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LABORATORIO DE HEMATOLOGA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA INTRODUCCION

Hematologa

Glbulos rojos, componente de la sangre que transporta oxgeno al resto de las clulas de organismo. La Hematologa (de gr. hema: sangre, logo: estudio hematologa: estudio de la sangre , --, "sangre" y -, "estudio") es la especialidad mdica que se dedica al tratamiento de los pacientes con enfermedades hematolgicas, para ello se encarga del estudio e investigacin de la sangre y los rganos hematopoyticos (mdula sea, ganglios linfticos, bazo, etc) tanto sanos como enfermos.1

Objeto de la hematologa La hematologa es la rama de la ciencia mdica que se encarga del estudio de los elementos formes de la sangre y sus precursores, as como de los trastornos estructurales y bioqumicos de estos elementos, que puedan conducir a una enfermedad. La hematologa es una ciencia que comprende el estudio de la etiologa, diagnstico, tratamiento, pronstico y prevencin de las enfermedades de la sangre y rganos hemolinfoproductores. Los especialistas en este dominio son llamados hematlogos. Enfermedades hematolgicas Las enfermedades hematolgicas afectan la produccin de sangre y sus componentes, como los glbulos rojos, glbulos blancos, lahemoglobina, las protenas plasmticas, el FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA mecanismo de coagulacin (hemostasia), etc. -linea eritroide, linea granulocitarias, megacarociaticas-. La hematologa comprende el estudio del paquete celular, el perfil o el estado sanguneo, los cuales son: Recuento de eritrocitos (y valor hematocrito) Recuento de leucocitos Determinacin de hemoglobina Velocidad de sedimentacin globular (VSG) Frmula leucocitaria (recuento diferencial de leucocitos)

Este manual fue elaborado con la intencin de iniciar al alumno en las practicas ms comunes de un estudio hematolgico y apegado al plan de estudios terico de esta materia

Practica 1 Conocimiento del laboratorio y medidas de seguridad


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Introduccin El trabajo en el laboratorio implica un riesgo latente desde el momento en que se pone un pie al interior del mismo .Es una zona donde se rene el mayor numero de reactivos qumicos ,tipos de energa y utensilios especializados ,de todo de estudio , llmese universidad ,centro e investigacin , hospital ,industria o centro de servicios. Es por todo esto que impera la necesidad de abordar este tema al iniciar un periodo de prcticas de laboratorio, y al mismo tiempo, iniciar una cultura de la prevencin de accidentes, de atencin al entorno de trabajo, y de seguridad como modo de trabajar en cualquier mbito profesional. Pongamos pues las siguientes premisas para plantear un esquema de trabajo hacia la prevencin y la seguridad en el laboratorio o en cualquier rea de trabajo. La seguridad es responsabilidad en lnea jerrquica Todos los accidentes pueden ser evitados Las personas son la base fundamental en la gestin de la prevencin de riesgos Una gestin eficaz de la prevencin de riesgos produce una mejora en el sistema de calidad , as como el aumento de produccin ( das / clase ) La prevencin efectiva de riesgos evita das perdidos debido a las bajas causadas por accidente o por enfermedades derivadas del trabajo . Seguridad en el laboratorio: 1.- ponerse la bata y despejar el rea de trabajo dejando sobre la mesa solo el material que va a utilizar en la prctica. 2.- desinfectar la mesa de trabajo con hipoclorito de sodio al 5% (cloro de uso domstico). 3.-seguir las recomendaciones universales para disminuir los riesgos al exponerse a productos biolgicos potencialmente contaminados, en la prctica clnica. Debido a que todos los pacientes pueden ser potenciales portadores de patologas que se transmiten por la va parenteral, sin tener un diagnstico objetivable, LAS PRECAUCIONES UNIVERSALES deben aplicarse en la prctica de la atencin de cualquier paciente en todo momento y en cualquier mbito de la atencin de salud, siendo esto lo que les confiere el carcter de Universales. a) Uso de gafas o tapabocas con visera durante la recoleccin de muestras con riesgo de salpicaduras procedentes de pacientes de con enfermedades infectocontagiosas. b) No re-enfundar agujas y desecharlas en el recipiente adecuado (o desechar la aguja y la jeringa en un galn destinado para tal fin, evitando la manipulacin. c) Preservar la tcnica asptica en la obtencin de muestras mediante procedimientos invasivos (venopuncin perifrica, catter central etc.)

. Limpieza del material de vidrio FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Los resultados de los experimentos, dependen en gran parte, de la limpieza del equipo: 1) muchos reactivos se usan en miligramos o microgramos, por lo tanto cualquier contaminacin, podra contribuir a un porcentaje significativo de la muestra experimental total del experimento. 2) Muchas sustancias son sensible a uno o ms contaminantes, como iones metlicos, detergentes o residuos orgnicos.

Objetivos: Los alumnos conocern el laboratorio, los materiales, los reactivos, las instalaciones elctricas, de gas, de agua y el funcionamiento de cada uno de ellos, sus interacciones, utilidades, modos de los, etc. Con la finalidad de aprender el manejo de los mismos en las practicas a realizar, en casos extremos de riesgos y contingencias. De igual manera aprendern a usar los utensilios de primeros auxilios y contra incendios, as como las rutas de evacuacin, elaborando un plan estratgico de emergencia para cada caso. Rombo de seguridad para sustancias qumicas.

Material Mesas de laboratorio Tomas de gas Agua Electricidad Material de vidrio De metal Aparatos Instrumental

Reactivos Slidos cidos Soluciones Alcoholes, etc.

Procedimiento experimental: A travs de la observacin y conocimiento del equipo de laboratorio, los reactivos y materiales, se plantearan formas de trabajar( vestimenta , organizacin , lentes , guantes) ,de prever posibles accidentes (distribucin de espacio , rutas de evacuacin , anaqueles ), zonas de riesgo , puntos crticos , y todos los casos que requieran revisin y FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA modificacin para mejorar la seguridad al interior del lugar de trabajReconocimiento y uso del material de laboratorio Familiarizarse con el material de laboratorio, aprender cmo se utiliza, sus posibles usos y la localizacin de los distintos materiales dentro del labotratorio. Materiales utilizados: Bateas Olla Autoclave Estufa de cultivos Estufa de secado del material Matraz aforado Embudo de lquidos y embudo de slidos Matraz Erlenmeyer Mortero Cubetas para tincin Vaso de precipitados Pipetas, micropipetas Centrfuga Placa Petri Fotocolormetro Fotodensitmetro Quitasato Frasco lavador Tubos Eppendorf Cmaras de Neubauer Microscopio Probeta Bureta Vidrio de Reloj Contenedor desechable Papel Parafilm Portapreparaciones Reflotrn A continuacin se sealan los materiales anteriormente citados que se observaron en el laboratorio y se citan ciertas caractersticas de ellos. : Matraz aforado: Son generalmente de forma ovoide, fondo plano y cuello estrecho y alto con tapn esmerilado, construido en vidrio fino. En el cuello llevan un trazo circular que marca el aforo o enrase y que indica la capacidad del mismo. En las paredes se indica adems de la capacidad del mismo, la temperatura a la que debe utilizarse. Se utilizan para preparar soluciones valoradas o de concentracin definida y para diluir muestras a volumen fijo. Probetas: Son vasos altos graduados, de forma cilndrica con un pie que les confiere cierta estabilidad; las hay de tamao variables, generalmente desde 5 cc hasta 1 litro. Presentan un pico que sirve para verter los lquidos ms fcilmente. Su uso ms frecuente es para medir y dispensar volmenes de lquido que requieren poca precisin. Pipetas: Son tubos de vidrio de poco dimetro, abiertos a ambos lados, terminando en punta por el inferior de salida del liquido, regulando esta con el dedo ndice, que rapa el orificio de la parte superior. Se utilizan pata transferir o verter un volumen determinado de liquido. Existen de varios volmenes. Deben llevar grabada en su pared la capacidad y un cdigo de color distinto segn el volumen al que estn calibradas. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Micropipetas: Son pipetas utilizadas para transferir pequeas cantidades de liquido. Contienen volmenes desde 1 a 1000 microlitros y pueden ser de volumen fijo o variable. Buretas: Son largos tubos graduados con una llave en un extremo denominada robinete u otro elemento para detener el flujo de liquido y un extremo afinado en la punta para dispensar el liquido. En su parte superior esta ligeramente ensanchada en forma de embudo a lo largo de ella va grabada la graduacin, generalmente en cc y decima de cc. Se utilizan para dispensar volmenes conocidos de lquido en un recipiente. Matraz Erlenmeyer: Son matraces de fondo redondo y cuello estrecho, llevan una escala volumtrica orientativa y se fabrican de varios Tamaos. Los kitasatos son matraces Erlenmeyer que llevan una boquilla lateral para poder conectar a vacio. Se utilizan para filtracin esterilizante de sustancias o muestras que contienen elementos que no soportan las altas temperaturas del autoclave. Vaso de precipitados: Son anchos de paredes anchas y cilndricas. Presentan un pico que sirve para verter los lquidos ms fcilmente. Se utilizan para la preparacin de reactivos como contenedores de soluciones que haya que someter a agitacin mecnica. Embudos: Los ms utilizados se emplean para transferir Lquidos o slidos a otros recipientes y como soporte del papel de filtro en el proceso de filtracin. Mortero: Se utiliza para pulverizar y homogeneizar sustancias solidas. Frascos lavadores: Se utilizan para contener agua destilada Vidrio de reloj: Laminas cncavas para pesar slidos. Cubetas de tincin: Se utilizan para teir por inmersin. Tubos de ensayo: Se utilizan para contener la muestra o analizar o efectuar reacciones en ellos. Gradillas: Sirven de soporte para tubos de ensayo. Contenedor desechable: Se utiliza para retirar el material potencialmente contaminante Papel Parafilm: Se utiliza para tapar los tubos de ensayo. Baos de calentamiento: Se utilizan para mantener a temperatura constante material y sustancias que as lo requieran. Estufas: La estufa de desecacin se utiliza para el secado del material, la estufa de cultivos se utiliza en microbiologa para incubar los cultivos de microorganismos. Centrfugas: Se utilizan para separar sangre coagulada o celular del suero o plasma y para aclarar lquidos orgnicos. Fotocolormetro: Se utiliza sobre todo para la determinacin de hemoglobina Cmara de Neubauer: Se utiliza para el recuento de glbulos rojos, blancos y plaquetas. Se ha examinado el material y se han aprendido nociones bsicas sobre su Utilizacin.

Cuestionario 1. Elabora un proyecto que implique un plan de seguridad para casos de contingencia en el laboratorio, detectando puntos crticos, manejo de reactivos, posibles soluciones y estrategias para asegurar la estancia y evacuacin de las personas presentes durante el fenmeno correspondiente (sismo, incendio, accidente, etc.) 2. Cmo se clasifican los reactivos de laboratorio? FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA 3. Cules son los colores utilizados para diferenciar la reactividad de las sustancias, y que significa cada uno de ellos? 4. Cul es el procedimiento adecuado para tratar un accidente donde hubo contacto con un acido, con una base, con fuego, con electricidad y con agua hirviendo? 5. Menciona algunas medidas de seguridad en el laboratorio, para realizar practicas de hematologa.

