INOCULAREA CU BACTERII SPECIFICE, SELECTIONATE DIN MICROFLORA PROPRIE SOLURILOR POLUATE CU TITEI

Autori: Anca Rovena Voiculescu, Mihai Dumitru, Mihai Toti

Specia umana functioneaza la vrful piramidei trofice n calitate de consumator omnivor, fara a avea ea nsasi un consumator specific superior, ceea ce duce la o nmultire necontrolata a populatiei umane. Prin constiinta de sine si inteligenta, omul a reusit sa devina din biosistem agresat de mediul natural, factor de exploatare a acestui mediu, conform programului pentru sine de autoconservare la nivel de individ si specie. Aliat cu inventiile sale tehnice, omul se cupleaza metabolic la ciclurile biogeo-chimice ale ecosistemelor, pe care le modifica la nivel de structura si functii printr-un proces activ de antropizare, devenind simultan victima si agent destructiv. nmultirea necontrolata implica o competitie acerba pentru resurse, ceea ce extinde procesul de antropizare spre cele mai inaccesibile zone ale planetei, iar intensitatea acestui proces, desfasurat intempestiv n ultimele secole, depaseste capacitatea de redresare prin autoreglare a ecosistemelor, invadate prin: urbanizare industrializare agrosistematizare Degradarea ecosistemelor pna la perturbarea echilibrului dinamic, a structurii si functiilor acestora, restrngerea biodiversitatii, ameninta nsasi specia umana, prin decuplarea sa energetica si materiala, deci, prin alterarea conditiilor sale de existenta.

n plus, n activitatea sa omul consuma si nu regenereaza resursele, respectiv substantele si energia folosite, n acelati timp eliminnd n mediu poluanti si deseuri, care perturba din ce n ce mai profund si puternic mecanismele de functionare ale geosistemului. Cercetarile n domeniul biologiei solului, n vederea ntelegerii proceselor biologice fundamentale care se petrec n sol, au cunoscut n secolul XX o adevarata explozie. La nceputul secolului trecut, cercetarile erau orientate spre mbunatatirea fertilitatii solului si cresterii productiei agricole Pna n anii 50, s-au studiat diferite tipuri de microorganisme (fixatoare de azot, nitrificatori, sulfo-oxidatoare etc) si relatiile dintre acestea si nutritia plantelor. n anii 60, cercetarile s-au axat pe corelatiile dintre transformarile solului, populatiile microbiene si activitatile enzimatice pentru sporirea fertilitatii solului. n anii 70, rezolvarea problemelor cu privire la asigurarea hranei (inocularea solului cu bacterii fixatoare de azot din genul Azospirillum fiind primul pas important n acest sens). Dupa anii 70, a avut loc n microbiologia solului un salt de la aplicarea acestei stiinte n agricultura, la folosirea microorganismelor n decontaminarea mediului poluat. Dupa anii 80, bioremedierea solurilor devine din ce n ce mai importanta ncepnd cu anii 80, s-au realizat primele experimente de laborator n care s-a folosit inocularea cu tulpini de microorganisme cu abilitati degradative ale compusilor organici Pornind de la activitatile degradative ale microorganismelor au fost elaborate numeroase tehnologii de depoluare, care sunt cuprinse generic n termenul de bioremediere. (Alexander, 1994).

Orice compus chimic a carui acumulare n natura devine periculoasa pentru mediu poate fi considerat drept POLUANT, iar inlaturarea lui cu ajutorul microorganismelor poate fi considerata BIOREMEDIERE Microorganismele capabile sa degradeze substantele xenobiotice sunt prezente, n general, n respectivele medii poluate, nsa biodegradarea naturala are loc cu rate foarte scazute. De aceea, s-au elaborat diverse tehnologii de bioremediere care presupun: cunoasterea cailor de optimizare a conditiilor biodegradarii, cunoasterea comportarii si efectelor substantelor chimice introduse n sol asupra ecosistemului selectarea unor microorganisme cu abilitati degradative superioare. Cercetari privind identificarea si caracterizarea bacteriilor si fungilor ce prolifereaza n solurile poluate cu petrol si apa sarata au fost efectuate de Toti si colab. (1989, 1991, 1992, 1999). S-au identificat principalele bacterii ce contribuie la degradarea petrolului (Pseudomonas, Flavobacterium, Corynebacterium etc), bacterii care se ntlnesc si n zacamintele de titei. De asemenea, s-au stabilit unele conditii n care aceste bacterii prolifereaza sau dispar si modul cum pot fi stimulate. S-au efectuat si studii asupra plantelor pionier ce se instaleaza pe terenurile poluate si asupra speciilor cultivate ce pot fi folosite n cursul ameliorarii. S-a efectuat un studiu amplu de caracterizare a distributiei cantitative si calitative a bacteriilor heterotrofe si fungilor filamentosi n solurile afectate de poluare din teritorii apartinnd schelelor de extractie a titeiului de pe ntreg teritoriul Romniei (Anca Voiculescu si colab., 2001). n sol, desi reprezinta o fractiune minuscula din greutate totala (0,35%) microorganismele au o importanta esentiala, fiind elementul activ, efectorul functiilor de fertilitate a solului (Eliade si colab.; 1983; Ghinea si colab., 1987).

