Curs BIOSENSORI

Introducere Ce este un biosensor? Definitia unui biosensor Proiectarea si constructia biosenzorilor; Principiul de functionare Principiul detectiei *Detectia electrochimica Clasificare Componentele biosensorului Exemple de electrozi enzimatici din generatia a I-a Electrozi enzimatici din generatia a II-a Electrozi enzimatici bazati pe enzime FAD-dependente Electrozi enzimatici bazati pe enzime NAD-dependente

 Notiuni de voltametrie ciclica Electrozi chimic modificati Mediatori redox

Ce este un biosensor?

Este un detector (instrument analitic) care converteste (transforma) semnalul biochimic intr-un semnal -electric, optic, termic sau mecanic- masurabil (cuantificabil)

Analiti

Bioreceptor Traductor (catalitic fizico-chimic afinitate)

Componenta electronica

Reprezentarea schematica a unui biosenzor

Ce au in comun?
Biosensor

Analit / bioreceptor / traductor / procesor

Nas

Molecule mici / membrana olfactorie / celule nervoase / creer

Ochi

Lumina / bare si conuri / celule nervoase / creer

Principiul de constructie si functionare a unui biosenzor

Un biosensor este un instrument analitic constand dintr-un component biologic imobilizat, responsabil pentru recunoasterea selectiva a speciei de analizat, aflat in contact intim cu un traductor adecvat.

Interactie cheielacat

Analati

METABOLITI, IONI, GAZE VAPORI ORANICI

Etapa generarii semnalului BIOCOMPONENT

ENZIME, ANTICORPI ORGANITE, CELULE

Transmiterea

TRADUCTOR

semnalului

ELECTROCHIMIC, OPTIC CALORIMETRIC PIEZOELECTRIC

Amplificare si procesare

Interactia specifica de bioafinitate (ex. lacat-cheie) dintre analit de determinat si elementul de recunoastere conduce la o modificare fzico-chimica, care este detectata de traductor, masurata si procesata adecvat.

Principiul Detectiei
Masoara modificari de masa

Masoara modificari de

distributie electrica

Masoara modificari de

intensitate luminoasa

Masoara modificari de

caldura

Sa permita o masurare selectiva a analitului de determinat in cadrul unei metode care necesita un minimum de preparare a probei

Poate fi reutilizabil (prezinta un raspuns reversibil) Disposable (de unica folosinta)

CLASIFICAREA BIOSENSORILOR Functie de:

Elementul de recunoastere moleculara

Tipul traductorului

Reactiile monitorizate ex. redox hidroliza

Speciile monitorizate

Monitorizare directa a -concentratiei de analit -reactiilor in care se consuma sau se produc substrate noi

Monitorizare indirecta a Inhibitorilor sau a activatorilor elementelor de recunoastere biologica

Diferitele categorii de biosensori

TRADUCTORUL BIOMOLECULAR (asigura selectivitatea biosenzorului) Enzime Sinzime Sisteme mutienzimatice

Avantaje

Dezavantaje

Selectivitate mare

si

activitate Stabilitate limitata

Cresterea posibilitatilor de Cresterea interferentelor, imobilizare, marirea probleme legate de gamei de compusi optimizarea conditiilor detectabili de lucru Simplitatea constructiei biosenzorului, marirea gamei de compusi detectabili Varietate mare, simplitatea constructiei, posibilitati de regenerare Selectivitate mare Relative ieftini Cresterea interferentelor si a timpului de raspuns al biosenzorului Selectivitate redusa, timp mare de raspuns

Organite celulare Tesut animal sau vegetal

Microorganisme

Anticorpi monoclonali policlonali Acizi nucleici Aptameri Receptori celulari Receptori sintetici

Cost ridicat Selectivitate limitata

selectivi

instabili

TRADUCTORUL FIZICO-CHIMIC (asigura sensibilitatea biosenzorului)

Modul de masurare (marimea masurata)

Avantaje

Dezavantaje

Electrochimic

Potentiometric (potentialul)

Amperometric (curentul) Impedimetric (impedanta) Coductometric Optic/optoelectronici (absorbanta, fluorescenta, luminiscenta, unda evanescenta) Piezoelectric Termistor Conductivitatea (conductanta) Optic fibre optice

Domeniu mare de Variatie logaritmica a raspuns; raspunsului; instrumentatie selectivitate simpla limitata Posibile interferente Variatie liniara a raspunsului Pret de cost scazut neselectivi

Dimensiuni mici, Instrumentatie raspuns rapid, speciala, maresc domeniul probleme in cazul compusilor solutiilor tulburi detectabili masa Dimensiuni reduse Simpli, liniar Raspuns lent

Modificari de (frecventa)

Calorimetric/termometric (caldura/temperatura)

raspuns Neselectivi, dificultati de lucru in faza gazoasa

Magnetic

Componentele biosensorului
Bioreceptor care costa dintr-o biomolecula ex. enzime, anticorpi, acizi nucleici care recunoaste un analit specific; Traductor care converteste etapa de recunoastere intr-un semnal masurabil; Procesarea semnalului

Elementele biosensorului

1. Analit (substrat)

Tipul/natura: biologic, chimic (chiar anaorganic)

Microbi (antrax, E.coli, Candida, Salmonella)

Molecule mici (glucoza, alcool, CO, CO2, uree, pesticide, aspirina, paracetamol, penicilina, TNT, colesterol, amino acizi)

Bio-macromolecule (AND, ARN, enzime, proteine, hormoni, virusuri)

Anticorp

Acizi nucleici Receptori proteici

FAD din Gox

Selectivittate/ stabilitate
Receptori biochimici Organisme Tesuturi Cellule Organite Membrane Enzime Anticorpi Acizi nucleici Chemoreceptori

Membrana este un amestec de proteine si alte molecule imbibate in matricea fluida a dublului strat lipidic
Glicoproteine

Fluid extracelular
Glicolipide

Fosfolipide Colesterol Proteina periferica Proteine transmembranare

Citoplasma

Filamentele citoscheletului

Functiile Proteinelor Membranare

Exterior Membrana plasmatica Interior Transportor Activitate enzimatica Receptor celular de suprafata

Marker de suprafata Adeziune celulelor de identificare

Atasare de citoschelet

PROBLEME LEGATE DE TRADUCTORUL BIOCHIMIC

Stabilitate mica a biomoleculelor Pret de cost ridicat pentru enzime si receptori Necesitatea adaugarii unor compusi suplimentari (ex. Oxigenul, cofactori) Probleme legate de imobilizarea biocomponentilor Performante scazute in medii neapoase Compatibilitate scazuta relativa la tehnologia de microfabricare rezultind in dificultati legate de proiectarea multisenzorilor Dimensiunile moleculare

Biosensorul ideal
Sensibilitate mare Selectivitate mare Timp de raspuns si revenire rapid Pret de cost scazut Usor de utilizat

Dializa

Receptor

Traductor

Componenta electronica

Prima generatie

MEMBRANA SENSOR

A doua generatie

SENSOR MODIFICAT BIOCHIMIC

A treia generatie

Biochip

Generatiile de biosensori. R - receptor

Electrozi enzimatici

BIOSENSORII au fost clasificati functie de modul de transfer de electroni dintre enzima si electrod in 3 generatii

La o valoare de potential controlata aplicata la suprafata senzorului amperometric biosenzorii genereaza un semnal analtic (curent) care este corelat direct cu concentratia compusului de analizat

Domeniul optim de potential: - 200 si 0,0 mV

*curenti de baza mici, zgomot redus *nu are loc reducerea oxigenului *interferente minime datorate oxidarii acidului ascorbic acidului uric paracetamol, etc

3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004

Oxido-reductazele enzimele redox reprezinta o clasa bine cunoscuta de macromolecule chimice care sunt comercializate si folosite drept element de biorecunoastere in constructia biosenzorilor

Transfer de electroni S Enzox

-

electrod P Enz red

Ele reprezinta o provocare pentru chimistii electroanalisti acestea fiind ideal de utilizat in constructia biosenzorilor deoarece ele catalizeaza reactii de oxido-reducere ale diferitelor substrate si ar putea fi implicate in reactii cu transfer direct de electroni cu suprafata electrodului
A.Heller, Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes, J. Phys.Chem. 96 (1992) 3579-3587

Prima generatie

3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004

Electrod enzimatic

Solutie de analit

Strat bioactiv

Traductor ectrochimica

Inventator
Leland C. Clark Jr.