Practica 2 Toma de muestra


OBJETIVOS: FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA 1. Que el alumno aplique las tcnicas estandarizadas ms comunes de obtencin de muestras de sangre perifrica con calidad analtica. INTRODUCCIN: La sangre es una suspensin, en la que aproximadamente el 50% del volumen total de esta corresponde al plasma y el otro 50% de este volumen corresponde a clulas que se encuentran suspendidas en el plasma. La obtencin de muestras de sangre para los estudios hematolgicos requiere de la aplicacin de las recomendaciones internacionales de control de calidad, que garanticen la integridad de la muestra. La puncin venosa es uno de los procedimientos ms comunes para extraer sangre, ya que posibilita la recoleccin de sangre venosa para posteriores anlisis de laboratorio, se requiere que el paciente est en condiciones basales (ayuno de 8 horas). Los sitos para puncin venosa son las venas del antebrazo y fosa antecubital; la vena baslica, ceflica y mediana del antebrazo y radial superficial, cubital superficial y mediana de la fosa antecubital. La obtencin de sangre capilar actualmente est limitada a estudios peditricos, sin embargo anteriormente era el mtodo ideal de extraccin de sangre para realizar frotes sanguneos, ya que inmediatamente despus de la puncin se recoge en las laminillas para realizar los extendidos, sin que haya necesidad del uso de anticoagulantes que puedan alterar la el volumen de la sangre y morfologa celular. Para realizar los extendidos de sangre perifrica, se utiliza sangre venosa anticoagulada generalmente con EDTA (cido etilendiaminotetraactico) preferentemente en su forma seca analizados los extendidos antes de que transcurran 2 horas desde la extraccin de sangre, o bien sangre capilar directamente de la puncin al portaobjetos( es lo ideal). Es recomendable que la sangre anticoagulada sea utilizada inmediatamente para impedir alteraciones morfolgicas. El control de calidad en todas las fases del anlisis hematolgico es indispensable para lograr confiabilidad de los resultados, por lo que se recomienda obtener muestras de sangre con calidad analtica, siguiendo el protocolo para la toma de muestra que sea apropiada al estudio. La calidad de las extensiones de sangre es indispensable y esto depende del anticoagulante usado, el tipo de sangre (venosa o capilar) con o sin anticoagulante.

MATERIAL: 1 gradilla Tubos de ensaye DE 13 X 100 mm con anticoagulante EDTA ( 3 por equipo) 1Pipeta automtica de 10L 5 puntas amarillas Jeringas o dispositivos para extraccin de sangre con tubos al vaco FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Torundas Torniquete o ligadura de 25 a 30 cm de largo Alcohol al 70% Lancetas estriles Papel absorbente suave Etiquetas para identificar al paciente Contenedor de objetos punzo cortantes Jabn de tocador para lavarse las manos Toallas de papel Franela o esponja Lpiz graso o crayola

Reactivos: EDTA (cido etilendiaminotetraactico) Metanol absoluto 100 mL Agua destilada pH 7 Amortiguador de fosfatos pH 6.4 100 mL (1 gotero) Solucin de hipoclorito al 5% para desinfeccin de mesas de trabajo.

Material biolgico: Muestras de sangre anticoagulada con EDTA o sangre capilar

RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD: 1.- ponerse la bata y despejar el rea de trabajo dejando sobre la mesa solo el material que va a utilizar en la prctica. 2.- desinfectar la mesa de trabajo con hipoclorito de sodio al 5% (cloro de uso domstico). 3.-seguir las recomendaciones universales para disminuir los riesgos al exponerse a productos biolgicos potencialmente contaminados, en la prctica clnica. Debido a que todos los pacientes pueden ser potenciales portadores de patologas que se transmiten por la va parenteral, sin tener un diagnstico objetivable, LAS PRECAUCIONES UNIVERSALES deben aplicarse en la prctica de la atencin de cualquier paciente en todo momento y en cualquier mbito de la atencin de salud, siendo esto lo que les confiere el carcter de Universales. a) Uso de gafas o tapabocas con visera durante la recoleccin de muestras con riesgo de salpicaduras procedentes de pacientes de con enfermedades infectocontagiosas. b) No re-enfundar agujas y desecharlas en el recipiente adecuado (o desechar la aguja y la jeringa en un galn destinado para tal fin, evitando la manipulacin. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA c) Preservar la tcnica asptica en la obtencin de muestras mediante procedimientos invasivos (venopuncin perifrica, catter central etc.) PROCEDIMIENTO PARA PUNCIN VENOSA 1.- Lavarse las manos perfectamente con agua y jabn. 2- Verificar que cada muestra est acompaada de informacin que incluya; nombre y apellidos del paciente, edad, sexo, procedencia cuando proviene de otra institucin, tipo de muestra, diagnstico presuntivo, fecha y hora de toma de la muestra, medicacin (si el paciente est recibiendo tratamiento), tipo de estudio a realizar. Por lo que las muestras de los alumnos deben estar acompaadas de esta informacin. 3.- Preguntar al paciente si guard el ayuno adecuado (en caso necesario), preguntar la hora de la ltima ingesta. 4- Tranquilizar al paciente e informarle del procedimiento al que ser sometido. 5.-Colocar adecuadamente al paciente; sentado paralelamente a la mesa de trabajo, apoyar el brazo sobre la mesa colocando una almohadilla bajo el codo y la palma de la mano hacia .arriba. 6.-Verificar el material a utilizar; tubos, anticoagulante, jeringas torniquete, torundas etc. 7.-Pedir al paciente que abra y cierre el puo para palpar mejor las venas. 8.-Seleccionar una avena adecuada para la puncin. Evitar tomar la muestra en el brazo donde hay catter. No extraer sangre de la misma extremidad utilizada para la administracin intravenosa de medicamentos, lquidos o transfusiones. Si no existe otro sitio disponible, asegurarse que la puncin venosa se localiza por debajo del catter IV. Evitar las reas edematosas, paralizadas o el mismo lado de una masectoma, al igual que las infecciones y problemas cutneos. La puncin venosa causa infeccin, alteraciones circulatorias o retraso en la cicatrizacin. 9.- Desinfectar el sitio de puncin con una torunda con alcohol al 70%, con movimientos en espiral comenzando por el sitio que se puncionar y prosiguiendo hacia fuera, dejar que la zona se seque y no tocar con ningn objeto que no haya sido esterilizado previamente. 10.- Aplicar el torniquete varios centmetros arriba de la zona de puncin, este no se dejar ms de un minuto. 11.- Fijar firmemente la vena por encima y por debajo del sitio de puncin con ayuda de los dedos pulgar y medio o ndice y pulgar de la mano izquierda. 12.- Realizar la venopuncin; a) Penetrar a travs de la piel con la aguja formando un ngulo de 15 entre el brazo y la aguja con el bisel hacia arriba, seguir la direccin de la vena con la aguja. b) Introducir la guja con suavidad pero con rapidez para reducir las molestias al paciente. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA c) Si se usa jeringa, tirar del mbolo hacia atrs con tensin lenta y uniforme, a medida que la sangre fluye en su interior, este movimiento no debe ser muy rpido ya que se puede bemolizar la sangre o colapsar la vena. d) Si se utilizan tubos al vaco, en cuanto la aguja haya penetrado la vena, se dirigir el tubo todo lo posible hacia delante en el dispositivo de sujecin, al mismo tiempo sujetar tenuemente la aguja en su lugar. Se debe permitir que el tubo al vaci se llene hasta la marca indicada. 13.-Retirar la ligadura tirando del extremo doblado despus de obtener el volumen de sangre deseado. 14.-Colocar un pedazo de algodn seco sobre la parte donde se encuentra oculta la aguja. Sacar la aguja con un movimiento rpido y depositarla en el recipiente de metal con desinfectante. 15.-Pedir al paciente que presione firmemente el algodn durante 3 minutos, con el brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazo a causa del riesgo que se forme un hematoma. 16.-Mezclar por inversin suave la sangre 15 veces (cuando el tubo colector tiene anticoagulante). 17.-Si la hemorragia de la puncin contina durante un tiempo prolongado, eleve el rea y aplique una curacin con presin. Observe al paciente y verifique si no ha ingerido anticoagulante o cido acetilsaliclico. Si el paciente se marea o tiende al desmayo, haga que coloque la cabeza entre las rodillas o se acueste y pdale respirar profundamente. Aplique una toalla fra en al cabeza o parte posterior del cuello. En caso que permanezca inconsciente, notifique de inmediato al mdico tratante. 18.-Los hematomas se previenen con una tcnica adecuada que consiste en evitar que la aguja atraviese la vena, liberar el torniquete antes de extraer la aguja, aplicacin de suficiente presin sobre el sitio de la puncin y al mantener la extremidad extendida hasta que se detenga la hemorragia.

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PROCEDIMIENTO PARA PUNCION CAPILAR: 1.-Si la puncin se realizar a un RN ste debe ser inmovilizado 2.-seleccionar el sitio de puncin 3.- en adultos el sitio adecuado para la puncin capilar es el pulpejo del dedo mediano o anular, cerca del borde, en nios el lbulo de la oreja, y en RN el taln del pie 4.-Se recomienda el lavado clnico de manos y uso de guantes si es necesario 5.-realizar la asepsia de la zona 6.-introducir la lanceta de 2 a 2.5 mm con un movimiento rpido 7.-presionar para extraer la cantidad necesaria de sangre desechando la primera gota 8.-depositar la muestra en capilar o laminilla. 9.-realizar hemostasis en el sitio de puncin y proteger con gasa estril 10.- verificar confort del RN 11.- si se presenta dificultades durante la puncin se recomienda repetirla, sobre todo cuando la muestra es insuficiente y se ha exprimido excesivamente la zona de puncin, ya que puede sufrir una hemodilucin por el lquido hstico.

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. CUESTIONARIO 1. Cul es el objeto de usar un anticoagulante en los estudios hematolgicos? 2. Explica en qu proporcin se usa el EDTA y porqu inhibe la coagulacin sangunea 3. Qu entiende por hemostasis? 4.Una muestra de sangre capilar obtenida del talon de un bebe,Para que estudio se emplea generalmente? 5.Mencione algunas de las precauciones que se deben tomar al trabajar con muestras sanguneas y Por qu?

