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SEPARAO DA AMILOSE DE FECULA DE MANDIOCA POR PRECIPITAO QUMICA. Cassava starch fractionation and amylase recovery

Cludio CABELLO Irene Miuki SAITO

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RESUMO A determinao das concentraes de amilose e amilopectina em amidos parmetro de importncia para indstrias de alimentos e diversos mtodos tm sido propostos para efetuar esta quantificao, que necessita de padres de um destes polissacardeos. Buscou-se neste trabalho, separar a amilose para ser utilizada como padro em anlises de amostras da mesma espcie vegetal. Foi utilizada a precipitao com 1-butanol seguida do fracionamento atravs de centrfuga de alta rotao, eliminando-se fraes contaminantes, tendo sido isoladas concentraes razoveis de amilose. Anlises por cromatografia de permeao em gel por excluso de tamanho (GPC) indicaram a eficcia do processo de separao. Verificou-se que a concentrao de 0,1 mg de iodo no reagente foi a mais adequada para complexao com 0,4 mg de amilose. A metodologia aplicada revelou-se simples e eficiente, permitindo a obteno de amilose de mandioca por processo simplificado. Palavras-chaves: precipitao qumica, fracionamento de amido, permeao em gel, GPC.

SUMMARY Starch is a polysaccharide composed by amylose and amylopectin. The proportion of these polymers is an important parameter for the food industry. Several methods have been employed to identify the structure and functional properties of these polymers. This work had as purpose to evaluate a new methodology to isolate the amylose fraction from cassava starch to use it as pattern in starch analysis. It was used precipitation with 1-butanol and fractionation in centrifuge. The gel permeation chromatography (GPC) of the amylose, showed the efficiency of the process. The results showed that 0.1 mg of iodine in the reagent was the ideal concentration to complex with 0.4 mg of amylose. The method studied can be considered simple and accurate and could be an alternative to obtain amylose from cassava starch at low cost. Keywords: chemical precipitation, starch fractionation, gel permeation, GPC.

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Prof. Dr. Diretor CERAT/Botucatu, e-mail dircerat@fca.unesp.br Bolsista Ps-Doutorado no CERAT/UNESP/Botucatu, e-mail imsaito@fca.unesp.br Botucatu, v. 2, p.57-67, outubro, 2006

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1. INTRODUO A fcula de mandioca obtida por extrao apresenta mecnica um teor de razes de trituradas amido e de

amido assim como a concentrao percentual em relao amilopectina (Buleon et al., 1998). O contedo de amilose num amido um parmetro de importncia na indstria de

mdio

aproximadamente 97% em peso seco (Cereda, 1979). Submetendo-se uma suspenso aquosa de fcula a um temperatura, numa aumento progressivo da sua transformao de aspecto

alimentos, uma vez que ele pode influenciar fortemente as propriedades fsico-quimicas da fcula, tais como viscosidade,

observa-se

retrogradabilidade, solubilidade e absoro de gua, bem como sua interao com outros componentes do alimento aonde seja adicionada (Suortti et al., 1998). A concentrao de amilose nos amidos varia conforme a sua origem botnica, a variedade da espcie e tambm do mtodo utilizado para a separao. Por esta razo de interesse dispor de um mtodo preciso para avaliar o contedo de amilose numa fcula considerando a sua origem botnica. O clssico mtodo de separao do polissacardeo amilose realizado por

substncia

gelatinosa,

esbranquiado, quando ultrapassada a faixa de 52 a 65C. Esta goma viscosa composta por dois polissacardeos principais: a amilose de cadeia linear e a amilopectina com cadeia ramificada (Bobbio & Bobbio, 1989). Estes polissacardeos so constitudos de unidades de D-glicose, unidas por ligaes do tipo -1,4 e 1,6 que podem ser hidrolisadas por tratamento cido/trmico ou enzimtico atravs de enzimas amilolticas (Whistler & Daniel, 1984). polissacardeos diferem-se pelo fato Os da

precipitao seletiva, utilizando-se a propriedade de complexao com 1-butanol e conseqente separao por centrifugao. Diversas

amilopectina apresentar ramificaes laterais cadeia principal de grande um tamanho e

