Sunteți pe pagina 1din 22

UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA

Cu titlu de manuscris C.Z.U.: 544.3 : 66.067 : 547.97

Alexei Baerle

STUDIU PRIVIND SEPARAREA ŞI STABILIZAREA

COLORANŢILOR ANTOCIANICI DIN ARONIA MELANOCARPA

Specialitatea 02.00.04 – Chimia Fizică

AUTOREFERAT

al tezei de Doctor în Chimie

Chişinău, 2006

Teza a fost elaborată în Catedra Chimie, Facultatea Inginerie şi Management în Industria Alimentară a Universităţii Tehnice a Moldovei

Conducător ştiinţific:

Vasile Guţanu, dr. hab. în Chimie, prof. univ., Universitatea de Stat din Moldova

Referenţi oficiali:

1. T. Lupaşcu, dr.hab. în Chimie, prof. univ. – Institutul de Chimie al A.Ş. R.M.

2. T. Isac, dr. în Chimie. – Universitatea de Stat din Moldova

Susţinerea publică a tezei va avea loc

în şedinţa consiliului ştiinţific specializat DH 30.02.00.04 din cadrul

Universităţii de Stat din Moldova Pe adresa: Chişinău, A. Mateevici, 60 (Blocul de studii IV al U.S.M.), aula

2006 ora

Teza de doctor şi autoreferatul pot fi consultate în bibliotecile Universităţii Tehnice a Moldovei şi a Universităţii de Stat din Moldova

Autoreferatul a fost expediat la

2006

Secretar ştiinţific al Consiliului Ştiinţific Specializat, dr. în Chimie,

Gonţa Maria

Autor

Baerle Alexei

1 Copyrights Alexei Baerle, 2006

CONSIDERAŢII GENERALE

Actualitatea temei: Conceptul de dezvoltare durabilă a societăţii include utilizarea eficientă şi deplină a surselor materiale de origine naturală. Această problema este extrem de importantă pentru Republica Moldova, fiind legată cu dezvoltarea agriculturii şi a industriei alimentare – ramuri strategice ale economiei naţionale. Gradul de prelucrare a materiei prime organice autohtone este mic, iar importul adaosurilor alimentari mai măreşte sinecostul producţiei. Adaosuri alimentari sintetici au calităţi nutritive dubioase, fiind alergeni, cancerigeni, etc. Înlocuirea acestora cu substanţe inofensive naturale este o problema strategică globală, legată de păstrarea sănătăţii şi a genofondului omenirii. Antocianii sunt coloranţi, caracteristici majorităţii fructelor şi legumelor. Ei posedă proprietăţi homeostatice, hipotensive, cardioprotectoare şi antitumorale. În Republica Moldova există o diversitate de surse vegetale, care ar putea servi pentru obţinerea antocianilor, dintre care una de perspectivă este scoruşul negru (Aronia Melanocarpa), drept depozit natural al substanţelor biologic active. Problema stabilităţii antocianilor este foarte actuală pentru industria alimentară. În literatura “pur chimică” acestei probleme sunt consacrate puţine

lucrări. Chimia fizică cu strategiile ei de cercetare permite de a studia diferite tipuri de obiecte şi sisteme, inclusiv şi cele naturale. Suportul puternic va aduce planificarea matematică a experimentului, care asigură cercetarea cantitativă, raţională şi multilaterală a sistemului şi aprecierea statistică a rezultatelor. Considerăm, că prezenta lucrare va contribui în măsura sesizabilă la apropierea fizico-chimiştilor către problemele industriei alimentare, concomitent, va permite tehnologilor să ţină cont de fizico-chimismul proceselor, care au loc cu antociani şi în prezenţa acestora în sistemele model şi, îndeosebi, în cele reale. Obiectivele investigaţiilor: Obiectivul cadru constă în cercetarea influenţei cantitative a mai multor factori asupra stabilităţii antocianilor. Atingerea acestui scop necesită realizarea următoarelor obiective operaţionale:

- Studierea influenţei factorilor chimici şi fizico-chimici asupra stabilităţii antocianilor în decursul tuturor etapelor de prelucrare a acestora;

- Elaborarea metodelor noi de cercetare a antocianilor, accesibile pentru laboratoarele care nu dispun de echipamentul de înaltă performanţă;

- Cercetarea proceselor de separare a antocianilor de substanţe balast şi propunerea metodelor noi de obţinere a antocianilor în stare pură, cristalină;

- Cercetarea stabilităţii antocianilor în contextul proprietăţilor lor biochimice şi fizico-chimice antioxidante şi antiradicalice. Inovaţia ştiinţifică şi valoarea aplicativă a lucrării:

- a fost propus mecanismul, care elucidează aportul solvenţilor organici asupra stabilităţii antocianilor în timpul extracţiei şi depozitării extractelor;

- au fost cercetate proprietăţile cromatografice ale antocianilor din Aronia şi precizat profilul antocianic al fructelor;

2 Copyrights Alexei Baerle, 2006

- au fost elaborate două metode noi de analiza separată ale speciilor hidrosolubile şi a agliconilor antocianici, care în perspectivă pot fi utilizate în condiţii de câmp, în laboratoare industriale, de cercetare şi didactice;

- a fost evidenţiat fenomenul catalizei intensive acide a glucozidelor antocianice până la aglicon în faza sulfocationitului în H-formă, care elucidează influenţa structurii sorbentului asupra stabilităţii antocianilor;

- a fost descoperit fenomenul sinergismului acido-alcoolic de desorbţie a antocianilor din faza sulfocationitului şi elucidate cauzele apariţiei lui;

- au fost elaborate metode noi, la nivel de invenţie, de obţinere a preparatelor antocianici în stare pură, cristalină;

- au fost cercetate proprietăţile reducătoare ale antocianilor, utilizând metoda nouă electrochimică, elaborata la Catedra Tehnologia Conservării a U.T.M. Au fost constatate proprietăţile antioxidante şi antiradicalice ale agliconului, respectiv, valoarea aplicativă a lui. Aprobarea lucrării la foruri ştiinţifice naţionale şi internaţionale:

Rezultatele au fost expuse şi discutate în cadrul conferinţelor internaţionale: a VI-a Conferinţa “Биоантиоксидант” (Moscova, 2002); I-ul Simpozion “Biochimie şi Biotehnologii în Industria Alimentară” (Chişinău, 2002); I-a Conferinţa Internaţională a Societăţii Chimice din Moldova “Achievements and Perspectives in the Modern Chemistry” (Chişinău, 2003); a XXVIII-a Conferinţa Naţională de Chimie (Vâlcea, România). Rezultatele de asemenea au fost expuse în cadrul Conferinţelor Tehnico-Ştiinţifice a Studenţilor şi Doctoranzilor U.T.M. (Chişinău, 2002, 2003); Conferinţei Tehnico-Ştiinţifice Jubiliare a Profesorilor, Doctoranzilor şi Studenţilor U.T.M. (2004). Invenţiile au fost apreciatele în cadrul salonului “Chiminvent-2005” (Iaşi) cu medalia de argint “Petru Poni”. Publicaţii: La tema tezei au fost publicate 13 lucrări ştiinţifice: 4 articole ştiinţifice, 2 brevete de invenţie, 7 rezumate. Structura şi volumul tezei: Teza este expusă pe 102 pagini dactilografiate şi este alcătuită de lista abrevierilor, introducere, analiza literaturii, descrierea metodelor de cercetare, discuţia rezultatelor experimentale şi concluzii. Bibliografia include 155 surse. Sunt prezentate adnotări în limbile română, engleza şi rusă. Lucrarea include 6 scheme, 20 figuri şi 25 tabele. Cuvinte cheie: antociani, planificarea matematică, separarea, stabilizarea, factori fizico-chimici, analiza cantitativă, schimbători de ioni, sinergismul de desorbţie, preparate cristaline, acţiunea antiradicalică.

CONŢINUTUL LUCRĂRII

Capitolul I. INTRODUCERE

Acest compartiment conţine argumentarea actualităţii temei abordate, obiectivele şi sarcinile investigaţiilor. Sunt reflectate noutatea ştiinţifică şi valoarea aplicativă a rezultatelor. Este indicată valoarea publicaţiilor ştiinţifice, în care a fost expus conţinutul tezei.

3 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Capitolul II. ANALIZA LITERATURII

II.1. Diversitatea şi unele proprieţăţi ale fenolilor vegetali Fenolii vegetali se împart în fenoli neflavonici, flavonoizi şi taninuri. Aceste substanţe determină în mare măsura gustul, aroma şi culoarea produselor vegetale, de asemenea manifestă proprietăţi farmacologice remarcabile. II.2. Clasificarea antocianilor Termenul “antocian” provine de la cuvintele “anthos” (floarea) şi “cyanos” (albastru). Pigmenţii cu structura flavilică se caracterizează printr-o diversitate naturală mare, amplificată datorită variaţiilor structurale în funcţie de pH şi de complexare.

OH

2 ' 3 ' 8 + O 7 4 ' 6 3 6 ' 5
2
'
3 '
8
+
O
7
4 '
6
3
6
'
5 '
5
4
inelul A
inelul B

I.

HO

II.

+ O OH HO O 1 6 O HO OH OH
+
O
OH
HO
O
1
6
O
HO
OH
OH

HO

Fig.1. I. Numerotarea cationului de flaviliu; II. 3-(1-O-glucozidă) de cianidină

II.3. Extracţia antocianilor din materii prime Tehnologia utilizată de extracţie trebuie să asigure extracţia cea mai amplă a produsului necesar, contaminarea minimă cu substanţe parazite, evitarea descompunerii enzimatice şi neenzimatice a extractului. II.4. Obţinerea preparatelor antocianice Metoda eficientă de purificare a antocianilor constă în folosirea cromatografiei de adsorbţie, inclusiv pe cationiţi. Cromatografia în stratul subţire se foloseşte pentru identificarea şi pentru separarea antocianilor. Cromatografia lichidă de performanţă înaltă (HPLC) oferă posibilitatea separării preparative ale antocianilor puri, însă, nu poate fi utilizată pentru obţinerea lor pe scara industrială. II.5. Stabilitatea antocianilor Stabilitatea antocianilor este influenţată interdependent şi complex de aciditatea soluţiei, temperatură, lumină, conţinutul O 2 dizolvat, polifenoli, glucide, SO 2 , etc. Stabilitatea în mediul acid creşte în şirul acetilderivaţii > glucozide > aglicon. În mediul bazic se destabilizează însăşi agliconul. Stabilitatea termică scade cu reducerea numărului şi volumului substituenţilor al sistemului flavilic. II.6. Metodele spectroscopice de cercetare Spectrele electronice (UV-Vis) conţin două benzi informative: I (λ = 220 – 280 nm) şi II (λ = 465 – 550 nm). Interpretarea lor trebuie să ţină cont de copigmentare. Spectroscopia de vibraţie (IR) poate fi folosită pentru identificare a agliconilor şi a derivaţilor acetilaţi. Rezonanţa magnetică nucleară (RMN) este importantă pentru descifrarea structurii fine ale antocianilor. Spectroscopia de masă se foloseşte pentru determinarea maselor molare ale substanţei şi ale intermediarilor, obţinuţi la degradarea acesteia.

4 Copyrights Alexei Baerle, 2006

II.7. Importanţa antocianilor în sistemele “in vivoAntocianii măresc randamentul fotosintezei, reglează schimbul elementelor nutritive. Proprietăţile antioxidante şi antiradicalice oferă antocianilor rolul de fitoconservanţi. Ei provoacă scăderea masei trombocitelor şi mărirea timpului de coagulare a sângelui. Antocianii suprimă dezvoltarea celulelor cancerice. Puterea inhibatoare a extractelor vegetale asupra celulelor de cancer se micşorează cu creşterea stabilităţii antocianilor din plantele respective. II.8. Caracteristica biochimică a speciei Aronia melanocarpa Aronia Melanocarpa Elliot (engl: chokeberry, mountain ash, rusă: рябина чёрноплодная) prezintă un arbust din familia Roseaceae, care se caracterizează prin diversitatea şi concentraţia sporită a substanţelor biologic active. Are un profil antocianic simplu, însă există divergenţe în descifrarea lui definitivă.