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Practica 3 Preparacion de extendidos sanguneos


Tincion de Wright y Tincion de Giemsa Introduccin: Para poder realizar una buena biometra hematica ees necesario hacer una buena diferenciacin de las diferentes clulas saguineas y para esto es necesario tener una buena extensin y una buena coloracin de la misma. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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La tincin de Wright se fundamenta en la tincin de Romanowsky que consiste en una combinacin de azul de metileno y eosina. La accin combinada de estos colorantes produce el efecto de Romanowsky y da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutrfilos y una coloracin rosada a los eritrocitos. Los componentes principales causantes de este efecto son el azur B (un producto de oxidacin del azul de metileno) y la eosina Y. La amplia variacin en los colores y sombras observadas con la tincin de Romanowsky permiten distinciones sutiles de las caractersticas celulares. La naturaleza cida o bsica de las estructuras celulares determina su avidez por los componentes del colorante policromtico de Wright; es as como los cidos nucleicos se tien con azul B que es el bsico y la hemoglobina con la eosina Y que es cida. Otras estructuras se tien por una combinacin de ambos y se denominan neutrfilas

TINCIN DE WRIGHT 1. Colocar los extendidos en un plano horizontal en el puente para tincin con la extensin de sangre hacia arriba 2. Cubrir toda la superficie de la preparacin con Wright. Esperar de 3 5 minutos (el tiempo ptimo es determinado por ensayo y error). 3. Agregar un volumen igual de solucin amortiguadora (pH 6.4) o en su defecto agua de destilada de pH 7 con resultados igualmente buenos. La cantidad de agua o buffer debe ser suficiente para cubrir la lmina completamente, pero no en exceso. 4. Soplar suavemente el extendido para mezclar hasta obtener una pelcula uniforme de apariencia metlica - verdosa. Esperar de 7 a 15 minutos (dependiendo de la maduracin del colorante). 5. Lavar el colorante con agua corriente manteniendo los extendidos en posicin horizontal. El lavado debe ser rpido (5 - 30 segundos) para evitar la precipitacin del colorante sobre la superficie del extendido. 6. Dejar secar al aire. TINCIN DE GIEMSA 1. Despus de realizar el extendido de sangre perifrica, dejar secar el frotis de 15 a 20 minutos 2. Fijar el extendido con 3 a 4 gotas de metanol absoluto por 3 minutos 3. Preparar en un tubo de ensayo una solucin con una proporcin de 1:9 con Giemsa y tampn PBS (1ml Giemsa y 9 ml PBS). 4. Cubrir la preparacin o sumergirla en la solucin preparada durante 10 minutos. 5. Lavar el portaobjetos con agua destilada. 6. Dejar secar. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA 7. Aplicar el cubreobjetos cuando sea necesario) sobre la preparacin. 8. Listo para su observacin en el microscopio. . PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LOS EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA Desengrasar los cubreobjetos para las extensiones de sangre perifrica. Obtener la muestra de sangre con anticoagulante EDTA o sangre capilar. 3. Homogenizar perfectamente la muestra por inversin 15 veces 4. Realizar el frotis por la tcnica de los dos portaobjetos que se describe en seguida: a. Depositar una pequea gota de sangre (aproximadamente 5 L) en el extremo de un portaobjetos limpio y libre de grasa. b. Con el borde de otro portaobjetos a 45, tocar la gota, esperar a que la sangre se distribuya por capilaridad (sin permitir que la sangre toque los extremos del portaobjetos que se desliza) y despus deslizar suavemente pero con suficiente rapidez el portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal hasta que la gota quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjetos. c. El grosor de la extensin sangunea puede variar segn sea el ngulo que se forma entre los dos portaobjetos, si es superior a 45, la extensin ser gruesa y corta; si es inferior a 45 ser larga y fina. d. Dejar secar el frotis de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente en posicin horizontal. Objetivo. El objetivo de esta practica es conocer la manera correcta de hacer un extendido, as como las diferentes tcnicas que existen para una correcta coloracin de las mismas.

Material Portaobjetos Puente de tincin cubetas de tincin Reactivos Solucin de eosina Solucin de azul de metileno Alcohol

Material biolgico Sangre perifrica con EDTA sangre capilar Procedimiento experimental. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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La tcnica para realizar la extensin sera la siguiente: A. Con los dedos ndice y pulgar de una mano, sujetar un extremo del porta normal (porta soporte), a nivel de sus bordes, y situarlo sobre una mesa. Tambin puede apoyarse, simplemente, el porta soporte sobre el extremo del dedo corazn de la mano que lo sujeta. De esta forma, el porta soporte forma un ngulo con la mesa. B. Con una pipeta pasteur coger un poco de sangre problema, depositar una pequea gota de esta (de unos 5 l) en la cara superior de ese porta, a no menos de 2 cm del extremo opuesto al que agarra la mano. C. Colocar un extremo del porta esmerilado (porta difusor o extensor) un poco por delante de la gota de sangre y formando un ngulo de 45 con el porta soporte. Es conveniente utilizar siempre el mismo porta extensor, para adaptarlo a esta funcin. D. Desplazar suavemente hacia atrs el porta extensor, hasta que alcance la gota de sangre. E. Dejar que la gota se extienda, por capilaridad, a lo largo del extremo del porta extensor que toca el porta soporte. F. Antes de que la sangre alcance los bordes de ese extremo, deslizar el porta extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, y a una velocidad media. Este deslizamiento debe acabar, aproximadamente, a 1 cm del extremo final del porta soporte, con un movimiento de ascensin del porta extensor. G. Secar rpidamente la extensin, agitndola al aire, para que sus clulas no se distorsionen. H. Escribir el nombre del enfermo, en el porta que soporta la extensin. Una vez hecha la extensin comenzar con la tincin,la cual puede ser la de Wright ,giemsa o la panotica.

Usaremos la tincin panptica: 1. Colocar la muestra en un cestillo para portas 2. Introducir la muestra en la primera cubeta para tincin que FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA contiene metanol, esto fijar la extensin, 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir. 3. Introducir la muestra en la segunda cubeta para tincin que contiene eosina, 5 inmersiones de 1 segundo tambin, escurrir. 4. Introducir la muestra en la tercera cubeta que contiene azul de metileno, 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir 5. Lavar con agua y esperar a que seque. Resultados: Depositamos una gota de aceite de inmersin sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100X. Analizamos si el frotis y la tincin estn bien realizados. El frotis ser correcto si: Tiene las dimensiones adecuadas No tiene artefactos provocados por anticoagulantes No tiene artefactos provocados por tcnicas defectuosas de extensin No tiene artefactos provocados por defectuosa fijacin o coloracin No tiene artefactos provocados por defectos del portaobjetos Otros defectos a la hora de realizarlo, contaminacin por polvo, hemlisis... La tincin ser correcta si: La tincin no es excesivamente rosada o azulada Tiene ausencia de precipitados Se diferencian bien las estructuras subcelulares en los leucocitos. Interpretacin de los resultados: Dependiendo de la zona del frotis podemos leer, linfocitos, realizar la frmula leucocitaria y visualizar neutrfilos y monocitos.

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. CUESTIONARIO

1. Cul es el objeto de usar un anticoagulante en los estudios hematolgicos? 2. Explica en qu proporcin se usa el EDTA y porqu inhibe la coagulacin sangunea 3. Cules son las propiedades de tincin de los colorantes de Romanowsky? 4. Cul es la funcin del metanol en la tincin de Giemsa? 5. Cules pueden ser las causas de error en la tincin de extendidos sanguneos? 6. Cul es la funcin del Buffer en la tincin de Wright .?

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Practica 4

Hematocrito

Introduccin El porcentaje de una muestra centrifugada de sangre que corresponde a los eritrocitos es el hematocrito El hematocrito es el porcentaje ocupado por glbulos rojos del volumen total de la sangre. Los valores medios varan entre 42%-52% en los hombres, y 37%-47% en las mujeres. Estas cifras pueden cambiar de acuerdo a diversos factores fisiolgicos, como la edad y la condicin fsica del sujeto. Es una parte integral del hemograma, junto con la medicin de la hemoglobina, y el conteo de leucocitos y plaquetas. Valores bajos de hematocrito La disminucin de glbulos rojos en la sangre es una anemia. Se puede relacionar con diferentes condiciones, como hemorragia o leucemia. Hay numerosos factores que pueden contribuir a desarrollar una anemia, como la baja en la ingesta de hierro, o pacientes con enfermedad renal crnica, que no generan suficiente eritropoyetina para estimular la produccin de glbulos rojos en la mdula sea Valores altos de hematocrito Se pueden asociar a deshidratacin o hipoxia. Patologas como la policitemia vera consisten en una desmedida produccin de glbulos rojos. En casos de enfermedad pulmonar obstructiva crnica, la hipoxia genera un FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA aumento en la produccin de eritropoyetina por el rin, lo que puede resultar en un hematocrito alto. Mtodos de medicin El hematocrito (PCV) se puede determinar por centrifugacin de sangre heparinizada en un tubo capilar (tambin conocido como un tubo de microhematocrito) a 10.000 rpm durante cinco minutos. Esto separa la sangre en capas. El volumen de concentrado de glbulos rojos, dividido por el volumen total de la muestra de sangre da el PCV. Debido a que un tubo se utiliza, esto puede ser calculada mediante la medicin de las longitudes de las capas. Con equipos de laboratorio modernos, el hematocrito se calcula por un analizador automtico y no se mide directamente. Se determina multiplicando el recuento de glbulos rojos por el volumen corpuscular medio. El hematocrito es un poco ms preciso como el PCV incluye pequeas cantidades de plasma de la sangre atrapada entre los glbulos rojos. Un hematocrito calcula como un porcentaje puede ser derivado al triplicar la hemoglobina concentracin en g / dl y colocar las unidades. El nivel de hemoglobina es la medida utilizada por los bancos de sangre. Se han dado casos en los que la sangre para la prueba se ha elaborado sin querer prximo a una lnea intravenosa que era infundir concentrado de hemates o lquidos. En estas situaciones, el nivel de hemoglobina en la muestra de sangre no ser el verdadero nivel para el paciente ya que la muestra que contiene una gran cantidad de material de infusin en lugar de lo que se diluye en la sangre total en circulacin. Es decir, si glbulos rojos se estn suministrando, la muestra contiene una gran cantidad de las clulas y el hematocrito se artificialmente muy alto. Por el contrario, si otros fluidos salinos se estn suministrando, la muestra de sangre se diluye y el hematocrito se artificialmente bajos.

El HCT puede determinarse por mtodos manuales o por mtodos automticos. Los mtodos manuales consisten en la centrifugacin de la sangre, aplicndola una fuerza de 2.000 a 5.000 g (macro mtodo) o de 12.000 a 15.000 g (micro mtodo). Los mtodos automticos pueden basarse en 2 principios: El clculo matemtico del HCT a partir de los valores de RBC y de volumen corpuscular medio, obtenidos electrnicamente con anterioridad. El anlisis de la sombra que produce la poblacin eritrocitaria, al reflejarse en un campo oscuro. Con los mtodos manuales tambin se cuentan, junto con el volumen de los hemates, el de los leucocitos, el de las plaquetas y el del plasma que queda atrapado entre los hemates. Por ello, el valor de HCT conseguido con mtodos automticos es FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA ms exacto y suele ser 1 o 2 unidades ms bajo que el logrado con mtodos manuales. Objetivo. Calcular el hematocrito y conocer las partes de la sangre

Materiales utilizados: Tubos capilares. Si la muestra es sangre capilar, estos han de estar heparinizados interiormente; mientras que si la muestra es sangre venosa y ha sido adecuadamente anticoagulada, pueden no estar heparinizados. Los heparinizados tienen una franja roja en uno de sus extremos. Plastilina. Algodn o gasas. Una centrifuga de microhematocrito. Esta consta de una especie de plato horizontal-con unos surcos para colocar los capilares, y permite aplicar una fuerza centrifuga de 12.000 a 15.000 g durante un tiempo controlado automticamente. Una regla milimetrada o un lector de microhematocrito. Procedimiento: 1. La determinacin ha de hacerse por duplicado. 2. Llenar cada tubo capilar con la sangre, hasta las 3/4 partes de su longitud. El Llenado se efecta por capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los extremos del tubo capilar con la gota de sangre, o introducindolo en el tubo de sangre e inclinando este, posteriormente, para facilitar el proceso. 3. Limpiar el exterior de cada tubo con un trozo de algodn o con una gasa. 4. Sellar el extremo de cada tubo por el que ha entrado la sangre con plastilina. Para ello, se hace penetrar el tubo en la plastilina, o incluso se atraviesa esta con aquel. 5. Colocar, debidamente equilibrados, los tubos en la centrifuga. En ella los tubos se sitan con su extremo tapado hacia afuera, ajustados al borde exterior y adecuadamente encajados en sus surcos. 6. Centrifugar los tubos a unas 12.000 g durante 5 minutos. Resultados: Puede realizarse de 2 maneras: Midiendo las columnas formadas en el interior de cada tubo con una simple regla milimetrada y calculando, seguidamente, el porcentaje que le corresponde a la columna de eritrocitos, mediante una sencilla regla de tres FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Mediante un lector microhematocrito de