consequentemente

exigir

tratamento

variaes deste mtodo tm sido utilizadas (Taki et al., 1988). Na determinao das

diferenciado para sua completa hidrlise. Este polissacardeo apresenta-se em cadeias de elevadas massas moleculares, o que confere s suas solues caractersticas de alta viscosidade e encontram aplicaes em alimentos. Os grnulos de amido apresentam tambm outros componentes tais como: protenas, lipdios e minerais, que em maior ou menor proporo, afetam o comportamento de suas pastas. A amilose formada por unidades de Dglicose ligadas entre si por ligaes do tipo -1,4 pode apresentar um pequeno nmero de ramificaes e o seu grau de polimerizao (DP) mdio varia conforme a origem botnica do
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concentraes de amilose em amostras de amidos, o mtodo de escolha tem sido o de espectrofotometria molecular, medindo o

complexo cromforo formado pela amilose e ons de iodo, conseqncia da formao de um complexo na forma de hlice (Knutson, 1999). Devido sua razovel reprodutibilidade e principalmente rapidez e baixo custo das anlises efetuadas tem sido intensamente

utilizado em procedimentos analticos. O objetivo deste trabalho foi descrever uma metodologia simplificada para obteno de amilose de fcula de mandioca e utiliz-la como
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padro em determinaes de concentraes deste polissacardeo, nas amostras de material de mesma origem botnica.

com adio de tampo acetato 2 M e adicionado 0,3 mL de enzima Pululanase da NOVO Nordisk. A suspenso foi ento colocada em banho maria com agitao lenta por 30 minutos a 58C e, em

2. MATERIAL E MTODOS 2.1 Material A fcula utilizada nos experimentos, produzida comercialmente na regio de Palmital e Candido Mota, SP, onde predominam as variedades Branca de Santa Catarina e Roxinha. Foi utilizada fcula de mandioca de um mesmo lote, fornecida pela Haloteck-Fadel Ltda Palmital-SP.

seguida, a temperatura foi elevada a 100C e mantida por 15 minutos quando ocorreu a completa gelatinizao. A temperatura foi

abaixada para 58C, tendo sido adicionado 0,3 mL de enzima Pululanase, e o sistema foi deixado em banho maria por 5 horas, aps o que foi efetuada a inativao trmica da enzima. Na seqncia, foram adicionados 40 ml de 1butanol, promovida uma forte agitao e mantido o material em repouso por 16 horas.

2.2 Purificao da fcula As amostras de fcula foram suspensas em gua pH neutro e temperatura ambiente e, aps a sua decantao, que ocorreu em aproximadamente 2 horas, a fase aquosa foi removida e o precipitado lavada com gua. Aps serem realizadas cinco operaes de lavagem, a fcula foi submetida a uma pr secagem em estufa a 40C/24 horas. Em seguida foi seca at peso constante a 105C. Uma amostra de aproximadamente 50 g da fcula lavada e seca foi colocada em um aparlho Sohxlet para extrao dos lipdios por refluxo com etanol, por aproximadamente 8 horas, sendo ento removida e submetida a uma pr secagem em estufa a 40 C/24 horas. Em seguida, foi seca at peso constante a 105C em estufa com circulao de ar. 2.3.3 Etapa II da centrifugao O material preparado conforme item 2.3.2 foi aquecido 40 C e colocado para centrifugar por 15 minutos a 16.000 g. O sobrenadante de aproximadamente 20% do volume da frao 2.3 Fracionamento da fcula 2.3.1 Gelatinizao e desramificao Foi preparada uma suspenso aquosa de fcula purificada a 5% (p/v), ajustado o pH a 4,5
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2.3.2 Etapa I da centrifugao O material preparado conforme item 2.3.1 foi aquecido a 40C e colocado para centrifugar por 30 minutos a 16.000 g em tubos plsticos tipo Eppendorf. O sobrenadante e

aproximadamente 15% do volume da frao inferior do precipitado foram removidos e

descartados.

O material restante teve sua

temperatura elevada a 100C em banho maria por 10 minutos e, na seqncia, foram

adicionados 40 mL de 1-butanol, seguido de agitao vigorosa e repouso por 16 horas.

superior e 15% do volume da frao inferior do precipitado foram removidos e descartados. O material restante foi estocado em soluo etanlica a 50%.
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2.6 Permeao em coluna cromatogrfica 2.4 Purificao do extrato de amilose Uma amostra de aproximadamente 15 g da amilose obtida na etapa II da centrifugao, foi lavada com gua para remover o etanol e dispersa em 50 mL de dimetil sulfxido (DMSO) e aquecida em banho maria a 85 C/15 minutos. Em seguida, foram adicionados 200 mL de gua destilada a 80 C e o sistema foi colocado em banho maria a 100 C/5 minutos. Foram adicionados 50 mL de 1-butanol, seguido de agitao e repouso por 3 horas. A seguir, o Foram Amersham utilizadas Pharmacia colunas marca XK

