Colorarea si colorantii in biologia celulara

Coloranti si mecanismele colorarii

Colorantii sunt compusi organici, marea lor majoritate corespunzand seriei aromatice. Un colorant este un produs ce poate colora durabil o substanta sau un asamblu de substante. Pentru aceasta au nevoie de: 1.grupari atomice specifice ce confera culoarea numite cromofore 2.grupari ce permit o fixare permanenta pe substanta de colorat numite grupari auxocrome Fenomenul culoare este legat de absortia selective de catre o substanta data a unor anumite lungimi de unda din spectrul vizibil astfel incat lumina reflectata de aceasta substanta apare colorata. Compusii organic ice contin grupari cromofore sunt numiti si cromogeni. Gruparile auxocrome din punct de vedere chimic sunt, cel mai des, functii simple, fara duble legaturi, polare sau semi-polare. Principalii auxocromi: hidroxil, amino, carboxil, cian, sulfonil Gruparile chimice care nu sunt nici cromofore nici auxocrome pot intervene modificand culoarea unui colorant. Se admite existenta unui raport intre puterea de colorare a compusilor cu duble legaturi conjugate si schimbarea rapida a configuratiei moleculare. CLASIFICARE COLORANTILOR 1.Dupa origine: -naturali, de origine vegetala sau de origine animala -sintetici

2.Dupa natura auxocromilor a. coloranti acizi sau anionici Colorantii continand auxocrom anionic sunt coloranti acizi ce coloreaza componentele subcelulare incarcate pozitiv; cel mai utilizat acid este eozina ce coloreaza in roz citoplasma, b. coloranti bazici sau cationici Colorantii bazici contin auxocromi cationici coloreaza componentele subcelulare incarcate negative; cei mai utilizati fiind : tionina, violet de metal, hemalaunul. c. coloranti neutri sunt purtatori de grupari cationice si anionice De ex: eozinatul de albastru de metilen si eozinatul de azur de metilen MECANISMELE COLORARII Se realizeaza prin intermediul unor factori fizici si a unor mecanisme chimice in proportii variabile. Marea majoritate a reactiilor de colorare au insa o explicatie in special chimica: proteinele ce nu sunt extrase in cursul prelucrarilor ce preced colorarea, reprezinta substratul molecular la nivelul caruia se ataseaza colorantii. Factori fizici: 1.Penetrarea pur mecanica 2.Adsorbtia 3.Absorbtia PRINCIPALELE METODE DE COLORARE 1.Numarul colorantilor utilizati: -simple cand se foloseste un singur colorant, fie nuclear fie citoplasmatic -combinate cand sectiunile se coloreaza succesiv cu doi sau mai multi coloranti; sunt folosite pentru colorarea in mod diferential

2.Utilizarea unor adjuvanti: -directa: colorantul se fixeaza prin simplul contact -indirecta sau prin mordansare necesita prezenta unui mediator sau mordant care fixeaza colorantul 3.Intensitatea colorarii -progresiva - se fac incercari successive sub control microscopic pana se ajunge la tenta de culoare optima a structurii celulare dupa care se opreste colorarea prin spalare -regresiva se face o supracolorare care prinde si alte structure celulare decat cele dorite, dupa care, excesul de colorant, este indepartat prin substante decolorante sau diferentiatorii 4.Starea materialului -coloranta vitala -coloratia permanenta Colorarea sectiunilor la parafina a. etapa de precolorare cuprinde: 1.Deparafinarea 2.Hidratarea b. colorarea propriu-zisa c. etapa de postcolorare 1.Spalarea 2.Deshidratarea 3.Clarificarea 4.Montarea lamelei pe sectiunile colorate Mediile de montare: a. apoase b. mediile de montare miscibile cu alcoolul c. anhidre 5.Etichetarea preparatului

Tehnica colorarii cu hemalaun-eozina (HE) cea mai raspandita coloratie foloseste succesiv un colorant nuclear si un colorant citoplosmatic