Interpretacin de los resultados: El valor normal del HCT est comprendido entre el 42 y el 47% en las mujeres, y entre el 45 y el 52% en los varones. Un valor bajo del HCT suele ser signo del padecimiento de una anemia. Sin embargo, hay falsos descensos del HCT ocasionados por hemodilucin Paradjicamente, el HCT suele ser normal en la fase ms temprana de las hemorragias agudas, pues en estas se pierden clulas y plasma en la misma proporcin. Un valor alto del HCT suele ser signo del padecimiento de una poliglobulina. Sin embargo, tambin hay engaosos ascensos del HCT producidos por hemoconcentracin (por ejemplo, el de la deshidratacin). Se puede hacer un clculo aproximado del n de hemates por mm3 de sangre, silos hemates son de forma, tamao y contenido en hemoglobina normal. La relacin entre el n de hemates y el hematocrito es una constante K Hematocrito x K = N hemates / mm3 siendo K = 110.000 Resultados obtenidos: Hemos obtenido un hematocrito de 44, por tanto la concentracin de hemates ser 44 x 110.000= 440.000 hemates/ mm3 Para saber si se ha procedido correctamente, tendremos que comparar nuestro resultado con el obtenido en la cmara de recuento.

Cuestionario 1. Explique la importancia de la determinacin del hematocrito en un estudio hematolgico 2. Qu es el hematocrito? 3. Qu tipo de padecimiento podemos esperar con valores de hematocrito bajos? 4. Cmo relacionara el valor de hematocrito con la cantidad de eritrocitos en una muestra sangunea?

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Practica 5

Determinacin de la Hemoglobina Introduccin:

Hemoglobina.

Grupo hemo. La hemoglobina (a menudo abreviada como Hb) es una heteroprotena de la sangre, de masa molecular 64.000 (64 kDa), de color rojo caracterstico, que transporta el oxgeno desde los rganos respiratorios hasta los tejidos, en vertebrados y algunos invertebrados. La hemoglobina es un pigmento de color rojo, que al interaccionar con el oxgeno toma un color rojo escarlata, que es el color de la sangre arterial y al perder el oxgeno toma un color rojo oscuro, que es el color caracterstico de la sangre venosa. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Estructura

El artista Julian Voss-Andreae cre en 2005 una escultura denominada Corazn de Acero (Heart of Steel) basada en la estructura central de la protena. Esta escultura est hecha de vidrio y acero corten. La oxidacin intencional de una obra inicialmente brillante refleja la reaccin qumica fundamental del oxgeno enlazado al fierro en la hemoglobina.1 Las imgenes muestran la escultura de 5 pies (1,6 metros) de altura inmediatamente despus de su instalacin, luego de 10 das y despus de varios meses de exposicin al ambiente. La forman cuatro cadenas polipeptdicas (globinas) a cada una de las cuales se une un grupohemo, cuyo tomo de hierro es capaz de unir de forma reversible una molcula de oxgeno. El grupo hemo est formado por: 1. Unin del succinil-CoA (formado en ciclo de Krebs o ciclo del cido ctrico) al aminocidoglicina formando un grupo pirrol. 2. Cuatro grupos pirrol se unen formando la protoporfirina IX. 3. La protoporfirina IX se une a un ion ferroso (Fe2+) formando el grupo hemo. Oxihemoglobina Cuando la hemoglobina tiene unido oxgeno se denomina oxihemoglobina o hemoglobina oxigenada, dando el aspecto rojo o escarlata intenso caracterstico de la sangre arterial. Cuando pierde el oxgeno, se denomina hemoglobina reducida, y presenta el color rojo oscuro de la sangre venosa (se manifiesta clnicamente por cianosis). Reaccin paso a paso:

Reaccin total:

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LABORATORIO DE HEMATOLOGA Tipos de hemoglobina Hemoglobina A o HbA, llamada tambin hemoglobina del adulto o hemoglobina normal, representa aproximadamente el 97% de la hemoglobina en el adulto. Est formada por dos globinas alfa y dos globinas beta. Hemoglobina A2: Representa menos hemoglobina despus del nacimiento. dos globinas alfa y dos globinas delta. marcado en la beta-talasemia, al no globinas beta. del 2,5% de la Est formada por Sufre un aumento poderse sintetizar

Hemoglobina S: Hemoglobina alterada genticamente presente en la anemia de clulas falciformes. Afecta predominantemente a la poblacin afroamericana y amerindia. Hemoglobina F: Hemoglobina fetal: formada por dos globinas alfa y dos globinas gamma. Tras el nacimiento desciende la sntesis de globinas gamma y aumenta la produccin de globinas beta. Oxihemoglobina: Representa la hemoglobina que posee unido oxgeno (Hb+O2) Metahemoglobina: Hemoglobina cuyo grupo hemo tiene el hierro en estado frrico, Fe (III) (es decir, oxidado). Este tipo de hemoglobina no puede unir oxgeno. Se produce por una enfermedad congnita en la cual hay deficiencia de metahemoglobina reductasa, enzima encargada de mantener el hierro como Fe(II). La metahemoglobina tambin se puede producir por intoxicacin de nitritos. Carbaminohemoglobina: se refiere a la hemoglobina que ha unido CO2 despus del intercambio gaseoso entre los glbulos rojos y los tejidos (Hb+CO2). Carboxihemoglobina: Hemoglobina resultante de la unin con el CO. Es letal en grandes concentraciones (40%). El CO presenta una afinidad 200 veces mayor que el oxgeno por la Hb, por lo que desplaza a este fcilmente y produce hipoxia tisular, pero con una coloracin cutnea normal (produce coloracin sangunea fuertemente roja) (Hb+CO). Hemoglobina glucosilada: aunque se encuentra normalmente presente en sangre en baja cantidad, en patologas como la diabetes se ve aumentada. Es el resultado de la unin de la Hb con glucosa u otros carbohidratos libres.

Tambin hay hemoglobinas de los tipos: Gower 1, Gower 2 y Portland. stas slo estn presentes en el embrin. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Valores de referencia Para varones: 18,0 2,0 g/dl. Para mujeres: 16,0 2,0 g/dl. Otras fuentes citan valores de referencia de: - varones 13 - 17 g/dl - mujeres 12 - 15 g/dl - en nios puede ser ms bajo, hasta 11 g/dl.

La determinacin de hemoglobina se basa en la transformacin de la hemoglobina en cianmetahemoglobina mediante los siguientes pasos: En primer lugar el Fe2+ de la hemoglobina, en presencia de ferricianuro potsico, se oxida a Fe3+, dando lugar a la metahemoglobina. Posteriormente, y en presencia de cianuro potsico, la metahemoglobina pasa a cianmetahemoglobina. Este es un compuesto estable, de color rojo, con un pico de absorcin mximo a 540 nm y cuya concentracin puede ser determinada por mtodos calorimtricos empleando un patrn de concentracin conocida. Materiales utilizados: tubos de ensayo Pipetas de seguridad Espectrofotmetro fotocolormetro Cubetas para colorimetra Reactivo de Drabkin: -Ferricianuro potsico 20 mM -Cianuro potsico 43 mM -Conservantes y estabilizantes Estndar equivalente a 20 mg de hemoglobina/dl. Sangre total anticoagulada con EDTA. o

Procedimiento: Preparamos tres tubos rotulados como B y P y M. Tendremos gran precaucin al FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA pipetear el reactivo de Drabkin, ya que contiene cianuro potsico y es muy toxico.

B Muestra (ml) Reactivo (ml) 5'0

P 0'01 5'0

M 0'01 5'0

El tubo B es el blanco de reactivos, porque el reactivo de Drabkin es de color amarillo y, aunque en condiciones normales su absorbancia debe ser cero, nos aseguramos de no incluir errores en la tcnica. Lo utilizamos como blanco de la tcnica y hacemos la lectura del problema frente a l. El tubo P es el patrn, se lee directamente, ya que est preparado como cianmetahemoglobina equivalente a una concentracin de hemoglobina de 20 g/dl. Dado que no precisa manipulacin, y que es estable en condiciones de conservacin adecuadas, no es necesario medir su absorbancia (D.O.) en cada determinacin. El M es la muestra, donde se mezcla el problema con el reactivo de Drabkin. Encendemos el fotocolormetro o el espectrofotmetro y procedemos de la siguiente forma: 1. Introducimos la fecha 2. Pulsamos para la medicin de absorvancias 3. Tcnica colorimtrica monocromtica 4.Utilizamos una longitud de3 onda de 546 que es la que ms se acerca. 5.Seleccion amos para que termostate una temperatura de 25 C 6.Esperamo s 5 minutos mientras que est

termostatando y luego procedemos a la medicin de las absorvancias Clculos: Los clculos para saber la concentracin son una simple regla de 3, ya que conocemos la concentracin del patrn (indicada en la caja de l) y la absorbancia medida anteriormente. Procedemos as: FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Concentracin patrn X= concentracin muestra absorbancia patrn absorbancia de la muestra

15 g/dl patrn X= 13,1 g/dl muestra

0.145 0,127

Interpretacin de los resultados: Los valores normales son: Hombres: 14-18 g/dl. Mujeres: 11-16 g/dl. Nios: 10-14 g/dl. La muestra medida daba como concentracin 13,1 g/dl por lo tanto est dentro de la normalidad. En este caso, es preferible hablar de valores de referencia, ya que existen diferencias notables entre zonas geogrficas y grupos tnicos donde existen ciertas anemias carenciales que afectan a un nmero elevado de la poblacin. CUESTIONARIO 1. Cul es la importancia de la hemoglobina? 2. a qu tipo de compuestos qumicos pertenece la hemoglobina? 3. Cul es el fundamento de la prueba que se emplea para la determinacin de hemoglobina? 4. A qu padecimientos se encuentra ligado un valor que est por debajo de los lmites normales? 5. Cmo observamos en un frotis de sangre, los eritrocitos cuando el valor de hemoglobina es bajo?

