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BASES DE ONCOGENESIS Y ALGUNOS FACTORES RELACIONADOS

1. Generalidades
Los oncogenes son, esencialmente, genes que son experimentalmente definidos por su capacidad de provocar el fenotipo transformado de las clulas en cultivo. Las clulas transformadas son capaces de se multiplicar en condiciones de reducida, o incluso, ausencia de factores de crecimiento exgenos. Estas definiciones son muy simplistas, pero son, en la prctica, tiles para los propsitos de anlisis de la actividad de los oncogenes, que representan piezas de la estructura bioqumica de la multiplicacin celular.

Para que un gen tenga propiedades funcionales para sustituir seales recibidas de la superficie celular, ste debe tener alguna interaccin reguladora especfica desempeando un papel concreto en los procesos normales de proliferacin celular. Siendo as, al identificar un oncogn, nosotros encontramos una parte potencialmente importante del mecanismo bioqumico de la multiplicacin celular.

El desafo reside en definir exactamente qu papel desempea el gen en las funciones de una clula normal. En muchos casos, para que un gen sea realmente un oncogn, tiene que poseer algn aspecto especfico o verse alterado en alguna actividad.

Lo requerido vara de gen a gen, pero la naturaleza de estas alteraciones tambin revela potencialmente informacin significativa acerca de la funcin habitual del gen en cuestin. Los productos de muchos oncogenes son, realmente, molculas que son estudiadas en varios captulos de la biologa molecular de una clula en estado de proliferacin. Los oncogenes tienen un enorme valor prctico.

Las clulas transformadas son tumorignicas y, por eso, por definicin, los oncogenes han sido identificados con el estudio de los cambios genticos en tumores que aparecen en el hombre de manera natural o que han sido inducidos en animales.

Esto significa que la comprensin de la identidad y funcin de los oncogenes representa una contribucin importante para la realizacin de un diagnstico y, consecuentemente, la terapia de los tumores.

Existen dos orgenes de oncogenes. Ciertas infecciones por virosis del ADN tienen la propiedad de ser capaces de transformar las clulas en cultivo ya que estn ntimamente asociadas a ellas o porque son la causa de tumores que surgen de manera natural. Estas virosis codifican genes que contienen funciones oncognicas. Tales oncogenes codificados con ADN de virus no poseen contrapartes en las clulas hospederas y son requeridos por virus debido a algn aspecto de su ciclo de vida infecciosa.

Las propiedades oncognicas se originan como una consecuencia de la interaccin entre el producto del gen viral y la maquinaria del ciclo celular del hospedero. Como ejemplos de tales genes podemos citar el gen Large T del virus SV40, el gen EIA del tumor asociado a la adenovirosis o el gen E6 de las virosis del papiloma humano.

El origen ms prolfico de los oncogenes es un conjunto de versiones acerca de las modificaciones que sufren los genes celulares normales. Cualquier gen celular normal que sea susceptible de ser alterado, sea en la secuencia, sea en la expresin para provocar la reproduccin celular, en ausencia de factores de crecimiento, es potencialmente un oncogn. Por otro lado, el aislamiento de un gen celular modificado confiere al fenotipo transformado una contraparte normal correspondiente que, en principio, asume el control de la multiplicacin celular. De esto se deduce el concepto de proto-oncogn, que se interpreta como la contraparte celular normal de un oncogn.

Los primeros ejemplos de genes oncognicos han sido descubiertos en asociacin con otra clase de virosis: las retrovirosis. Estas virosis tienen un estilo de vida no usual. En su estado infeccioso comprenden un genoma de ARN recubierto de una pelcula de protena. Cuando el virus infecta una clula, el genoma ARN se copia en la doble tira de ADN por transcripcin inversa codificada por el virus y la copia de ADN del genoma viral se integra en el genoma hospedero. En circunstancias normales, de la transcripcin del genoma viral integrado resultan nuevos virus infecciosos.

Conocemos dos tipos diferentes de tumores que estn asociados con la infeccin retroviral. El primero, el tipo ms severo, puede ser producido por infeccin de un animal hospedero con el virus. El clsico ejemplo de este tipo es el virus del sarcoma Rous que induce a sarcomas (tumores de tejidos moles) despus de infectar los pollos.

Los tumores inducidos por estas virosis son frecuentemente muy agresivos y matan el hospedero en el plazo de semanas o meses. Estos tumores son tambin multiclonales en origen; esto significa que el tumor est compuesto por multitud de clulas que han sido infectadas consecutivamente por el virus.

El motivo por el cual este tipo de virus induce a un tumor es porque, en cualquier momento de la historia de su ciclo vital, se recombin con el genoma del hospedero y se incorpor a un gen normal del hospedero en su propio genoma. De este excepcional suceso se derivan varias consecuencias; una de ellas es que los genes celulares normales se quedan bajo el control de los elementos reguladores virales. Es posible que, en el proceso de recombinacin, el gen hospedero pueda sufrir mutaciones; entonces, como resultado del acto de recombinacin con el genoma hospedero, el proto-oncogn hospedero se manifieste de forma anormal y tambin pueda resultar alterado en su funcin. El anlisis de esta forma de descubrimiento de los proto-oncogenes lleva a concebirlos como los homlogos normales de los genes que se haban recombinado con el virus.

El segundo tipo de tumor asociado con retrovirosis infecciosas es algo diferente. En este caso, el tumor se origina generalmente de un modo lento y puede no aparecer en todos los animales infectados. En algunos casos el efecto de la integracin retroviral es heredado de generacin en generacin y se manifiesta como una predisposicin heredada de ciertas especies de ratones para desarrollar tumores mamarios.

Esto es el resultado de la herencia de una copia integrada del Virus Tumoral Mamario en el Ratn (MMTV). Los tumores formados en estas situaciones son todos monoclonales en origen. Esto significa que el tumor se origina en una clula singular fundadora infectada. En estas condiciones, debe haber un proceso adicional antes de que el potencial oncognico del virus sea liberado. Para que este tipo de virus llegue a producir un tumor es fundamental que se haya integrado en las cercanas de un proto3

oncogen y, como consecuencia, haya adoptado las expresin del proto-oncogen bajo el control de sus propios elementos promotores. La activacin transcripcional del gen hospedero por el virus es la que lleva a la formacin del tumor. Esto explica, en parte, la larga latencia y monoclonalidad de este tipo de tumor. Adems de esto, tambin se requiere que el virus se integre en un lugar especfico que tiene que estar localizado en las cercanas de un proto-oncogn cuyo potencial oncognico pueda ser activado por alteracin en su manifestacin.

El mtodo de aislamiento de oncogenes implica su clonacin directamente del ADN genmico en virtud de su funcin oncognica. El razonamiento que est fundamentando esta hiptesis es el siguiente: si los tumores son el resultado de mutaciones genticas que llevan a la conversin del proto-oncogn en un oncogn, debe entonces ser posible clonar directamente las secuencias del ADN oncognico de tumores en virtud de su capacidad para transfectar clulas normales.

La estrategia experimental bsica la encontramos reflejada en un cierto esquema. El ADN es extrado de un tipo especfico de tumor y transfectado a una clula target que sea transformacin en clula sensible, tal como 3T3. Este procedimiento origina colonias transformadas raras como resultado de la adquisicin de un segmento de ADN con funcin oncognica. Entonces, muy probablemente, estas clulas captarn grandes cantidades de ADN celular normal, esto es, diluido, captando ADN de las colonias transformadas y usndolo para la retransformacin en un segundo ciclo. Este proceso se repite hasta un segmento mnimo de ADN en transformacin por contener el oncogn que puede ser clonado con este procedimiento. Debemos especificar que este abordaje del problema no prueba que el gen aislado haya sido la causa del tumor original.