Activitatea microorganismelor din sol este influentata de prezenta microhabitatelor, de tipul de sol, de structura si textura acestuia, de asigurarea cu substante organice si nutrienti si de factorii de mediu. n functie de multitudinea de factori care actioneaza, activitatea microorganismelor este variabila, att din punct de vedere biologic (alternanta fazelor vegetative cu fazele de latenta), ct si din punct de vedere al activitatii metabolice si de nutritie. Numeroase microorganisme din sol au capacitatea de a utiliza hidrocarburile gazoase, solide si lichide din seria alifatica, aromatica si asfaltica drept unica sursa de carbon si energie, descompunndu-le la compusi cu greutate moleculara mai mica, sau chiar la dioxid de carbon si apa. Raspndite larg n mediile naturale, si uneori semnificative numeric, microorganismele active ataca diferiti compusi, ca: petrolul, kerosenul, uleiurile minerale, parafina, gazul de iluminat, gazele de sonda, cauciucul natural si sintetic, uleiurile de racire, suprafetele asfaltate, conductele subterane si cablurile electrice protejate de coroziune cu ajutorul materialelor impregnate cu parafina, elastomeri sau diferiti derivati ai hidrocarburilor. Primele observatii asupra acestui proces dateaza din anul 1895, cnd Miyoshi (Geamanu, 2002) a observat ca straturile subtiri de parafina (considerata biologic inerta) sunt patrunse de hifele de Bothrytis cinerea. Ulterior, Rahm (1906) a demonstrat ca mai multi microfungi utiliznd-o ca unica sursa de carbon si energie. Importanta fenomenului n natura a fost semnalata de Seyer (1933) si de Chibnall si colab., (1934) pe baza frecventei ridicate a microorganismelor din sol,

inclusiv Penicillium glaucum pot ataca parafina, descompunnd-o si

active n sol si a incapacitatii de acumulare a unor hidrocarburi sintetizate de plante sau unor ceruri produse de insecte (Berca, 2000). Capacitatea de a utiliza hidrocarburile este larg raspndita n lumea microorganismelor, fiind ntlnita la bacterii (inclusiv actinomicete), la levuri, la fungii filamentosi, dar si la alge. Prezente n sol, n apele dulci si marine si n unele sedimente, ntr-o gama larga de conditii de mediu, aceste microorganisme au capacitatea de a sintetiza un spectru larg de enzime care asigura degradarea hidrocarburilor individuale si potentialului de ndepartare, sau de conversie a titeiului din mediu. Deversarea de titei brut n sol are drept rezultat o crestere numerica a populatiilor de bacterii, cu o reducere concomitenta a diversitatii lor, respectiv cu predominanta speciilor care degradeaza hidrocarburile la compusi mai simpli, determinnd disparitia lor treptata. Numarul microorganismelor care degradeaza hidrocarburile creste foarte mult dupa poluare, cu cteva ordine de marime si se mentine ca atare, uneori chiar mai mult de un an. n sol, dupa contaminare, microfungii care degradeaza hidrocarburi reprezinta 60-82% din totalul acestui grup, iar bacteriile 50% din micropopulatia respectiva. n timp ce n ecosistemele nepoluate numarul microorganismelor care utilizeaza hidrocarburile poate reprezenta doar 0,1% din total, n cele poluate opate ajunge pna la 100% din numarul microorganismele viabile. Aceasta se datoreaza faptului ca n mediile cu niveluri nalte de poluare are loc modificarea compozitiei n specii microbiene prin eliminarea acelora sensibile la poluant.