Capitolul III. PARTEA EXPERIMENTALĂ

Au fost utilizaţi reactivii comerciali clasificaţi “Ч.Д.А.” şi “О.С.Ч.”, cei de tipul “Чşi “Т” au fost purificaţi suplimentar. Purificarea cationiţilor a fost

efectuată până la înlăturarea urmelor de Fe 3+ . Probele cationiţilor în forme flavilice

au fost păstrate la t = – 20°C. Au fost preparaţi reactivi cu compoziţia originală:

A.) Diluant – soluţie , ce conţine etanol (minimum 85 % (v)) şi HCl 1 % (m), se obţine prin adăugarea a 4 mL HCl(conc.) la 200 mL etanol, sau prin adăugarea 20 mL soluţie de 4M HCl la 180 mL etanol.

B.) Piroclorură se obţine prin dizolvarea a 10 g de pirocatehol în soluţie de 1M HCl, până la volumul 100 mL. C.) Amestecuri pentru Cromatografia în Stratul Subţire – au fost pregătiţi direct

în cameră cromatografică nemijlocit înaintea măsurărilor.

Controlul pH a fost efectuat în regim automat de termocompensaţie, cu electrodul

saturat de AgCl/Ag de referinţă, electrodul ЭСЛ-43-07 de măsurare.

Reglarea vitezei volumetrice de curgere a fost realizată cu micropompa MC–760.1. Termostatarea probelor a fost efectuată în termostat, înzestrat cu hidropompa şi

cu un termometru de precizie (±0.1°C); în baia de apa cu termoreleu, ±3°C. Utilizarea metodei factorilor polivariabili a permis variaţia concomitentă

a tuturor parametrilor, care influenţează proprietăţile sistemului. Optimizarea condiţiilor a fost realizată prin metoda mişcării pe gradient. Au fost utilizate metodele de cercetare UV-Vis, IR, RMN, spestroscopică

de masă, metodele de cercetare a proprietăţilor antioxidante şi antiradicalice.

Capitolul IV. REZULTATE ORIGINALE ŞI DISCUŢIA LOR

IV.1. Modelarea matematică şi optimizarea procesului de extracţie Degradarea antocianilor în procesul obţinerii produselor alimentare se reflectă negativ asupra proprietăţilor organoleptice ale acestora. Stabilizarea antocianilor trebuie să aibă un raţionament economic, prin reducerea cheltuielilor energetice şi optimizarea procesului tehnologic. Noi am cercetat influenţa diferitor

5 Copyrights Alexei Baerle, 2006

factori asupra extracţiei antocianilor şi, concomitent, a altor substanţe biologic active: zaharurilor reducători, polifenolilor, substanţelor uscate. IV.1.1. Extracţia cu etanol – acetonă – eter dietilic – HCl – apă (I) Dintr-o singură partidă de fructe dezgheţate şi strivite de Aronia au fost pregătite concomitent toate probele de pulpă, fiind asigurată repartizarea uniformă a fracţiei solide şi a sucului între probe. Probele au fost imediat etanşate şi congelate. Extractele obţinute au fost diluate până la volumul de 250 mL şi centrifugate. Tabelul 1. Codificarea şi limitele de variaţie ale parametrilor de influienţă

Cod

Factorul de influenţă

Minim (–)

Centrul

Maxim (+)

X

1

Concentraţia etanol,

% (v)

20

30

40

X

2

Concentraţia HCl,

% (m)

1.0

1.5

2.0

X

3

Temperatura, °C

40

45

50

X

4

Concentraţia acetonei,

% (v)

0

5

10

X

5

Volumul extractantului, mL

75.0

87.5

100

X

6

Concentraţia (C 2 H 5 ) 2 O,

% (v)

0

5

10

X

7

Durata de extracţie,

min

30

60

90

Au fost cercetate următoarele răspunsuri ale sistemului: Y 1 – masa antocianilor extractaţi, mg/g; Y 2 – masa substanţelor uscate, mg/g; Y 3 – masa zaharurilor reducători, mg/g. Valorile răspunsurilor au fost raportate la 1 g de fructe. În baza datelor obţinute au fost calculate ecuaţiile regresionale şi apreciate valorile criteriilor de validitate b critic :

Y 1 = 0.855 + 0.030X 1 0.025X 2 + 0.081X 3 + 0.068X 4 +

+ 0.053X 5 + 0.161X 6 + 0.026X 7

b critic = 0.019

{IV.1.1.}

Y 2 = 129.9 + 2.5X 1 – 7.3X 2 + 15.4X 3 + 3.0X 4 +

+ 1.1X 5 + 10.8X 6 + 3.0X 7

b critic = 1.2

{IV.1.2.}

Y 3 = 42.7 + 0.7X 1 + 0.7X 2 + 1.5X 3 + 0.8X 4 +

+ 0.8X 5 + 0.8X 6 + 0.5X 7

b critic = 1.1

{IV.1.3.}

În ecuaţiile {IV.1.1.} şi {IV.1.2.} coeficienţii pe lângă X sunt semnificativi, adică, mai mari, decât b critic corespunzător. Extracţia antocianilor şi a substanţelor uscate (SU) este influenţată pozitiv de temperatură, de concentraţiile eterului şi ale acetonei. Influenţa pozitivă a eterului este surprinzătoare, ţinând cont, că antocianii sunt practic insolubili în acest solvent. Fenomenul influenţei pozitive poate fi explicat prin faptul, că eterul contribuie la agitarea intensă a probei în timpul extracţiei. Nu sunt excluse şi interacţiunile sinergetice între solvenţi, care, însă, nu pot fi apreciate conform matricei de planificare elaborate. Influenţa negativă a HCl asupra extracţiei SU poate fi explicată prin formarea compuşilor volatili şi prin efectul deshidratant al HCl în timpul determinării SU. Ecuaţia {IV.1.3.} denotă, că extracţia zaharurilor reducători depinde semnificativ doar de temperatură. Valorile celorlalţi factori sunt mai mici, decât b critic , ceea ce indică atingerea stării “aproape staţionare” a suprafeţei de răspuns. În cadrul optimizării răspunsului Y 1 se observă o creştere moderată a răspunsului Y 3 , fără atingerea maximumului, ceea ce denotă, că influenţa pozitivă a temperaturii se datorează hidrolizei polizaharidelor. În schimb se ating valorile maxime ale răspunsurilor Y 1 şi Y 2 . Rezultatele