Practica 6 Resistencia globular eritrocitaria

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ERITROCITOS. Llamados tambin hemates o glbulos rojos, son los elementos formes (clulas) ms numerosos de la sangre (alrededor de 5 000 000 por mm), que tienen un tamao bastante uniforme (dimetro de unos 7.5m) y la forma de discos bicncavos, por lo que al observarlos con el Microscopio se aprecia una zona central ms clara. Reciben su nombre porque en grandes cantidades le proporcionan el color rojo a la sangre, aunque al observarlos aislados en preparaciones de sangre fresca (sin teir), presentan un color amarillo verdoso

Formacin

de

los

eritrocitosLos

eritrocitos

se

derivan

de

las clulas

madre comprometidas denominadas eritrotoblasto que se encuentran en la mdula sea. Lahormona eritropoyetina renal estimula a la eritropoyesis (formacin de eritrocitos) y es responsable de mantener una masa eritrocitaria en un estado constante. A medida que la clula madura, la produccin de hemoglobina aumenta, el ncleo paulatinamente se vuelve picntico y es expulsado fuera de la clula. Vida media Tienen una vida media de 4 meses (100 a 120 das). Cuando pierden su capacidad funcional son destruidos en el Bazo e Hgado donde son fagocitados por los macrfagos y la hemoglobina se metaboliza, su grupo prosttico (protoporfirina) contribuye a formar los pigmentos biliares (biliverdina y bilirrubina), mientras que el hierro es utilizado de nuevo en la formacin de hemoglobina. .

Etimologa El nombre eritrocito deriva de la combinacin de los vocablos del griego antguo ( - erythrs): "rojo", y ( - kytos): "clula" Caractersticas morfofuncionales La Membrana citoplasmtica del hemate est

asociada al citoesqueleto, compuesto por protenas como la Espectrina, Ancrina y la deBanda 3, entre otras. La funcin de esta armazn protenica determina la forma del glbulo rojo, sino que permite su necesaria deformacin al pasar por capilares muy estrechos, en los que el eritrocito adopta conformaciones elipsoidales y otras variedades. LosEsfingolpidos presentes en la membrana constituyen los Antgenos para los grupos sanguneos del Sistema ABO. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA El citoplasma tiene afinidad por los colorantes cidos (eosina) con los que adquiere un tono rosado debido a la presencia deHemoglobina. Son clulas que no presentan Ncleo, Mitocondrias, Lisosomas, Ribosoma s, Retculo endoplasmtico y Aparato de Golgi. Esto hace que su Metabolismo sea muy limitado, Si bien es cierto que requiere una cantidad menor de energa que otras clulas, necesita de ella y de su capacidad reductora para diferentes procesos. La mayor parte
+2

del ATP se de bajas

consume

en

el

mantenimiento

concentraciones

de Na+ y Ca y elevadas de K+en el interior celular, en contra del gradiente de concentracin. Por otra parte, el potencial reductor se requiere para mantener el Fe+2 de la hemoglobina en su estado funcional, los grupos SH de la hemoglobina y otras protenas al estado reducido, imprescindible para mantener la integridad de laMembrana celular y del citoesqueleto. Caracterizacin Los eritrocitos se caracterizan por: Su contenido fundamental es la

hemoglobina, que le proporciona al eritrocito su color caracterstico y la funcin de transportar el oxgeno desde los pulmones hasta los tejidos, y parte del bixido de carbono desde los tejidos hasta los pulmones, participa de esta manera en el proceso de la respiracin. Adems, como todas las protenas, contribuye a mantener el equilibrio cido-bsico de la sangre al actuar como un sistema amortiguador del pH sanguneo (sistema buffer o tampn). En determinados estados patolgicos ocurren variaciones de los eritrocitos en cuanto a su nmero (eritrocitosis: "aumento" y eritropenia:"disminucin"), tamao (anisocitosis: "diferencia de tamaos"), forma (poiquilocitosis: "diferentes formas") y contenido dehemoglobina (hipocrmicos: "bajo contenido" e hipercrmicos: "alto contenido"). Eritrocitosis La eritrocitosis se observa en la policitemia mientras que en las anemias se pueden presentar distintas alteraciones de los eritrocitos, principalmente en su tamao y contenido de hemoglobina (constantes corpusculares), que sirven de base a la clasificacin morfolgica de las anemias: Normoctica hemlisis), FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS normocrmica (por hemorragias y

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Microctica hipocrmica (por dficit de hierro) y Macrocticas (por dficit de vitamina B12 y cido flico). Propiedades fsicas Su elasticidad. Tendencia a adherirse. Densidad. Resistencia globular. Funcin antignica. Estas clulas poseen una gran elasticidad, por lo que pueden pasar por los capilares sanguneos de pequeo calibre. En la circulacin lenta y en las preparaciones de sangre fresca que se mantienen en reposo tienen la tendencia de adherirse entre s y formar columnas semejantes a pilas de monedas, su membrana. Sedimentacin: Los eritrocitos son los componentes de la sangre de mayor densidad, por eso, cuando se extrae sangre y se coloca en un tubo de vidrio con cualquier anticoagulante (heparina), al mantenerla en reposo o centrifugarla, los eritrocitos se sedimentan. Basndose en esa propiedad se realizan 2 pruebas de inters clnico: la eritrosedimentacion que determina la velocidad de sedimentacin de los eritrocitos (-20 mm/h) y el hematcrito para calcular el volumen relativo de estas clulas con el plasma sanguneo (4050 V %). Equilibrio osmtico entre el contenido de los eritrocitos y el plasma por la tensin superficial de

En condiciones normales existe un equilibrio osmtico entre el contenido de los eritrocitos y el plasma. Si la concentracin del plasma aumenta (hipertnico), el agua sale de los eritrocitos y se retraen, por lo que presentan una superficie dentada (crenacin). Si la concentracin del plasma disminuye (hipotnico), el agua penetra en los eritrocitos y se FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA hinchan, por lo que adquieren una forma esfrica, hasta que se desintegran y la hemoglobina se disuelve en el plasma (hemlisis). La resistencia globular o capacidad del eritrocito de retener la hemoglobina cuando se le coloca en soluciones hipotnicas, se puede medir mediante la prueba de fragilidad osmtica de los eritrocitos, que es de utilidad en el diagnstico de las anemias hemolticas.

Fundamento de la prctica: El estudio de la fragilidad osmtica de los hemates valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presin osmtica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Para ello, se enfrentan los hemates problema a soluciones tamponadas de cloruro sdico cuya concentracin es decreciente a partir de 9 gramos por mil (soluciones hipotnicas). Cuando los eritrocitos estn en contacto con soluciones hipotnicas, penetra agua a travs de su membrana y se hinchan. Al hincharse los hemates, una parte de la Hb que contienen puede salir al exterior a travs de los poros de su membrana. Si la entrada de liquido es excesiva, los hemates se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban (hemlisis). En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su volumen en un 70% como mximo. Esta prueba evala por tanto la capacidad que tienen los glbulos rojos de soportar un incremento tenido acuoso (resistencia osmtica eritrocitaria o ROE). Dentro de una misma sangre la ROE de los hemates varia de unos a otros. Materiales: Tubos de hemlisis. Pipetas de 1 o 2 ml. graduadas para medir cantidades del orden de 0,01 mL Solucin de NaCl al 1% (preparada mediante desecacin del NaCl y agua destilada hervida de 5 a 10 minutos para eliminar el oxigeno) y agua destilada. La muestra ser sangre preferiblemente heparinizada.

Procedimiento: Partiendo del sodio cloruro al 1% preparamos las siguientes diluciones: 10 ml a,85%, 10ml al 0,75%..., es decir diluciones cada vez mas hipotnicas. Para ello se puede aplicar C1.V1= C2.V2 Se pipetea en 13 tubos de hemlisis 2ml de cada dilucin en cada uno de ellos, a cada tubo aadimos 0,02 ml=20 microlitros de sangre. Mezclamos por inversin e incubamos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se homogenizan suavemente y se centrifugan durante 5 minutos a 2000 r.p.m. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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LECTURA: Se anota la concentracin del primer tubo donde comienza la hemlisis, que se percibe par la aparici6n de una tonalidad roja en la solua6n y la concentracin primera del tubo donde se produce la hemlisis total, que se percibe por un intenso color rojo en la solucin y escasa o ningn sedimento de hemates. Resultados: VALORES NORMALES Resistencia mnima o inicial no debe aparecer a concentraciones superiores al 0,45% ya que indicara que la resistencia osmtica estara disminuida. Resistencia mxima o total en condiciones normales corresponde concentraciones inferiores al 0,3% En general los hemates ms jvenes (recin salidos de MO) son ms resistentes que los viejos ya circulantes. Despus de grandes hemorragias, la resistencia est aumentada debido a la mayor cantidad de clulas jvenes en sangre.

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A la hora de la lectura, segn avanzamos en el nmero de tubos el depsito de hemates es menor, llegando al nmero 13 donde no hay nmero de hemates. La hemlisis va aumentando segn disminuye la concentracin. Hayamos la resistencia mnima en torno al 0,42-0,46 % y la resistencia mxima en torno al 0,30-0,34 %. Interpretacin de los resultados: Cuando la ROE baja, aumenta la hemlisis en los tubos que contienen solucin salina a mayor concentracin. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en la eliptocitosis u ovalocitosis congenita y en la estomatocitosis hereditaria, debido a que en estas enfermedades la superficie de los hemates esta disminuida con respecto a su volumen, por lo que estos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su fragilidad osmtica.

Cuando la ROE sube, la aparici6n de la hemlisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen solucin salina a una concentracin menor que lo previsto. Esto acontece con los reticulocitos y con los glbulos rojos propios de la talasemia minor y de la anemia ferropenica, debido a que estas clulas tienen incrementada su superficie en relacin con su volumen, por lo que toleran mejor la entrada de agua y tienen disminuida su fragilidad osmtica. Cuestionario 1. Por qu es importante conocer la fragilidad osmtica de los eritrocitos? 2. a que padecimientos esta asociada la fragilidad osmtica? 3. Mencione algunas caractersticas de los eritrocitos 4. Qu sucedera al poner en contacto eritrocitos con soluciones hipertnicas .? 5. Escriba los resultados de su practica y explique.

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Practica 7

Grupo sanguneo

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El tipo de sangre es determinado, en parte, por los antgenos de los grupos sanguneos A, B, O presentes en los glbulos rojos y blancos , inclusive. Un grupo sanguneo es una clasificacin de la sangre de acuerdo con las caractersticas presentes o no en la superficie de los glbulos rojos y en el suero de la sangre. Las dos clasificaciones ms importantes para describir grupos sanguneos en humanos son los antgenos (el sistema ABO) y el factor Rh. El sistema ABO fue descubierto por Karl Landsteiner en 1901, convirtindolo en el primer grupo sanguneo conocido; su nombre proviene de los tres tipos de grupos que se identifican: los de antgeno A, de antgeno B, y "O". Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reaccin inmunolgica que puede desembocar en hemlisis, anemia, fallo renal, shock o muerte. El motivo exacto por el que las personas nacen con anticuerpos contra un antgeno al que nunca han sido expuestas es desconocido. Se piensa que algunos antgenosbacterianos son lo bastante similares a estos antgenos A y B que los anticuerpos creados contra la bacteria reaccionan con los glbulos rojos ABOincompatibles. El cientfico austraco Karl Landsteiner recibi el Premio Nobel de Fisiologa o

Medicina en 1930 por sus trabajos en la caracterizacin de los tipos sanguneos ABO.

