamina K para su correcta funcionalidad, aqu se incluyen los factores II, VII, IX y X, as como las dos principales protenas reguladoras de la coagulacin protena C y protena S. Todos ellos contienen de 10 a 12 residuos de glutamina, que son carboxilados a cido carboxiglutmico por una carboxilasa que precisa como cofactor a la vitamina K. Este paso es importante para la unin del in calcio y necesarios para la interaccin de estas protenas con las membranas plaquetarias (fosfolpidos plaquetarios). Los factores no carboxilados se conocen como P.I.V.K.A. (Protein Induced by

Vitamin K Absence) que no son funcionales y poseen actividad anticoagulantes

por un mecanismo competitivo sobre los factores carboxilados. 587

Cofactores Se dividen en dos grupos:

Procofactores plasmticos: incluyen a los factores V, VIII y quiningeno. El FV circula en plasma como una protena monomrica y el FVIII circula junto con el factor de von Willebrand (FvW) que al activarse, se disociarn por protelisis.

Procofactores celulares: incluyen al factor tisular (FT) y la trombomodulina (TM). El FT es el nico factor que no se encuentra normalmente en la circulacin sangunea, es una protena especfica presente sobre la membrana plasmtica de clulas como monocitos o clulas endoteliales. El FT se activa nicamente al entrar en contacto con el FVII, momento en el que se inicia la coagulacin plasmtica. La TM se expresa sobre las clulas del endotelio vascular, participa como anticoagulante activando a la protena C (1)

4. FIBRINOLISIS El sistema fibrinoltico consiste en la conversin de una proenzima, el plasmingeno, en su forma activa, la plasmina, la cual es capaz de degradar la fibrina y, as, eliminar el cogulo previamente formado. La transformacin del plasmingeno en plasmina se produce mediante la accin proteoltica de dos enzimas: activador tisular del plasmingeno (tPA) y activador del plasmingeno tipo urocinasa (uPA). La plasmina degrada la fibrina del cogulo y la transforma en productos de degradacin del fibringeno (PDF) que contienen residuos de lisina y arginina en posicin carboxiterminal. Estos residuos constituyen los sitios de unin para el tPA y el plasmingeno, y son por tanto responsables de amplificar enormemente la cascada de la fibrinolisis. A esta tendencia profibrinoltica se opone una actividad 588

antifibrinoltica, de tal modo que slo un adecuado equilibrio entre ambas fuerzas dar lugar a un correcto funcionamiento del sistema fibrinoltico. La inhibicin de la fibrinolisis se produce a diferentes niveles. Por una parte, estn los inhibidores de los activadores del plasmingeno: el principal inhibidor de la fibrinolisis in vivo es el inhibidor del activador del plasmingeno tipo 1 o PAI-1, que se sintetiza en el endotelio vascular y tambin en el hgado. Otros inhibidores son el PAI-2, fundamentalmente de origen placentario y el PAI-3, con una menor actividad antifibrinoltica. Se ha descrito tambin otro mecanismo que regula negativamente la activacin del plasmingeno, se trata de la va del inhibidor de la fibrinolisis activable por trombina (TAFI). Los residuos de los aminocidos bsicos exhibidos en la superficie de la fibrina parcialmente degradada sirven de anclaje al plasmingeno y al tPA. Cuando el plasmingeno y el tPA coinciden en la superficie del cogulo de fibrina, se produce la conversin del plasmingeno a plasmina. A este nivel el TAFI, una vez activado por la trombina (TAFIa), es capaz de eliminar los residuos de lisina y arginina de la superficie de la fibrina, impidiendo la formacin de plasmina y, por lo tanto, limitando la cascada de la fibrinolisis. A otro nivel se puede regular la actividad proteoltica de la plasmina por la accin de la 2-antiplasmina, su principal inhibidor fisiolgico, y, en menor medida, por la 2-macroglobulina y el TAFIa. stos son, bsicamente, los factores implicados en la fibrinolisis, de tal modo que una correcta hemostasia depende del balance de fuerzas entre todas estas tendencias opuestas. Hay que resaltar que se trata de un equilibrio dinmico y

adaptable a diferentes situaciones tanto fisiolgicas como patolgicas. (3)