6 Copyrights Alexei Baerle, 2006

experienţelor mişcării pe gradient confirmă corectitudinea planificării etapei de cercetare, de asemenea faptul, că ecuaţiile {IV.1.1.} – {IV.1.3.} sunt adecvate. IV.1.2. Extracţia cu sistemul etanol – HCl – apă (II). Am observat, că în spectrele electronice ale extractelor apar picuri suplimentare, ce indică degradarea componenţilor. De asemenea există necesitatea de a obţine extracte de uz alimentar, care nu ar conţine reactivi toxici, cum sunt eterul dietilic şi acetonă. Acestea ne-au determinat să efectuăm experienţa numai în prezenţa etanolului. Intervalul de variaţie a fost ales în baza rezultatelor optimizării cu sistemul I. În extractele obţinute au fost determinate răspunsurile : conţinutul total de coloranţi Y 4 , mg/g; concentraţia compuşilor fenolici Y 5 , mg/g; substanţelor uscate Y 6 , mg/g. Extractele diluate au fost trecute prin H-cationit, şi după diferenţa a densităţilor optice a fost apreciată cantitatea coloranţilor în forma sărurilor de flaviliu Y 7 , mg/g. În filtratul prin cationit a fost determinat conţinutul substanţelor fenolice Y 8 , mg/g . Reieşind din rezultatele experienţelor au fost calculate ecuaţiile regresionale:

Y 4 = 3.174 + 0.160X 1 + 0.014X 2 + 0.083X 3 + 0.014X 4 +

+ 0.054X 5 + 0.029X 1 X 2 + 0.007X 2 X 3

b critic = 0.093

{IV.1.4.}

Y 5 = 7.419 + 0.365X 1 + 0.051X 2 + 0.181X 3 – 0.067X 4

– 0.064X 5 + 0.181X 1 X 2 + 0.125X 2 X 3

b critic = 0.184

{IV.1.5.}

Y6 = 170.7 + 2.0X 1 – 0.3X 2 – 0.3X 3 + 0.1X 4 +

+ 0.2X 5 + 0.6X1X 2 + 0.1X 2 X 3

b critic = 1.5

{IV.1.6.}

Y 7 = 2.241 + 0.088X 1 – 0.021X 2 + 0.023X 3 + 0.014X 4 +

– 0.067X 5 + 0.012X 1 X 2 + 0.040X 2 X 3

b critic = 0.076

{IV.1.7.}

Y 8 = 6.424 + 0.448X 1 + 0.229X 2 + 0.059X 3 – 0.067X 4

+ 0.027X 5 + 0.120 X1X2 + 0.109X2X3

b critic = 0.202

{IV.1.8.}

Ecuaţiile {IV.1.4.} – {IV.1.8.} demonstrează, că centrul experienţei se află în regiunea “stării aproape staţionare”. Observăm, că sistemul de extracţie II este mai eficient, decât sistemul I. Acest fapt confirmă odată în plus corectitudinea planificării experimentului şi rezultatele ascensiunii după gradient în sistemul I şi interpretarea lor, permiţând de a efectua optimizarea răspunsurilor Y 4 – Y 8 , doar variind temperatura extragentului. Valorile optime ale factorilor X 2 – X 5 corespund centrului experimentului de modelare: X 2 = 45 % (v), X 3 = 50 min., X 4 = HCl 0.45 % (m), X 5 = 4.5 mL/g. Valoarea gradientului temperaturii a alcătuit X 1 = + 4 °C. Condiţiile optime pentru răspunsurile Y 4 , Y 6 şi Y 7 se realizează în apropierea experienţei nr. 10 II , la temperatura 70°C. Răspunsurile Y 5 şi Y 8 ating valorile maxime la 82°C. Aceasta înseamnă, că creşterea conţinutului substanţelor fenolice în extract nu corespunde creşterii concentraţiei antocianilor fotocolorimetric activi. Prezintă interes comparaţia valorilor optime ale factorilor de influenţă, obţinute de noi pentru antocianii din Aronia, cu valorile respective pentru antocianii din Hibiscus Sabdariffa ( etanol 70% (v), HCl 4% (m), V extr. /m probă = 10.0 mL/g ). Cauzele posibile ale acestor divergenţe substanţiale sunt surse vegetale diferite şi în măsura mai mare, lipsa studierii influenţei factorului de temperatură în lucrarea respectivă. Ultima presupunere se confirmă cu datele experimentale privind optimizarea extracţiei antocianilor din tescovina de struguri, conform cărora concentraţia optimă a etanolului la t = 30°C este 70 % (v).

7 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Prezenţa maximumelor de extracţie la 70-73 °C poate să indice concurenţă proceselor de extracţie a antocianilor şi de descompunere a lor. La temperaturi mai mari de 66 °C în cromatogramele extractelor se evidenţiază spotul agliconului, adică, creşte ponderea produsului de hidroliza în extract (Figura 2).

t-ra 20°C t-ra 66 °C t-ra 74 °C cianidină

cianidină

forme native monomerice

t-ra 74 °C cianidin ă cianidin ă forme native monomerice 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50
0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60

Piroclorură

Fig.2. Cromatogramele obţinute prin eluarea ascendentă pe hârtie.