Importancia Cada individuo posee un conjunto diferente de antgenos eritrocitarios, y por su nmero --existen a da de hoy cerca de 27 sistemas antignicos conocidos, ms algunos antgenos diferenciados que an no han sido atribuidos a ningn sistema especfico --- es difcil encontrar dos individuos con la misma composicin antignica. De ah la posibilidad de la FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA presencia, en el suero, de anticuerpos especficos (dirigidos contra los antgenos que cada individuo no posee), lo que resulta en aglutinacin o hemlisis cuando ocurre una transfusin incompatible. Diferentes sistemas antignicos se caracterizan por inducir a la formacin de anticuerpos en intensidades diferentes; por lo que algunos son ms comunes y otros, ms raros. Los sistemas antignicos considerados ms importantes son el sistema ABO y el Sistema Rh. Estos son los sistemas comnmente relacionados a las temidas reacciones de transfusiones hemolticas. Reacciones contra antgenos eritrocitarios tambin pueden causar ladolencia Hemoltica del recin nacido, causada por el factor Rh+ del padre y del beb y el Rh - de la madre[3] - (DHRN o Eritroblastosis Fetal), cuya causa generalmente (no siempre) se asocia a diferencias antignicas relacionadas al Sistema Rh. La determinacin de los grupos sanguneos tiene importancia en varias ciencias: En Hemoterapia, se vuelve necesario estudiar al menos alguno de estos sistemas en cada individuo para garantizar el xito de las transfusiones. As, antes de toda transfusin, es necesario determinar, al menos el tipo ABO y Rh del donador y del receptor. En Ginecologa/Obstetricia, se puede diagnosticar DHRN a travs de su estudio, adoptndose medidas preventivas y curativas. En Antropologa, se puede estudiar diversas razas y sus interrelaciones evolutivas, a travs del anlisis de la distribucin poblacional de los diversos antgenos, determinando su predominancia en cada raza humana y hacindose comparaciones.

Caractersticas del Sistema ABO Las personas con sangre del tipo A tienen glbulos rojos que expresan antgenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antgenos B en el plasma de su sangre. Las personas con sangre del tipo B tiene la combinacin contraria, glbulos rojos con antgenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antgenos A en el plasma de su sangre. Los individuos con sangre del tipo O 0 (cero) no expresan ninguno de los dos antgenos (A o B) en la superficie de sus glbulos rojos pero tienen anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antgenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Esta clasificacin internacional, debida a Landsteiner, ha reemplazado a la de Moss, en la cual el grupo I corresponde al grupo AB de la precedente, el grupo 2 al grupo A, el grupo 3 al grupo B, y el grupo 4 al grupo O. Estos cuatro grupos sanguneos constituyen el sistema ABO. A causa de estas combinaciones, el tipo 0 puede transfundir a cualquier persona con cualquier tipo y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo ABO. La denominacin O y cero es confusa, y ambas estn muy extendidas. El austriaco Karl Landsteiner design los grupos sanguneos a principios del s. XX. Algunas fuentes indican que O podra deberse a la preposicin Ohne, que es "sin" en alemn (Sin antgeno). Sin embargo all se dice Null Blutgruppe, y casi nunca la alternativa O Blutgruppe. En alemn O se dice /o/ y 0 (cero) se dice Null. En ingls O se lee /ou/ y a veces el cero tambin se lee /ou/ (por ejemplo en un n de telfono, o en una fecha). Sistema ABO y O blood-group es de uso mayoritario en ingls. Otros idiomas de Europa mantienen la designacin null, en sus variantes zero,cero,nula, etc. En Centroamrica y el Caribe es ms comn O positivo, evitando la similitud cero positivo con el trmino seropositivo -se llama seropositivo al individuo que presenta en sangre anticuerpos que, cuando se le somete a la prueba diagnstica apropiada, prueban la presencia de un determinado agente infeccioso- que mucha gente relaciona con el retrovirus VIH, causante del SIDA (sndrome de inmunodeficiencia adquirida).

Herencia del tipo ABO Para tener una visin ms amplia de como se produce la herencia gentica se puede ver el artculo Gregor Mendel. Son controlados por un solo gen con tres alelos: O (SIN, por no poseer los antgenos ni del grupo A ni del grupo B), A, B. El alelo A da tipos A, el B tipos B y el alelo O tipos O siendo A y B alelos dominantes sobre O. As, las personas que heredan dos alelos OO tienen tipo O; AA o AO dan lugar a tipos A; y BB o BO dan lugar a tipos B. Las personas AB tienen ambos genotipos debido a que la relacin entre los alelos A y B es de codominancia. Por tanto, es imposible para un progenitor AB el tener un hijo con tipo O, a excepcin de que se de un fenmeno poco comn conocido como el "fenotipo Bombay" o diversas formas de mutacin gentica relativamente extraas.

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Herencia del factor Rh En 1940, el Dr. Landsteiner descubri otro grupo de antgenos que se denominaron factores Rhesus (factores Rh), porque fueron descubiertos durante unos experimentos con monos Rhesus. Las personas con factores Rhesus en su sangre se clasifican como Rh positivas; mientras que aquellas sin los factores se clasifican RH negativas. Las personas Rh negativas forman anticuerpos contra el factor Rh, si estn expuestas a sangre Rh positiva. Los antgenos del sistema Rh son de naturaleza proteica. El antgeno D posee la mayor capacidad antignica. Los genes responsables de este sistema se localizan en el cromosoma 1. Existen dos teoras sobre el control gentico: Teora de Fisher: Tres genes C, D, E (presentan antgeno D aquellas combinaciones que contengan el alelo D como por ejemplo cDe). Teora de Wiener: En determinados casos se expresa un antgeno D dbil Du (rh-) como consecuencia de: 1. La represin del gen D por un gen C en posicin trans (cromosoma opuesto). 2. La existencia de un alelo Du. 3. La formacin de un antgeno D incompleto. Teora de Tippet (1986): Tippet emite la teora de la existencia de dos genes RHD y RHCD, que son secuenciados en 1990 por Colin y colaboradores. La enfermedad del Rh es provocada por una madre Rh- que concibe un hijo Rh+. Los anticuerpos de la sangre materna destruyen los Rh+ del beb. Si la madre piensa tener un segundo hijo debe aplicarse una vacuna que elimina los anti-Rh, llamada lagammainmunoglobulina. sta debe ser aplicada dentro de las 72 horas despus del primer parto, ya que si se tiene un segundo bebe con Rh+ la madre producir anti-Rh en exceso que destruir la sangre del hijo, produciendo una enfermedad llamada Eritroblastosis fetal(anemia severa), si es que el hijo nace, porque por la produccin en exceso de los anti-Rh el hijo puede morir intrauterinamente. Los grupos sanguneos Rh (descubierto por Landsteiner y Wiener en 1940) tiene un inters clnico similar a los grupos ABO dada su relacin con la enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN) y su importancia en la transfusin. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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La

importancia

de

este

sistema

antignico

estriba

en

el

peligro

de

realizar transfusiones sanguneas, en las que la sangre del donante sea Rh positivo y la del receptor Rh negativo, porque en esta ltima se desarrollan lentamente anticuerpos (aglutininas anti Rh), durante las semanas siguientes, y el individuo queda sensibilizado, por lo tanto, si se repite despus la transfusin, esta provoca la aglutinacin y hemlisis de los eritrocitos, que puede ser de suma gravedad. Esta reaccin hemoltica tambin ocurre en la eritroblastosis fetal, enfermedad del recin nacido, que generalmente se produce cuando la madre es Rh negativo y desarrolla anticuerpos contra el feto Rh positivo.

Compatibilidad Los donantes de sangre y los receptores deben tener grupos compatibles. El grupo O- es compatible con todos, por lo que, quien tiene dicho grupo se dice que es un donante universal. Por otro lado, una persona cuyo grupo sea AB+, podr recibir sangre de cualquier grupo, y se dice que es un receptor universal. Por ejemplo, una persona de grupo A- podr recibir sangre O- o A- y donar a AB+, AB-, A+ o A-.1

Cabe mencionar que al recibirse la sangre de un donante, sta se separa en distintos hemocomponentes y ah se determina la compatibilidad con los debidos grupos sanguneos. Actualmente ya casi no se realizan transfusiones de sangre entera, si as fuera no debemos utilizar el trmino "donante o receptor universal" ya que debemos tener en cuenta que la sangre entera est compuesta principalmente por glbulos rojos (con sus antgenos) y por plasma (con sus anticuerpos). De ese modo, si se transfundiera a una persona de grupo A la sangre de un supuesto dador universal de grupo O, estara ingresando anticuerpos anti A (del donante que es grupo O), que como se mencion, tiene anticuerpos anti-A y anti-B a la persona a transfundir provocando una incompatibilidad ABO pudiendo provocar incluso la muerte FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Como se aclar, la sangre se separa en distintos hemocomponentes, los glbulos rojos, plasma, y plaquetas. De esta manera, se pueden transfundir los glbulos rojos de un donante O a cualquier grupo sanguneo ya que no cuenta con antgenos para el sistema ABO en sus glbulos rojos. Por el contrario, se puede transfundir su plasma a un individuo solamente con el mismo grupo sanguneo, teniendo en cuenta que el grupo O cuenta con anticuerpos anti-A y anti-B. Lo mismo sucede con el grupo AB

Tabla de compatibilidad entre grupos sanguneos1 2

Receptor Donante

O-

O+

A+

B+

AB

AB+

O-

O+

A+

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B+

AB

AB+ Frecuencia

La distribucin de los grupos sanguneos en la poblacin humana no es uniforme. El ms comn es O+, mientras que el ms escaso es AB-. Adems, hay variaciones en la distribucin en las distintas subpoblaciones humanas.

Frecuencia del grupo O en poblaciones nativas. Ntese el predominio de este grupo en los pueblos indgenas americanos. Historia evolutiva Ya desde hace aos se cree que la historia evolutiva del sistema ABO en humanos se remonta de 1 a 2 millones de aos.29 Ahora se ha demostrado que los neandertales tenan este sistema, y en especial que tenan el grupo sanguneo 0, lo que aportara pruebas empricas de que al menos hace unos 400 mil aos, en la

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LABORATORIO DE HEMATOLOGA poca del ancestro comn entre Homo sapiens y neandertales, ya exista el sistema AB0 en humanos.30 Sistemas de grupos sanguneos inmunolgicos Son, entre otros, los siguientes:31 Sistema ABO Sistema Rhesus (Rh) Sistema MNS Sistema Duffy Sistema Diego Sistema P Sistema Lutheran (Lu) Sistema Kell Sistema Lewis Sistema Kidd (Jk) Sistema Fisher Sistema I

Determinacin del grupo sanguneo Es un mtodo para saber cul es el tipo especfico de sangre que tiene. El tipo de sangre que tenga depende de si hay o no ciertas protenas, llamadas antgenos, en sus glbulos rojos. La sangre a menudo se clasifica de acuerdo con el sistema de tipificacin ABO. Este mtodo separa los tipos de sangre en cuatro categoras: Tipo A Tipo B Tipo AB Tipo O

Su tipo de sangre (o grupo sanguneo) depende de los tipos que haya heredado de sus padres. Materiales FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

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Porobjetos tubos de ensaye Antisueros A , B , Rh Sangre total