Hematoxilina un compus natural, de origina vegetala formula ei C16H14O6 nu este un colorant capatand aceasta proprietate dupa oxidarea in hemateina Oxidarea hematoxilinei: prin maturare naturala expunere prelungita la aer prin maturare artificiala - tratare cu agenti oxidanti Hemateina sub forma de lacuri se numeste hemalaun. Ea permite obtinerea unei coloratii nucleare bune in albastru violet Eozina derivat de xantina si mai precis fluoresceina este sarea de sodium a derivatului tetrabromat al fluoresceinei = eozina hidrosolubila Eozina B sau albastra, derivatul dibromat al dinitrofluoresceinei este utilizata mai rar utila atunci cand este combinata cu azur A sau albastru de toluidina. Timpii acestei metode: 1. operatiunile etapei de precolorare: deparafinare, hidratare 2. colorarea propriu-zisa 3. operatiunile etapei de postcolorare: deshidratare, clarificare, montarea lamelei, etichetare Rezultate -nucleii apar coloranti in albastru violet de hemalaun -citoplasma se coloreaza in roz cu eozina

COLORATII VITALE Consideratii vitale Punctul de plecare al acestei metode a fost punerea in evidenta a anumitor tesuturi,cellule sau anumitor organite, evidentiere obtinuta prin administrarea la un animal viu, a unor coloranti bine alesi. Anumite colorantii vitale sunt utilizare in scop pur morfologic dar interesul principal al metodei rezida in explorarea permeabilitatii tisulare si celulare, in analiza fenomenelor ce se deruleaza in timpul absorbtiei, transportului de substante in organism, a acumularii si eliminarii substrantelor introduce in mediul intern in scop experimental. Nu sunt metode de rutina Ele reprezinta metode de cercerare si un procedeu de diagnostic Coloratie vitala = toate coloratiile executate pe elemente vii, obtinute administrand colorantul la animalul de experienta in intregime Coloratie post-vitala = coloratia aplicata tesuturilor sau celulelor extrase din organismul viu Clasificarea colorantilor vitali vitali acizi vitali bazici

- aceasta clasificare nu include si substantele din familia Sudan care pot fi considerate coloranti vitali ai lipidelor coloranti acizi: nu sunt coloranti in sensul propriu al cuvantului dar sunt inclusi in aceasta categorie deoarece ei sunt utilizati pentru evidentiarea elementelor histiocitare 2. coloranti bazici
1.

Etapele coloratiei vitale -absorbtia -repartitia intracelulara -acumularea elective a colorantului Patrunderea unui colorant vital in interiorul celulelor depinde de permeabilitatea normala sau modificata a plasmalemei avute in vedere ca si de capacitatea celulei de a fixa colorantul respective. Acumularea colorantului depinde de structura si compozitia chimica a celulelor si tesuturilor. Acumularea colorantului vital sub forma granulara modalitatea cea mai frecventa. Colorantii bazici se acumuleaza inainte de toate la nivelul formatiunilor preexistente, adica organite celulare sau paraplasma. Colorantii acizi se acumuleaza in granule sau vacuole care se formeaza in momentul acestei acumulari. Acumulare floculatie, intervenind si fenomene electrostatice Particularitatile fizico-chimice ale solutiilor colorantilor vitali formula de structura a colorantului vital ar avea mult mai putina importanta decat particularitatile fizico-chimice ale solutiei utilizate intervin in mod essential in determinarea caracterelor fizico-chimice a acestor solutii marimea particulelor incarcarea lor electrica pH-ul presiunea osmotica vascozitatea constanta dielectrica a mediului prezenta coloizilor si altor factori
-

Reguli generale dev aplicare ale colorantlor vitali -modul de alicare al colorantilor vitali variaza intr-o mare masura in functie de structurile ce se doresc a fi evidentiate si de functia pe care se doreste a o explora 1.Folosirea colorantilor acizi 2.Folosirea colorantiloe bazici