Biotech

modelo

26/100 com dimetro interno de 26 mm e comprimento total de 100 cm, sendo providas de dupla parede (jaqueta) que permitiu a

manuteno de temperatura controlada atravs de circulao de gua termostatizada a 25C. Foram utilizados no enchimento das

colunas Sephadex G-75 grau mdio que tem faixa de excluso para dextrina estimada entre 1 x 10
2 4

a 1 x 10

Daltons. Solues de amilose

material foi centrifugado a 16.000 g/15 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado recuperado com etanol para remoo do DMSO. Este precipitado foi lavado com gua destilada e disperso num volume de 20 mL de gua destilada formando um concentrado de amilose.

foram aplicadas no injetor de amostra na quantidade de 8,5 mL e introduzidas na coluna por arrastamento pela fase mvel gua

deionizada taxa de 20 mL/hora. O coletor automtico foi programado para coletar em cada tubo de ensaio, fraes de 100 gotas que equivalem a 3 mL sendo que o incio da coleta

2.5 Identificao da amilose A amilose foi identificada atravs da sua reao de complexao com o iodo, utilizandose a espectrofotometria de absoro molecular. A soluo de iodo foi preparada, dissolvendo-se 0,0330 g de iodo P.A em 0,1079 g de iodeto de potssio P.A e elevando o volume a 1000 ml. Cada mililitro desta soluo apresenta 0,033 mg de on iodato. As amostras de amilose de

de fraes foi em 2 horas aps injeo da amostra, pois antes destes tempos nenhum soluto permeou completamente o gel e emergiu da coluna. Ao final da corrida cromatogrfica, quando se atingia o ltimo tubo, o coletor era desligado juntamente com o bombeamento da fase mvel. medida a Em cada amostra coletada foi concentrao de carboidratos

conforme item 2.7 e comprimento de onda mximo de absoro do complexo amilose-iodo formado pela adio de soluo de iodo descrita no item 2.5.

aproximadamente 0,4 mg foram misturadas a 3 ml desta soluo de iodo, repousavam por 15 minutos e a seguir foram feitas as medidas no espectrofotmetro. Foi utilizado um modelo

espectofotmetro da Hewllet Packard

2.7

Determinao

da

concentrao

de

8453, equipado com detector de varredura (diodo array), para obteno de curvas de

amilose Nas amostras de permeado obtidas na cromatografia da amilose, foram realizadas determinaes da concentrao de carbono

absoro na faixa de 250 a 800 nm.

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orgnico total utilizando um espectrofotometro gasoso de absoro no infravermelho marca Shimadzu, modelo TOC-5000A instalado no Laboratrio de Anlises do CERAT/UNESP. Cada amostra era previamente filtrada em membrana 0,22 m e foi tomado o valor mdio de trs injees de amostras consecutivas para determinar a concentrao em ppm de carbono. Amostra padro de biftalato de potssio (C8 H5 O4 K ) equivalente a 1.000 ppm de carbono foi injetada para efetuar ajustes na curva de calibrao. A concentrao de amilose foi

experimentalmente, que 3,0 mL da soluo de reagente iodo (0,1 mg) foram suficientes para as dosagens de amostras com at 0,4 mg de amilose. McGrance et al. (1998) utilizaram

metodologia semelhante e observaram uma concentrao mnima de 72,7 mg/L de amilose para 57,5 mg/L de iodo. A Tabela 1 mostra os comprimentos de onda (nm) dos picos de absoro de diferentes massas de fcula de mandioca gelatinizada e os respectivos valores de absorbncia. A presena da amilose na reao de complexao com o iodo, produz uma diminuio no valor da absoro na faixa de 288 nm e simultneo incremento na faixa de 630 nm. Jarvis & Walker (1993) tambm observaram este efeito utilizando

determinada indiretamente atravs do valor da concentrao de carbono multiplicado conforme metodologia proposta por Silva & Cabello (2006).