Existe un cierto nmero de casos en los que el gen que resulta eventualmente clonado se modifica para adquirir actividad transformadora como una deleccin/artefacto, o mutaciones adquiridas durante el proceso de transfeccin. Por ejemplo, un gen normal puede integrarse en las cercanas del ADN como un poderoso promotor o perder alguno de los elementos reguladores negativos en su promocin durante el proceso de integracin. Es por esto que decimos que esta tcnica identifica genes que pueden transformar clulas, sea como resultado de una mutacin en el ADN del tumor original, 4

sea como resultado de la activacin de la expresin en el proceso de transferencia. Un problema ms sutil es qu tipo de genes aislados tienden a reflejar el tipo de clula que se usa como objetivo para la transformacin. Usando una diana singular, tal como 3T3, tiende a llevar a la repeticin del aislamiento de los mismos genes de entre una amplia variedad de ADNs tumorales. Esto refleja la sensibilidad de la clula objetivo para la actividad del oncogn.

Un aspecto comn a muchos tipos de tumores es que presentan cromosomas anormales. En particular, las translocaciones cromosmicas son comnmente asociadas a tipos particulares de tumores. Esta es una situacin en donde un segmento de un cromosoma determinado se divide y se junta con otro.

Lo que es interesante de estos casos son las frecuentes asociaciones entre pares especficos de cromosomas en translocacin asociada con un tipo particular de tumor. Posiblemente, el ejemplo ms clarificador sea el del cromosoma Philadelphia encontrado en el 95% de pacientes con leucemia mielognica crnica y que implica una translocacin de un a regin del cromosoma 11 de los humanos en el cromosoma 22.

La base subyacente de estos eventos es que, como resultado de una translocacin, un proto-oncogn se ha desplazado, sea para la cercana de un promotor heterlogo, sea porque se haya fundido con una secuencia de codificacin de protena para producir una protena hbrida. La caracterizacin de los pares de genes relacionados con recolocaciones cromosmicas, lleva a la identificacin de proto-oncogenes que pueden ser activados, tanto por expresin ectpica, como por fusin gnica. Es interesante resaltar que muchos ejemplos de fusiones gnicas generadas por esta va produjeron una oligomerizacin y rotura del proto-oncogn.

Un ejemplo final de identificacin de los oncogenes es tambin el que se origina debido a otro tipo de anomala cromosmica en tumores humanos. Nos referimos al fenmeno de amplificacin de un gen. En esta situacin el tumor revel que haba sufrido una amplificacin de los segmentos especficos del ADN en los cuales reside el proto-oncogen objetivo. Este proceso debe suceder en presencia de un gran nmero de copias del gen en la clula transformada.

El fenmeno de amplificacin de genes revela una clase muy especfica de genes: aquellos cuyas funciones oncognicas son activadas porque estn presentes en niveles ms elevados que sus correspondientes contrapartes normales.

La identificacin de genes (y sus contrapartes proto-oncogenes), esencialmente revela un componente de la maquinaria del ciclo celular: una protena que, cuando est sujeta a la activacin oncognica, tiene la capacidad de inducir progresin a travs del ciclo celular. El principal inters desde la perspectiva del control del ciclo celular es la comprensin de la funcin bioqumica de la protena en cuestin y cmo su conversin oncognica lleva a la transformacin celular.

Una observacin ms pormenorizada en una muestra de oncogenes identificados por diferentes tcnicas revela que no hay un aspecto evidente de que estos genes compartan su capacidad para transformar clulas. Los oncogenes (y los proto-oncogenes) representan una diversidad de funciones secuenciadas y localizaciones celulares.

Dicho con otras palabras, no hay ninguna explicacin para la transformacin, o tumorigenicidad. Esto era de esperar por lo ya conocido de los mecanismos de control del ciclo celular. Siguiendo esta lnea de pensamiento se clarifica que la mayora de los oncogenes se distribuyen en cuatro clases funcionales familiares: factores de crecimiento, receptores implicados en sealizacin celular y factores de transcripcin. Llegados a este punto un aspecto relevante a considerar es el mecanismo por el cual un proto-oncogn es accionado y se convierte en oncogn. Esto no solo establece las condiciones bajo las cuales los procesos de conversin oncognica tendrn lugar, sino que tambin revelan algo sobre la funcin ordinaria que desempea el proto-oncogn y su posicin en el mapa de control del ciclo celular.

2. Factores de crecimiento
Un cierto nmero de oncogenes son factores de crecimiento. El oncogn SIS est incorporado en el genoma del virus del sarcoma de los simios y codifica el PDGF B ( platelet derived growth factor). La capacidad del virus del sarcoma de los simios para formar tumores es, por eso, el resultado de la expresin del PDGF-B, bajo el control de los elementos reguladores virales, al contrario de su promotor. 6

Un cierto nmero de miembros de la familia FGF-(fibroblast growth factor) FGFs 3, 4 y 8 han sido identificados como dianas para la activacin transcripcional por insercin proviral de MMTV (virus murino de tumor mamario). En este caso, la integracin del genoma viral en la vecindad del gen target FGF resulta en la expresin de FGF bajo el control del promotor viral en la glndula mamaria. Un mecanismo similar est implicado en la activacin de la familia Wnt de los factores de crecimiento por insercin proviral MMTV. Un ejemplo final es el FGF4, que ha sido aislado directamente del ADN genmico, por dos vas: (1) transfeccin del ADN de los tumores sarcoma Kaposi en las clulas 3T3; (2) como una consecuencia de su inclusin en una regin del ADN que est sujeta a la amplificacin del ADN en los tumores del estmago.

De hecho, es muy probable que en ambos casos el aislamiento del FGF4 como un oncogn sea un artefacto que se origine del protocolo experimental al contrario de una reflexin sobre una implicacin de FGF4 en el tumor original. El gen FGF4 contiene un cierto numero de elementos regulatrios represores fuertes en su promotor que fueron separados de la secuencia que codifica el FGF4 en el proceso de aislamiento del gen. Como resultado, el gen FGF4 transfected se encuentra activado transcripcionalmente, lo que es la base de su capacidad para transformar clulas. Esto viene a ilustrar el principio comn de la activacin oncognica de los genes de los factores de crecimiento: - la activacin oncognica casi invariablemente envuelve activacin transcripcional del gen, llevando a la produccin del factor de crecimiento en un sitio no apropiado.

En efecto, este mecanismo puede ser reproducido experimentalmente, forzando la expresin de los factores de crecimiento en los tejidos adultos, por varios medios. En muchos casos el resultado es la produccin de un tumor en las clulas en que el factor de crecimiento heterlogo est presente. La capacidad de los factores de crecimiento para transformar clulas, por eso, resulta de un mecanismo autocrino. La clula no depende de seales externas para inducir la proliferacin, una vez que es capaz de producir sus propias seales. Hay dos consecuencias intrigantes de este mecanismo de activacin. La primera, implica que, en muchos tejidos adultos por lo menos, la justificacin por que las clulas son quiescentes es debido a que estn privadas de 7

estimulacin de factores de crecimiento apropriado. Segundo, la expresin ectpica de un factor de crecimiento por una clula transformada, o tumorignica puede estimular la vecindad compuesta por clulas no transformadas por un mecanismo paracrnico.

Esto puede llevar a muchas de las consecuencias secundarias de la formacin del tumor, tales como la fibrosis (produccin de una malla de tejido, anlogo a la cicatriz alrededor del tumor), o angiognesis (induccin de la formacin de nuevos vasos sanguneos cerca del tumor por estimulacin de clulas endoteliales). Estas consecuencias secundarias de la expresin del factor de crecimiento ectpico son frecuentemente significativas en la historia natural del tumor en el hospedero.

3. Receptores de los factores de crecimiento


Un nmero significativo de oncogenes contienen la clave definidora de los receptores de los factores de crecimiento. Se trata de protenas transmembrana con dominios con actividad tirosina quinosina intrnseca en la regin intracelular (intrinsic tyrosine kinase).