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5. MODELOS DE COAGULACIN Distintos modelos de la coagulacin in vivo se han descrito desde finales del siglo XIX. Las primeras descripciones estuvieron relacionadas con individuos que desarrollaban trombosis, se demostr que la formacin del cogulo de fibrina se genera a partir de su precursor el fibringeno mediante una conversin enzimtica mediada por la enzima trombina que a su vez provena de la protrombina. En los siguientes aos se realizaron mltiples investigaciones hasta conocer el factor responsable del inicio del proceso de coagulacin. En el ao 1904 Morawitz describi por primera vez un esquema de la coagulacin sangunea. Afirm que los tejidos vasculares liberaban una tromboplastina tisular tras la lesin vascular, necesaria para el inicio del proceso de coagulacin y propuso cuatro componentes esenciales para la coagulacin: protrombina, fibringeno, calcio y tromboplastina. Descubri tambin la presencia de antitrombinas en la circulacin que modulan la trombocinasa, mejor conocida como factor tisular (FT). En el trascurso de los aos se fueron descubriendo los factores de la coagulacin. Ya en los aos 60 dos grupos de investigacin por separado, propusieron un modelo de coagulacin que incorporaba una complejas reacciones, donde la activacin secuencial de los factores de coagulacin, daban como resultado la generacin de una enzima llamada trombina. En este modelo las vas de coagulacin se dividieron en dos sistemas: sistema extrnseco y sistema intrnseco. Le dieron una mayor importancia a la va intrnseca como iniciadora de la coagulacin a travs del factor XII. Ambas vas convergan en una va comn y eran capaces de activar al factor X, el cual unindose con el cofactor V activado, generaban la trombina. Este modelo denominado Cascada de y de gran utilidad en el laboratorio, para explicar la activacin in vitro de la 590

Coagulacin, es razonablemente bueno

coagulacin a travs del tiempo de protrombina (TP) y tiempo de

que corresponden a las vas extrnsecas e intrnsecas respectivamente.

tromboplastina parcial activado (TTPa)

Figura 1. Cascada de la coagulacin

Sin embargo en base a los descubrimientos de los ltimos aos este modelo es inadecuado para explicar las vas fisiolgicas de la hemostasis in vivo al no considerar la interaccin del sistema con las clulas que participan en la coagulacin. Es evidente que la hemostasia no es posible sin la participacin de las plaquetas, y por otra parte el FT es una protena que est presente en la membrana de diversas clulas esenciales en la coagulacin. Adems diferentes clulas expresan protenas procoagulantes, anticoagulantes y receptores para diversos componentes de la hemostasia, lo que ha supuesto un paradigma para explicar las reacciones que tienen lugar durante el proceso hemosttico. (4) El modelo clsico de la cascada de la coagulacin es por tanto inconsistente con el comportamiento clnico de la disfuncin de la hemostasia. Se comprob que ambas vas no operan de forma independiente y que los dficit de factores de la va intrnseca que prolongan el TTPA no conllevan el mismo riesgo hemorrgico:

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deficiencias de factor XII no cursan con hemorragia y las de XI puede cursar con hemorragia leve, mientras que las deficiencias de factores VIII y IX (hemofilia A y B respectivamente) conllevan hemorragias graves. Otra observacin clave fue el hecho de que el complejo FT/VII no slo activa el factor X, sino tambin el factor IX (4). Varios grupos han explicado procesos fundamentales que rompen la estructura del modelo clsico de la coagulacin: - La interaccin FT/VIIa activa no solamente al factor X sino tambin al IX, llegndose a la conclusin de que la va extrnseca sera la de mayor relevancia fisiopatolgica in vivo. - El evento disparador de la hemostasia in vivo es la formacin del complejo FT/FVIIa. - La trombina activa directamente al factor XI en una superficie cargada. De todo ello se ha concluido que es poco probable que el modelo tradicional funcione en condiciones fisiolgicas, por lo que Hoffman y otros investigadores han propuesto una alternativa denominada Modelo Celular de la Coagulacin (5). 6. MODELO CELULAR DE LA COAGULACIN El modelo celular de la coagulacin se explica en 3 diferentes etapas. 6.1. INICIACIN El FT es el principal iniciador de la coagulacin in vivo que acta como receptor para el factor VII. Se expresa en numerosos tipos de clulas y est presente en monocitos circulantes y clulas endoteliales en respuesta a procesos inflamatorios. Las clulas estn localizadas fuera del endotelio, lo que previene la iniciacin de la coagulacin cuando el flujo es normal y el endotelio est intacto. Es necesario que se produzca una lesin que rompa la barrera que separa al FT y al factor VII. 592