Forma en que se realiza el examen La sangre se extrae de una vena, por lo general de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de puncin se limpia con un antisptico y luego se coloca una banda elstica alrededor del antebrazo con el fin de ejercer presin y hacer que las venas se llenen de sangre. Luego, se introduce una aguja en la vena y se recoge la sangre en un frasco hermtico o en una jeringa. Durante el procedimiento, se retira la banda para restablecer la circulacin y, una vez que se ha recogido la sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de puncin para detener cualquier sangrado. En los bebs o nios pequeos, el rea se limpia con un antisptico y se punza con una aguja o lanceta puntiaguda. La sangre se puede recoger en una pipeta (tubo pequeo de vidrio), en una lmina portaobjetos, en una tirilla de examen o en un recipiente pequeo. Finalmente, se puede aplicar un vendaje en el sitio de la puncin si hay algn sangrado. El examen para determinar el grupo sanguneo se denomina sistema o tipificacin ABO. La sangre se mezcla con anticuerpos contra sangre tipo A y tipo B, y la muestra se revisa para ver si los glbulos sanguneos se pegan o aglutinan. Si dichos glbulos se aglutinan, eso significa que la sangre reaccion con uno de los anticuerpos. El segundo paso se llama tipificacin o prueba inversa. La parte lquida de la sangre sin clulas (suero) se mezcla con sangre que se sabe que pertenece al tipo A o al tipo B. Las personas con sangre tipo A tienen anticuerpos anti-B y las que tienen sangre tipo B tienen anticuerpos anti-A. El tipo de sangre O contiene ambos tipos de anticuerpos. Estos dos pasos pueden determinar con precisin el tipo de sangre de una persona. La determinacin del grupo sanguneo tambin se hace para decir si usted tiene o no una sustancia llamada factor Rh en la superficie de los glbulos rojos. Si uno tiene la sustancia se considera Rh+ (positivo) y los que no la tienen Rh- (negativo). La tipificacin del Rh utiliza un mtodo similar al sistema ABO. Preparacin para el examen No se necesita preparacin especial para este examen. Lo que se siente durante el examen Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras slo sienten un pinchazo o sensacin punzante. Posteriormente, puede haber una sensacin pulstil o una contusin en el sitio donde se insert la aguja. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA Razones por las que se realiza el examen Este examen se hace para determinar el tipo de sangre de una persona. Los mdicos necesitarn conocer su tipo de sangre cuando le vayan a hacer una transfusin de sangre o un trasplante, debido a que no todos los tipos de sangre son compatibles entre s. Por ejemplo: Si usted tiene sangre tipo A, nicamente puede recibir sangre tipo A y tipo O. Si usted tiene sangre tipo B, nicamente puede recibir sangre tipo B y tipo O. Si usted tiene sangre tipo AB, puede recibir sangre tipo A, B, AB y O. Si usted tiene sangre tipo O, nicamente puede recibir sangre tipo O.

La sangre tipo O se le puede dar a alguien con cualquier tipo de sangre, razn por la cual las personas con este tipo de personas son llamadas donantes de sangre universales. La determinacin del grupo sanguneo es especialmente importante durante el embarazo. Si se detecta que la madre tiene sangre Rh negativa, entonces el padre tambin debe ser evaluado. Si el padre tiene sangre Rh positiva, entonces la madre necesita recibir un tratamiento para ayudar a prevenir el desarrollo de sustancias que le pueden hacer dao al feto. Ver: incompatibilidad Rh Si usted es Rh+, puede recibir sangre Rh+ o Rh-, pero si es Rh-, nicamente puede recibir sangre Rh-.

Valores normales Tipificacin ABO: Si sus glbulos sanguneos se pegan o aglutinan al mezclarse con: Suero anti-A, usted tiene sangre tipo A. Suero anti-B, usted tiene sangre tipo B. Sueros anti-A y anti-B, entonces usted tiene sangre tipo AB.

Si los glbulos sanguneos no se pegan o aglutinan cuando se agrega suero anti-A y antiB, usted tiene sangre tipo O. Prueba inversa: Si la sangre se aglutina nicamente cuando se agregan clulas B a la muestra, usted tiene sangre tipo A. Si la sangre se aglutina nicamente cuando se agregan clulas A a la muestra, usted tiene sangre tipo B. Si la sangre se aglutina cuando se agregan cualquiera de los tipos de clulas a la muestra, usted tiene sangre tipo O. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA La falta de aglutinacin de los glbulos sanguneos cuando la muestra se mezcla con ambos tipos de sangre indica que usted tiene sangre tipo AB. Tipificacin del Rh: Si los glbulos sanguneos se pegan o aglutinan al mezclarlos con suero anti-Rh, usted tiene sangre de tipo Rh positivo. Si la sangre no coagula al mezclarse con suero anti-Rh, usted tiene sangre de tipo Rh negativo.

Cules son los riesgos Los riesgos asociados con la toma de una muestra de sangre pueden ser: Desmayo o sensacin de mareo Punciones mltiples para localizar las venas Sangrado excesivo Hematoma (acumulacin de sangre debajo de la piel) Infeccin (un riesgo leve en cualquier momento que se presente ruptura de la piel)

Consideraciones especiales Existen muchos antgenos adems de los mayores (A, B y Rh). Muchos antgenos menores no se detectan rutinariamente durante la determinacin del grupo sanguneo. Si no se detectan, usted puede an experimentar una reaccin al recibir ciertos tipos de sangre, incluso si los antgenos A, B y Rh son compatibles. Un proceso llamado pruebas cruzadas, seguido de una prueba de Coombs, puede ayudar a detectar estos antgenos menores y se realiza de manera rutinaria antes de las transfusiones, excepto en situaciones de emergencia. Nombres alternativos Determinacin del grupo sanguneo ABO (hemoclasificacin); Pruebas cruzadas; Determinacin del Rh Cuestionario. 1. Cul es la importancia de la determinacin de los grupos sanguneos? 2. Qu tipo sanguneo debe tener una persona para considerarse donador universal?

3. Qu tipo sanguneo debe tener una persona para considerarse receptor


universal.?

4. A que se refiere el factor Rh


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5. para que porque es necesario conocer el tipo de sangre al que pertenecemos?

Referencias Goodnough LT. Transfusion medicine. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 183. Actualizado: 2/5/2010 Versin en ingls revisada por: David C. Dugdale, III, MD, Professor of Medicine, Division of General Medicine, Department of Medicine, University of Washington School of Medicine; Yi-Bin Chen, MD, Leukemia/Bone Marrow Transplant Program, Massachusetts General Hospital. Also reviewed by David Zieve, MD, MHA, Medical Director, A.D.A.M., Inc.

Practica 8 Anemias y Hemograma

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La anemia hemtic a (sangunea) que es debida a una alteracin de la composicin sangunea, determinada por una disminucin de la Frotis de sangre en un paciente con anemia por masa eritrocitaria qu deficiencia de hierro. Los (eritrocitos) estn e condiciona una plidos por falta de hemoglobina y tienen variado concentracin baja tamao y forma. Tambin se observa un glbulo de hemoglobina (ver blanco (la clula ms grande y con ncleo) y los parmetros 3 plaquetas(pequeas de color morado). estndares). Rara vez se registra en forma independiente una deficiencia de uno solo de estos factores. La anemia es una definicin de laboratorio que entraa un recuento bajo de eritrocitos (vase hematocrito) y un nivel de hemoglobina menor de lo normal.

Anemia

Cronicidad La anemia se considera crnica si dura ms de seis meses. Valores normales Los rangos de normalidad son muy variables en cada poblacin, dependiendo de factores ambientales (nivel sobre el mar) y geogrficas. A nivel del mar encontraremos valores normales mnimos, y a gran altura los valores
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normales debern ser ms altos (la menor presin parcial de oxgeno (O2) obliga al organismo a optimizar su transporte). Adems, hay variaciones de sexo, observando valores menores en las mujeres (posiblemente por la prdida de eritrocitos y contenido sanguneo en cada ciclo menstrual).

Sexo Mujeres MCV: MCH:

Nmero de Eritrocitos Hematocrito Hemoglobina 42-52 % 36-48 % MCHC: RDW: 13-17 g/dl 1216 g/dl 31-37 g/dl. 11,5-14,5 3,6-5,0 x 10 /mm 80-100 fl. 27-31 pg/clula.
6 3

Hombres 4,2-5,4 x 106/mm3

En general, se establece como normal para un varn un hematocrito entre 42% y 52%, hemoglobina entre 13 y 17 g/dl, y para una mujer: hematocrito entre 36% y 48%, y hemoglobina entre 12 y 16 g/dl.

Estos niveles son algo arbitrarios, pues existen lmites en los valores normales. Por ejemplo, un sujeto puede tener una disminucin de 1 a 2 g/dl en su hemoglobina, y aun as estar dentro de los lmites normales.

Expresin clnica Los sntomas y signos de la anemia se correlacionan con su intensidad, su rapidez de instalacin y el sitio donde se produce. Otros factores influyentes en el cuadro sintomtico son la edad, el estado nutritivo, cardiovascular y respiratorio. Los sntomas que se observan en la anemia aguda se denominan sndrome anmico, e incluyen: debilidad (astenia), palpitaciones y falta de aire (disnea) con el esfuerzo. Frecuentemente y sobre todo en las anemias severas se
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observa esplenomegalia, hepatomegalia,petequias, equimosis, y/o ictericia. Tambin puede incluir sntomas propios de otros sistemas, como cardiovascular (taquicardia, disnea de esfuerzo marcada, angor, claudicacin intermitente), digestivo (dispepsia, disfagia, anorexia, diarrea) o neuropsiquitrico ,depresin, cambios de carcter como irritabilidad. En la prdida sbita de sangre (hemorragia aguda) y en particular si es voluminosa (aprox. 2 L o 40% del volumen sanguneo), predominan los sntomas de inestabilidad vascular por hipotensin, contraccin vascular, aparecen los signos del shock hipovolmico, tales como confusin, respiracin de Kussmaul, sudoracin, y taquicardia.1

Diagnstico

Diagnostico de laboratorio anlisis clnico: hemograma.

Sntomas La anemia afecta si el paciente no presenta suficiente hemoglobina o eritrocitos por litro de sangre. Desde los sntomas tempranos de la anemia, es suave, es fcil confundir los sntomas de la anemia desde sntomas de una cierta enfermedad seria. Los sntomas importantes de la anemia incluyen: palpitacin de corazn, fatiga, vrtigos, prdida de concentracin, respiracin rpida del corazn y piel plida. La falta de nimo y la depresin podan tambin ser un sntoma importante de la anemia. El pulso del dolor de cabeza, de la irritabilidad, del sncope y de limitacin son tambin sntomas de la anemia. Las muestras observables de la anemia son: taquicardia, edema perifrico suave, murmur sistlico de la eyeccin y ronquidos venosos. Los pectoris de la angina entre la gente mayor son una muestra clara de la anemia. Las mujeres tienden para desarrollar la menstruacin y la amenorrea anormales si la anemia los afecta mientras que los varones desarrollan impotencia y disminuyen la libido. La anemia podra o ser el
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resultado de un desorden heredado o podra resultar debido a su ambiente, tal como infeccin o exposicin a una toxina o a una droga.

Clasificacin . Anemia

ndice de produccin de reticulocitos inadecu ada respuesta productora a la anemia.

ndice de produccin reticulocitos con respuesta adecuada productora =hemolisis o prdida de sangre sin problemas en la produccin de

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reticulocitos. Hallazgos clnicos y MVC normal: Hemolisis aguda o prdida sin tiempo para compensar por la mdula sea**.

Sin hallazgos clnicos de hemolisis o prdida de sangre: Alteracin de la produccin.

Hallazgos clnicos y MVC anormal: Hemolisis o prdida y alteracin crnica de la produccin*.