El gen neu ha sido aislado (como el nombre indica) de un neuroblastoma inducido qumicamente en el ratn por va de la transfeccin del ADN. El gen neu no es ms que el HER-2, un miembro de la familia de receptores EGF. Sin embargo el oncogn neu es sutilmente diferente, tiene mutaciones puntuales especficas en el dominio

transmembrana. El resultado de estas mutaciones es para inducir el dominio transmembrana domain del receptor HER-2 para sufrir dimerisation espontnea.

Un cierto nmero de receptores del factor de crecimiento han sido identificados en tumores como resultado del proceso de translocacin cromosmica que llevan a la produccin de fusiones con otras protenas celulares. Entonces, tanto los genes FGFR-1 (fibroblast growth factor receptor 1), como el PDGFRB (factor de crecimiento derivado de plaquetas) han sido recuperados de leucemias como fusiones gnicas con otro gen, TEL. TEL es un factor de transcripcin, que puede parecer extrao a primera vista ya que la fusin de un factor de transcripcin con un receptor de factor de crecimiento lleve a una activacin oncognica. 8

Una inspeccin de los productos proteicos de estas fusiones da la informacin. TEL es una protena dimrica y las fusiones oncognicas invariavelmente implican fusin de la dimerisation domain de TEL con tyrosine kinase domain del receptor target. Esto lleva a la fusin del dominio de dimerizacin con el dominio con actividad tirosina quinasa.

El mecanismo esencial de la activacin oncognica de los receptores del factor de crecimiento es la dimerisation, forzada como el resultado de una mutacin especfica o de una fusin del gen. Como resultado, las vas de transduccin de seal son activadas sin necesidad de estimulacin del factor de crecimiento. En esta situacin, la clula transformada acta como si estuviese recibiendo una seal del factor de crecimiento extrnseco y comienza a reproducirse.

4. Transduccers de seal
Una de las clases de oncogenes ms frecuentemente recuperados son miembros de la familia de genes Ras, de pequeas protenas G asociadas a la membrana. Entonces, los miembros de la familia de genes Ras han sido incorporados en los genomas de un cierto nmero de diferentes retrovirosis formadoras de tumores, tales como las virosis de sarcoma de ratones Harvey y Kirsten (ste es el origen del nombre Ras). Los genes Ras tambin son frecuentemente recuperados del ADN tumorignico usando la va de transfeccin del ADN. En todos los casos estos genes Ras oncognicos se encuentran con mutaciones point que directa o indirectamente, eliminan la actividad GTPase intrnseca de la protena Ras. Mas an, las mutaciones puntuales de este tipo en los Ras genes aparecen frecuentemente en tumores humanos de muchos tipos ocurriendo naturalmente. El resultado de estas mutaciones es que el Ras est permanentemente activado, independientemente de la presencia de estmulos activadores, por eso est en estado de necesidad de activacin por los estmulos activadores. Los genes Ras oncognicos, por eso, exponen la clula a una seal mitognica intracelular continua.

Muchas quinasis protecas intracelulares tienen el diseo clsico de las quinases de los domains cataltico y regulatrio en el cual el componente regulador acta para suprimir la actividad quinasis, excepto si est ligada o modificada, por co-factores. 9

La desrepresin fisiolgica de la actividad quinasis puede ser por eso mimetizada por mutaciones que suprimen las funciones inhibidoras del dominio regulador. Este es un mecanismo comn de activacin oncolgica de los transducers de quinasis intracelular. Por ejemplo, el gen Raf ha sido originariamente identificado como un oncogenio transformador del virus del fibrosarcoma del ratn. La incorporacin del gen Raf en el genoma viral provoc la rotura de la protena, promoviendo la activacin constitutiva de la actividad de la quinasa y la activacin concomitante de la va MAPK (mitogen-actived protein quinase) downstream.

Otra familia de quinasis, cuya posicin en la cascada de sealizacin es menos clara, son las quinasis de tirosina citoplasmticas asociadas a membrana de la familia Src.

El Src es el miembro prototipo de esta familia de genes y ha sido el gen transformado incorporado en el prototipo de retrovirus transformador, el virus sarcoma Rous. Ms an, el gen Src tiene un status especial en la historia de los oncogenes como el primer proto-oncogn que ha sido identificado en la base de su incorporacin en un virus transformador. Todas las versiones oncognicas del Src se encuentran truncadas o han sufrido mutaciones puntuales, que bloquean un dominio inhibidor N-terminal, lo que lleva a la estimulacin de la actividad quinasa. En general podramos decir que los transducers de seal oncognicos activan las vas de seal intracelular como un resultado de mutaciones que bloquean, o suprimen, regiones de la protena relacionada con la supresin o atenuacin de actividad.

5. Factores de transcripcin
Se ha encontrado un nmero considerable de factores que tienen funcin oncognica.

El gen fos ha sido identificado como un oncogn transformador del virus del osteosarcoma FBJ y el NFkB ha sido identificado como el gen transformador del retrovirus de la reticuloenteliosis del pavo. En todos los casos, el mecanismo de la activacin oncognica es la introduccin de mutaciones que activan constitutivamente

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las acciones de la protena, llevando otra vez a una actividad que no necesita de activadores. En el caso del gen fos el mecanismo de activacin parece resultar de truncations de las secuencias codificadoras y no-codificadoras del gen cuando ha sido incorporado en el virus. En el extremo 3 del gen se ha introducido una deleccin que tiene, por la menos, dos consecuencias. Una es para cambiar las secuencias de desestabilizacin en la regin no-codificadora 3 del gen. Esto causa estabilidad en el mensaje fos oncognico. La segunda es para sustituir un fragmento de la regin C-terminal de la protena normal que parece estar relacionada con la supresin transcripcional de la expresin del gen fos. El resultado combinado de estos cambios es para producir una forma de protena que se manifiesta as de manera estable y no transitoria durante el ciclo celular normal. En el caso del NFKB la forma oncognica de la protena ha sido truncada en el N-terminal y esto bloquea la asociacin con el inhibidor TKB.

De esta manera se consigue la localizacin permanente del factor de transcripcin en el ncleo y la subsecuente activacin de los genes diana downstream sin necesidad de que sea activado por liberacin de seal por mediacin del complejo citoplasmtico inactivo. Un ejemplo muy intrigante de un factor de transcripcin oncognico es el cmyc. Este gen ha sido frecuentemente recuperado como un oncogn por varias vas: sea directamente incorporndolo en un genoma retroviral transformador, localizado cerca de una insercin proviral en un tumor, o sujeta a reajustes cromosmicos. El ltimo paso es la base subyacente del cromosoma Philadelphia, que resulta de la recolocacin del gen myc en el cluster de genes de inmunoglobulina. El resultado de esta recolocacin es para traer al gen myc bajo control transcripcional de los elementos reguladores del gen de la poderosa inmunoglobulina especfica de las clulas B. En todas estas manifestaciones de acciones oncognicas del gen myc, los efectos se originan por la elevada presencia del gen normal en vez de la mutacin y prdida de funcin. Esto es significativo porque, en circunstancias normales de progresin del ciclo celular, parece como si el gen myc se manifestara transitoriamente o estuviera presente en niveles en muy bajos, indicando as que no es normalmente activo, o que sus acciones son ejecutadas en cantidades limitadas de protenas.

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Por eso est claro que el gen myc desempea algn papel en la progresin tumoral, pero la pregunta es: cul es ese papel?. La protena myc celular normal es un factor de transcripcin del tipo HLH box, est localizada en el ncleo y (como ha sido demostrado por mutacin del dominio de unin DNA transforma las clulas como resultado de su interaccin con el ADN.