Cuando se produce una lesin en la pared vascular, las clulas subendoteliales que contienen FT entran en contacto con el plasma y se inicia el proceso de generacin de trombina al unirse al factor VII creando el complejo FT/VIIa. ste complejo a su vez activa ms VII, y tambin acta sobre el factor IX y X. El factor Xa se combina en la superficie celular con el Va para producir pequeas cantidades de trombina, que jugarn un papel importante en la activacin de las plaquetas y del factor VIII en la siguiente fase (4). 6.2. AMPLIFICACIN En esta fase la clula fundamental es la plaqueta. stas se adhieren a la matriz subendotelial, siendo activadas en lugares donde se ha expuesto el FT. Las pequeas cantidades de trombina generadas en la fase anterior junto con el calcio sanguneo y los fosfolpidos plaquetarios, amplifican la seal procoagulante inicial activando a los factores V, VIII y XI que se ensamblan en la superficie plaquetar para promover posteriores reacciones en la siguiente fase. Esta fase se acaba cuando el factor Va y el VIIIa se unen a la membrana celular de una plaqueta activada para poder formar dos complejos que iniciarn la fase siguiente (6). 6.3. PROPAGACIN Los complejos iniciadores de la propagacin son la tenasa (VIIIa/IXa, Ca2+ y fosfolpidos) y el complejo protrombinasa (Va/Xa, Ca2+ y fosfolpidos). El complejo tenasa cataliza la conversin del factor Xa, mientras que el complejo protrombinasa cataliza, a nivel de la superficie plaquetar, la conversin de protrombina en grandes cantidades de trombina, lo que se conoce como explosin de trombina necesaria para la formacin de un cogulo estable de fibrina. 593

La trombina generada, activar al factor XIII o factor estabilizador de fibrina y a un inhibidor fibrinoltico (TAFI) necesarios para la formacin de un cogulo de fibrina resistente a la lisis (4). La trombina es la enzima principal de la coagulacin, la velocidad y el pico mximo de produccin de trombina son factores muy importantes para que todas sus funciones se lleven a cabo. Las principales funciones de la trombina son: activacin de las plaquetas, del cofactor V y VIII, del factor XI y XIII, activacin de la va del inhibidor de la fibrinolisis por trombina (TAFI), es la enzima responsable de la transformacin del fibringeno a fibrina, interviene en la unin al receptor PAR-4 en la superficie de las plaquetas y participa en los procesos de inflamacin y cicatrizacin de heridas (7).

Figura 2. Nuevo Modelo celular de la hemostasia (3)

En resumen, segn el modelo celular de la hemostasia, la coagulacin fisiolgica depende del contacto del FT subendotelial en el lugar de la lesin con el factor VIIa y del ensamblaje de las reacciones de coagulacin a nivel de superficie celular plaquetar, lo que favorece la formacin de trombina a nivel local y la generacin de 594

un cogulo estable de fibrina. Este modelo contempla una va nica y la focalizacin del proceso en las superficies celulares (4). 7. CONTROL DE LA COAGULACIN Existen varios mecanismos que regulan la coagulacin para prevenir un exceso de formacin de trombina y la posible oclusin del flujo sanguneo. Existe una expresin de antitrombina III y del inhibidor de la va del factor tisular (TFPI) que inhiben al factor Xa que no est unido a las clulas que liberan TF o las plaquetas activadas. Por otra parte la trombina se autorregula al unirse a la trombomodulina y as activar a la protena C que va a impedir la generacin de nuevas molculas de trombina al escindir irreversiblemente el factor Va y el VIIIa. Esta protena requiere de un cofactor la protena S que va a actuar aumentando su afinidad por la membrana celular unas 10 veces. La protena C inhibir al factor Va en un endotelio no daado, pero no lo bloquear si se encuentra sobre una plaqueta activada. El complejo protena C-protena S tambin inactiva a un importante inhibidor de la fibrinolisis, el inhibidor del activador del plasmingeno. La fibrinolisis es esencial para disolver el cogulo formado por los mecanismos hemostticos (6). 8. MTODOS DE DIAGNSTICO (8) 8.1. CONDICIONES PREANALTICAS Para la determinacin del estudio hemosttico lo primero que necesitamos es una correcta obtencin de la muestra. Son necesarios tubos con citrato sdico como anticoagulante. Estos tubos contienen una concentracin de citrato sdico de 130 mM, que con la sangre se quedar en una concentracin final de 13mM, para ello se deben extraer 9 partes de sangre y una de citrato sdico. Para la hematolgica bsica se debe utilizar un tubo con cido etilen diamino tetractico (EDTA) como 595

