Sunteți pe pagina 1din 9

UNIVERSITATEA DE VEST VASILE GOLDI DIN ARAD

MASTERAT

ANALIZE DE LABORATOR UTILIZATE N DOMENIUL BIOMEDICAL

REFERAT

MIJLOACE TEHNICE UTILIZATE N CULTURI DE CELULE

Masterand Clejan ( aiti ) Maria

Tipuri celulare ntlnite n organismul uman. Proliferare i diferen iere celular , culturile celulare

Toate tesuturile sunt constituite din celule si substanta intercelulara. Substanta intercelulara poate fi reprezentata ntr-o cantitate ce difera n functie de tesut: foarte redusa cum ntlnim n tesutul epitelial sau abundenta n tesutul conjunctiv. La tesutul conjunctiv n aceasta substanta se gasesc si elemente fibrilare. Att substanta intercelulara ct si fibrele sunt produse de elaborare ale celulelor tisulare locale. Astfel devine clar ca elementul constitutiv de baza al fiecarui tesut este celula, care reprezinta unitatea morfologica si functionala a oricarui tesut. Dimensiunile celulei sunt particulare fiecarei localizari tisulare n diferite organe: -4-5 microni (celulele granulare din cerebel), -7-8 microni (limfocite, eritrocite), -30-40 microni (neuronii din coarnele anterioare ale maduvei spinarii), -180-200 microni (ovulul). Forma celulelor Este dependenta de functia lor si de modul de agregare, din care cauza celulele n preparatele histologice se prezinta sub forme variate: -celula sferica: ( ovocit, leucocit, adipocit, condrocit, etc), Celula sferica. Adipocitul (celula grasa). Are un 22522f521w contur sferoidal, continnd un nucleu turtit si situat spre periferie, sub plasmalema si putina citoplasma. Celula poliedrica (celulele spinoase din epiteliul malpighian epiderm, epiteliul bucal), Celule poliedrice. Celulele stratului spinos epidermic sunt prevazute cu multe laturi, au nucleul sferic si situat central, 1, iar ntre ele lasa spatii intercelulare. Celulele nu sunt lipite una de alta si se leaga ntre ele prin spini intercelulari, 2, (desmozomi). Celula pavimentoasa (celulele endoteliale, celulele mezoteliale), Celula turtita (pavimentoasa) cu citoplasma putina si ntinsa iar nucleul discoidal proemina n zona centrala. Limitele celulare se evidentiaza prin impregnare argentica , se coloreaza n negru.

Celula stelata (neuronul celulele nervoase).Corpul celulei prezinta prelungiri periferice care sunt mai intens impregnate la origine dnd celulei aspect stelet. Nucleul este rotund, slab colorat, cu nucleol situat central. Celula fuziforma. Celula musculara neteda. Celula are forma alungita, (de aici si numele de fibra) si ascutita la cele doua capete, (forma de fus). Nucleul alungit este situat central. Celula flagelata. Spermatozoidul. Se remarca la o extremitate a celulei capul spermatozoidului ovalar, intens colorat (contine nucleul) si o prelungire subtire si usor flexuoasa-coada (flagelul) spermatozoidului. Celula piriforma(celula Purkinje,din scoarta cerebeloasa). Celula cubica ( celulele epiteliului tiroidian, celulele plexurilor coroide, celulele din epiteliul canaliculului biliar din spatiul Kiernan), Celula are forma cubica, nucleu sferic situat central. Celula cilindrica (celula epiteliului mucoasei gastrice, celula epiteliului mucoasei intestinale, celula epiteliului mucoasei uterine), Celule cilindrice, nalte, ce prezinta doi poli (pol bazal si pol apical). La polul apical apar fine striatii, platoul striat. Nucleul este ovalar situat n treimea inferioara. Celula caliciforma (celula mucoasa din epiteliul mucoasei intestinale si din epiteliul mucoasei respiratorii),Celula caliciforma ( are forma unui caliciu de floare sau a unei cupe de sampanie) Celula piramidala (neuronii piramidali din scoarta cerebrala, celula secretorie din acinii serosi), Celula cu prelungiri mult ramificate dndu-i un aspect neregulat (Ex: celula pigmentara, melanocitul). Pigmentul secretat de melanocit este melanina, ce confera citoplasmei aspectul brun nchis.Celula pigmentara ce prezinta prelungiri mult ramificate dndu-i celulei un aspect ce nu-i permite ncadrarea n nici o forma bine precizata, din care cauza i se spune ca este de forma neregulata. Este colorata prin pigmentul sau. Celula discoidala (hematia), sau echivalente celulare. Este anucleata, vazuta din fata este rotunda si mai slab colorata la mijloc, vazuta din lateral apare ca un disc biconcav. Plasmodiul este o formatiune citoplasmatica multinucleata rezultata dintr-o singura celula prin cresterea citoplasmei si nmultirea nucleilor. Ex: Fibra musculara striata.Se remarca forma de panglica a fibrei musculare striate n a carei citoplasma bogata si eozinofila se gasesc numerosi nuclei ovalari, dispusi n periferie. Sub sarcolema, aspectul striat al citoplasmei, este dat de structura specifica a miofibrilelor fibrei musculare.