Presumiblemente por eso, sus acciones implican la activacin (o supresin) de la presencia del gen target downstream. Un cuadro definidor de los factores de transcripcin de la familia HLH box es que ellos forman dimers con el partner de las protenas HLH box como parte de su mecanismo de accin. El myc, adems, es capaz de to dimer con otras protenas partner. May es un partner dimerizacin del producto gnico myc normal y esta parceria es necesaria para el myc para ejecutar sus funciones de transformacin. La deleccin de la dimerizacin dominio del myc bloquea la capacidad para transformar clulas. Sin embargo, la situacin es complicada por el hecho de que max sea tambin capaz de compartir con otras dos protenas de la clase HLH box, Mad y Mxil. La formacin de estas parcerias lleva a la ocultacin de max y a la inhibicin de la parceria transcripcionalmente competente myc/max. Mad y Mxil se encuentran en niveles elevados en clulas no proliferativas y por eso inihiben la actividad myc.

Cuando las clulas son inducidas a la proliferacin, el nivel de Mad y Mxil declina y la parceria Myc/Max profutiva puede formarse. Bajo este punto de vista, la accin de myc parece ser una manifestacin de progreso a travs del ciclo celular en vez de una causa. Sin embargo, este esquema representa una explicacin para las acciones oncognicas de la protena myc. Los niveles elevados de myc favorecen la inhibicin de max por secuerstro de los inhibidores a los que se une, escapando, por eso, del control normal. El myc representa un ejemplo excelente de relacin entre la diseccin bioqumica convencional de los mecanismos de control ciclo celular y el abordage de los oncogenes.

El facto del de que el myc es un oncogn implica que debe estar relacionado con el control del ciclo celular de alguna manera, pero los downstream targets para la activacin myc/max y las seales upstream que regulan las funciones myc estn an 12

sin esclarecer. La evidencia reciente indica que un aspecto posible de la actividad myc es la induccin de genes que estn implicados en el control del tamao de la clula o ms estrictamente, del contenido proteico. La expresin forzada de myc en los linfocitos B (como acontecera en clulas que poseen un gen myc oncognico) lleva a un aumento del tamao celular. Adems, el examen de los targets genticos de la activacin myc revela que muchos de estos genes que codifican protenas, estn directa o indirectamente implicados en el metabolismo de la clula y en la sntesis proteica, tales como factores de iniciacin de la traduccin y protenas ribosmicas. Las ciclinas (u otros genes) se quedan al el final de la cascada de seales pueden, en teora, ser objetivos claros para la activacin oncognica. La ciclina D es la nica de tal diana que est habitualmente asociada con un fenotipo tumorignico cuando se encuentra amplificada en ciertos tipos de tumor y por eso se presenta en niveles mas elevados que el normal. En efecto, una reflexin posterior sugerir que las ciclinas y otros componentes de la maquina del ciclo celular son, de hecho, dianas muy pobres para conducir las clulas a travs del ciclo celular una vez que sus funciones esenciales dependen de su apariencia ordenada y distruicin. Los cambios genticos que alteran su aspecto pueden ser previstos para tener consecuencias catastrficas para la viabilidad de la clula.

Alterando la funcion de un gene envolvido en cascadas de seales resulta en una capacidad para liberar la proliferacin celular de las seales upstream, la produccin de seales proliferativas y una clula que, en esencia, prolifera cuando sus contrapartes normales no. Esto se manifiesta en la capacidad para transformar clulas (especialmente lneas de clulas estabelecidas), que es, en una primera aproximacin, equivalente a la tumorignesis. Ms an, muchos oncogenes han sido identificados debido a su ntima implicacin en la formacin de tumores en animales experimentales o en los humanos. Los oncogenes tienen, casi invariablemente, una de las cuatro funciones genricas que enumeramos: pueden se factores de crecimiento, receptores, elementos implicados en la transduccin de seales citoplasmticas o factores de transcripcin. Entonces, el proceso normal de control del ciclo celular puede estar sometido a varios niveles diferentes. Es importante resaltar, sin embargo, que todos los mecanismos de control del ciclo celular, 13

susceptibles de transformacin oncognica, se sitan arriba (upstream) del punto de restriccin.

El mecanismo exacto de transformacin oncognica depende enteramente de la funcin bioqumica de la protena en cuestin. Pero, hablando en trminos generales, esto puede cambiar, sea para liberar (desaclopar) la actividad de las protenas de las seales upstream, o para prevenir la inhibicin de otras protenas celulares. En otras palabras, los oncogenes son esencialmente activos cuando no deberian serlo.

Finalmente, es curioso contemplar el hecho de que todos los mecanismos de activacin oncognica son, fundamentalmente, de origen gentico: implican cambios de codificacin del propio gen, o alteraciones en los elementos reguladores transcripcionales que influencian la expresin del gen. Esto puede parecer obvio, pero tiene profundas consecuencias para nuestra comprensin del control del ciclo celular en las clulas malignas.

6. Genes supresores de tumor


Hoy da sabemos que los mecanismos de control del ciclo celular son, esencialmente activos en la naturaleza. Esto quiere decir que el progreso a travs del ciclo celular implica la activacin de una serie de procesos bioqumicos secuenciales. Cada paso depende de la activacin previa, de un paso anterior, llevando a la interaccin de un factor de crecimiento con un receptor de la superficie celular. Esta idea ha sido reforzada por la accin de oncogenes que, en algn tipo de mutacin o alteracin de la regulacin del gen, activa en diferentes niveles el mecanismo normal de control del ciclo celular. Esta visin es una simplificacin muy elemental. Es necesario conocer la identidad y la actividad de los genes cuyas acciones estn encaminadas a prevenir el progreso a travs del ciclo celular, excepto cuando existen ciertas condiciones. Estos genes, en virtud de sus actividades ms especficas, son los denominados genes supresores de tumores.

La idea de la activacin oncognica de un proto-oncogn, por mutacin o activacin gnica, prevera que los tumores que se forman de manera natural se 14

originaran en la cintica de un estmulo singular. Un solo evento, una mutacin o una insercin viral, es suficiente para inducir la formacin de un tumor. Esto puede verse reforzado por la capacidad de que un nico oncogn sea suficiente para transformar lneas de clulas estables, tales como la 3T3. Esto lleva a prever si un individuo tiene probabilidad de desarrollar un tumor en un perodo de tiempo equivalente a su previsin de vida. Sin embargo, se sabe perfectamente que, bajo determinadas circunstancias, el proceso de tumorignesis es ms complejo y presenta una cintica derivada de multi-estmulos. Por ejemplo, est claramente determinado que, para muchos tipos comunes de cncer tales como los de mama, pulmn y colon, la probabilidad de desarrollar un tumor aumenta con la edad. En casos en que la induccin del tumor pueda ser atribuida a la accin de un carcinogenio genotxico (dao del ADN), tal como radiacin o el humo de cigarrillo, hay una relacin entre la extensin de la exposicin a un carcinogenio y la probabilidad de que aparezca un tumor.

Evidentemente, no todos los individuos expuestos a un carcinogenio van a desarrollar tumores y, adems, suele haber un largo perodo de espera entre el tiempo de exposicin al carcinoma y la formacin de un tumor. En general, este tipo de datos epidemiolgicos sugieren que para la formacin de tumores es necesario que ocurran una serie de procesos no slo un suceso singular. Este concepto se ve reforzado por las conclusiones de estudios experimentales con oncogenes activados en vivo. Por ejemplo, si un oncogn activado est presente en todas las clulas de un tejido particular, la expectativa anticipa que el tumor resultante puede ser multiclonal en origen, i.e. derivados de todas las clulas del tejido de donde el oncogn se ha manifestado. En la realidad, este tipo de experimentos da con frecuencia un resultado diferente.

Los tumores que se originan en presencia de un oncogn activado suelen ser multiclonales en la naturaleza (i.e. derivados de una clula fundadora singular) y se originan despus de un perodo de espera relativamente largo. Esto es reminiscencia de la cintica de la induccin tumoral por insercin retroviral e indica claramente que otros eventos extraos adicionales, quiz genticos en la naturaleza, tienen que acontecer antes de que un gen activado pueda inducir la formacin de un tumor.

