Tema 13: Transcripcin.

Flujo de informacin gentica

Replicacin

Transcripcin

Traduccin

DNA

RNA

Protenas

Retrotranscripcin

Tema 15 Transcripcin Introduccin Tipos de ARN RNA polimerasas Fases: Iniciacin Elongacin Terminacin Transcripcin en Eucariotas

Transcripcin
* Proceso de sntesis de ARN.

* Mecanismo celular por el cual la informacin gentica contenida en el ADN es transferida a una molcula de ARN.

RNA
* Macromolcula sintetizada por las RNA polimerasas por transcripcin de una secuencia de nucletidos de DNA que sirve como molde. A diferencia del DNA el RNA engloba a una familia muy heterognea.

* Formado por nucletidos unidos por enlaces fosfodiester. Presenta una composicin similar a la del DNA: Nucletidos: A, U, G y C.

* Generalmente son de cadena sencilla.

* La estructura primaria viene determinada por la secuencia de nucletidos y pueden presentar formas muy variadas de estructuras secundarias (stem-loop structures), formadas por uniones intracatenarias. Tambin han sido observadas estructuras terciarias para ciertos tRNA y rRNA.

* La estructura secundaria de las regiones de doble cadena, se asemeja a la forma A del DNA, ms que a la forma B, la cual no puede ser adoptada debido a impedimentos estricos a causa del grupo OH del C2 de la ribosa.

RNA
Tipos de RNAs en la clula eucaritica Tipos de RNAs en la clula eucaritica
RNA heterogneo nuclear (hnRNA). RNA mensajero (mRNA). RNA ribosmico (rRNA). RNA de transferencia (tRNA). RNA pequeo nuclear (snRNA): U1, U2, U4, U5, U6

RNA citoplasmtico pequeo (scRNA): 7SL RNA.

RNA
El RNA heterogneo nuclear (hnRNA).
Representa las molculas precursoras del RNAm que son transcritas directamente del DNA y que codifican para una protena determinada. Incluyen secuencias codificantes (exones) y no codificantes (intrones). Este RNA ser procesado.

El RNA mensajero (mRNA).

Representan las molculas procesadas del hnRNA que codifican para una protena determinada. Su secuencia de nucletidos es traducida en una secuencia de aminocidos en el proceso de traduccin para sintetizar una protena .

Se incluyen formas muy heterogneas tanto en tamao como en secuencia, existiendo, en general, una molcula de mRNA para cada gen o grupo de genes que vayan a expresarse

Es el menos abundante de todos los RNAs celulares. En E. Coli. Representa entre el 2 y el 5 % del total del RNA

RNA
El RNA ribosmico (rRNA):
Es el RNA ms abundante en la clula Principal componente de los ribosomas.Tienen una funcin cataltica y estructural en la sntesis de protenas.

Existen diferentes tipos en funcin de sus coeficientes de sedimentacin, asociados de forma especfica a la subunidad grande y a la subunidad pequea de los ribosomas, tanto en procariotas como en eucariotas.

16S 23S 5S

(subunidad ribosmica pequea). (subunidad ribosmica grande). (subunidad ribosmica grande).

Procariotas

18S 28S 5,8S 5S

(subunidad ribosmica pequea). (subunidad ribosmica grande). (subunidad ribosmica grande). (subunidad ribosmica grande).

Eucariotas

RNA
El RNA de transferencia (tRNA).
Es el RNA ms pequeo con unos 75 nucletidos de media.

Su funcin es transportar los aminocidos en forma activada hasta el ribosoma, durante el proceso de traduccin del mRNA.

Existe al menos un tipo de tRNA para cada uno de los 20 aminocidos. Sin embargo, algunos aminocidos tienen varios tRNAs como por ejemplo la Leu y la Arg, que pueden ser transferidos a la cadena polipeptdica por 6 tRNAs diferentes cada uno.

Todos los tRNAs presentan en su extremo 3 la secuencia de nucletidos CCA, independientemente del aminocido que transporten. El extremo 3 constituye el extremo aceptor del aminocido.

RNA
El RNA pequeo nuclear (snRNA):
Participan en el proceso de soldadura de los exones durante la formacin del mRNA. Splicesome.