Valorile Y 4 , Y 6 şi valorile Y 1 , Y 2 reflectă aceeaşi parametri de ieşire, respectiv, în cadrul utilizării sistemului extractant I şi II. Cantitatea antocianilor, extraşi cu sistemul II este considerabil mai mare, decât cu sistemul I, care conţine eter dietilic şi acetonă. Am demonstrat astfel, că acetona şi eterul dietilic au acţiune controversă: măresc eficacitatea extracţiei şi, concomitent, contribuie la destabilizarea antocianilor.

IV.2. Influenţa solvenţilor organici asupra stabilităţii antocianilor IV.2.1. Solvenţi destabilizatori. Expunerea îndelungată a extractelor, ce conţin acetona şi eterul dietilic la temperatura camerei, duce la degradarea vizibilă a antocianilor, care se exprimă

prin apariţia precipitatelor de culoare cafenie în prezenţa acetonei şi prin decolorarea extractelor, care conţin eter dietilic. Merită să fie cercetată

influenţa acestor solvenţi, folosiţi tradiţional pentru

obţinerea şi purificarea prepa- ratelor antocianici. În spectrele

electronice de rezoluţie joasă se observă „prăbuşirea” picului la 490 nm, care corespunde descompunerii flaviliului. Spectrele, obţinute la 50˚ C, au o deosebire considerabilă: conco- mitent cu scăderea densităţii optice la 490 nm, se observă

A 0.5 0.4 1 0.3 2 0.2 0.1 3 0.0 300 400 500 600 nm
A
0.5
0.4
1
0.3
2
0.2
0.1
3
0.0
300
400
500
600
nm
Fig.3. Spectrele UV-Vis ale extractului
antocianic cu C(acetonă) = 60 % (v), obţinute
la 50 °C: 1 – 0 ore; 2 - 24 ore; 3 – 48 ore.

8 Copyrights Alexei Baerle, 2006

apariţia picului la 440 nm, care corespunde produşilor de condensare a antocianilor. Viteza de degradare a antocianilor creşte odată cu creşterea concentraţiei acetonei. Analiza curbelor cinetice de degradare a antocianilor ne-a permis să determinăm ordinele globale de reacţie. În modul surprinzător, se observă abateri substanţiale de la valoarea ordinului global de reacţie, egal cu 1. Tabelul 2. Caracteristicile cinetice ale reacţiilor de degradare a antocianilor

Concentraţia acetonei,

% (v)

0%

20%

40%

60%

Solubilitatea oxigenului, Potenţialul redox, Ordinul de reacţie la 25˚ C Ordinul de reacţie la 50˚ C Timpul de înjumătăţire, 25˚ C, Timpul de înjumătăţire, 50˚ C, Energia de activare,

mg %

7.48

7.33

9.31

8.73

V

0,422

0,406

0,394

0,393

––

2.80

1.02

0.35

––

1.92

1.39

0.74

ore

~ 240

130

40

38

ore

~ 12

10

10

7

kJ/mol

95.9

82.1

44.4

54.2

Dependenţa ordinului de reacţie de temperatură şi de concentraţia acetonei denotă mecanismul complex al reacţiei de descompunere. Scăderea ordinului de reacţie la creşterea concentraţiei acetonei permite a presupune, că cinetica descompunerii este influenţată de reacţii radicalice. Evident, că cinetica procesului de degradare poate fi influenţată de concentraţia acetonei şi în modul indirect, prin intermediul altor factori, valorile cărora sunt dependente de compoziţia sistemului. În particular, se observă creşterea moderată a solubilităţii oxigenului în sistemul acetonă-apă cu creşterea concentraţiei acetonei. De asemenea am demonstrat, că în sistemul etanş distrugerea antocianilor are loc mai lent, decât în extractele de aceiaşi compoziţie, însă cu accesul liber de aer. La hidroliza glucozidelor de cianidină şi separarea ulterioară a cianidinei cristaline, are loc distrugerea rapidă a cianidinei din soluţia supranatantă, cu formarea produşilor, asemănători celor, care se obţin în prezenţa acetonei. În aceste condiţii soluţie conţine glucoză, adică, o aldoză. Presupunem, că efectul distrugător al acetonei şi al glucozei asupra antocianilor se datorează grupei funcţionale –CO– cu capacitatea remarcabilă de condensare. Influenţa eterului dietilic asupra stabilităţii antocianilor este chiar simplă. Nu se formează precipitatele ale produşilor cafenii de degradare-condensare, soluţia devene incoloră. Scăderea rapidă liniară a densităţii optice presupune ordinul zero al reacţiei, ce serveşte drept un indice al desfăşurării reacţiilor radicalice. Mecanismul radicalic de degradare a glucozidelor în soluţii apoase se manifestă în prezenţa urmelor de alcool izoamilic. La agitarea sistemului aqua- organic, care conţine acest alcool, faza apoasă se satură cu aer. Descompunerea antocianilor în fazele apoase astfel obţinute se desfăşoară rapid (cca. 18 ore), până la soluţii incolore. Aşadar, în prezenţa oxigenului alcoolul izoamilic manifestă acelaşi comportament faţa de antociani, ca şi eterul dietilic.

IV.3. Transformările antocianilor în faza solidă a adsorbantului IV.3.1. Particularităţile cromatografice ale antocianilor din Aronia. La trecerea extractelor antocianice prin cationit o bună parte din coloranţi se absorb