Anemia macroctica(VC M>100)

Anemia normoctica(80<V CM<100)

Anemia microctica(VC M<80)

Anemia Drepanoctica: Los glbulos rojos adoptan forma de hoz en estados de bajo oxgeno (hipoxia) debido a una alteracin en la hemoglobina (HbS) y de su membrana; aumentando su fragilidad y subsecuente destruccin intravascular. La clasificacin fisiopatolgica est basada en el mecanismo que conlleva al estado de anemia, diferencindolas en: Anemias mediadas por trastornos en la produccin de glbulos rojos

Endocrinopatas
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Proceso inflamatorio crnico Fallo renal crnico Anemia aplsica

Eritropoyesis inefectiva:

Defecto en la sntesis de cidos nucleicos: deficiencia de cido flico y cobalamina (anemia con macrocitosis: los reticulocitos no se dividen y de ah el aumento de tamao de los eritrocitos). Defecto en la sntesis del grupo hemo: anemia microctica por dficit de hierro y anemia sideroblstica Defecto en la sntesis de las globinas: talasemia beta y anemia drepanoctica

Anemias por prdida de sangre Prdidas agudas (repentinas)

Prdidas crnicas (hemofilias, lesiones gastrointestinales, trastornos de la menstruacin, etc.)

Anemias hemolticas Talasemia alfa


Anemia drepanoctica o de clulas falciformes Esferocitosis hereditaria Anemia por dficit de la enzima G6FD Anemia por hemoglobinopatas Anemia por infecciones (paludismo) Anemia por agresiones mecnicas (anemia microangioptica, coagulacin intravascular diseminada, prpuras trombocitopnicas, etc.) Anemias autoinmunes (anemia nocturna, anemia inmunohemoltica) perniciosa, anemia paroxstica

Causas Generalmente, la anemia puede ser provocada por varios problemas, entre los que se incluyen los trastornos en la produccin de los eritrocitos:
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Eritropoyesis insuficiente:

Endocrinopatas: alteracin en la regulacin neuro-hormonal de la homeostasis. Hipotiroidismo: deficiencia de hierro y de eritropoyetina. Hipertiroidismo: aumento del plasma, generando una pseudo anemia por hemodilucin.

Insuficiencia Adrenal: la disminucin de glucocorticoides disminuye la eritropoyesis.

Hipoandrogenismo: eritropoyesis. Falta de alimentacin.

la

disminucin

de

andrgenos

disminuye

la

Hipopituitarismo: la disminucin de las hormonas adenohipofisiarias disminuye la eritropoyesis (excepto la prolactina, compensando la presencia de esta anemia). Hiperparatiroidismo: el aumento de la parathormona disminuye la eritropoyesis, adems de aumento significativo del riesgo de fibrosis en la mdula sea. Proceso inflamatorio crnico: el aumento de la produccin de citoquinas (sobre todo la Interleukina-6) ejerce un efecto inhibidor de la eritropoyesis, al aumentar la sntesis y liberacin de hepcidina heptica, cuyo mecanismo es bloquear la salida de hierro heptico, aumentar los almacenes de hierro en los macrfagos y disminuir la absorcin intestinal de hierro. Adems el TNF-alfa y la interleucina-1 estn relacionados con una resistencia a la eritropoyetina. Fallo renal crnico: principalmente por una disminucin de la produccin de eritropoyetina en el rin. Aunque secundariamente, por un acumulo de metabolitos txicos y alteracin del ambiente medular para la eritropoyesis. Anemia aplsica: generalmente adquirida por consumo de frmacos que generan una reaccin autoinmune de los linfocitos T (benceno, metotrexato, cloranfenicol) contra las clulas precursoras de eritrocitos y leucocitos (excepto de los linfocitos). Se caracteriza por una pancitopenia. Existen algunas formas hereditarias, siendo la ms comn la anemia de Fanconi, que se caracteriza por un defecto en la
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reparacin del ADN eritrocitario (BRCA 1 y 2, Rad51); es de carcter autosmica recesiva, localizada en el cromosoma 16. Eritropoyesis inefectiva

Defecto en la sntesis de cidos nucleicos Dficit de cido flico: el tetra hidro folato (THF; forma activa del cido flico) es un transportador de fragmentos de un slo carbono. Con este carbono, el metil-THF formado, contribuir con la enzima timidilato sintetasa, para la conversin de deoxi-uridilato a timidilato (de U a T en el ADN). Un defecto en el cido flico, produce errores en las cadenas de ADN. Dficit de cobalamina: la cobalamina (derivado de la cianocobalamina - vitamina B12) se requiere para la conversin de homocistena a metionina, esta reaccin necesita de un grupo metilo que es brindado por el Metil-THF. Si hay una deficiencia decobalamina, no se produce esta reaccin de la sintetasa de metionina; con el consecuente acmulo de metil-THF. Esta forma del metil-THF no puede ser retenido en la clula y escapa, generando tambin una deficiencia de cido flico. (El THF para ser retenido necesita conjugarse con residuos de glutamato, empero, como metil-THF, no puede realizarse esta conjugacin, adems de no liberar su grupo Metil en la reaccin; se escapa de la clula).

Defecto en la sntesis del grupo Hem

Dficit de hierro: en la sntesis del grupo Hem, el ltimo paso es la incorporacin del hierro a la Protoporfirina IX; reaccin catalizada por la ferroquelatasa en la mitocondria de la clula eritroide. El 67% de la distribucin de hierro corporal se encuentra en las molculas de Hb. En consecuencia, una deficiencia (severa) de Hierro, genera una baja produccin de eritrocitos, adems de otros sntomas como alteraciones esofgicas, en uas, etc. Anemia sideroblstica: en la sntesis del grupo Hem, el primer paso es la condensacin de una glicina con un Succinil-CoA para formar una molcula conocida como delta - ALA (delta - cido amino levulnico), reaccin catalizada por la enzima ALA-sintasa. Esta enzima requiere al piridoxal fosfato (derivado de la vitamina B6) como coenzima y de Metil-THF como donador del grupo Metilo. En la anemia sideroblstica congnita, existe una mutacin en la codificacin de la enzima ALA-sintasa que produce una
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consecuente alteracin en la sntesis del grupo Hem. En la anemia sideroblstica adquirida (por alcohol, cloranfenicol, plomo, zinc), se postula el descenso de los niveles de piridoxal fosfato (B6), conllevando a una baja sntesis del grupo Hem. Ntese que se produce un aumento del Metil-THF que, al igual que la anemia por deficiencia de cobalamina, concluye en un escape del cido flico. Defecto en la sntesis de las globinas

Talasemias: la hemoglobina ms abundante en los seres humanos adultos es la conocida como A1 (un par alfa y un par beta). En las talasemias se produce un defecto en la sntesis de las globinas. Si sta es localizada en la globina alfa se llama alfa-talasemia (donde se evidencia un aumento compensatorio de la globina beta). Si sta es localizada en la globina beta se llama beta-talasemia (donde se evidencia un aumento compensatorio de la globina alfa). En la alfa talasemia se reconoce una anemia hemoltica, consecuentemente ms aguda y peligrosa; en la beta talasemia se reconoce una anemia no tan agresiva (a pesar de la No unin del 2,3 DPG a la cadena Beta). Notar que el acmulo de las globinas dentro del eritroide puede producir lisis celular. Existe un aumento de los niveles de hierro, debido a la lisis y la destruccin por los macrfagos quienes liberan el Hierro nuevamente a la sangre o lo dirigen hacia el ambiente de la mdula sea. Esto generar una hipertrofia heptica (para conjugar la bilirrubina), hipertrofia esplnica (por la destruccin de los eritrocitos) y una hipertrofia medular (para compensar los bajos niveles de eritrocitos en sangre).

Drepanocitosis (anemia falciforme): la funcin de la hemoglobina en el eritrocito es permitir la captacin del oxgeno gaseoso y facilitar de manera reversible su liberacin en los tejidos que lo requieran. En la anemia falciforme (drepanoctica) hay una mutacin en el ADN que codifica la estructura de las globinas (valina por glutamato en el 6to aminocido), lo que se constituye en una llamada hemoglobina anormal tipo S. Esta hemoglobina S, ante una baja PO2, tiende a agregarse, generando un cambio estructural en el eritrocito; adaptando una forma de guadaa o pltano (falciforme). Adems se ha evidenciado un defecto en la membrana (en el canal de Ca+2, permitiendo su entrada a la clula, con la compensatoria salida de K+) comprometiendo an ms la gravedad de esta anemia. Esta particular forma no les permite un paso fluido por los capilares
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ms pequeos, produciendo una hipoxia tisular grave; con riesgo de isquemia, infarto y agregacin microvascular.

Infecciones:2 anemia por inflamacin/infeccin crnica. Ciertas enfermedades: enfermedad renal y del hgado. Ciertos medicamentos: los que interfieren en la sntesis de ADN, o que suprimen la produccin de cido gstrico. Nutricin deficiente:3 nios malnutridos, alcoholismo crnico, celiaqua. .

En medicina el hemograma o CSC (conteo sanguneo completo) o biometra hemtica es uno de los elementos diagnsticos bsicos. Es un cuadro o frmula sangunea en el que se expresan el nmero, proporcin y variaciones de los elementos sanguneos. Recoge:
1. Nmero de hemates, hematocrito, hemoglobina e ndices eritrocitarios FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA 2. Recuento y frmula leucocitaria 3. Nmero de plaquetas

Valores normales

Hemates (adultos) Mujeres: 4,2 - 5,4 millones/mm (En unidades SI: 4,2 - 5,4 x10/L) Hombres: 4,6 - 6,2 millones/mm (En unidades SI: 4,6 - 6,2 x10/L)

Hemoglobina(adultos)

Mujeres: 11,5 - 14,5 g/dL Hombres: 13,5 - 16,0 g/dL

Hematocrito (adultos) Es la proporcin entre los hemates y el plasma sanguneo Mujeres: 37 - 42% Hombres: 40 - 50%

ndices eritrocitarios (adultos) Volumen corpuscular medio (VCM), se obtiene dividiendo el hematocrito entre el nmero de hemates.

Valores normales: 78 - 100 fL

Hemoglobina corpuscular media (HCM), se obtiene dividiendo la hemoglobina entre el nmero de hemates

Valores normales: 27 - 32 pG

Concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM), se obtiene dividiendo la hemoglobina entre el hematocrito

Valores normales: 30 - 35 g/dL

Leucocitos:

Valores normales: 4,5 - 10,5 mil/mm (En unidades SI: 4,5 - 10,5 x109/L).

Plaquetas:

Valores normales: 150.000 - 400.000 /mm (En unidades SI: 150 - 400 x 109/L).

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS

LABORATORIO DE HEMATOLOGA

Frmula leucocitaria: consiste en la diferenciacin de los distintos tipos de leucocitos de la sangre. adems se puede hacer un estudio sacando sangre de la medula osea y se podr saber si estamos en un caso de anemia aguda muy coila la que causa la muerte tiempo despus

Se diferencian los siguientes tipos celulares bsicos: polimorfonucleares (de los cuales los neutrfilos segmentados constituyen el 45-75%, eosinfilos 0-3% y basfilos 02%), linfocitos (15-45%) y monocitos (5-10%)

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICOBIOLOGICAS