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20/4/2010

Disciplina de Morfo-Funcional II (Gentica Humana) Departamento de Cincias Biolgicas (UESB)

Tpicos O Advento da Gentica Molecular

Ferramentas de Gentica Molecular Humana

Princpios da Clonagem Molecular Metodologias de Anlise dos cidos Nucleicos - Southern blotting - Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) - Sequenciamento de DNA - Microarrays - Hibridao in situ com Fluorescncia (FISH) Ferramentas de Gentica Molecular e a Biotecnologia

Prof. Dr. Marcus Vincius de Matos Gomes

O Advento da Gentica Molecular DNA: A Notcia do Sculo

Estrutura Molecular do DNA

James Watson

Francis Crick

Interpretao do Cdigo Gentico

Interpretao do Cdigo Gentico - 1966

Relao: Bases do DNA Sequncia Protena

Fita molde Transcrio

Ncleo
Traduo

Cadeia Polipetdica

Citoplasma (Ribossomos)

Muitas Doenas Gentica Modificao no DNA Altera o RNA Protena alterada

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Principais Obstculos para Anlise dos cidos Nuclicos

Princpios da Clonagem Molecular

Processo que envolve transferncia da seqncia de DNA de interesse para uma clula de um microorganismo

1) Pequena Quantidade de Material por Clula - Cada clula apenas duas cpias de cada gene - Quantidade Insuficiente para anlise

E. coli

2) Tamanho da Molcula de DNA - Clula diplide humana: DNA contm ~ 3 bilhes de pares bases - Como selecionar regies especficas associadas s doenas?
Cultivo in vitro

Microorganismo cultivado em meio de cultura reproduz a seqncia de DNA junto com seu complemento de DNA

Descoberta das Enzimas de Restrio

Dcada de 1970

Enzimas de Restrio
Endonucleases de restrio bacteriana enzimas que reconhecem e clivam seqncias especficas no DNA

Ex. EcoRI

Extrada de Escherichia coli

Seqncias palindrmicas mesma seqncia em ambos filamentos

DNA do ORGANISMO A

DNA do ORGANISMO B

Exemplos de Enzimas de Restrio

GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI GAATTC CTTAAG

Extremidades lisas ou abruptas

EcoRI

Extremidades coesivas ou aderentes

G CTTAA

AATTC G

G CTTAA

AATTC

G CTTAA

AATTC G

G CTTAA

AATTC

MOLCULA DE DNA RECOMBINANTE

AATTC G G AATTC CTTAA G G CTTAA

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Clivagem do DNA de organismos diferentes com mesma enzima de restrio

Primeira Molcula de DNA Recombinante

Vetor de Clonagem
DNA Fragmentado

Ligao dos fragmentos

Transferncia de DNA clivado para microorganismo

Enzima DNA ligase

Ligado ao vetor
G CTTAA

Transformao

AATTC G

G CTTAA

AATTC G

Multiplicao

Paul Berg (1972)

MOLCULA DE DNA RECOMBINANTE

AATTC G G AATTC CTTAA G G CTTAA

Reproduo do DNA exgeno junto com DNA bacteriano em meio de cultura

Vetores
Molculas de DNA que podem se replicar de modo autnomo em um hospedeiro (bactria ou levedura) podendo ser isolado aps replicao Bactria ou levedura cultivadas e multiplicadas por tempo indeterminado em laboratrio

Tipos de Vetores
Plasmdeo
Molculas circulares de DNA que se replicam extracromossomicamente em bactrias e leveduras

Contm genes no essenciais bactria

Isolar determinado gene ou sequencia de DNA Obteno de grandes quantidades dessa sequencia Tecnologia do DNA Recombinante Novas combinaes do DNA criadas in vitro
Plasmdeo

Passam de uma bactria para outra

Duplicam-se independentemente do DNA da bactria

Constituio Molecular do Plasmdeo

DNA do ORGANISMO GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG

- Origem de replicao (Replicar na bactria) - Marcadores de seleo (Genes que conferem resistncia antibitico)

Plasmdeo Digesto com EcoRI

G CTTAA

EcoRI

AATTC G

G CTTAA

AATTC

- Stios de restrio (cortes e ligao do DNA de interesse)

AATTC G G CTTAA

Permite insero de fragmento de DNA de ~15 kb de DNA

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Plasmdeo contendo DNA exgeno

Bacterifagos
Vrus bacterianos com molcula de DNA bifilamentar

Infectam E.coli
DNA viral DNA Bactria

Replicam-se
Ciclo Ltico Plasmdeo Ciclo Lisognico

Produzem novos vrus e cpias do DNA inserido

Transformao
Mtodos: - Precipitao com Cloreto de Clcio - Eletroporao

Adequado para clonagem de fragmentos de DNA humano de at 20kb

Cromossomos Artificiais de Bactria (BACs) e Leveduras (YAC)

Cosmdeos

Capacidade de inserir fragmento maior de DNA: ~100 a 300 kb Estrutura especial:

Vetores desenvolvidos Um brao: telmero, centrmero e marcador de seleo

Como um plasmdeo

Estrutura de bacterifago lambda para embalar grande pedaos de DNA em capas de protenas

Clonagem de fragmentos de ~ 45 kb

Um brao: telmero e marcador de seleo

Braos ligado ao DNA de interesse digerido com EcoRI transferido para o hospedeiro [E.coli (BAC) ou Saccharomyces cerevisae (YAC) ]

Escolha dos Vetores

Entre os principais fatores: Tamanho do fragmento a ser clonado

Construo de Bibliotecas
Biblioteca = Conjunto de clones de bactrias ou leveduras que contem vetor com fragmentos de DNA inseridos

Plasmdeo Fagos Cosmdeos BAC YAC

~4.000pb ~20.000pb
Biblioteca genmica: clones contendo fragmentos de DNA genmico

~40.000pb
Biblioteca de cDNA (DNA complementar)

~200.000pb ~400.000pb
* cDNA obtido de RNA mensageiro por transcrio reversa

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RNA Mensageiro Processado Fluxo da Informao Gnica Transcrio Reversa

DNA
Transcrio

cDNA
Enzima Transcriptase Reversa
Processamento Pstranscricional

DNA
Transcrio

RNAm
Traduo

RNA

Processamento Ps-transcricional

RNAm

Traduo

Protena

*Induzida in vitro

Protena

Processamento do RNAm xons: contm seqncias codificantes (cdons) ntrons: seqncias intercalares no codificantes Transcritas e retiradas (splicing)
Transcrito Primrio
1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon

Biblioteca de cDNA

Splicing
RNAm 1 2 3 4 5

Clones contm informao codificadora (RNAm) sem introns Genes mais expresso em tecido especficos mais cpias na biblioteca Vetores especficos induo da expresso gnica (Biotecnologia)

Como encontrar uma sequencia especfica de DNA ou cDNA na biblioteca? Sondas

Seqncias de DNA sintticas - complementares seqncia de DNA de interesse Marcadas com composto qumico: radioativo (32P), corante fluorescente

Pareamento da sonda Especfico para seqncia complementar

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Mtodos de Anlise dos cidos Nuclicos

Clonagem Molecular isolamento e multiplicao dos fragmentos de DNA ou cDNA especficos Mutaes Associadas a Doenas Polimorfismos Padro Anormal de Expresso Gnica Sequenciamento Genmico Etc

Metodologias de Anlise dos cido Nuclicos

Anlise das Sequncias (?)

Mtodos Especficos de Anlise do DNA ou cDNA in vitro

1) Transferncia de Southern (Southern Blotting) Tcnica desenvolvida na dcada de 1970

Visualizao Esquemtica da Metodologia de Southern blotting

Anlise de Sequencia Especfica de DNA ou cDNA Princpio: DNA Isolado

(paciente, organismos, bilbiotecas)

Edwin Southern

Disgesto do DNA com Enzima de Restrio

Eletroforese em Gel de Agarose

Transferncia para Membrana

Digesto com Enzima de Restrio

Eletroforese

Hibridao com Sonda de Sequencia Conhecida

Transferncia

Revelao da Hibridao

Hibridao com Sonda Especfica

Separao da Membrana

Aplicao em Gentica Mdica

Mutao conhecida DNA normal - hibridao Utilizar sondas especficas DNA com mutao: ausncia de hibridao

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2) Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) - 1986

Reao em Cadeia da Polimerase

Amplificao enzimtica de DNA Produz grande quantidade de cpias - fragmento especfico de DNA Componentes da Reao: Mquinas de PCR ou Termocicladores Reagentes: Enzima Taq Polimerase Primers seqncias pequenas de DNA (18 a 25 pb) - sintetizadas dNTP matria prima para construo da fita de DNA (dATP, dTTP, dGTP,dCTP Amostra de DNA

Papel do Termociclador

Denaturao 94 C

Extenso 72 C

Pareamento 55C a 68C

Grfico da PCR

Anlise dos Resultados da PCR Gel de eletroforese

Plateau

[ ] de DNA

n. de ciclos
Colorao Brometo de Etdeo Excitao em Luz UV

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4) Sequenciamento de DNA (1975-1977)

Sequenciamento de DNA
Sequenciamento de Sanger Determinao da seqncia do fragmento clonado ou amplificado por PCR
Fred Sanger

Componentes da Reao:

Anlogos qumicos dos nucleotdeos: ddATP,ddTTP, ddCTP,ddGTP

Incorporao inibe Taq Polimerase e interrompe a amplificao

Primer ou iniciador Taq Polimerase cpia Fita de DNA molde

Deoxirribonucleosdeo trifosfato

Dideoxirribonucleosdeo trifosfato

Sequenciamento Manual

Permite extenso pela Taq Pol

Impede extenso pela Taq Pol

Deoxirribonucleosideos normais

Pequena quantidade de dideoxirrubonicletdeos

Incorporao do ddTP bloqueia extenso

Sequenciamento Automtico (1986)