Electrodul de oxigen a stat la baza

Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 2, 41-48 (1956) Ann. NY Acad. Sci. 102, 29-45 (1962).

in 2005 a obtinut Premiul Fritz J. and Dolores H. Russ.Foto realizata cu aceea ocazie

constructiei unor sensori electrochimici mai inteligenti prin fixarea unei enzime

D glucoza + O 2 GOx D glucono - lactona + H2O2

Updike, S.J. and Hicks, J.P. Nature 214, 986-988 (1967)

Biosensorul pentru glucoza Detectia apei oxigenate folosind un electrod de Pt

Reactia enzimatica Glucoza Glucozoxidaza + O2 Glucolactona + H 2O2 E E H 2 O2 S

Reactia electrochimica H 2O2

E > + 0,6 V

2 H + + O2 + 2 e-

H2O2 formata difuzeaza atit in afara membranei spre solutie cit si spre suprafata unui electrod de platina unde este oxidata electrochimic
FG.G. Guilbault, G.J. Lubrano, Anal.Chim.Acta, 60 (1972) 254 FS.J. Updike, G.P. Hicks, "The Enzyme Electrode", Nature, 214, 1967

Exemple de biosensori din prima generatie METABOLIT PRODUS ELECTROACTIV Reactia Substrat + O2
ENZIMA

PRODUS ELECTROACTIV VARIATIE SEMNAL ELECTRIC Produs + H2O2

SENZOR electrochimic
Enzima

(oxidaza)

Glucoza + O2 Lactatul + O2 Urea

E1

acidul gluconic + H2O2 Piruvat + H2O2

E2

hidrolaza
ureaza

HCO3- + NH4+

BIOSENZORI CLASICI (prima generatie)

DOMENIUL CONCENTRATIILOR DE SUBSTRAT CARE POT FI DETERMINATE PRIN INTERMEDIUL DIFERITILOR SENZORI ELECTROCHIMICI

METODA
Potentiometrie Amperometrie Sensor de gaz potentiometric Sensor de gaz amperometric

SENZOR
H+, Na+, CN-, NH4+, IPt/H2O2 NH3, CO2

Dom. Conc. mol/l

10-5 10-2 10-7 10-3 10-4 10-2

Oxygen

10-5 10-4

PANCREASUL ARTIFICIAL

POMPA ANALITICA

INJECTAREA INSULINEI

ANALIZA GLUCOZEI

COMPUTER

INJECTAREA INSULINEI

0,5 C B I (nA)

0,3 A
ASIMILAREA GLUCOZEI 360 mg/dL

0,1 0 15 30 TIMP (minute)

SEMNALUL DAT DE UN SENZOR PENTRU GLUCOZA IN TIMPUL VARIATIEI DE GLUCOZA INTR-UN SOARECE ANESTEZIAT A = MASURAREA GLUCOZEI INITIALE B = MASURAREA GLUCOZEI DUPA ASIMILAREA DE GLUCOZA C = MASURAREA GLUCOZEI IN URMA INJECTARII DE INSULINA

Biosensor pentru determinarea alcoolului

El are la baza un sensor amperometric de Pt pentru H2O2 acoperit cu o membrana continind alcool-oxidaza (Aox) imobilizata si cu o membrane hidrofoba gaz permeabila, care elimina majoritatea interferentelor posibile. Alcoolul din saliva difuzeaza prin membrane gaz permeabila si reactioneaza cu enzima conform ecuatiei:

AOx

Alcool + O2 H2O2 + Acetaldehidea Aox = alcool oxidaza H2O2 produsa este masurata de sensorul amperometric si corelata cu concentratia de alcool din saliva. Alcoolul are o presiune de vapori relativ mare ceea ce duce la eliminarea interferentelor datorate compusilor nevolatili.

Etanol
ADH

Acetaldehid

NAD+

NADH + H+

ADH=alcool dehidrogenaza

Detecie la 340nm

Principiul determinarii spectrometrice a alcoolului

Concentraia de NADH crete proprorional cu cea a etanolului. NADH-ul este determinat pe baza absorbanei lui la 340nm

 exemplu reprezentativ de steroid component esential in membranele celulare animale precursor in biosinteza tuturor steroizilor, hormonilor, a vitaminei D etc. stocat in celule sub forma unui ester a acizilor grasi

Valori normale: colesterol liber- 1,29-2,07 mM colesterol total- 3,36-6,47 mM

Reactia catalizata de enzima Colesterol oxidaza (COx)

Colesterol + O2
COx

Colesterol-4-en-3-ona

+ H2O2

Reactia bioelectrochimica de detectie a colesterolului

C OXIDAZE acceptorul natural de e- O2

Dezavataje: solubilitate limitata a O2 H2O2 denatureaza enzima H2O2 poate reationa cu alte substante din solutie species
Eappl > -600mV

O2 + 2H + 4e

2OH-

C Electrodul Clark
dezavanaje: masoara scaderea semnalului
(semnal de baza mare) Supra-potential
Eappl > +600mV

H2O2

O2 + 2H+ + 2e-

C dezavantaje:

supra-potential
raspunsul electrodului nu este stabil

Prima generatie de biosensori

Oxidarea electrochimica a H2O2 la suprafata electrozilor conventionali are loc la valori de potentiale + 600 mV fata de Ag|AgCl Sistemul este supus unor reactii de interferenta Raspunsul nu este stabil in timp

Electrochimia O2 si H2O2 sufera de aplicarea unor valori mari de potentiale = suprapotentiale

I. Probleme in electrochimia proteinelor

Existenta unor viteze mici cu transfer de electroni cu sau in interiorul proteinelor (viteza transferului de electroni reprezinta
etapa limitativa de viteza).

necesara realizarea unei orientari speciale proteina-electrod

Adsorptia la suprafata electrodului

proteinele trebuie sa fie de puritate analitica

(!!) Ambele fenomene impun necesitatea modificarii suprafatei de electrod

ADSORBTIA ORIENTATA A PROTEINELOR REDOX LA SUPRAFATA ELECTRODULUI MODIFICAT CU PROMOTOR

M. J. Eddowes, H.A.O. Hill, J. Am. Chem. Soc., Chem. Commun., 771-772 (1977).

TIOLI FOLOSITI CA PROMOTORI PE Au

EFECTUL Promotorilor ASUPRA ENZIMEI Ecresterea stabilitatii operationale si pe termen lung a enzimei in pasta

Eimbunatatirea cineticii enzimatice

E produce legarea corecta a enzimei redox pe suprafata electrodului, facilitand transferul direct de electroni

L. Guo and H. A. O. Hill, Direct Electrochemistry of Proteins and Enzymes, Adv. Inorg. Chem., 36 (1991) 341- 375.

Mono-straturi auto-asamblate (SAM) folosite in orientarea-reconstructia enzimelor

+ apo-HRP + hemina (si EDC) + diaminoalcani SAM mixte

ex., Gox, GDH-PQQ

Refacerea HRP la suprafaa unui electrod de aur modificat cu grupri tiol-heminice

H. Zimmermann, A. Lindgren, W. Schuhmann, L. Gorton, Chem. Eur. J. 6 (2000) 592-599

II. Probleme in electrochimia proteinelor Difuzia lenta a proteinei

trebuie utilizati transportori de electroni redox activi (mediatori).

Reactiile cu transfer de electroni (ET) sunt deseori cuplate cu transferul de protoni

potentialele redox sunt puternic dependente de pH.

Elctrozi chimic modificati

Electrozi chimic modificati

Llimitarile metodelor electrochimice n analiza i sinteza chimica:

- pasivarea electrodului datorit adsorbiei sau depunerii pe suprafaa acestuia a unor compui chimici sau a unor precipitate nedorite; - existena unor viteze de reacie electrochimic mici pentru anumite specii chimice care n aceste condiii necesit aplicarea unui suprapotenial pentru realizarea reaciei.

ELECTROZI CHIMIC MODIFICATI (CME)

Un electrod chimic modificat poate fi definit ca reprezentnd o modificare raionala intentionat a structurii moleculare a suprafeei electrozilor convenionali n scopul utilizrii lor n cadrul unor aplicaii specifice

Electrozii chimic modificai (CMEs) se bazeaz pe fixarea unui centru redox (mediator) pe suprafaa electrodului. Acesta funcioneaz ca un mediator pentru transferul rapid de electroni Spre molecula de substrat, care in lipsa mediatorului este oxidat sau redus lent (sau deloc n unele cazuri) la suprafaa unui electrod convenional.

(Bio)compozite/Integrate electroanalitice (bio)sisteme

(Bio)sensori amperometrici bazati pe particule conductoare (bio)compozite

Electrozii chimic modificati (Chemosensori) Electrozii modificati biologic (Biosensori) R R R R Modificarea suprafetei R

R R R R R R

R R

T T

R R

R R

Modificarea in masa Bulk

Biocompozite moi/rigide

Modificatori Electrocatalizatori Enzime Anticorpi ADN

Carbon Aur Platina

S. Alegret, A. Merkoi, M.I. Pividori, and M. del Valle. Electrochemical biosensors based on rigid conducting carbonpolymer composites. Encyclopedia of Sensors, vol. 3 (2006) pp 23-44

Compozite

Medred e
-

SUBSTRATox SOLUIE

Medox SUPRAFAA ELECTRODULUI

SUBSTRATred

Mox + Mred - ne-

Sred

Sox+Mred

La elctrod
Mox

la interfaa electrod modificat/soluie

Reprezentarea schematic a unui CME si a reaciei de electrod

Reactiile chimice si electrochimice

Reactie omogena

Substrat Substrat

Produs Produs

Mediator Mediator oxidat oxidat

Reactie heterogena

Mediator Mediator redus redus

Electrod
M. Sadakane, E. Stechkhan, Chem. Rev., 98 (1998) 219.

Necesitatea unei astfel de medieri apare ori de cte ori

viteza direct a transferului de electroni este mic i

la nivelul unui electrod convenional este necesar aplicarea unui suprapotenial

Caracteristicile unui electrod chimic modificat ideal pentru aplicaii analitice: -stabilitate mecanic i chimic att ale electrodului de baz ct i ale gruprii modificatoare, precum i a legturii dintre electrod i acesta din urm;

- stabilitate n timp a activitii gruprii modificatoare fa de compusul de analizat;

- un domeniu larg de linearitate a rspunsului; - cureni de baz mici i stabili pe domeniul de potenial utilizat; - compatibilitate cu o gam larg de solveni apoi i organici;

PROPRIETATILE MEDIATORILOR FOLOSITI IN CONSTRUCTIA BIOSENSORILOR CPotentialul formal apropiat de al biomoleculei, posibil in domeniul potentialului optim Si independent de pH; Celectrochimie reversibila CReactie rapida cu enzima redox Cstoichiometrie a reactiei cu transfer de electroni bine definita (1 sau 2 electroni) CStabili atit in stare oxidata cit si in cea redusa CSa nu se autooxideze CSuficient de solubili pentru a permite un mecanism de transfer (mediatori difuzionali) sau CSolubilitate mica in mediul inconjurator (mediatori imobilizati)

P. N. Bartlett, P. Tebbutt, R. G. Whitaker, "Kinetic Aspects Of The Use Of Modified Electrodes And Mediators In Bioelectrochemistry", Progress in Reaction Kinetics, l6 (2), 1991

Ralph Buzz Adams (1924 2002) Hidrofilizarea suprafetei de electrod realizata prin pretratarea oxidativa a suprafetei CPE

Electrod PC picurator

De ce pasta de carbune? Domeniu de potential de lucru extins Valori mai scazute ale curentului de fond si ale zgomotului

Fmodificarea chimica simplu de efectuat Fieftina Fsuprafata electrodului usor reinnoibila Fposibilitatea fabricarii usoare de ultramicroelectrozi

Pasta de carbune
Structura grafitului

Nanotuburi de Carbon
-straturi cilindrice de grafit bi-dimensional formate din hexagoane de atomi de carbon

SWNT Grupari functionale chinonice care pot fi prezente pe suprafata carbonului.

MWNT

S. Iijima, Nature 354, 56 (1991) MWNT S. Iijima, T. Ichihashi, Nature 363, 603 (1993) SWNT

DIFFERITE POSIBILITATI DE SCADERE A SUPRAPOTENTIALULUI a) depunerea unor metale nobile pe suprafata Pt sau Pd/Au pe suprafata electrozilor de carbon electrozilor de carbon

Electrozi de carbon platinizati Depunere sub vid a Pd, Au pe grafit Depunerea electrochimica a Pt, Rh pe carbon

Micsoreaza potentialul cu aprox. 200-300 mV

b) Folosirea altor materiale de electrod pentru oxidarea H2O2

Ni SnO2 TiO2
F

Stabilizeaza raspunsul fata de oxidarea H2O2 Micsoreaza suprapotentialul pentru oxidare al H2O2

DIFFERITE POSIBILITATI DE SCADERE A SUPRAPOTENTIALULUI

c)Inlocuirea oxigenului O2 cu un alt acceptor de e- (mediatori); ex. FEROCENUL

d)folosirea unor electro-catalizatori ex.metalo-ftalocianinele

e) folosirea electrozilor modificati cu peroxidaza

Electrozii chimic modificati bazati pe enzime

Combina trei etape selective enzima mediatorul Potentialul aplicat

Imobilizarea atit a enzimei redox cit si a mediatorului pe/in suprafata de electrod

Adaugarea doar a substratului UN SENSOR REAGENTLESS

Voltametrie ciclic
Voltametria ciclic reprezint o tehnic electrochimic fundamental. Principial, aceasta const n msurarea curenilor de electroliz n timpul baleajului ciclic al potenialului electrodului de lucru fa de un electrod de referin nepolarizabil, care opereaz la curent nul, n timp ce curentul de electroliz se scurge spre un contra-electrod.

A. J. Bard, L. R. Faulkner, Electrochemical Methods; Fundamentals and Applications, Wiley Interscience Publications, 2000.

Celula electrochimica Cconstructie: -sticla pyrex - dimensiune variabila functie de volumul utilizat 2550 cm3 ; in cazul folosirii enzimelor volumul celulei este de 1cm3 -Orificiu barbotare gaz inert (ex. azot, argon, heliu)

Electrozi: Indicator (de lucru): metale nobile sau materiale carbonice Referinta (Ag/AgCl) Auxiliar (Pt)

Instrumentatie

(BAS inc., USA)

Masuratorile electroanalitice sunt realizate cu potetiostate controlate prin intermediul unui calculator incluzand un software adecvat.

Tehnici electroanalitice de interogare a suprafetei de electrod Voltametria ciclica informatii electroanalitice

Voltamograma ciclica redand parametrii de pic importanti

Parametrii importanti ai unei voltamograme ciclice sunt picurile de potential Ep si picurile de curenti ip.

Parametrii care caracterizeaz voltamograma ciclic a unui proces redox reversibil

separarea dintre potenialele corespunzatoare picurilor anodice si catodice (Epa - Epc) este egal cu 0,059/n (mV) pentru toate vitezele de baleaj unde n este numrul electronilor echivaleni transferai n timpul procesului redox: E=Epa-Epc=0.059/n (mV)

Prin experiente de voltametrie ciclica se poate determina valoarea potentialului formal de oxido-reducere(Ef) pentru un cuplu redox reversibil : Ef=(Epa+Epc)/2

raportul curenilor de pic (ipa/ipc) este egal cu 1 pentru toate vitezele de baleaj. ipa/ipc=1

funcia curentului de pic crete liniar cu rdcina ptrat a v (viteza de baleaj) pentru un proces limitat de difuziune;

Dependenta picurilor de curenti si de potential de viteza de baleaj poate fi redata prin graficul ip vs. (viteza de scanare)1/2 Un proces cvasi-reversibil este caracterizat de o Ep > 58/n mV, valoarea crescand cu cresterea n.