9 Copyrights Alexei Baerle, 2006

rapid. Filtratul, trecut prin cationit, capătă o nuanţă portocalie. În spectrele electronice ale lui se observă micşorarea substanţială a extincţiei sărurilor de flaviliu. La diluarea filtratelor cu apă se formează sisteme cu opalescenţă, din care la centrifugarea sau sedimentarea îndelungată se separă precipitate colorate în roşu- portocaliu. Astfel, o parte a antocianilor se află în extract în forma care nu se absoarbe, “pasivă”. Aceste forme se evidenţiază prin cromatografierea extractelor crude (I), filtratelor prin cationit (II) şi eluatelor de pe cationit (III). Pentru a clarifica numărul real de specii din profilul antocianic al Aroniei, am utilizat diferite combinaţii a eluanţilor. Eluantul “butanol-acetiqueevidenţiază 3 spoturi, ce semnalează despre prezenţa speciilor (Glu–Glu)–Agl sau (Glu–Ac)–Agl. Totodată, 3,5-diglucozida trebuie să asigure apariţia a 4 spoturi cu acest eluant. Soluţia dilemei s-a dovedit a fi simplă. În urma cromatografierii preparatului pur de cianidină se ivesc 2 spoturi separate a aceleiaşi substanţe. Evident, că efectul în cauză apare ca rezultat al reducerii timpului de eluare prin substituirea hârtiei Whatmann cu hârtie de filtru cu o densitate scăzută, şi datorită compoziţiei critice a fazei mobile. Soluţia apoasă de acid citric, folosită în calitate de eluant, de asemenea evidenţiază lipsa 3,5-diglucozidei cianidinei. Astfel, este demonstrat cu certitudine, că glucozidele antocianice ale speciei Aronia Melanocarpa sunt 3-monoderivaţii cianidinei. IV.3.2. Transformarea antocianilor polimerici sub influenţa cationitului. La expunerea îndelungată a extractelor formelor pasive ale antocianilor pe H-sulfocationitul proaspăt, are loc adsorbţia acestor forme. Fiecare porţiune nouă de cationit, adăugată în faza lichidă, adsoarbe aceeaşi cantitate de antociani. Capacitatea de sorbţie a cationitului în aceste condiţii este aproximativ de 100 de ori mai mică, decât capacitatea de sorbţie a cationitului faţă de cianidina pură. Structura polimerică a formelor “pasive” nu le permite să difuzeze în interiorul granulelor cationitului, ce duce la scăderea uriaşă a capacităţii de sorbţie. Desorbţia antocianilor “pasivi” duce la apariţia spotului agliconului în eluat. Aceasta indică, că formele respective suferă transformarea în formă activă (aglicon) sub influenţa grupelor funcţionale ale cationitului. Toate încercările de a obţine spoturile glucozidelor în eluat de pe cationit după saturarea lui cu formele “pasive" au eşuat. Însă s-a stabilit cu certitudine, că în faza cationitului glucozidele se transformă în aglicon, cu o viteza de 10 ori mai mare, decât cea a scindării polimerilor antocianici în monomeri. Reieşind din acestea, am propus mecanismul transformărilor reciproce ale speciilor antocianice în prezenţa sulfocationitului. IV.3.3. Particularităţile hidrolizei glucozidelor în faza solidă a sulfocationitului. Aflându-se în faza sulfocationitului, glucozidele suferă hidroliza până la aglicon. În acelaşi timp, formarea agliconului în soluţii începe cu viteze considerabile doar la temperaturi mai mari de 60 °C. De pildă, la 25 °C gradul de hidroliza în faza cationitului atinge 50 % în 7 zile. La aceleaşi concentraţii ale H + în faza lichidă formarea agliconului la 25 °C nu se observă în decurs de câteva luni. Mai mult ca atât, la temperatura camerei în soluţii se observă polimerizarea lentă a antocianilor în forme condensate, depistabile cromatografic. Hidroliza se desfăşoară foarte rapid în H-cationitul îmbibat cu apă, terminându-se în 2 – 3 zile.

10 Copyrights Alexei Baerle, 2006

În cazul probelor uscate, hidroliza se încetineşte pe parcursul termostatării. S-a demonstrat, că procesul de hidroliză a antocianilor în interiorul fazei sulfocationitului se datorează în exclusivitate apei libere. Procesul de hidroliza în faza cationitului, care conţine doar apă legată, nu este stopat complet, ce se datorează, probabil, echilibrului dinamic de hidratare-deshidratare a grupelor funcţionale. O concluzie importantă este aceea, că cationitul uscat în H-formă poate servi drept “depozit” al antocianilor.

IV.4. Analiza cantitativă separată a antocianilor hidrosolubili şi a agliconului. Transformarea glucozidelor în aglicon prezintă interes pentru cercetarea stabilităţii antocianilor în produsele alimentare. Obiectivul nostru principal a constituit elaborarea şi evaluarea metodei, care ar include procedee simple, ieftine şi rapide de analiza cantitativă separată, şi care ulterior ar putea fi aplicată cu succes în laboratoarele industriale, didactice şi de cercetare din ţara noastră. IV.4.1. Analiza prin metoda cromatografică pe hârtie. Spre deosebire de procedeele cunoscute, unde se utilizează hârtia Whatmann, am utilizat hârtia ordinară de filtru. În calitate de eluant am folosit pentru prima dată amestecul de pirocatechol : HCl 1M (1 : 9 (m : v); piroclorură), care s-a demonstrat ca excelent stabilizant al componenţilor pe cromatogramă, şi care asigură separarea definitivă a speciilor. Cromatografierea are loc 1.5 – 2.5 ore până la separarea completă. Cromatograma se usucă la t < 40 °C. Din ea se taie 3 benzi cu dimensiuni egale:

de cianidină (C) (R f = 0.35–0.41), de glucozide (G) (R f = 0.56–0.62) şi “sterilă(S) în zona frontului solventului. Benzile se extrag 10 min. cu porţiuni a câte 5 mL de diluant. Extractele obţinute se centrifughează pentru eliminarea fibrelor de hârtie. Densitatea optică a soluţiilor C şi G se măsoară faţă de soluţia S. Raportul densităţilor optice (D C – D S ) / (D G – D S ) prezintă raportul aglicon / glucozide în amestecul analizat, reflectând gradul de transformare a glucozidelor în aglicon. Analizei pot fi supuse doar soluţii foarte concentrate ( > 500 mg/L ), astfel ca densităţile optice ale extractelor C şi G să se încadreze în limitele 0.2–0.4. IV.4.2. Analiza prin extracţia fracţionată a agliconului. În scopuri extragerii agliconului din faza apoasă se utilizează alcoolii “graşi”, de pildă, izoamilic. Noi am observat, că acesta formează emulsii U/A stabile, stratificarea cărora necesită cca. 0.5 ore. Pentru a reduce timpul stratificării, am modificat compoziţia fazei organice, adăugând solvenţi apolari. Eterul de petrol, benzenul, xilenul şi heptanul au redus timpul de spargere a emulsiilor iAmOH / Apă până la 5 s – 3 min. Pe neaşteptate am observat, că primii trei solvenţi, chiar în cantităţi mici, “resping” agliconul din faza organică în faza apoasă, ceea ce complet nu corespunde scopului abordat. Pentru heptan efectul în cauză a fost observat la concentraţii > 20 % (v). Concentraţia heptanului < 10 % (v) nu contribuie la spargerea rapidă a emulsiei. Raportul alcool izoamilic : heptan = 85 : 15 ( v : v ), notat iAmOH-Heptan, a dovedit să fie optimal – în acest caz separarea rapidă a fazelor este îmbinată cu eficacitatea extracţiei agliconului în faza organică. Valoarea experimentală a constantei de repartiţie K Org/Aq (Cy) este de 20±1 unităţi. Acest fapt permite micşorarea substanţială a volumului fazei organice, respectiv

11 Copyrights Alexei Baerle, 2006

reducerea costului analizei. Trebuie de ţinut cont, că la concentraţiile etanolului de cca. 10 % (v) se observă trecerea considerabilă a glucozidelor în Org şi a agliconului în Aq. La concentraţiile etanolului > 15-20 % se formează faza aqua–

etanolică, unde sunt concentraţi antocianii, şi faza “sterilă” heptanică. Proba, care conţine antociani, se diluează cu soluţie 0.2 M HCl astfel, ca soluţia rezultantă să conţină cel mult 5 % (v) etanol şi cca. 17 – 55 mg antociani într-un litru. În această soluţie se determină concentraţia totală de antociani (σ). 15 mL soluţie se trec în pâlnia separatoare cu capacitatea de 50 mL şi se extrag cu 3

mL amestec iAmOH-Heptan. Proba se agită intens, apoi se lasă să se stratifice.

Extracţia şi separarea fazelor se repetă încă de 2 ori, obţinându-se faza apoasă,

care nu conţine aglicon. În această faza se determină conţinutul glucozidelor (γ).

Conţinutul agliconilor (α) se calculează din diferenţa: α = σ γ . Timpul unei analize prin extracţia fracţionată alcătuieşte cca. 15 min. Metoda elaborată este pe

bună dreptate “expres”, de aceea am acceptat-o ca pe o metodă curentă de lucru.

IV.5. Influenţa diferitor factori asupra proceselor de sorbţie / desorbţie Procesele de sorbţie şi de desorbţie ale antocianilor pe cationiţi dau naşterea metodelor industriale de perspectivă de separare a acestor coloranţi în stare pură. IV.5.1. Procesul de sorbţie. A fost cercetată influenţa câtorva factori (tab.2.). Am presupus, că influenţa factorilor micşti X 1 X 2 X 3 şi X 1 X 3 este nulă, ce a permis să le înlocuim cu factorii semnificativi suplimentari. Asemenea raţionamente nu sunt valabile pentru factorul mixt X 1 X 2 , deoarece etanolul însăşi va suferi o repartizare cromatografică în timpul filtrării. La viteze mari de filtrare poate să aibă loc şi “strecurarea” solventului, adică, acesta nu va influenţa procesele de sorbţie şi de desorbţie în aceiaşi măsura, ca şi în cazul vitezelor mici. Tabelul 3. Factorii de influenţă şi valoarile lor în variabile codificate

Factor de influenţă

Cod

Min.

Centru

Max.

Viteza filtrării,

mL / min.

X

1

0.60

0.80

1.00

Concentraţia etanol, % (v)

X

2

15

20

25

Concentraţia HCl,

% (m)

X

3

0.60

1.00

1.40

Raza granulelor,

mm

X 4 = X 1 X 2 X 3 X 5 = X 1 X 3

0.18

0.27

0.36

Temperatura, °C

32

38

44

Analiza matematică a curbelor de sorbţie în coordonatele D = f(V filtrat ) a permis să apreciem: Y 1 – Sorbţia totală, mg/g ; Y 2 – Cantitatea antocianilor, necesară pentru saturaţia polimerului, mg/g ; Y 3 – Viteza relativă de sorbţie, % ; Y 4 – Capacitatea dinamică de sorbţie, mg/g. După analiza statistică se obţin ecuaţiile regresionale:

Y 1 = 38.50 8.50X 1 5.71X 2 10.37X 3 10.84X 4 +

+ 7.97X 5 + 0.27X 1 X 2 – 0.81X 2 X 3

Y 2 = 156.3 17.6X 1 10.1X 2 15.9X 3 38.0X 4 +

+ 20.3X 5 21.2X 1 X 2 13.1X 2 X 3

Y 3 = 23.70 2.43X 1 2.13X 2 3.65X 3 1.28X 4 +

+ 0.95X 5 + 2.01X 1 X 2 + 0.16X 2 X 3

b critic = 2.07;

b critic = 2.0;

b critic = 1,09;

IV.5.1.

IV.5.2.

IV.5.3.

Y 4 = 2.545 0.293X 1 0.038X 2 – 0.001X 3 – 0.004X 4 +

+ 0.010X 5 + 0.066X 1 X 2 + 0.031X 2 X 3

b critic = 0.034;

IV.5.4.