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Observando detenidamente esta situacin podramos decir que la activacin de un proto-oncogn no es suficiente para inducir la formacin de un tumor en un animal real y concreto y, por tanto, en esta secuencia de sucesos deben existir otros mecanismos en las clulas normales que inhiben la formacin de tumores por oncogenes activados.

La existencia de tales mecanismos puede ser inferida de estudios en cultivos de clulas. Entonces, si una clula normal (digamos un linfocito o un macrfago) se funde con una clula maligna (supongamos una clula transformada 3T3), la clula hbrida resultante, que contiene los genomas de ambas parejas, se transforma en un comportamiento no maligno. El genoma de la clula normal, por eso, parece contener informacin gentica que suprime, por algunos medios, la actividad transformadora del genoma de la clula maligna.

Sin embargo, si tales celulas hbridas se mantienen durante un perodo de tiempo en cultivo, con frecuencia se puede observar prdidas de cromosomas y que la composicin gentica de las hbridas cambia con el tiempo.

Cuando esto acontece, el fenotipo maligno durmiente en las clulas hbridas puede estar correlacionado con la prdida de cromosomas especficos o regiones de cromosomas, derivados de parientes no-malignos. Esto indica que la supresin del fenotipo maligno en la clula hbrida se debe a la presencia de informacin gentica en las clulas hbridas que se deriva de la clula parental normal. En este tipo de experiencias el fenotipo transformado presenta caractersticas genticas recesivas. Este resultado, visto desde la perspectiva de la accin del oncogn, es algo contra-intuitivo. Si analizamos los resultados de un gran nmero de experimentos realizados con una amplia gama de pares malignos y no malignos en una gran variedad de especies y los consideramos en conjunto, parecera que existirian multiplas pero no muchas regiones del genoma que tienen la capacidad para suprimir la malignidad en las clulas hbridas.

Esto indica que la capacidad para suprimir el fenotipo maligno en las clulas hbridas es propiedad de un nmero de genes relativamente pequeo y que suele conservarse en funcin de las especies. Posteriores anlisis indican que el fenmeno de transformacin celular resulta de la colisin de productos gnicos mltiples y tambin es posible observar la capacidad de los oncogenes para transformar en cultivo clulas pre16

senescentes no estables. Es considerablemente difcil transformar clulas primarias con la presencia de un nico oncogn activado comparado con la relativa facilidad de transformacin observada en las lneas celulares estables. Sin embargo, es posible transformar clulas primarias con razonable eficiencia si se emplean pares de oncogenes. Al testar pares de oncogenes se observa que caen en dos clases o grupos complementarios.

Para transformar una clula primaria se requiere un miembro de cada clase. En el primer grupo se encuentran los oncogenes inmortalizantes que son los productos de los oncogenes virales del ADN tales como SV4OLT , el adenovirus E1A y el oncogn myc. En un segundo grupo estn los derivados de los oncogenes de sealizacin clsica por mutacin de proto-oncogenes tales como Ras o Src. Este hallazgo tiene dos implicaciones importantes. Primero, sugiere que la clase de oncogn inmortalizante acta en vas bioqumicas separadas de aquellas que activan procesos de sealizacin mitognica. Segundo, esto implica que el proceso de establecimiento e inmortalizacin, que invariablemente implica cambios cromosmicos e inestabilidad gentica, puede estar mimetizado por la accin de oncogenes inmortalizadores.

Tomadas conjuntamente, estas consideraciones son el resultado de la prdida o supresin de alguna actividad celular. Esta actividad puede ser suprimida por la accin de oncogenes inmortalizadores derivados de virosis de ADN tumorignicas, y, presumiblemente, es tambin inactivada por algunas carencias en tumores que aparecen de forma natural. Todo este proceso descrito hasta ahora evidencia claramente la existencia de algunos mecanismos bioqumicos que evitan que una clula se reproduzca indefinidamente en presencia de una seal mitognica continua.

Los datos nos hacen intuir que este mecanismo putativo est, en cierta medida, relacionado con la integridad del genoma y que puede ser inactivado o suprimido por desestabilizacin del genoma o mutacin. Lo que es necesario, sin embargo, es tener una pista para identificar qu molculas estn implicadas en este proceso, ms que el conocimiento de lo que ellas puedan interactuar o ser reguladas por la accin de genes virales de ADN tumorignico.

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Un posterior avance en la identificacin de estos productos genticos viene del anlisis de la base molecular de determinadas mutaciones genticas. Se trata de ciertas mutaciones que resultan de una predisposicion heredada para formar tumores. Estas mutaciones exihiben una penetrancia muy elevada, i.e. virtualmente cada individuo que hereda el gen mutado desarrollar un tumor. En muchos casos los tumores aparecen en la infancia, lo cual contrasta con la dependencia de la edad de la mayora de los tumores de la poblacin humana. Finalmente, los individuos que desafortunadamente heredan estas mutaciones, con frecuencia desarrollan tumores mltiples; esto tambin se contrapone con la mayora de los tumores que se forman de manera natural.

Dos ejemplos de tales tumores ilustran este punto. El retinoblastoma es un tumor relativamente raro de la niez, del retinoblasto del ojo y presenta un cuadro claro de herencia mendeliana. Los individuos que heredan el gen de susceptibilidad al retinoblastoma tienen tendencia a desarrollar retinoblastomas mltiples y tambin muestran una muy elevada propensin a desarrollar otros tipos de tumor durante el resto de su vida.

El sndrome de Li-Fraumeni es un sndrome de susceptibilidad de cncer heredado muy raro en el cual los individuos que heredan la mutacin desarrollan mltiples tipos de tumores agresivos en la infancia. En todos los casos el sndrome de susceptibilidad de cncer heredada est asociado con delecciones cromosmicas especficas, indicando que la base de la predisposicin heredada es la prdida de regiones particulares de informacin gentica. Si suponemos que un gen localizado en la zona de falta de ADN est relacionado con la inhibicin del proceso de formacin tumoral, esta consideracin nos lleva a la hiptesis de doble estmulo la cual sugiere que, para que un tumor se forme, las dos copias de un gen target deben ser inactivadas por mutacin.

Por lo tanto, en individuos normales, deben darse dos mutaciones inactivadoras, una en cada copia del gen. Sin embargo, un individuo que hereda un gen que ya haya sufrido la mutacin de prdida de funcin requiere solamente una mutacin adicional singular en la otra copia del gen para que el tumor se origine. Esto dar origen a una situacin en la que la formacin tumoral dependa de una lesin gentica singular, de ah la explicacin inicial y la caracterizacin del fenotipo como altamente penetrante. 18

Esta hiptesis supone predecir que si el gen target puede ser identificado, una cpia seria mutada en el tejido normal y ambas copias seran mutadas en el tumor, lo que ya ha sido confirmado. Los sndromes de retinoblastoma y Li-Fraumeni son excepcionales, pero son casos bien definidos de genes mutados heredados que conducen a la formacin de tumores. Esto sirve para cuestionarse en qu medida esta idea es aplicable a la mayora de los tumores en que no es posible discernir un cuadro obvio de herencia mendeliana estricta.

Un examen detallado de clusters de tipos especficos de tumor dentro de familias ha llevado a la identificacin de genes adicionales que confieren susceptibilidad a la formacin de tipos especficos de tumor; Dos ejemplos son BRCA1 y BRCA2 (para el cncer de mama asociado); estos son genes que se encuentran mutados en cerca del 5% de mujeres con cncer de mama precoz. Parece probable que las mutaciones de estos genes no sean completamente determinantes (i.e. ni todos los individuos que heredan la mutacin desarrollarn un tumor) y que, ciertamente, estos dos genes solos no pueden contar para la mayora de los tumores de mama que ocurren en la poblacin, implicando que otros genes permanezcan por identificar.

No obstante, sirve para ilustrar el supuesto de que las mutaciones inactivantes en un conjunto crucial de genes diana pueden ser las responsables de la mayora, sino de todos, los tumores que surgen de manera natural. Considerando toda la evidencia precedente en conjunto, nos conduce a la idea de que hay actividades dentro de la clula que deben ser inactivadas por algunos medios para que una clula se reproduzca indefinidamente. stas deben estar codificadas por genes supresores de tumores.

Existen dos vas prcticas para la identificacin de los genes supresores de tumores que se deducen de la evidencia acumulada. La primera sera para identificar los componentes celulares que interactan con productos gnicos virales del ADN tumorignico, y el segundo sera clonar genes que son delectados, o mutados, en sndromes de susceptibilidad de cnceres heredados. Es muy gratificante verificar que ambas vas convergen en los mismos productos gnicos. Esto confirma la sospecha de que hay un nmero relativamente bajo de productos gnicos con funciones supresoras de tumores. 19

7. Gen retinoblastoma (RB)


El gen diana (llamado Rb), que est apaciguado en individuos con susceptibilidad heredada de retinoblastoma, ha sido aislado por mtodos de clonacin positional (?), que en muchos casos de retinoblastoma implica delecciones cromosmicas de pequeas regiones. Se ha confirmado rpidamente que este gen era, asimismo, responsable de todos los casos examinados de retinoblastoma heredado y gracias a esta informacin crucial, las previsiones bsicas de la hiptesis del doble estmulo pudieron ser confirmadas. Los individuos de riesgo heredaron una copia mutada singular del gen, y tumores derivados de estos individuos tenan mutaciones inactivadoras o delecciones en ambas copias del gen. Ms an, la introduccin de un gen Rb salvaje en clulas tumorales derivadas de pacientes con retinoblastoma ha sido capaz de restaurar el crecimiento normal. Finalmente, se ha verificado que el gen Rb estaba mutado en una variedad de tumores adultos espontneos, indicando que podra estar relacionado con otra gama de tumores a parte del retinoblastoma.

El gen Rb codifica una fosfoprotena localizada en el ncleo de masa molecular 110kda. El producto gnico Rb forma un complejo con las protenas oncognicas virales de ADN SV40LT, E1A, HPVE6 en clulas infectadas viralmente. El sitio de interaccin con las oncoprotenas virales ADN es el domino que ha resultado ser el punto mutado en algunos mutantes de inactivacin del gen Rb. Esto implica que esta regin de la protena Rb puede ser significativa para sus funciones supresoras de tumor y el propsito de la asociacin entre los productos gnicos virales y el pocket domain puede ser para inactivar, o inhibir, la asociacin del Rb con las protenas celulares normales. Esto llama la atencin de la identidad de los componentes celulares que interactan con Rb.

Un cierto nmero de protenas interactuando con Rb han sido identificadas por diferentes vas. Un partner importante es el factor de transcripcin, E2F, una familia multignica de protenas, que, en asociacin con un factor DB partner de heterodimerizacin puede activar la expresin de un cierto nmero de genes implicados en el mecanismo de la sstesis del ADN, tales como la dehidrofolato redutase, el 20

antigenio nuclear celular proliferante (PCNA antgeno nuclear de proliferacin celular sub unidad de la polimerasis de ADN y, significativamente, el gen ciclina E. Esto indica que el E2F participa en la coordinacin del comienzo de la fase S por activacin transcripcional de la maquinaria de sntesis del ADN y de la activacin de la actividad de la CDK la fase-S. Ms consistente an con esta idea es la presencia forzada prematura. Cul es la funcin del complejo E2F/Rb El E2F se liga al Rb va pocket domain y es, por eso, presumiblemente liberado en presencia de oncoprotenas virales ADN. Esto sugiere que el complejo E2F/Rb acta para suprimir la transcripcin de los promotores dependientes de E2F y que, para que la fase S ocurra, esta supresin debe atenuarse. La interaccin de Rb con E2F bloquea la llamada activacin del domain de E2F), que es necesaria para la activacin de dependiente de E2F de los promotores downstream. El E2F, en efecto, atrapa la proteina Rb a los promotores dependientes de E2F en forma de un complejo transcripcionalmente silencioso. La supresin de la transcripcin es posteriormente facilitada por el reclutamiento de la histona deacetilase en el complejo va asociacin con Rb. Esto sucede en el assembly del nucleosoma en las cercanas de los promotores dependientes de E2F y la supresin de la posicin especfica de la transcripcin.

El complejo entre Rb y E2F debe por eso ser disociado o inactivado de alguna manera para que la actividad de E2F se manifieste y la fase S pueda proseguir. Esto, a su vez, indica que la funcin Rb debe ser controlada por alguna forma de mecanismo regulador dependiente del ciclo celular. Un examen ms pormenorizado de la protena en poblaciones celulares sincronas revela que, inmediatamente antes del comienzo de la fase S, sta es fosforilada en un cierto nmero de sitios, incluyendo el pocket domain. Esta fosforilacin es mediada por el complejo ciclina D/CDK y resulta en la activacin de la actividad de E2F presumiblemente por disociacin del complejo represor E2F/Rb. En esencia, el Rb acta para bloquear el programa de expresin gnica necesario para el comienzo de la fase S, por represin transcripcional de los promotores dependientes de E2F. Esta actividad inhibitoria puede ser atenuada por mutacin y prdida de la funcin de Rb, en asociacin con oncogenes virales ADN, o en el curso del progreso del ciclo celular normal, por fosforilacin o por activacin de los complejos CDK activos. En este contexto, la Rb parece una puerta y el final de la fase G1 e impide el progreso a travs del ciclo celular excepto si se abre por la actividad de las CDK/ciclinas. El

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bloqueo de la actividad de Rb, por eso, desplaza una barrera para progresar a travs del ciclo celular.

Aunque este razonamiento nos d una explicacin persuasiva para saber cmo puede resultar la deleccin del gen Rb en la propensin para formar tumores, est claro que hay aspectos de la funcin E2F/Rb que quedan sin ser comprendidos. La ablacin gentica de E2F puede ser prevista y tener consecuencias fatales en funcin de su papel en la entrada en la fase S. De hecho, los ratones con esta ablacin son viables y frtiles, pero presentan una probabilidad aumentada de desarrollar tumores en la fase tarda de la vida. Basndonos en estas observaciones, el E2F parecera paradjico que nos mostrara las propiedades esperadas de un gen supresor de un tumor. Esto puede reflejar la accin de otros miembros de la familia E2F en los ciclos celulares normales, o que el papel de E2F se manifieste solamente bajo condiciones celulares especficas. Adems, los ratones que son genticamente deficientes en Rb de hecho mueren durante la gestacin como resultado de la dramtica muerte celular en los sistemas nervioso y hematopoitico. Esto indica que, como con E2F, la funcin Rb no es aparentemente necesaria en cada ciclo celular y, Rb puede tener otras funciones en el desarrollo y diferenciacin va asociacin con proteinas no-E2F.

8. p53
El segundo ejemplo que debemos examinar es un gen supresor de tumor, que debemos examinar es el p53, denominado as en base a su descubrimiento como una protena celular normal de masa molecular 53 KDa, fuertemente asociada con el producto oncognico viral de ADN SV40LT. Consecuentemente tambin se ha encontrado que interacta con los oncogenes virales ADN codificados por las virosis del papiloma humano. En base a estos conocimientos, el p53 podra ser considerado un candidato a gen supresor de tumor. Esto ha sido firmemente establecido cuando fue descubierto que el sndrome Li-Fraumeni pues resultaba de la herencia de una mutacin del gen p53. Adems, la mutacin del gen p53 (sea por delecciones, o mutaciones puntuales) es un cuadro extremadamente frecuente de muchos (pero no todos) los tumores que se forman naturalmente. Ms an, hasta en un 85% de los cnceres de mama, pulmn y colon se han reconocido mutaciones del gen p53. Finalmente, los ratones que son genticamente deficientes en el p53 presentan 22

una mayor propensin para desarrollar tumores, especialmente en respuesta a agresiones genotxicas, tales como carcinogenios qumicos, radiacin ionizante. Vista en

conjunto, esta informacin evidencia claramente que la funcin p53 normal acta como protectora contra la formacin tumoral, pero su actividad no es probablemente necesaria para todos los ciclos celulares. Interesa, entonces, saber cual es la funcin de p53.