Transferul de electroni din cadrul biosensorilor Generatia a doua

Transferul mediat de electroni intre o enzima redox si un electrod (pentru o reactie de oxidare)

3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004

Cei mai folositi mediatori ferrocenul si derivatii acestuia

S P

Oxidaseox Oxidasered

Medred Medox
electrode e-

Biosensorul va opera la potentialul formal redox al mediatorului

MECHANISMUL DE REACTIE
-D-Glucoza + E-FAD (Goxox) E-FADH2 + 2Fe (Cp)2 R+ E-FADH2 + gluconic acid (Goxred) E-FAD + 2Fe (Cp)2 R + 2H+

220mV vs Ag /AgCl 2Fe (Cp)2 R 2 Fe(Cp) R+ + 2e-

Voltamograma ciclica pentru hidroxi-ferocen proces redox cu transfer de un electron conform schemei:

2Fc

FAD

glucoza

2Fc2+

FADH2

gluconolactona

volti Schema medierii in mediu omogen a reactiei de oxidare a glucoz oxidazei prin intermediul ferocenului. In figura se prezinta voltamogramele ciclice ale sistemului in prezenta unor concentratii crescatoare de glucoza. Datele au fost inregistrate la nivelul unui electrod de carbune sticlos. a) fara glucoza, b) 0,5 mmol dm-3 glucoza, c) 2,5 mmol dm-3 glucoza.

DEHIDROGENAZE NAD+-dependente
S NAD+ MEDred

NADH

MEDox

Dehidrogenazele NAD+ dependente

reprezinta unele din putinele enzime care transfera direct electronii prin intermediul moleculei de cofactor (NADH)

(!)Problema: regenerarea cofactorului in urma transferului de electroni

Realizata prin folosirea mediatorilor,fara degradarea cofactorului

MEDIATORI SELECTIVI FOLOSITI PENTRU MICSORAREA SUPRAPOTENTIALULUI DE OXIDARE A NADH-ului

O functionalitate de baza utilizata ca mediator parafenilendiimina prezinta o sarcina electrica

R- N

R R

++ prezinta viteze mari de reactie cu NAD(P)H nNu este stabila redox nGreu de imobilizat nE0'pH 7.0 = + 200 mV vs SCE este destul de mare

OXIDAREA ELECTROCHIMICA A NADH-ului LA SUPRAFATA UNUI ELECTROD CHIMIC MODIFICAT

Para-fenilendiimina

prezentand sarcina +

domeniul optim de potentiale 0 and -100 mV vs SCE ++ viteza de reactie mare cu NAD(P)H Interferente minime

Mediatorii incarcati pozitiv par a fi utili (necesari)

Ei prezinta viteze mari de reactie cu NADH Nu conduc la reactii secundare Conduc la molecule de NAD+ enzimatic active Se formeaza un complex cu transfer de sarcina intre NADH si mediator Ceea ce pare a fi o singura etapa cu transfer de H- e un proces mult mai complicat

MEDIATORI FOLOSITI PENTRU SCADEREA SUPRAPOTENTIALULUI DE OXIDARE A NADH-ului MEDIATORI ORGANICI (neselectivi) MEDIATORI SELECTIVI NOI MEDIATORI ARTIFICIALI PROTEINELE REDOX MEDIATORI NATURALI