3. RESULTADOS E DISCUSSO Uma amostra qualquer de fcula de mandioca amido gelatinizada aps reagir com uma soluo de iodo, apresenta espectro do complexo formado entre o iodo e os

amilose pura para produo do complexo com iodo. Na Figura 1 esto apresentados os espectros da soluo de iodo e as amostras. Observam-se os picos caractersticos da soluo de iodo com absoro mxima em 288 e 352 nm, os quais apresentaram menor altura quando esta soluo complexava com 0,2, 0,4 e 0,6 mg de amido hidrolisado.

polissacardeos amilose e amilopectina, com trs picos principais, que ocorrem nos intervalos de: 288 a 292 nm; 349 a 352 nm e 628 a 640 nm. Algumas variaes nestes valores podem ser observadas, as quais dependem das

TABELA 1

Absorbncia (A) mxima do

concentraes relativas do iodo e de amilose e/ou amilopectina. Verificou-se

complexo do iodo com correspondentes massas de fcula de mandioca gelatinizada.

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AMOSTRA

PICO 1 (nm)

A (AU) 1.485 1.341 1.339 1.131

PICO 2 (nm) 352 352 351 351

A (AU) 0.986 1.037 1.159 1.091

PICO 3 (nm) n/c 653 627 639

A (AU) 0 0.612 1.149 1.503

Reagente iodo* Hidrolisado (0,2 mg) Hidrolisado (0,4 mg) Hidrolisado (0,6 mg)

288 288 289 290

* O reagente iodo foi usado como referncia. n/c no caracterizado

1,6 1,4 1,2 1,0

iodo H g 0.2m H g 0.4m H g 0.6m

A s r (U ) bo o A

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 200 300 400 500 600 700 80 0 900 1000 1100 1200

com entodeonda(nm prim )

FIGURA 1 Curvas dos espectros da soluo de iodo complexado com 0,2, 0,4 e 0,6mg de hidrolisado de fcula de mandioca gelatinizada. Atravs dos espectros da Figura 1, observa-se que a partir de 400 nm o reagente iodo diminui sua absoro enquanto que o complexo formado com a amilopectina e a amilose incrementa fortemente atingindo seu mximo em torno de 630 nm. Knutson (1999) observou que as absores mximas do absoro ocorre abaixo de 600 nm. Jarvis &

Walker (1993) verificaram que as absores ocorrem na faixa de 620-680 nm. Banks, Greenwood & Khan (1971) verificaram que o comprimento de onda de mxima absoro do complexo com iodo est relacionado com o tamanho da cadeia polimrica da amilose segundo uma isoterma de absoro de

complexo iodo-amilose ocorrem entre 609 a 624 nm e quando utilizava compostos com amilose de conhecida massa molecular este valor de
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Langmuir. Os ensaios efetuados consideraram a mesma amostra e mesma temperatura ambiente

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em torno de 25C. Os espectros da Figura 1 sugerem a utilizao da relao 0,1 mg de iodo para 0,4 mg de hidrolisado, por permitir

A etapa II objetivou aumentar a pureza da frao amilose e utilizou o DMSO desramificante facilitando a de amilose e como

amilopectina, de molcula

identificar pequenas variaes de concentrao, sem afetar outras faixas do espectro. No fracionamento da fcula, conforme estabelecido no tem 2.3, houve necessidade de dois tratamentos com enzima pululanase, na concentrao de aproximadamente uma unidade enzimtica por grama de fcula, pois a presena de amilopectina, deixou altamente viscoso o hidrolisado, precipitao Foram prejudicando do complexo ensaios deste modo a

separao

remanescentes de amilopectina entrelaadas nas estruturas do de amilose. A posterior

precipitao seguida de

complexo

amilose-butanol mostrou ser

centrifugao,

importante para a garantia de pureza da amilose recuperada. No grfico da Figura 2 pode-se observar os espectros das fraes amilopectina que foi retirada do sobrenadante, amilose precipitada e reagente iodo. A absoro mxima da

amilose-butanol. com outras

realizados

concentraes de suspenses de fcula e verificou-se que a primeira concentrao, de 5% (p/v), foi a mais adequada. Verifica-se na

amilopectina ocorre em 541 nm e em seguida comea a diminuir rapidamente e

simultaneamente ocorre um forte crescimento da curva de amilose que atinge absoro mxima em torno de 640 nm e diminui lentamente, formando uma espcie de patamar at 720 nm, quando ento diminui abruptamente. Estes perfis sugerem a eficcia dos dois tratamentos para separao atravs da precipitao, que pode ser verificada pelas afinidades do reagente iodo com os respectivos polissacardeos ocorrerem em faixas bastante distintas do espectro, quais sejam; amilopectina em 541 nm, complexo cromforo de cor castanho avermelhado; amilose em 640 nm, complexo