Sincitiul este o formatiune citoplasmatica multinucleata rezultata prin contopirea mai multor celule. Ex. Osteoclastul, sincitiul trofoblastic, etc. Apare ca o celula voluminoasa cu citoplasma bogata, cu contur neregulat continnd multi nuclei sferoidali.

Metode de studiu ale biologiei celulare

Culturile de celule

Dezvoltarea organismului uman este rezultatul unor procese de diviziune, crestere, nmultire si diferentiere celulara care duce la dobndirea unor functii si structuri morfologice specifice tipurilor de celule. Mecanismele cresterii si proliferarii celulelor au fost urmarite experimental prin cultivarea de celule in vitro . Definitie: termenul general de "culturi de celule" desemneaza totalitatea tehnicilor prin care un organ, un tesut sau celule dispersate (natural sau prin tehnici de laborator) sunt mentinute n viata sau multiplicate n afara organismului ("in vitro"). Prin culturile de celule, se poate studia comportamentul celulelor n conditii strict definite: -se adauga sau se extrag molecule specifice (de exemplu factori de crestere) si se determina efectele asupra comportamentului celular; -se obtin populatii omogene de celule pentru analize biochimice; pe culturi mixte, se studiaza interactiunile ntre tipurile celulare. Pe lnga scopurile de cercetare, culturile de celule sunt folosite si pentru producerea vaccinurilor virale.

A. Clasificarea culturilor de celule :


Dupa felul substratului, pot fi:

- pe suport organic nutritiv; - pe suport organic nenutritiv; - pe suport anorganic; - n suspensie n mediu lichid. Dupa tipul de material biologic cultivat se disting doua mari categorii de culturi:

1. Culturi de organe (organocultura) - reprezinta ntretinerea, de obicei fara multiplicare, n medii nutritive adecvate a unor fragmente de organ (intestin, trahee, rinichi). n general, cultura de organe "in vitro" este dificila si necesita medii nutritive complexe si conditii tehnice speciale. 2. Culturi de celule - reprezinta multiplicarea "in vitro" a celulelor din: -fragmente de tesut (explante); in jurul explantului se formeaza o coroana de celule care se multiplica; -suspensii de celule naturale sau obtinute prin dispersarea n laborator. n prezent, se pot obtine culturi celulare n linie continua, mentinute de-a lungul a 15-20 de pasaje fara a se transforma sau degenera, precum si linii celulare stabilizate, care si mentin nealterati parametrii morfologici si fiziologiei initiali dupa multiple diviziuni. Clonarea reprezinta separarea unei singure celule si multiplicare a ei separata rezultnd o linie celulara uniforma din punct de vedere genetic. n organism, celulele se gasesc sub influenta mecanismelor de conservare si control. Odata scoasa din mediul natural de viata, celula are nevoie, pentru a supravietui si a se multiplica "in vitro", de o serie de conditii de ordin fizic, chimic, bioenergetic care sa mimeze ct mai mult situatia "in vivo". Reusita culturilor de celule "in vitro", depinde n mare masura de: -folosirea instrumentarului steril; -aplicarea unor tehnici aseptice; -utIlizarea unor medii de cultura care sa asigure celulelor cultivate "in vitro" conditii apropiate de acelea pe care le ofera organismul viu.

Deosebirile esentiale dintre aceste doua modalitati de viata si de multiplicare celulara sunt: - "in vivo", celulele sunt supuse controlului neuroendocrin si influentei tesuturilor din vecinatate; aportul de substante nutritive si eliminarea produselor de metabolism se face continuu prin snge si limfa; - "in vitro", celulele nu sunt supuse acestui control; aportul si eliminarea sunt periodice.

B. Mediile de cultura
Se pot clasifica dupa mai multe criterii: dupa consistenta - sunt medii lichide si semilichide; dupa compozitie - exista medii naturale, semisintetice si sintetice; dupa valoarea nutritiva si scopul urmarit - se cunosc medii de crestere, care asigura proliferarea celulelor din cultura, medii de mentinere utilizate pentru ntretinerea culturilor ajunse la dezvoltare maxima si care pastreaza toate activitatile celulare si medii defective, testarea celulelor n conditii speciale de crestere.

Mediile de cultura celulara trebuie sa asigure: -echilibrul ionic obtinut cu solutii izotone (pentru pastrarea continua a presiunii osmotice); pHul optim (pH 7.2 - 7.4) mentinut cu substante tampon (tampon fosfat sau bicarbonat de sodiu CO2); n mediu exista si un indicator de pH; -temperatura optima, continutul de 02 si de CO2 favorabil; -elemente nutritive, indispensabile metabolismului: hidrati de carbon (glucoza), proteine animale (din lichide biologice - plasma, ser, lichid amniotic) si aminoacizi esentiali, grasimi, vitamine, hormoni, substante stimulatoare ale cresterii; -evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin adaugarea de antibiotice (penicilina, streptomicina) si antifungice (stamicin, micostatin); -stimularea multiplicarii si cresterii celulelor prin adaugarea de extracte embrionare.