La presencia forzada de la protena salvaje p53 en las clulas lleva al ciclo celular a detenerse antes de fase S y eventualmente a la muerte celular. Es, por eso, una protena cuyas funciones normales son de parar la proliferacin celular y de la muerte celular. Es, por eso, importante saber como el p53 ejecuta esta funcin. La p53 salvaje es una protena localizada en el ncleo encontrada en forma de

tetrmero. Puede considerarse que comprende tres dominio funcionales. La regin Cterminal es necesaria para la oligomerizacin de la protena y se liga preferentemente a la hebra nica de ADN o a las terminales del ADN. El dominio central participa en la secuencia especfica de reconocimiento del ADN y su afinidad para el ADN es modulada por la fosforilacin de, o unin del ADN con, el C-terminal dominio (carboxilo terminal). Finalmente, la regin N-terminal de p53 interacta con otras protenas celulares requeridas para la activacin transcripcional y es otro objetivo de los eventos de fosforilacin reguladores.

Sobre esta base consideramos que el p53 es un factor de transcripcin de unin a una secuencia especfica del ADN cuya actividad es facilitada por la asociacin con fragmentos de hebra nica de ADN y acompaantes celulares. Ms an, muchas mutaciones de p53 que ocurren de forma natural, inhiben la ligazn de ADN por medios directos o indirectos y la oncoprotena SV40LT bloquea el DNA-binding domain del p53. Las funciones de supresin del ciclo celular del p53 deben, por eso, resultar de su capacidad para regular la transcripcin gentica. Interesa, pues, saber como acta el p53 en el papel de gen supresor de tumor.

Quiz, no sorprendentemente, desde el punto de vista de sus funciones biolgicas, la presencia de p53 es muy baja en tejidos normales debido, entre otras cosas, a un recambio muy elevado de la protena en condiciones normales. De hecho, en muchos casos, la protena p53 es solamente detectada en clulas que proliferan 23

muy rpidamente (i.e.tienen una elevada proporcin de poblacin en la fase S), o en clulas normales en donde un pico transitorio de aparicin es detectado en el comienzo de la fase S. Sin embargo, los niveles de p53 en la clula son dramticamente elevados en respuesta a los tratamientos que producen lesin del ADN, tales como exposicin a radiaciones ionizantes, carcinogenios genotxicos, y, quiz desgraciadamente, agentes quimioteraputicos dainos para el ADN del cncer como la adriomicina. Este hallazgo prev una clave vital pues sugiere que p53 acte como el guardin del genoma en otras palabras, p53 es un gen que es inducido en respuesta al dao del ADN y acta para bloquear la progresin del ciclo celular. Bajo estas circunstancias, las clulas con dao genmico no pueden dividirse y la accin de p53 suprime la acumulacin de reajustes cromosmicos y futuras mutaciones. Si se repara el dao del ADN los niveles de p53 caen y progresan de modo que el ciclo celular prosigue. Si el dao de ADN no es reparado, el p53 eventualmente acta para matar la clula. En otras palabras, el p53 es un mecanismo central que controla la integridad del genoma en cada clula y acta para evitar que la clula contenga reajustes en posteriores reproducciones. De esto se deriva que una prdida de la funcin de p53 debe llevar a la inestabilidad del genoma y a la acumulacin de mutaciones. Debemos prestar atencin a que ste es uno de los puntos clave de las lneas de clulas estables, como base de muchos tipos de activacin de proto-oncogenes.

El p53 es, por eso, un factor de transcripcin que tiene capacidad para detener el progreso del ciclo celular cuando est presente en niveles apropiados en clulas con el ADN daado. Esta inhibicin del progreso del ciclo celular (y muerte celular) puede estar mediatizada por genes target para transactivacin de p53. Se ha invertido un esfuerzo considerable en la identificacin de genes cuya transcripcin es regulada por el p53. Un target para la induccin del p53 es una protena llamada GADD45. GADD45 que se liga al PCNA (proliferating cell nuclear antigen), que es inducida por E2F, una subunidad reguladora del complejo de polimerasis de ADN.

La asociacin de GADD45 con PCNA tiene la propiedad interesante de bloquear la actividad de la polimerasis de ADN en la replicacin del ADN, pero no en la 24

reparacin. En teora, el efecto de la presencia de GADD45 debe, por eso, servir para parar la replicacin del ADN pero no para su reparacin. Dentro de los productos gnicos p53 inducibles ms significativos est el p21(tambin conocida como Waf1), que parece ser el agente responsable de muchos efectos de la manifestacin del p53 sobre el progreso del ciclo celular. La expresion forzada del p21 en una clula proliferativa induce una parada del progreso del ciclo celular que es muy similar a la inducida por p53. La protena p21 es un inhibidor CDK que bloquea la actividad de las ciclinas/CDK, ligndose al complejo ciclina/CDK de una manera que bloquea el dominio de activacin del CDK. El resultado inmediato de la accin de p21 es bloquear la fosforilacin del complejo E2F/Rb, cuyo efecto cierra la puerta de entrada en la fase S, y bloquea el complejo ciclina E/CDK, por eso tambin bloquea la organizacin de las funciones de la fase S.

Los efectos biolgicos de p53 son mediados por asociacin con otras protenas celulares que se asocian con el dominio de activacin del N-terminal. Como ya se ha mencionado anteriormente, el p53 se asocia con el antigenio SV40LT en las clulas infectadas por el virus, pero tambin se ha encontrado que p53 se liga a otras dos oncoprotenas virales de ADN. El adenovirus E1A se liga al domain N-terminal de transactivacin de p53, desactivando, por eso, las funciones de activacin transcripcional de p53, y el gen E6 del papilomavirus humano puede tambin ligarse con p53, promoviendo su degradacin. Por analoga con la asociacin de oncoprotenas virales con Rb, antes descritas, se puede presumir que la funcin de las protenas virales es generalmente para desactivar la actividad de p53.

En este caso, presumiblemente para promover el proceso de replicacin del ADN viral durante el ciclo infeccioso. Del mismo modo puede suceder tambin que las protenas virales compitan en la ligazn con las protenas celulares normales. Estudios in vitro han revelado que un cierto nmero de protenas se ligan a p53. Estas incluyen helicasis de ARN y elementos del aparato transcripcional basal. Sin embargo, un potencial partner significativo del p53 es la protena MDM2 (mouse double minute). Esta ha sido originariamente identificada en sarcomas murinos como un oncogn putativo activado por amplificacin gnica. La protena MDM2 se liga al domain de transactivacin del N-terminal de p53 y bloquea sus funciones biolgicas. La activacin de la protena MDM2 por amplificacin gnica sugiere que sta ejerce sus 25

acciones por secuestro la protena p53 biolgicamente activa, simulando por eso la p53, desactivando mutaciones. Adems, la MDM2 es tambin un target para la induccin del gen p53, sugiriendo la existencia de alguna forma de loop feedback inhibidor, por induccin de p53, debido a la presencia de MDM2 que revierte el control inhibidor ejercido por p53.

La MDM2 puede tambin estar implicada en la modulacin de funciones de p53 bajo condiciones fisiolgicas normales, una vez que los ratones deficientes en MDM2 mueren rpidamente despus de criarse el modo dependiente del p53. Esto sugiere que una funcin de MDM2 es para neutralizar un efecto txico potencial de p53 en el desarrollo embrionario.