anticoagulante. 8.2. EXPLORACIN DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA Tiempo de sangra: es el periodo de tiempo desde que se realiza una pequea incisin en la piel y el momento en que finaliza el sangrado. Es la nica prueba que permite medir in vivo la reaccin plaqueta-endotelio y demuestra la capacidad hemosttica de las plaquetas. Se usa la tcnica de Ivy que consiste en practicar una incisin en la cara anterior de antebrazo mediante una hoja especial de 1 cm de longitud y 1 mm de profundidad. El tiempo de hemorragia normal es entre 3 minutos y 30 segundos, y 8 minutos y 30 segundos. Las causas de prolongacin del tiempo de sangra son las alteraciones en la pared vascular, trombocitopenias, defectos en la agregacin o adhesin plaquetar. Funcin plaquetaria: para su evaluacin estudiaremos el PFA-100, agregometra y el estudio de las glucoprotenas de membrana. Para evaluar el PFA-100 (9) se utiliza sangre total citratada. No es tan especfica como el Ivy pero es ms rpida y menos dolorosa para el paciente adems de evitar los posibles errores producidos por problemas cutneos del paciente. Se realiza una simulacin in vitro del tiempo de hemorragia. Reproduce un flujo constante de sangre que atraviesa una membrana porosa de colgeno y epinefrina o colgeno y ADP. El paso por la membrana produce la activacin de las plaquetas y su agregacin. El aparato registra el tiempo de obturacin del flujo. El tiempo de obturacin est aumentado en pacientes con trombocitopenia, enfermedad de Von Willebrand y en pacientes que toman medicacin que altera la funcin plaquetar.

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Otro estudio es la agregometra que se realiza cuando el tiempo de oclusin en PFA-100 esta alterado. Utiliza el mtodo turbidimtrico de Born, que consiste en medir la trasmitancia del plasma del paciente cuando se produce la agregacin plaquetar. Obtenemos el porcentaje de agregacin plaquetaria frente a un panel de agentes agregantes: ADP, colgeno, ristocetina, adrenalina, cido araquidnico, trombina, endoperxidos cclicos y un ionforo de calcio. La respuesta de las plaquetas a los diferentes agentes agregantes se divide en cuatro fases sucesivas: el cambio de forma, la agregacin, la movilizacin y la liberacin del contenido de los grnulos. Por ello, podemos estudiar donde se produce el fallo en el funcionamiento plaquetario. El ltimo estudio para la determinacin de la funcin plaquetar es la determinacin de las glucoprotenas de membrana que se puede estudiar por dos tcnicas diferentes: 1- Tcnica electrofortica en gel de policrilamida donde se detecta y caracteriza la glucoprotena. Esta tcnica no permite detectar las propiedades antignicas de las protenas ni su interaccin con otras protenas. 2- Tcnica inmunolgica: citometra de flujo, permite medir diferentes subgrupos dentro de la poblacin plaquetaria estudiada, es capaz de detectar cambios conformacionales en las glucoprotenas (ejemplo: complejo IIb-IIIa) y diferenciar las plaquetas activadas de las que estn en reposo. Exploracin de la cintica plaquetaria: se realiza un marcaje a las plaquetas con un radionclido y se mide la radioactividad ligada a las plaquetas circulantes. Nos permite cuantificar la supervivencia plaquetar, la tasa de renovacin plaquetaria y los lugares de destruccin perifrica en el paciente (habitualmente el bazo). 597

Exploracin de la adhesividad: se realiza la tcnica de Baumgartner que estudia la interaccin entre las plaquetas y el subendotelio en condiciones de flujo definidas. Reproduce la circulacin sangunea y permite emular los parmetros reolgicos de flujo y coeficiente de cizallamiento. Nos permite observar trastornos hemorrgicos congnitos (por defectos en la unin del Factor von Willebrand al subendotelio y al GPIb). Nuevos mtodos de estudio de la funcin celular global de las plaquetas: transcriptmica y protemica(10). Se sabe que las plaquetas poseen varios mRNA. Existen principalmente dos tcnicas transcriptmicas para el estudio de los transcriptos, que son los microarrays y la SAGE (anlisis seriado de expresin gnica)

(11). Las tcnicas protemicas nos proporcionaran conocimientos del contenido

proteico plaquetar y de su importancia en las alteraciones de la funcin plaquetar o su respuesta a frmacos antitrombticos. 8.3. PRUEBAS DE ESTUDIO DE DITESIS HEMORRGICA Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): el plasma citratado en presencia de tromboplastina parcial o cefalina y cloruro clcico se coagula a una velocidad dependiente de la concentracin de todos los factores (excepto VII y XIII). Se inicia la reaccin aadiendo al plasma una sustancia cargada negativamente (slice, caoln o cido elgico). Esta prueba presenta un error sistemtico cuando no se cumple la proporcin 9:1 de sangre: citrato y nos da un valor de TTPa alargado. La relacin (TTPa / TTPa control) > 1,5 se correlaciona con dficit de factores y el riesgo de hemorragia. Podemos detectar hemofilias tipo A y B e inhibidores de la coagulacin (anticoagulante lpico). Se usa para el control del tratamiento con heparina.