Son pequeas secuencias de unos 150 nucletidos de media: U1, U2, U3, U4, U5, U6,

El RNA citoplasmtico pequeo (scRNA):

Es un RNA de unos 300 nucletidos 7SL RNA que forma parte del SRP (Signal Recognition Particle) que ejerce una funcin especfica en el envo de protenas recin sintetizadas hacia compartimentos intra- o extracelulares.

Transcripcin
* El concepto de mRNA fue introducido por Franois Jacob y Jacques Monod en 1961. Mensajero de vida muy corta entre el ncleo y el citoplasma

* Polinucletido. * Composicin reflejo de la del ADN que lo especifica. * Heterogneo en tamao. * Asociado transitoriamente con los ribosomas. * De sntesis y degradacin rpida.

Transcripcin Iniciacin: tiene lugar en secuencias promotoras

o promotores

Elongacin: polimerasa Terminacin: -independiente

-dependiente

Transcripcin en procariotas
* La enzima clave en la sntesis del ARN es la ARN polimerasa.
Descubierta por Jerard Hurwitz y Samuel Weiss independientemente

* Es una holoenzima de unos 500 kd formada por cuatro clases de subunidades *Actividad Cataltica: Ataque nucleoflico del grupo 3-hidroxilo de la cadena naciente sobre el fosforilo alpha del NTP entrante, producindose un enlace fosfodiester * Polimeriza en sentido 5-3 *Procesativa: Desde el inicio de la transcripcin no abandona el molde hasta la terminacin *No tiene actividad correctora. Tasa de error 10-4 *No necesitan cebadores. Capaces de iniciar la transcripcin

RNA polimerasa: Procariotes

Un solo tipo de RNA polimerasa para todos transcritos

Subunidad

Mr kDa 36.5

n 2

Funcin Iniciacin de la cadena. Interaccin con protenas reguladoras y promotores Iniciacin y elongacin Unin al DNA Desconocida Reconocimiento del promotor

151 155 11 70

1 1 1 1

Ensamblaje de la Partcula Central

2 2 2 = core enzyme

Prticula Central Unin al DNA de forma no especfica

70

32

vegetativa (principal )

Choque Trmico (emergencias)

Subunidad SIGMA Reconocimiento del Promotor Retirada de nitrogeno Intercambiable (emergencias)

60

Iniciacin de la Transcripcin

Transcripcin

* La polimerasa se une a secuencias especficas dentro del ADN, denominadas centros promotores. La subunidad colabora en la localizacin de la secuencia promotora

Tcnica de la huella Se utiliza para identificar y caracterizar secuencias promotoras

Footprinting

Regiones protegidas Hebra codificante Con sentido

Hebra no codificante Sin sentido Molde

Transcripcin
Centros promotores
5 Upstream

+1
3 Downstream

Secuencia -35

Secuencia -10

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin
Centros promotores
* Los promotores presentan diferentes eficacias en la iniciacin de la transcripcin.
1 transcripcin cada 2 segundos a 1 cada 10 minutos

* Los promotores ms fuertes tiene secuencias 35 y 10 que coinciden con las consensos.

* La distancia ptima entre ambas secuencias consensos es de 17 nucletidos.

Tema 13: Transcripcin.

Inicio

Transcripcin en procariotas

* La ARN polimerasa se une al ADN de manera inespecfica y busca el sitio promotor desplazndose por la molcula de ADN. * Puede detectar las secuencias 35 y 10 sin desenrollar la doble hlice. * Estas caractersticas hacen que la bsqueda del promotor sea un proceso rpido.

Tema 13: Transcripcin.

Inicio

Transcripcin en procariotas

* La ARN polimerasa produce un la separacin de la molcula de ADN en una regin situada entre 9 a +2. * En concreto cada ARN polimerasa unida desenrolla un segmento de de ADN de 17 pb.

1,6 vueltas de la hlice B-DNA

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en procariotas
* La ARN polimerasa tiene dos sitios de unin de ribonucletidos. * El sitio de iniciacin incluye preferentemente ATP o GTP. La mayora de los ARN comienzan por una purina. * El sitio de elongacin incluye el resto de ribonucletidos que sern aadidos.