n ultimele trei decenii s-au identificat peste 200 de specii de microorganisme capabile sa metabolizeze hidrocarburile, microorganisme care au fost numite de Aluarn (1973), hidrocarbonoclastice. n urma analizarii microbiologice a probelor de soluri poluate cu titei unele n concentratii excesive (>30%), au fost izolate tulpini bacteriene cu o nalta rata de supravietuire n aceste conditii severe de poluare. Tulpinile bacteriene au fost multiplicate, izolate si purificate prin cultivarea dilutiilor zecimale succesive de sol (pe medii nutritive solidificate (Topping, CZPA). Identificarea pna la nivel de specie s-a facut prin examinari macro- si microscopice, teste fiziologice, cultivare pe medii selective (Bergey, 1986, Clark F., 1965). Majoritatea speciilor izolate apartin genurilor bacteriene cunoscute pentru specii capabile sa biodegradeze hidrocarburi din titei. Ulterior unele dintre tulpinile izolate au fost testate n laborator pentru evidentierea capacitatii de degradare a hidrocarburilor petroliere de catre microorganisme:

bS-a realizat prin nsamntarea acestora pe medii minerale la care s-a

adaugat titei, drept unica sursa de carbon si energie.

bMicroorganismele au fost izolate din solul poluat cu titei, prin tehnica

inocularii dilutiilor seriale de sol pe medii nutritive, n placi Petri. Dupa dezvoltarea pe mediul de cultura au fost izolate si purificate prin trecerea pe medii de cultura n tuburi de sticla.

bTulpinile izolate n tuburi au fost inoculate n mediu mineral lichid

(1,8ml) n care s-au adaugat 10l titei, drept unica sursa de carbon.

bAu fost selectionate acele specii de microorganisme care au dovedit

prin cresterea pe acest mediu, capacitatea de a utiliza hidrocarburile din titei. Tulpinile active au constituit o colectie de microorganisme adaptate la poluarea solului cu titei, care au fost prezervate n vederea folosirii lor pentru inoculare n cadrul unor experiente de bioremediere a solurilor poluate cu titei. Inoculul creat si aplicat ulterior in cadrul unor experimente a fost alcatuit din tulpini deja testate n laborator pentru abilitatea de a degrada hidrocarburi si apartin genurilor: Pseudomonas, Arthrobacter, Mycobacterium, Flavobacterium Actinomyces. n poluarea cu titei succesul bioremedierii depinde ntr-o foarte mare masura de compozitia comunitatilor microbiene din sol si de potentialul lor degradativ. Contaminarea solului cu titei n concentratii ridicate exercita efecte toxice asupra comunitatilor microbiene active din sol, reducndu-le diversitatea taxonomica si genetica, nsa, cu supravietuirea populatiilor care au toleranta fiziologica sporita si capacitatea de a utiliza substratul (Atlas et al., 1991). n cazul experientelor efectuate n casa de vegetatie si cmp experimental, n conditii de poluare controlata cu titei, comunitatile de bacterii heterotrofe, au fost alcatuite din specii ale genurilor Pseudomonas, Arthrobacter, Bacillus, Mycobacterium, reputate pentru tulpinile capabile sa degradeze hidrocarburi.

Pseudomonas sp. colonii confluate n urma unei dezvoltari abundente pe mediul Topping

Colonii de Bacillus, Arthrobacter si Mycobacterium

Bacillus -aspect macroscopic

Colonii diverse dezvoltate pe mediul Topping

Asociatie de colonii de Pseudomonas si Arthrobacter dezvoltate pe mediul Topping

Pentru reusita unei decontaminari cu ajutorul biopreparatelor bacteriene alcatuite din microorganisme selectionate este necesara crearea unui mediu ct mai favorabil adaptarii, multiplicarii si activitatii degradative a tulpinilor inoculate n solul poluat.

Cele mai importante cai de optimizare a conditiilor biodegradarii constau n asigurarea unor conditii de mediu favorizante pentru cresterea si multiplicarea microorganismelor degradative (Dumitru, M., 2000). Conditiile care favorizeaza, precum si principalii factori implicati n bioremediere sunt (dupa Henis, 1997): Prezenta si abundenta initiala a agentilor degradarii Microorganismele asociate Capacitatea de multiplicare Nivelul concentratiei poluantului (poluantilor) Solubilitatea poluantului Adsorbtia poluantului de catre microorganisme Recalcitranta poluantului Prezenta altor agenti toxici Prezenta nutrientilor Perioada de contaminare (aclimatizarea) Prezenta acceptorilor de electroni Conditiile fizice; umiditate, temperatura, pH, Eh Pentru orice strategie de bioremediere se opteaza, alegerea trebuie sa fie precedata de analize microbiologice, chimice si fizice, n functie de rezultatele carora solul poluat va trebui sa fie amendat pna la realizarea conditiilor optime pentru microflora degradativa. Parametrii clasici de masurare n laborator a eficacitatii unui proces de bioremediere sunt: numaratorile populatiilor de microorganisme, determinarea ratei respiratiei microbiene (consumul de oxigen sau producerea de bioxid de carbon), monitorizarea ratei disparitiei poluantului din sol.