El modelo global para la accin de p53 por eso, sugiere que la funcin de transactivacin sea activada con la exposicin sobre la hebra nica de ADN, o las terminales del ADN. Esta situacin puede darse tanto durante la estimulacin de la replicacin en el esquema de sntesis del ADN programada como por un resultado de lesin no programada del ADN. La activacin de p53 ocurre va dos mecanismos: el primero es la estabilizacin de la protena debido a que se atena el efecto de la destruccin de p53 mediada por MDM; el segundo, es tambin evidente que la funcin de p53 requiere fosforilacin y que las pruebas recientes as lo indican ya que esto ocurre va activacin de protenas quinasis que son reclutadas para regiones de ADN daado.

Pudiera ser que estas quinasis tambin tuviesen una funcin gentica supresora de tumor, una vez que la incapacidad para fosforilar p53 provocara una prdida de la funcin de p53. Por consiguiente, podemos aadir que un cierto nmero de genes supresores de tumores, tales como BRCA1, CHK1 y ATM, participan en la va llevando a la fosforilacin de p53. Finalmente, los dos mecanismos concurren en que la fosforilacin de la regin N-terminal de p53 bloquea la asociacin con MDM. Como consecuencia de la activacin p53, un cierto nmero de genes target downstream; incluyendo p21 y GADD45, son activados transcripcionalmente. La actividad colectiva de estos genes participa en la detencin del progreso a travs del ciclo celular. Cuando la reparacin del ADN est completada, la degradacin de p53 aumenta, los niveles de la protena p53 caen y progresan a travs del ciclo celular que 26

recomienza. La protena p53 puede, por eso, considerarse como un ejemplo de una protena implicada en puntos de control del ciclo celular, cuya funcin primordial es suprimir el control del ciclo celular en fases crticas y prevenir la propagacin de las clulas con lesin del ADN.

Se puede interpretar, por tanto, que p53 en cuanto que no es necesaria para el progreso de la clula, debe estar ntimamente relacionada con el engranaje del ciclo celular. Una consecuencia a largo plazo de la inhibicin de la funcin de p53 es la acumulacin de alteraciones genmicas, incluyendo mutaciones y reajustes que llevan a la activacin del oncogn. Los medios por los cuales p53 consigne la detencin del ciclo celular estn por explorar, va p21, la maquinaria del ciclo celular central ciclina/CDK e, indirectamente, las acciones de otro gen supresor de tumor, Rb.

9. Inhibidores CDK
El inhibidor CDK inducido por la p53 es un miembro de una familia ms grande de protenas con funciones de inhibicin de CDK. Todos los inhibidores CDK causan la detencin de G1 cuando su presencia es muy elevada en clulas transfectados. Esto es, en efecto, una versin forzada de senescencia prematura. Podemos decir que la prdida de la funcin inhibidora CDK tambin previene de que las clulas entren en senescencia y se vuelvan susceptibles de transformacin ante un estmulo nico, por oncogenes activados.

La perdida de la funcin inhibidora CDK por mutacin, o inhibicin, por oncogenes virales del ADN es por tanto un evento bioqumico de gran relevancia para el fenmeno de estabilizacin de la clula. La induccin de la funcin inhibidora del CDK tambin provee la base para la detencin del crecimiento reversible inducida por la familia TGFB (factor transformante beta). Debera, pues, estar previsto que esta clase de protenas presentaran una funcin supresora de tumor. Adems, el bloqueo, directo o indirecto, de las vas inhibidoras de CDK prueba ser un tema central en la actividad de los genes supresores de tumor. La protena p21 es el miembro prototipo de la familia Kip de los inhibidores CDK cuyos otros miembros son p27 y p57. La diferencia entre estos inhibidores reside en la especificidad de los miembros de la familia CDK que son inhibidos por p57 y p27, ya que presentan inhibicin CDK de

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amplio espectro, mientras que la inhibicin de p21 est restringida al complejo CDK4/ciclina D de la fase G1. Podemos mencionar que existen pruebas evidentes de que la actividad de p27 juega un papel normal en el control del ciclo celular. Los niveles de la protena p27 se mantienen elevados en las clulas quiescentes pero bajan cuando das clulas son estimuladas para progresar a travs del ciclo celular. Los ratones que son genticamente deficientes en p27 son ms grandes que sus contrapartes normales como resultado de un nmero aumentado de clulas en cada rgano, indicando que la actividad de p27 est relacionada con la regulacin de la masa de tejido en el desarrollo normal. La p27 posee todos los indicadores de un gen supresor de tumor clsico, una vez que los ratones deficientes en p27 son tambin susceptibles a la produccin de tumores en la pituitaria.

La segunda familia de inhibidores CDK son la familia inK4, p16, p18 y p19; estos son inhibidores especficos de las quinasis CDK4 y CDK6 dependientes de las ciclinas en la fase G1, que realizan funciones esenciales en la regulacin de la funcin de Rb. El p16 inK4A es un gen frecuentemente mutado en muchos tipos de tumores humanos y debe mantenerse en una posicin junto con la p53 como un target primordial para mutaciones en el cncer humano. Es poco frecuente que el gen p16 pueda ser traducido en dos estructuras de lectura alternativa para producir dos productos gnicos diferentes: la protena p16 inhibidora de CDK y una segunda protena p19 ARF, una estructura proteica de lectura alternativa que tambin bloquea la proliferacin celular. La p19ARF acta directamente en la funcin de p53 va inhibicin de la accin de MDM2 con la consiguiente activacin de las funciones de detencin del crecimiento de p53.

El anlisis gentico de la malignidad ha revelado la existencia de vas adicionales que regulan la progresin del ciclo celular que se manifiestan de dos formas. Una es el bloqueo de la entrada en la fase S, como el ejemplificado por la actividad de la protena Rb. Este bloqueo debe ser atenuado para facilitar el progreso en la fase S y su transcurso por el resto del ciclo celular. La segunda es la existencia de puntos de control que, aunque no son esenciales para la progresin a travs del ciclo celular, tienen la capacidad de bloquear el proceso de lesin del ADN.

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Ambos caminos centran su accin sobre la supresin de las vas CDK del engranaje del ciclo celular.

La mayora de las malignidades implican, directa o indirectamente la desactivacin de las vas bioqumicas que inhiben la actividad de las CDKs. La funcin de los oncogenes activados de promover la proliferacin celular indefinida solamente puede ser revelada cuando estas vas han sido desactivadas. Esto cria una base mecanicista para la comprensin de la necesidad de mutaciones mltiples para que se produzca el proceso de la malignidad.

El anlisis de la funcin del gen supresor de tumor tambin ha revelado una conexin ntima con los procesos que conducen a la activacin de proto-oncogenes por mutacin o reajuste del genoma. Esto es debido al hecho de que todo el proceso est regulado por mecanismos de control de checkpoints, como el ejemplificado por la protena p53. Estos mecanismos bloquean el progreso del ciclo celular cuando la lesin del ADN se produce en la va del inhibidor de CDK y en la intervencin directa en el mecanismo de replicacin del ADN. La substitucin de los controles de los checkpoints permite la desestabilizacin de la integridad gentica y promueve la propagacin de mutaciones y de reajustes del genoma; esto lleva inevitablemente a la activacin del proto-oncogn y promocin del crecimiento celular progresivo en forma de tumor.

Esto nos proporciona una visin unificadora de los objetivos genticos que debe ser modificada en el proceso de formacin tumoral. El primero, son los componentes de la maquinaria de sealizacin del punto de pre-restriccin. El segundo, son componentes relacionados con la sensibilizacin y reparacin del ADN daado; y el tercero, control de las actividades de CDKs que organizan la secuenciacin de los pasos principales del engranaje del ciclo celular.

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