* El grupo 3-OH del primer nucletido ataca al P-alfa del segundo, formndose un enlace fosfodiester. * La ARN polimerasa no necesita un cebador para iniciar la polimerizacin. * Las cadenas de ARN pueden formarse de novo.

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en procariotas
Elongacin G o A

P 5

Iniciada la transcripcin la subunidad sigma se separa del complejo DNA-RNA-Protena

Tema 13: Transcripcin.

Inhibidores de la iniciacin

Rifamicinas:

Rifamicina B y rifampicina

No son efectivas una vez iniciada la elongacin

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en procariotas
Elongacin
* Tras la polimerizacin de 6-10 nucletidos la subunidad se separa de la holoenzima.

* La burbuja de transcripcin (ARN polimerasa, ADN molde y ARN naciente), se desplaza a lo largo de la molcula de ADN.

Transcripcin en procariotas

Transcripcin en procariotas
* El ARN sintetizado se enrolla con la hebra de ADN molde formndose un hbrido ADN-ARN, de unos 8-10 nucletidos de longitud.

* La regin desenrollada del ADN y la longitud del hbrido DNA-RNA permanecen constantes mientras la ARN polimerasa avanza por el molde.

* La molcula de ADN debe de ir desenrollandose por delante de la burbuja y enrollandose por detrs. Esto lo hacen las topoisomerasas (DNA girasa).

Transcripcin en procariotas
* Para evitar que el extremo 5 del ARN se enrolle sobre sobre el ADN, justo antes de que se forme una vuelta completa la cadena de ARN se curva alejndose de la cadena de ADN.

Se enrollara

Transcripcin en procariotas
* La velocidad de sntesis del RNA es aproximadamente de unos 50 nucletidos/s. * La ARN polimerasa carece de actividad nucleasa y su tasa de error es de 104-105 bases.

Por qu tienen una tasa de error unas 105 veces superior la de la ADN Por qu tienen una tasa de error unas 105 veces superior aala de la ADN polimerasa carece de actividad correctora polimerasa yycarece de actividad correctora ??

Transcripcin en procariotas
Finalizacin
Se paraliza la formacin de enlaces fosfodisteres. Se separa el hbrido ARN-ADN. Se rebobina el ADN y se libera la ARN polimerasa.

Dnde se termina la transcripcin ?

* Existen secuencias de parada (stop signals) en el ADN. * Una de ellas consiste en una regin palindrmica rica en GC seguida de otra rica en AT.

Transcripcin en procariotas
Finalizacin

El transcrito puede formar una estructura en horquilla, seguida de una cola de poli U

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en procariotas
Finalizacin 1)

2)

Las uniones U-A (RNA-DNA) son poco estables.

3)

Se separa el hbrido y se libera la molcula de ARN.

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en procariotas
* La burbuja se vuelve a cerrar y la holoenzima sin la subunidad tiene menos afinidad por el ADN bicatenario que por el monocatenario, por lo tanto se separa del ADN.

* La holoenzima se une de nuevo al factor sigma y vuelve a buscar un nuevo promotor.

Terminacin -independiente

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en procariotas
Terminacin -dependiente
* Los ARN que presentan seales de terminacin dependientes de rho () no suelen presentar el lazo en horquilla seguido de uracilos. * El factor rho detecta seales de terminacin no detectadas por la RNA polimerasa. * El factor rho tiene una estructura hexamrica, actividad ATPasa y se une especficamente al ARN monocatenario. * Se une a una secuencia de unos 72 nucletidos (12 por subunidad) y se activa.

* Su activacin parece ser debida ms a rasgos estructurales en la molcula de ARN naciente (no existen secuencias consensos).

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en procariotas
Terminacin -dependiente

Unin de rho al ARN naciente

La actividad ATPasa le permite moverse unidireccionalmente a lo largo de la hebra de ARN

Debilita la interaccin entre el molde y el transcrito provocando su separacin, la de la enzima y la del propio factor rho

Transcripcin en eucariotas
En eucariotas la transcripcin la realizan 3 tipos de RNA polimerasas.