CONCLUZII Aplicarea metodologiei de detoxificare prin bioremediere in situ a solurilor poluate cu compusi organici proveniti din titei a necesitat realizarea unui biopreparat alcatuit din bacterii specifice. Tulpinile bacterieneau fost izolate si selectionate din microflora autohtona a solurilor puternic poluate cu titei de pe teritoriul schelelor petroliere din Romnia. Tulpinile izolate au fost testate n laborator pentru evidentierea capacitatii de degradare a hidrocarburilor petroliere de catre microorganisme prin nsamntarea acestora pe medii minerale la care sa adaugat titei, drept unica sursa de carbon si energie. A fost alcatuita o colectie de microorganisme din care s-a realizat un biopreparat bacterian. Testarea biopreparatului bacterian s-a facut prin inocularea unui sol brun luvic vertic din clasa argiluvisolurilor care reprezinta 48% din totalitatea solurilor poluate din Romnia, n experiente organizate n casa de vegetatie si cmp experimental.

BIBLIOGRAFIE

1. Alexander M., Biodegradation and Bioremediation, Academic Press, San Diego New York Boston London Tokyo Toronto, 1994. 2. Atlas R.M. and D. Pramer, Focus on bioremediation. ASM News, 56: 7, 1990. 3. Berca M. Ecologie generala si protectia mediului. 294-299, Editura Ceres Bucuresti, 2000.

4. Bergey`s Manual of Sistematic Bacteriology, vol. 2, Williams and Wilkins,Baltimore,USA, 1986 5. Clark, F., - Agar plate method for total microbial count. Method for Soil Analysis, vol. 2. American Society for Agronomy, Madison, WL, pp.1460-1465, 1965. 6. Dumitru M., Starea agrochimica a solurilor din Romnia, Stiinta solului, vol. XXXVI, nr. 2, 2002. 7. Eliade G., Ghinea L., Stefanic Gh., Bazele biologice ale fertilitatii solului, Edit. Ceres, Bucuresti, 1983. 8. Geamanu I., Microbiologie, Edit. Universitas Bucuresti, 2002 9. Henis Y., Bioremediation in agriculture: dream or realiy ? In: Modern Agriculture and the Environment, by D. Rosen et al., Kluwer Academic Publishers, pp. 481-489, 1997. 10. 11. Teza de Doctorat, 2003. Toti M., M. Dumitru, Anca Rovena Voiculescu, Gabriela Mihalache,

Carolina Constantin, M. Mihalache, 2003, "Metodologia de remediere a solurilor poluate cu titei cu ajutorul microorganismelor specifice selectionate din microflora autohtona", Editura GNP MINISCHOOL, Bucuresti 12. Toti M., M. Dumitru, Carolina Constantin, Poluarea cu petrol si

apa sarata a solurilor din Romnia. Ed. RisoPrint Cluj Napoca, 227 pag., 1999. 13. Toti M., Rauta, C., Dumitru M., Capitanu, Gament Eugenia, Damian

Maria, - Distributia principalelor tipuri de poluare cu reziduuri petroliere si apa sarata din Romnia. Analele ICPA nr. 52, Bucuresti, 1992. 14. Toti M., Rauta, C., Dumitru M., Capitanu, V., Mocanu Adina, Damian

Maria, Gament Eugenia, - Implementarea unui sistem de monitoring

(supraveghere, prognoza, avertizare) n zona solurilor poluate cu petrol si stabilirea influentei fiecarei surse de poluare. Arhivele ICPA. 1991. 15. Toti M., Rauta, C., Dumitru M., Capitanu, V., Mocanu Adina, Damian

Maria, Gament Eugenia, - Implementarea unui sistem de monitoring (supraveghere, prognoza, avertizare) n zona solurilor poluate cu petrol si stabilirea influentei fiecarei surse de poluare. Arhivele ICPA. 1991. 16. Voiculescu Anca Rovena, M. Dumitru, M. Toti, Gabriela Mihalache,

Carolina Constantin, - Quantitative and Qualitative Distribution of Microflora in Petrleum and Salty Water Polluted Soils, Stiinta Solului, vol. XXXV, nr. 1-2, p.68-75, 2001. 17. Voiculescu Anca-Rovena Rolul unor microorganisme n

detoxificarea si bioremedierea solurilor poluate cu compusi organici - Toti M., Rauta, C., Dumitru M., Capitanu, Gament Eugenia, Damian Maria, - Distributia principalelor tipuri de poluare cu reziduuri petroliere si apa sarata din Romnia. Analele ICPA nr. 52, Bucuresti, 1992.