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ENZIMAS DE RESTRICCIN
SECUENCIAS PALINDRMICAS
EcoRI 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5
hidroliza los enlaces fosfodister que unen las bases G y A de cada hebra, de este modo los cortes que crea son escalonados y dan lugar a la formacin de fragmentos de ADN cuyos extremos tienen una corta regin monocatenaria que resultar complementaria a las de los otros fragmentos.
ENZIMAS DE RESTRICCION
Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1g de DNA en 1 hora. Se han identificado ms de 200 endonucleasas de restriccin.
http://www.neb.com/nebecomm/products/category 1.asp
ENZIMAS DE RESTRICCION
Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes: A. Cortes pegajosos, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI y Pst I. B. Cortes Romos (Desoxinucleotidil transferasa terminal).
ENZIMAS DE RESTRICCION
EXTREMOS ROMOS
Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot.
Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southerny Northern blotting. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creacin de DNA recombinante.
ENZIMAS DE RESTRICCIN
1711C>T (A486V)
2,825 l 1 l 0,1 l
HhaI 1 U 6 l
10 l
Amplificado
Volumen final
Incubacin a 37C
4 horas
P 1711C>T Electroforesis
Polimorfismo Tamao del Amplificado (bp)
Enzima de Restriccin
Genotipo
Protocol
Storage Conditions
10mM Tris-HCl (pH 7.4), 300mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol. Nocardia corallina. Buffer D. 37 C.
B
75100%
C
75100%
D
100%
MULTI-CORE
75100%
Frequency of Cutting
Ad-2
20
X174
0
pUC18
0
M13mp18
0
pBR322
0
Notes
For site-specific methylation information, consult McClelland, M., Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 364059.
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
CAMARA DE ELECTROFORESIS GEL DE AGAROSA
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS CAPILAR
EQUIPO ABI PRISM 310
ELECTROFORESIS
Tcnica en la cual una partcula cargada se hace desplazar a travs de un medio aplicando un campo elctrico.
La velocidad de migracin es funcin de la densidad de carga y sta a su vez es funcin de una serie de parmetros que marcan las condiciones experimentales como: pH, fuerza inica, voltaje, interacciones con el soporte.
La fuerza que ejerce el campo elctrico sobre la partcula cargada, es proporcional a la carga de la partcula y al voltaje del campo elctrico aplicado. F = Q X V
Otra fuerza se opone al movimiento de la partcula y es proporcional al tamao y la forma de ella y a la viscosidad del buffer. Fr = F X V Estas dos fuerzas se equilibran cuando la partcula empieza a migrar y hace que alcance una velocidad constante.
TIPOS DE SOPORTES
El procedimiento electrofortico se lleva a cabo sobre dos soportes::
1. Soportes No Restrictivos: Las partculas colocadas sobre ellos, se separan nicamente en funcin de su carga elctrica. Los principales soportes son: Papel Acetato de Celulosa Agarosa
TIPOS DE SOPORTES
2. Soportes Restrictivos:
El soporte ejerce algn tipo de resistencia al desplazamiento de las molculas de la muestra. La resistencia estar dada por el tamao del poro del soporte y por el tamao y caractersticas de las molculas que deben desplazarse sobre el soporte. Los principales tipos de soportes son: Geles de Almidn Geles de Poliacrilamida
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
AGAROSA: Es uno de los componentes del agar. Se prepara como un gel de concentracin entre 0.5 2 gr %. El tamao del poro es grande y permite el paso de molculas de peso molecular relativamente alto, por lo cual migran tan solo en funcin de su carga. Su aspecto claro y transparente facilita la cuantificacin por densitometra.
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
POLIACRILAMIDA
Se forman por polimerizacin de la acrilamida con un agente enlazante. El tamao del poro vara, segn la concentracin de la acrilamida y las molculas puedan ser separadas por diferencias en sus cargas y tamaos. Soporte ideal para obtener mayor y mejor nmero de separaciones electroforticas. Se puede leer por densitometra. Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ELECTROFORESIS CAPILAR
POLIMERO POP 4 Soporte restrictivo que permite la separacin de molculas de ADN desde un par de bases en adelante. Se deposita en un capilar de 1 mm de dimetro y este se introduce en un equipo automatizado que posee una placa de calentamiento y un laser que detecta la seal de los fluorocromos.
FLUOROCROMOS
REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS
Obtencin de la Muestra Montaje de la jeringa
Montaje de la muestra
ELECTROFEROGRAMA
LADDER ALLICO
PERFIL GENTICO