* RNA polimerasa I

Nucleolo

ARNr de 18S, 5,8S y 28S

* RNA polimerasa II

Nucleoplasma

Precursores del mRNA y snRNA

* RNA polimerasa III

Nucleolplasma

ARNt y ARNr de 5S

Transcripcin en eucariotas
* RNA polimerasa II * Complejo de entre 8 y 12 subunidades. * Poseen dos grandes subunidades de unos 240 y 140 kd. RPB1 () RPB2 ()

La subunidad de 240 kd posee mltiples repeticiones de la secuencia consenso en el extemo Carboxilo terminal YSPTTSPS
(27 en levaduras y 50 en mamferos)

* Son secuencias regulables por fosforilacin y participan en el reconocimiento de seales de activacin.

Transcripcin en eucariotas
Iniciacin:los genes de eucariotas, al
Regin promotora
* Destacar la presencia de la regin TATA box hacia el nucletido 25 y -100

igual que los de procariotas, precisan de promotores para iniciar la transcripcin

Secuencia consenso ms frecuente

* Presente en la mayora de los promotores de los genes eucariticos dando mRNA.

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en eucariotas
Regin promotora. Secuencias adicionales para una alta
actividad promotora
* Otras secuencias importantes entre las posiciones 40 y -110.

-110

-40

-25

CAAT

GC

TATA

Transcripcin en eucariotas
Inicio
* La ARN polimerasa II necesita de factores de transcripcin para iniciar la transcripcin (TFII). * La transcripcin comienza con la unin del factor TFIID al compartimentoTATA. * La unin se realiza a travs de la TBP (TATA Binding Protein) una subunidad del complejoTFIID. Provocando cambios conformacionales en la estructura del ADN.

TBP

ADN

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en eucariotas
Inicio
A la unin de TFIID por la subunidad TBP, le sigue la unin secuencial de otros factores de transcripcin TFIIA, TFIIB, TFIIF

RNA polimerasa II y TFIIE

Helicasa

Aparato bsico de transcripcin Aparato bsico de transcripcin

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en eucariotas
Inicio
* Existen mltiples factores de transcripcin que pueden unirse a mltiples sitios en el ADN.

Sp1

HSTF

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en Eucariotas
Inicio
* En eucariotas, adems de la regin promotora existen otras regiones intensificadoras (enhancers) que participan tambin en la iniciacin. * Las secuencias intesificadoras no tienen una localizacin precisa respecto al sitio de iniciacin. * Las secuencias intesificadoras son bidireccionales. * Pueden ejercer su efecto sobre promotores situados a miles de pares de bases de distancia. * Las secuencias intesificadoras pueden localizarse secuencia arriba, secuencia abajo o incluso en medio de un gen. * Una secuencia intensificadora suele ser efectiva en un determinado tipo de clula y no en otras (intensificador de la inmunoglobulina en linfocitos B).

Activacin de la transcripcin en eucariotas

Paso 1: DNA-binding transactivators (DBTs) se unen a las secuencias intensificadoras (enhancer sequences). Paso 2: DBTs unen a los co-activators con actividad HAT (Histona Acetil Transferasa) permitiendo la remodelacin de la cromatina. Paso 3: DBTs tambin interactan con el TFIID permitiendo que la TBP se una a la TATA box.

Paso4: Unin de la RNA pol II y formacin del complejo bsico de transcripcin Paso 5: Iniciacin de la transcripcin

=Histones =DNA-binding transactivators =Enhancers

TATA TATA

=HMG proteins
AC AC AC
TATA

AC

AC AC Inr AC

AC

HAT

AC

AC

AC

AC

TATA

AC AC AC

AC

HAT

RNA Polymerase II TATA TBP And basal TFs P P PP TFIID TFIIH Phosphorylation of C-terminal tail of RNA pol.II

Tema 13: Transcripcin.

Transcripcin en Eucariotas
Elongacin y Terminacin
* La transcripcin en eucariotas tambin suele empezar por A o G.

* La terminacin es poco conocida en eucariotas.

* En algunos transcritos existe la estructura en horquilla seguida de la secuencia de residuos de uracilo.

* La mayora de los ARN mensajeros eucariotas experimentan procesos de maduracin como la adicin de una cola de poli-A en el extremo 3y otras modificaciones.