Mediile nutritive contin: -o solutie salina (solutie tampon si indicator); -elemente proteice (ser sau plasma sau lichid amniotic, aminoacizi); -elemente stimulatoare ale cresterii (extracte tisulare de origine embrionara sau adulta); -vitamine; -antibiotice.

C. Tehnica culturii celulare

Se desfasoara n mai multe etape, n toate etapele se respecta riguros regulile de asepsie. a. Reeditarea - se face din cele mai varitate tesuturi provenite de la om, animal sau plante. Dupa provenienta lor tesuturile ce urmeaza a fi cultivate se mpart n: - tesuturi normale: - embrionare (se cultiva usor, crestere rapida); - adulte (medii complexe, crestere lenta, precedate de un timp de latenta de cteva zile); -tesuturi tumorale. b. Dispersarea mecanica (maruntirea embrionului) se realizeaza ntr-un mediu steril, cu ajutorul unui foarfece special. Daca nu se obtin rezultate satisfacatoare, fragmentele rezultate sunt supuse dispersarii chimice cu tripsina la 37C, pe suprafata unui agitator magnetic. Actiunea tripsinei se opreste prin racirea solutiei si apoi celulele se separa de solutia de tripsina prin centrifugare si se nlatura supenatantul reprezentat de tripsina. Se resuspenda sedimentul celular ntr-un mediu nutritiv, apoi se prepara o dilutie 1:10 a suspensiei celulare n mediu nutritiv pentru efectuarea numararii. c. Numararea cu camera de numarare (hemocitometru). Din dilutia preparata (9 ml de mediu nutritiv, 1 ml din suspensia de celule) se pune o picatura pe suprafata unei camere de numarare, pentru a stabili densitatea celulelor din suspensie.

Dupa determinarea densitatii suspensiei celulare, se adauga un anumit volum de mediu nutritiv astfel nct sa se ajunga la numarul optim de celule pe mililitru, si anume 106 celule /ml. d. Determinarea viabilitatii celulelor din suspensie cu ajutorul solutiei de albastru de triptan 0.5%; -se adauga 0.1 mI solutie n 0.9 ml de suspensie celulara. -o picatura din acest amestec se examineaza la micro scopul fotonic - celulele vii ramn necolorate, cele moarte aparnd albastru-violet. Mortalitatea nu trebuie sa depaseasca 10%. e. O cantitate din suspensia de celule pentru care s-a determinat viabilitatea si densitatea optima se repartizeaza pe suprafata recipientului de cultura, ct mai uniform, cu ajutorul unei pipete Pasteur; se tine la termostat la 37C, timp de 30 - 60 min. apoi se introduce mediul de cultura, astfel ca el sa nu antreneze fragmentele fixate pe peretii recipientului. Vasul se nchide si se incubeaza la 37C, fara a se agita timp de 3-4 zile. Metoda este analoga si n cazul utilizarii testurilor solide umane, embrionare sau adulte. f. Controlul culturilor Controlul mediului de cultura se efectueaza la 12-24 de ore pentru: - contaminare (bacterii, fungi, virusi); - constantele fizico-chimice (pH, proteine totale); -aprecierea eficientei culturii (densitatea celulara pe suport, eficienta de formare a coloniilor). Controlul morfologic al celulelor din culturi se face prin: - microscopie fotonica pe preparate proaspete se examineaza celulele vii la microscopul cu contrast de faza sau pe preparate permanente fixate si colorate; - histoautoradiografie; - microscopie electronica.

Activitate practica Cultura de limfociti din sngele periferic

Reeditarea Se ia 3ml snge, prin punctie venoasa la plica cotu1ui, cu ajutorul unei seringi sterile, heparinata anterior recoltarii. Se poate recolta snge si din punctie n pulpa degetului, nsa aceasta metoda comporta risc de infectie a culturii mai frecvent, motiv pentru care are aplicatie limitata. nsamntarea mediului - consta n repartizarea mediului de cultura special n flacoane de sticla sterile de 20 - 30 ml, n care se va pune 10 ml de mediu de cultura n conditii sterile. Se lasa sa ajunga la temperatura camerei, dupa care se plaseaza n fiecare flacon 12 - 20 picaturi din sngele recoltat (numarul picaturilor fiind n functie de leucograma persoanei investigate). Se nchide flaconul cu un dop steril si se agita usor pentru omogenizare. Cultura este tinuta la termostat la 37C timp de 72 - 96 ore, interval n care la fiecare 24 ore se verifica ph-ul si aspectul. Acidifierea mediului este tamponata cu fosfat - tampon. Culturile care si schimba culoarea sau devin tulburi, vor fi ntrerupte, deoarece cultura este compromisa.