2001 Rascunho do Sequenciamento do Genoma Humano

Concluso do PGH em 2003

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5) Microarrays
Dado Biolgico (in vitro)

Metodologia de Anlise em Larga Escala

Avaliao simultnea da expresso de milhares de genes

Computador (in silico)

Rob

Milhares de Sequencias de DNA depositadas perfil de expresso

Deposita pequenos fragmentos de DNA em spots (10-200 m) numa lmina

Cada spot contm sequencias de DNA complementares a um cDNA (mRNA do gene especfico)

Princpio dos Estudos de Expresso Gnica por Microarrays Tecido Normal e Tecido Alterado (Tumor)

Leitura pelo scanner

Marcao com fluorescncias de cores diferentes

Correlao: - Hibridao (DNA spot - cDNA) x Nvel de Expresso Abundncia do cDNA (Tecido Normal x Alterado) Assinatura Molecular = Padro de Expresso

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Bandamento GTG

Mtodos de Citogentica e Cito-Molecular

46, XY

Procedimento Utilizado em Anlise Citogentica

Cultura de Linfcitos *Fitoemaglutinina: estimulador mittico

* Colchicina: interrompe mitose na metfase

* Soluo Hipotnica: disperso dos cromossomos

Sistema Ikaros de Anlise Digital de Cromossomos

Mtodos Citogenticos Especiais Bandamento de Alta Resoluo Colorao com Giemsa Anlise: Cromossomos -Prfase ou Pr-Metfase - 550 a 850 Prbandas Metfase 350 -550 bandas

Bandamento C - Regies centromricas heterocromatina constitutiva - Corante - Giemsa tratamento com hidrxido de sdio - Distino dos cromossomos 1, 9, 16 e Y

* Heterocromatina constitutiva densamente condensada DNA repetitivo

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6) Hibridao in situ com Fluorescncia (FISH)

FISH
Utilizao de Sondas de DNA capazes de hibridar com DNA contido dentro dos cromossomos

Cito-molecular
Caractersticas e utilidades Determinar a presena ou ausncia de seqncias especficas de DNA Detectar alteraes submicroscpicas

Aplicao dos Mtodos de Anlise Molecular no Estudo de Alteraes Citogenticas

Sondas marcadas com fluorescncia - hibridao com DNA Sondas seqncias de genes ou locus especficos cromossomos inteiros Hibridao clulas em metfase ou intrfase (sem cultura celular)

FISH

Utilizao da Metodologia de FISH no Diagnstico de Alteraes Cromossmicas Numricas - FISH clula intrfase - Sondas para genes ou locus especficos

Azul = cr 18 Verde = X Vermelho = Y

Azul= cr 18 Verde = X

Azul = 18 Vermelho = cr 21

Utilizao da Metodologia de FISH no Diagnstico de Alteraes Cromossmicas Estruturais Caritipo de Paciente com Sndrome Velocardiofacial (VCF)

FISH Sondas especficas para cromossomo 22 - Mar (CTL) - 22q

VCF

Translocao Deleo 22q11

Perda de Fragmento 22q Translocao t (2;22) - Deleo

Translocao t(2;22)
Huber et al., (2007) Huber et al., (2007)

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Utilizao da Metodologia de FISH no Diagnstico de Alteraes Cromossmicas Estruturais FISH com sondas para genes ou locus especficos

FISH com Sondas para Cromossomos Inteiros

WCP Whole Chromosome Probes

Translocao cromossomo16 Sondas: 16p e 16q

Translocao t(17;18) Sondas WCP17 e WCP18

SKYSKY- Spectral Karyotyping Fluorocromos diferentes deteco simultnea de mltiplas sondas Caritipos complexos Identificao de cromossomos marcadores

Utilizao da Metodologia de SKY no Diagnstico de Alteraes Cromossmicas Estruturais Complexas

Ferramentas de Gentica Molecular e a Biotecnologia

Utilizao na Terapia e Tratamento de Doenas

Caritipo Cncer de Mama

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Biotecnologia

Fundada em 1976

Avanos no Conhecimento de Manipulao dos cidos Ncleicos

Aprimoramento das Metodologias - Molculas de DNA Recombinantes

Potencial Industrias Farmacuticas Produo de protenas, hormnios, etc..- deficientes em doenas humanas

Primeira aplicao da biotecnologia para uso em humanos - 1982

Enzimas Recombinantes Tratamento de Doenas Genticas

Ex: Cerezyme (Genzyme) Reposio da Enzima Glicosidase cida Pacientes com Sndrome de Gaucher

Primeira Insulina Recombinante - Produo Industrial

Aprovada pela FDA (Food and Drug Administration USA) Tratamento de Diabetes Comercializado por: Eli Lilly and Company

Ex: Replagal - Alfa agalsidase (Shire) Reposio da Enzima Alfa Galactosidase A Pacientes com Doena de Fabry

Aplicao das Ferramentas de Gentica Molecular na Terapia de Doenas Genticas

FIM

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