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Tiempo de protrombina o de Quick (TP): el plasma citratado en presencia de tromboplastina y cloruro clcico se coagula a una velocidad dependiente de la actividad de protrombina, de los factores V, VII, X y el fibringeno. Evala la va extrnseca. Se usa para el control del tratamiento crnico con cumarnicos. Detecta anomalas de factores y se correlaciona el riesgo de hemorragia junto con TTPa. Los resultados se expresan en la unidad: ndice normalizado internacional (INR) es la razn del tiempo de coagulacin del paciente respecto al control elevado a un valor llamado ISI (ndice de sensibilidad internacional) que es propio de cada tromboplastina. Tiempo de trombina (TT): tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al aadir una baja concentracin de trombina. Valora la capacidad de polimerizar del fibringeno. Se prolonga en niveles muy bajos de fibringeno o niveles altos de productos de degradacin del fibringeno o de la fibrina. Tiempo de reptilasa: tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al que se aade reptilasa (reptilasa es una enzima proteoltica extrada del veneno de la serpiente Bothrops atrox que acta como el fibringeno). Se alarga en hepatopatas, disfibrinogenemias e hipofibrinogenemia. Es insensible a la heparina (se usa esta tcnica cuando queremos comprobar si un plasma contiene heparina). Concentracin de fibringeno: se usa el mtodo Von Clauss (12) que utiliza plasma citratado diluido en el que se aade un exceso de trombina. Mide el tiempo de transformacin del fibringeno a fibrina. Siendo la concentracin de fibringeno proporcional al tiempo medido por el analizador, extrapolndose el resultado del paciente a la correspondiente curva de calibracin realizada en el ensayo.

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Dosificacin de la actividad de los factores:

Factores II, V, VII y X: Dependiendo de qu factor quieras medir se usa plasma

citratado con exceso de los otros factores y se inicia la coagulacin con tromboplastina y calcio. El tiempo de coagulacin es proporcional a la concentracin del factor.

Factores VIII, IX, XI y XII: igual que el anterior pero se inicia la coagulacin con
cefalina y calcio.

Factor XIII: se debe activar el factor XIII con trombina y valorar la actividad
trasglutaminasa sobre un sustrato o con un sustrato cromognico. Factor von Willebrand (FvW): puede realizarse por medio de una determinacin por aglutinacin donde se aade ristocetina para inducir o mimetizar el cambio que se produce en el factor von Willebrand cuando se ha unido al colgeno. Se induce la agregacin plaquetaria. Se determina por tcnicas de ELISA, electroinmunoensayo. Determinacin de dmero D: el dmero D es un producto de degradacin de la fibrina. Su exceso nos indica estados de hiperactivacin de la coagulacin como coagulacin intravascular diseminada (CID). Tambin nos orienta a posible tromboembolismo e hiperfibrinolisis. Se detecta por mtodos cuantitativos (ELISA o tcnicas

turbidimtricas) o semicuantitativos (aglutinacin por partculas de ltex o inmunofiltracin). 2-antiplasmina: es el principal inhibidor de la plasmina (13). Es una glucoprotena. Se incuba el plasma citratado con exceso de plasmina. Luego se aade un sustrato cromognico que mide la cantidad de plasmina residual, est ser inversamente proporcional a la capacidad antiplasmnica del plasma, debida prcticamente en su totalidad a la 2-antiplasmina. 600

8.4. DETECCIN DE INHIBIDORES El alargamiento de las pruebas bsicas de coagulacin o la deteccin de niveles bajos de un factor no siempre son debidas a un dficit o defecto, sino que puede ser consecuencia de la presencia de un inhibidor. Deteccin de anticoagulante lpico (AL): son autoanticuerpos dirigidos contra complejos protena-fosfolpidos que impiden la correcta unin de los factores de coagulacin a las superficies fosfolipdicas. Se asocian a una tendencia trombtica. Resultados: se produce alargamiento de la TTPa, o el tiempo de protrombina. Para diagnosticar un paciente con AL deben cumplirse los siguientes criterios: prolongacin de al menos una prueba de coagulacin que necesite fosfolpidos, confirmacin de que la alteracin se debe a un inhibidor y no a un defecto de factores, evidencia de que la actividad inhibitoria depende de los fosfolpidos y evidencia de que el inhibidor no va dirigido contra factores de coagulacin. Se determina por dos test: Test de Exner, mide el tiempo de coagulacin de un plasma mezclado en diferentes proporciones con un plasma control, con caoln y cloruro clcico. Es sensible a heparina y a los inhibidores especficos contra factores de coagulacin. Al ser positivo descartaremos los inhibidores especficos contra factores de coagulacin, y el Test de Russell, se coagula un plasma con veneno de la serpiente de Russell, que activa el factor X en presencia de pequeas cantidades de fosfolpidos. Tambin es sensible a la heparina. Deteccin de anticuerpos antifosfolpidos: son anticuerpos contra los fosfolpidos

(14). Los pacientes presentan episodios trombticos, abortos recurrentes o

trombocitopenia. Se determinan con tcnicas ELISA utilizando como antgeno la cardiolipina o la fosfatidilserina. 601

Deteccin de inhibidores contra los factores de la coagulacin: se detectan inhibidores contra los factores de la va intrnseca, los ms frecuentes son anticuerpos IgG anti-FcVIII. Se utiliza el test descrito por Ewing y Kasper, en el que se valora el TTPa de una mezcla del plasma normal y del paciente, incubados juntos durante dos horas a temperatura ambiente de 37C. En presencia de un inhibidor, el TTPa posterior a la incubacin es prolongado en comparacin con los controles sin inhibidor. 8.5. PRUEBAS PARA VALORAR LA TENDENCIA TROMBTICA Cuando a un paciente se le relaciona con una patologa trombtica se debe hacer un estudio bsico de trombofilia, es decir, antitrombina, protena C, protena S, resistencia a la protena C activada, anticoagulante lpico, factor VIII, homocistena, anticuerpos antifosfolpidos, la mutacin factor V Leiden y la mutacin G20210A del gen de la protrombina. Antitrombina: principal inhibidor fisiolgico de las sernproteasas. Su cuantificacin funcionalmente se basa en la inhibicin de la antitrombina por trombina o factor Xa. Se incuba el plasma citratado problema con un exceso de trombina o de factor Xa en presencia de heparina que acelera la inhibicin. A continuacin se aade un sustrato cromognico, con el que se valora la enzima residual, que es inversamente proporcional a la cantidad de antitrombina presente en el plasma. Si en la cuantificacin funcional se obtiene niveles bajos de antitrombina se hace la determinacin antignica. Se realiza por mtodos de inmunodifusin radial, electroinmunoensayo o ELISA. Si es un defecto de sntesis (los niveles detectados por la cuantificacin funcional y la determinacin antignica son los mismos) y si es una protena disfuncional (son mayores los niveles obtenidos por la determinacin 602

antignica que por la cuantificacin funcional). Protena C: es una glucoprotena vitamina K dependiente con accin anticoagulante. Se puede hacer su determinacin funcional midiendo la protena C activada sobre un sustrato. Se puede utilizar el complejo trombina-trombomodulina o veneno de serpiente para activar a la protena C. La deteccin se realiza aadiendo un sustrato cromognico o su sustrato natural (factor Va y VIIIa). El primero es un mtodo colorimtrico y el segundo una tcnica coagulativa en la que se valora el alargamiento del tiempo de coagulacin por la protena C activa. Protena S: es un cofactor no enzimtico para la actividad de la protena C activada sobre los factores Va y VIIIa. En el plasma va unida en un 60% a C4b binding

protein (C4bBP) (15). El C4bBP es una glicoprotena de alto peso molecular del
complemento, formada por 7 subunidades idnticas y una subunidad . Las subunidades se unen a C4b y la unidad se une a la protena S (PS). Para evaluar su concentracin hay que conocer la concentracin total, la libre y su funcionalidad. La determinacin de protena S libre se realiza eliminando los complejos C4bBP-PS mediante precipitacin con polietilenglicol. Luego se mide con una tcnica ELISA. La determinacin protena S total se realiza por tcnicas ELISA o de

electroinmunoensayo. Por ltimo, para la determinacin funcional se mide el alargamiento del TTPa o de protrombina en el que el plasma citratado del enfermo se ha diluido en plasma deficiente en protena S y al que se aade factor V y protena C activada. El alargamiento del tiempo de coagulacin es proporcional a la concentracin de protena S. Hay tres tipos de defectos: Tipo I (niveles bajos de PS total, libre y funcional), tipo II (niveles normales de PS total y libre y disminucin de la PS funcional) este 603

tipo es poco frecuente y posteriormente se ha comprobado que muchos de los pacientes de este grupo realmente tenan el factor V Leiden mutado, y el tipo III (niveles normales de PS total, bajos de PS libre y funcional). Mutacin factor V Leiden: cuando existe una mutacin en el nucletido 1691G>A en el gen del factor V, se produce un cambio de una arginina por una glutamina. Lo que da lugar a una mayor resistencia a la degradacin del factor V por la protena C activada, lo que est asociado a trombofilia. Se analiza el ADN mediante amplificacin por PCR del fragmento genmico que contiene el nucletido y se hace una digestin con una enzima de restriccin. Mutacin 20210G>A del gen de la protrombina: La mutacin se da en el fragmento genmico del gen de la protrombina. Se produce un cambio en la zona 3 (no codificante), en el nucletido 20210G>A. Se detecta por amplificacin de la zona y posterior digestin con una enzima de restriccin. La presencia de la mutacin se asocia a niveles ms elevados de factor II, y a un incremento del riesgo trombtico. Mutacin Jak2: JAK2 (16) es una protena con funcin tirosinquinasa implicada en la traduccin de seal de los receptores de mltiples citoquinas. Se ha descrito una mutacin en dominio pseudotirosinkinasa de esta protena que confiere un estatus de activacin permanente a esta protena, lo que ocurre es que no puede ser inhibida por sus inhibidores. Esta mutacin se sita en el aminocido 617 y se produce un cambio de valina por fenilanina. La presencia de esta mutacin se ha descrito en la trombocitosis esencial con una sensibilidad del 65% y una especificidad del 100%. Se analiza por High Resolution Melting (HRM), este mtodo se basa en un anlisis de PCR a tiempo real para identificar las variaciones en las secuencias de cidos nucleicos, utilizando las curvas de la temperatura de melting (disociacin del ADN). 604

9. TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA El diagnstico de la hemostasia exige la realizacin de una historia clnica, una exploracin fsica y un estudio complementario de laboratorio. 9.1. TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA (17) Trombocitopenia: se define como valores de plaquetas totales inferiores a 150000/l. Por debajo de 50000/l se dan hemorragias espontneas y por debajo de 10000/l pueden resultar mortales. La trombocitopenia es resultado de uno o varios de los siguientes procesos: disminucin de su produccin por la mdula sea, secuestro, por lo general en un bazo crecido, o mayor destruccin de las plaquetas. En primer lugar hay que descartar la posible presencia de una

"Pseudotrombocitopenia", sobre todo en pacientes sin una causa manifiesta de trombocitopenia. Es un error in vitro causado por la aglutinacin de las plaquetas mediada por los anticuerpos anti-EDTA. Se debe comprobar el resultado y observar si se ha producido un cogulo en la muestra por incorrecta homogeneizacin del anticoagulante con la sangre recin obtenida. Descartar la existencia de agregados plaquetarios con la observacin de un frotis de sangre perifrica al microscopio ptico. Y por ltimo diagnosticar la psedotrombopenia con la realizacin del recuento plaquetario en sangre recogida en un tubo con citrato de sodio. Los sntomas de los pacientes con trombocitopenia son pequeos sangrados de vnulas pequeas o capilares en lugar de vasos grandes. La piel de estas personas muestra muchas manchas purpreas pequeas, de las que deriva el nombre de

prpura trombocitopnica. La prpura trombocitopnica es un trastorno adquirido

que desencadena la destruccin de plaquetas mediada por factores inmunitarios y tambin se produce la inhibicin de la liberacin de plaquetas a partir del 605

megacariocito.

Trombocitopenia hereditaria, puede darse de forma aislada o como parte de otro

sndrome. Es una enfermedad hereditaria autosmica dominante, autosmica recesiva o ligada a X. En la actualidad se sabe que muchas formas de trombocitopenia autosmica dominante estn relacionadas con mutaciones en el gen de la cadena pesada de miosina no muscular MYH9. Trombocitosis: casi siempre se debe a una deficiencia de hierro, inflamacin, cncer o infeccin (trombosis reactiva), o un proceso mieloproliferativo subyacente (trombocitemia idioptica o policitemia verdadera) Trombopatas: dentro del grupo de trombopatas vamos a comentar la enfermedad de Von Willebrand, enfermedad de Bernard-Soulier y la enfermedad de Glanzman.

Enfermedad de Von Willebrand: es el trastorno hemorrgico hereditario ms

frecuente (18). El factor de von Willebrand desempea dos funciones: como

principal molcula de adhesin que fija la plaqueta al subendotelio expuesto y como protena fijadora para el factor VIII, lo cual trae consigo una prolongacin importante de la vida media del factor VIII en la circulacin sangunea. La enfermedad de von Willebrand se ha clasificado en tres tipos principales (1, 2 y 3) y cuatro subtipos del tipo 2 (2A, 2B, 2M y 2N). El tipo 1 es el ms frecuente. Los pacientes presentan, sobre todo, hemorragias en mucosas, equimosis excesiva y epistaxis. A menudo, la enfermedad de von Willebrand leve tipo 1 se manifiesta inicialmente durante las extracciones dentales o con la amigdalectoma. Muchos factores influyen tanto en las concentraciones de FvW como en los sntomas de hemorragia, se sabe que influyen el grupo sanguneo del paciente, su estado hormonal tiroideo, la raza, el estrs y el ejercicio. 606

Los pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 2 tienen defectos funcionales en el FvW. La enfermedad de von Willebrand adquirida es un raro trastorno que se observa en pacientes con gammapatas monoclonales, mieloma mltiple y macroglobulinemia de Waldenstrm. Se sospecha en pacientes con sntomas recientes de hemorragia grave en mucosas, sobre todo en individuos de edad avanzada.

Enfermedad de Bernard-Soulier: Enfermedad con herencia autosmica recesiva que

se manifiesta por hemorragias desde la infancia. Existe un dficit del receptor plaquetario GpIb-IX-V.

Enfermedad

de

Glanzman:

Enfermedad

hereditaria

autosmica

recesiva,

caracterizada por un dficit del receptor de plaquetas GpIIb-IIIa. 9.2. TRASTORNOS DE LA COAGULACIN Trombosis venosa: Es el resultado de la formacin de un cogulo obstructivo en las venas. Ocurre principalmente en las venas profundas de la pierna, desde donde algunas fracciones del cogulo a menudo embolizan hacia los pulmones. Los sntomas de trombosis venosa no son especficos y requiere estudios por imgen. El tratamiento con anticoagulantes debe ser rpido y adecuado. Los factores de riesgo para la trombosis, estn relacionados con la inmovilizacin o con la

hipercoagulabilidad. Trombofilia hereditaria: Estos pacientes tienen una tendencia genticamente determinada al tromboembolismo venoso. Su primer episodio de trombosis suele aparecer alrededor de los 25-30 aos. No son recomendables los anticonceptivos orales que contienen estrgenos y se considerar la profilaxis anticoagulante despus del parto en mujeres con trombofilia hereditaria. 607

Hemofilias: La hemofilia es una enfermedad hemorrgica recesiva ligada a cromosoma X producida por mutaciones en el gen F8 (hemofilia A o hemofilia clsica -> dficit factor VIII) o el gen F9 (hemofilia B -> dficit factor IX). Afecta a 1:10.000 varones, las mujeres son portadoras de la enfermedad. Clnicamente la hemofilia A y la hemofilia B son indistinguibles. El fenotipo de la enfermedad se correlaciona con la actividad residual del factor VIII o el IX y se clasifica como grave (<1%), moderada (1 a 5%) o leve (6 a 30%). En las formas grave y moderada, la enfermedad se caracteriza por episodios hemorrgicos en articulaciones, partes blandas y msculos despus de un traumatismo menor o incluso en forma espontnea. Los pacientes con enfermedad leve experimentan hemorragias poco frecuentes que por lo general son consecutivas a traumatismos. Entre aquellos con actividad residual de factor VIII o IX de ms de 25% del valor normal, la enfermedad se descubre nicamente por la hemorragia que se presenta posterior a un traumatismo importante o durante las pruebas de laboratorio que por lo general se realizan antes de una intervencin quirrgica. Las pruebas globales de la coagulacin muestran slo una prolongacin aislada del anlisis de TTPa. Los pacientes con hemofilia tienen tiempos de sangrado y recuentos plaquetarios normales. El diagnstico se establece despus de la determinacin especfica de la actividad coagulante de factor VIII o factor IX. Coagulacin intravascular diseminada (CID): es un sndrome caracterizado por la formacin incontrolada de fibrina intravascular en respuesta a la exposicin de la sangre a concentraciones patolgicas de fosfolpidos de los tejidos que da lugar a un consumo de factores de coagulacin y plaquetas con una hiperfibrinlisis secundaria. Se produce un depsito de fibrina en zonas de microcirculacin que ocluyen los 608

vasos en la microcirculacin y puede derivar a un fallo multiorgnico. Las causas ms frecuentes son la sepsis bacteriana, trastornos malignos como tumores slidos, leucemia promieloctica aguda y causas obsttricas. La prpura fulminante es una forma grave de coagulacin intravascular diseminada debida a trombosis de zonas extensas de la piel. Los anlisis de laboratorio deben incluir pruebas de coagulacin (TTPa, TP y TT), marcadores de productos de la degradacin de la fibrina (dmero D), recuentos plaquetarios y eritrocticos y anlisis del frotis sanguneo al microscopio ptico, con la observacin de esquistocitos (fragmentos de eritrocitos). Dficit de vitamina K: el dficit de la vitamina K se ha relacionado con las deficiencias combinadas de todas las protenas dependientes de vitamina K, incluidas las protenas procoagulantes protrombina, VII, IX y X, y los anticoagulantes protena C y protena S (19). La vitamina K es una vitamina liposoluble y es el cofactor para la carboxilacin del carbono gamma de los residuos de cido glutmico en los factores dependientes de vitamina K. El dficit de vitamina K en un paciente produce episodios hemorrgicos leves a graves.

609

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