literatura a utilizao de enzima desramificante isoamilase, para hidrlise das ligaes tipo 1,6, que tambm pode ser promovida pela enzima pululanase. A opo de utilizao de pululanase deveu-se s suas caractersticas de suportar as condies de operao, tais como: pH de 4,5; temperatura de 60C e pelo fato desta enzima ser considerada segura para a produo de alimentos (Jensen & Norman, 1984). Na etapa I de centrifugao, retirou-se a parte inferior do precipitado, para remoo das fibras e outras substncias insolveis da fcula. J na etapa II, a remoo da parte inferior do precipitado visava remover algum contaminante remanescente, enquanto na parte superior, buscava-se remover amilose contaminada com algumas formavam molculas uma de massa amilopectinas gelatinosa que de

cromforo de cor azul marinho. A extino mxima para a amilose foi observada em 640 nm.

consistncia de mdia viscosidade.

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1,4 1,2 1,0 0,8 As r o(U ) bo A 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 com entodeonda(nm prim )
Iodo am ilose A ilopectin m

FIGURA 2 - Espectro do reagente iodato complexado com amilose e amilopectina em comparao com o reagente sem complexao.

Estes valores de absoro tambm foram observados por Matheson & Welsh (1988) que utilizaram a propriedade cromfora da ligao iodo-amilose em amostras onde a amilopectina tinha sido removida utilizando uma lecitina, a Concanavalin A . Esta substncia quando utilizada em determinadas condies de pH, temperatura e fora inica, efetua uma

requer muitas etapas na marcha analtica e consome reagentes de maior custo quando comparado a outros mtodos. Gibson et al. (1997) observaram que o comprimento de onda mximo de absoro do complexo iodo-amilose aumentava com o incremento do grau de polimerizao do polissacardeo, mas neste trabalho no foi possvel constatar este fato, pois a amostra utilizada de amido era de uma nica variedade de mandioca. Na Figura 3 observa-se o perfil de concentrao de carboidratos das fraes

complexao com as cadeias de amilopectina atravs da extremidade no-redutora e provoca a precipitao deste complexo. Yun & Matheson, (1990) observaram que a frao precipitada com a Concanavalin A tinha peso molecular

coletadas na permeao de amostra de amilose conforme descrito nos itens 2.6. Indica tambm os correspondentes comprimentos mximos de absoro do complexo amilose-iodo produzido pelas reaes de cada frao com iodo

semelhante ao da amilopectina e formava complexo cromforo com iodato com absoro mxima em 560 nm. O mtodo pde ser considerado eficiente mas no adaptvel para ser utilizado rotineiramente em determinaes quantitativas de amilopectina e/ou amilose pois
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conforme item 2.5.

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No intervalo KAv 0,1 a 0,26 ocorre a permeao de praticamente toda a amilose injetada que produz uma variao de absoro do complexo cromforo formado com o iodo com mximo em 648 e mnimo em 615 nm. No intervalo KAv 0,27 a 0,40, o eludo ainda apresentava compostos com carbono mas que no foram capazes de produzir complexao com iodo, e indicando provavelmente serem dextrinas com grau de polimerizao menor do

que

seis

unidades

de

glicose

anidra No outro

(McGrance, Cornell & Rix, 1998). intervalo de KAv 0,68 a

0,85 observou-se um

composto com carbono em sua composio mas que no complexava com o iodo. Anlises com cromatogrfia lquida de alta resoluo

identificou como sendo traos remanescentes de 1-butanol que fora utilizado na etapa de separao.

FIGURA 3 Perfil de eluio de amostra de amilose indicando as concentraes e respectivo comprimento de onda de absoro mxima em funo do Kav.

Observa-se no perfil de eluio que os carboidratos permeados que absorveram iodo so de tamanho aproximado e formam um conjunto de semelhante composto cromforo absorvendo numa regio tpica e caracterstica de amiloses.

Considerando o perfil cromatogrfico e os correspondentes compostos cromforos obtidos, pode-se concluir com relativa segurana que o processo de separao da amilose foi eficaz e produziu elevada. amilose A concentrada com aplicada pureza para

metodologia

separao da amilose, foi considerada simples e 4. CONCLUSES

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de

pequeno

consumo

de

tempo,

com

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potencialidade de aplicao a amidos de outras espcies vegetais.

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