12 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Din {IV.5.1.} – {IV.5.3.} rezultă, că creşterea vitezei filtrării, concentraţiilor etanolului şi a HCl, razei granulelor polimerului, defavorizează procesul de sorbţie. Se observă, că coeficienţii b 1 –b 4 în {IV.5.2.} sunt de 2–3 ori mai mari, decât în {IV.5.1}, ce înseamnă, că creşterea valorilor factorilor de influenţă mai degrabă micşorează eficacitatea sorbţiei, decât modifică capacitatea de schimb a polimerului. De asemenea, valorile coeficienţilor b 1 –b 4 a ecuaţiei {IV.5.3.} sunt negative. În ecuaţia {IV.5.4.} viteza filtrării manifestă influenţa cea mai pronunţată. Astfel se confirmă faptul, că la viteze mari componenţii extractului se “strecoară” prin polimer. Influenţa negativă a acidului clorhidric (b 3 ) în ecuaţiile {IV.5.1–IV.5.4} dovedeşte existenţa schimbului ionic “clasic”:

R–SO 3 H + Cy + (CyGlu + ) RSO 3 Cy (CyGlu) + H + Interacţiunile solvent-antocian-polimer devin vizibile datorită influenţei semnificative a concentraţiei de etanol (X 2 ). Coeficienţii b 5 sunt pozitivi. Asemenea influenţă a temperaturii se explică prin hidroliza CyGlu până la Cy, adsorbit respectiv de cca. 4 ori mai bine, decât CyGlu. IV.5.2. Procesul de desorbţie. Experimentul separat de desorbţie poate să completeze tabelul privind cauzele şi mecanismul influenţei diferitor factori. Experimentul de desorbţie a fost efectuat conform planului de tipul EFF 72 (tab.3.). Tabelul 4. Codificarea factorilor cercetaţi în experinentul de desorbţie

Factorii de influenţă

Cod

Min. (-)

Centrul

Max. (+)

Viteza filtrării,

mL / min.

X

1

0.40

0.50

0.60

Concentraţia etanol, % (v)

X

2

40

50

60

Concentraţia HCl,

% (m)

X

3

1.00

1.25

1.50

Raza granulelor,

mm

X 4 = X 1 X 2 X 3 X 5 = X 1 X 3

0.18

0.27

0.36

Temperatura, °C

40

50

60

1.6

1.2

0.8

0.4

0.0

С, mg/mL σ γ α 0 10 20 30 40 mL
С, mg/mL
σ
γ
α
0
10
20
30
40
mL

Fig. 4. Curbele tipice de eluare

Înlocuirea factorilor micşti cu factorii noi de influenţa a fost efectuată în acelaşi fel, ca şi în experimentul de sorbţie IV.5.1., pentru a putea compara

rezultatele. Prin coloană au fost

trecute porţiuni a câte 50 mL de extractanţi cu compoziţii prestabilite (factorii X 2 şi X 3 , tab.3). În eluat au fost

determinate: concentraţia totală

a antocianilor (σ); raportul concentraţiilor α / γ. Au fost construite curbe de

desorbţie în coordonatele C(σ), C(α), C(γ) = f(V extractant ) (Figura 4). Picuri ascuţite

la V pic 1/6 din volumul total al extractantului, dovedesc eficacitatea mare a

desorbţiei. Curbele de desorbţie se apropie din ce în ce mai lent de axa absciselor,

ce dovedeşte existenţa difuziei antocianilor în faza cationitului. Analiza curbelor de

eluare permite calcularea răspunsurilor sistemului: Y 5 – Gradul de desorbţie a antocianilor din cationit, % ; Y 6 – Cantitatea totală de antociani desorbiţi, mg/g ;

13 Copyrights Alexei Baerle, 2006

Y 7 – Cantitatea desorbită de CyGlu, mg/g ; Y 8 – Cantitatea desorbită de Cy, mg/g ; Y 9 – Gradul de hidroliză a CyGlu, % ; Y 10 – Concentraţia sumară a antocianilor în maximumul curbei de eluare, mg/mL ; Y 11 – Concentraţia glucozidelor în maximumul curbei de eluare , mg/mL ; Y 12 – Concentraţia agliconilor în maximumul curbei de eluare, mg/mL . Y 5 = 63.76 + 0.77X 1 + 1.35X 2 + 1.20X 3 6.69X 4 +

+ 10.79X 5 – 0.48X 1 X 2 + 2.28X 2 X 3 .

b critic = 1.07

{IV.5.5.}

Y 6 = 23.641 + 0.272X 1 + 0.468X 2 + 0.426X 3 2.439X 4 +

+ 3.831X 5 – 0.173X 1 X 2 + 0.809X 2 X 3 .

b critic = 0.380

Y 7 = 16.440 + 1.752X 1 + 0.035X 2 + 0.544X 3 1.885X 4 +

+ 2.427X 5 – 0.137X 1 X 2 + 0.589X 2 X 3 .

Y 8 = 6.201 1.480X 1 + 0.433X 2 – 0.118X 3 0.554X 4 +

+ 1.403X 5 0.310X 1 X 2 + 0.219X 2 X 3 .

Y 9 = 27.19 6.94X 1 + 1.44X 2 – 0.02X 3 + 0.47X 4 +

b critic = 0.462

b crit. = 0.192

+ 1.91X 5 – 1.01X 1 X 2 – 0.59X 2 X 3 .

b critic = 0.94

{IV.5.6.}

{IV.5.7.}

{IV.5.8.}

{IV.5.9.}

Y 10 = 1.956 + 0.102X 1 + 0.492X 2 + 0.281X 3 0.137X 4 +

+ 0.506X 5 0.054X 1 X 2 + 0.104X 2 X 3 .

b critic = 0.033

{IV.5.10.}

Y 11 = 1.633 + 0.065X 1 + 0.379X 2 + 0.225X 3 0.176X 4 +

+ 0.391X 5 – 0.070X 1 X 2 + 0.104X 2 X 3 .

b critic = 0.077

{IV.5.11.}

Y 12 = 0.323 + 0.037X 1 + 0.113X 2 + 0.056X 3 + 0.039X 4 +

+ 0.115X 5 + 0.016X 1 X 2 + 0.000X 2 X 3 .

b critic = 0.051

{IV.5.12.}

Viteza de eluare nu afectează răspunsurile sistemului în aceeaşi măsură, ca în cadrul sorbţiei. Influenţa negativă puternică asupra procesului de desorbţie o are mărirea granulelor cationitului (X 4 ). Este remarcabil, că acest factor influenţează negativ şi procesul de sorbţie. Aşadar, cinetica globală a proceselor sorbţ