I. MEDIATORI ORGANICI - neselectivi (structurile de baza pentru multi mediatori)

NMP+ = N-metilfenazinium

TCNQ = tetracianochinodimetanide

PARAMETERII CARE DETERMINA VITEZA DE REACTIE A MEDIATORULUI (constanta de viteza de ordinul II, k) CU ENZIMA
E0' (potentialul formal) log k ~ E0' (in acord cu teoria lui Marcus) E0' = (E0'mediator E0'enzima) natura mediatorului (acceptor de 1e- sau de 2e- (H+)) sarcina (ex. centrul activ al glucoz oxidazei este incarcat negativ) dimensiunea (mediatorul trebuie sa se potriveasca la dimensiunile si structura centrului activ)

OXIDAZELE SI DEHIDROGENAZELE CU COFACTORI LEGATI (FAD, FMN, PQQ, Cu) ambele pot utiliza mediatori care transfera 1 si 2 e- - (ne-acceptori de protoni si acceptori de protoni) = = = > transmiterea de 2 e- de la cofactorul legat redus spre mediator poate decurge sevential

Dehidrogenazele NAD(P)+ dependente (oxidarea NAD(P)H-ului) In cazul lor functioneaza numai acceptorii de 2 e- (si proton) care prezinta viteze mari de reactie = = = > ceea ce sustine ideea unei etape cu transfer a unui H- de la NAD(P)H la molecula acceptoare

PEROXIDAZELE functioneaza orice" agent reducator (donor de e-)

MEDIATORI CHIMICI UTILIZATI IN BIOELECTROCHIMIE aceptori/donori 1 evs aceptori/donori 2 e--H+

Diferente intre mediatorii acceptori/donori de 1 e- si 2 e-

acceptori/donori de 1 e-

acceptori/donori 2 e--H+

+E nu variaza cu pH-ul ionii H+ nu participa +nu exista intermediari radicalici reactie redox stabila -(!)viteze de reactie mici cu NADH -viteze de reactie moderate cu peroxidazele

-E variaza cu pH-ul participa 1-2 ioni de H+ -prezinta intermediari radicalici reactie redox instabila + viteze de reactie mari cu NADH + viteze de reactie mari cu peroxidazele

Generatia a III-a de biosensori

PEROXIDAZELE PQQ-DEHIDROGENAZELE

PEROXIDAZE
Peroxidaze din plante HRP, tutun, boabe de soia Peroxidaze din fungii Arthromyces ramosus cloroperoxidaze Peroxidaze din drojdii citocrom c peroxidaze

ENZIME CU COFACTORI micsti CHINOHEMOPROTEINE FLAVOHEMOPROTEINE

chinohemoproteine, PQQ - fructoz dehidrogenaza - alcool dehidrogenaza PQQ sau FAD
Hemul

Hemul

Microperoxidaze

Plante Bacterii Ciuperci Tesuturi animale

flavohemoproteine, FAD - flavocitocromul b2 - lactat dehidrogenaza - flavocitocromul c552 - sulfit oxidaza - celobioz dehidrogenaza

EXEMPLE DE ENZIME IMPLICATE N BIOELECTROCATALIZ

PEROXIDAZA

LACAZA

CELOBIOZ DEHIDROGENAZA

Fn 1980 Yaropolov i colab., au demonstrat capacitatea HRP de a cataliza reacia de electro-reducere H2O2

HRP H2O2 + 2H+ + 2e2H2O

POD-ale prezinta activitate catalitic oxidnd un numr mare de: polifenoli i poliamine aromatice
A.I.Yaropolov et al., Doklady Phys.Chem., 249 (1980) 1077

Peroxidazele 40 enzime
enzime din clasa oxido-reductazelor care contin feriprotoporfirina drept cofactor Cofactor hemul
-

OOC CH H2C H3C N Fe N N N

COO H2C CH2

CH3

H2C

C H H3C

CH3 C CH 2 H

Feriprotoporfirina IX

PEROXIDAZELE

40 enzime

HRP=este enzima nativa in stare ferica (Fe3+), compusul I si II=intermediari de reactie in stare oxidata, SH2 =substrat donor de electroni (sau mediatorul), SH* =radical liber care este produsul reactiei de oxidare a substratului, k1, k2 si k3=constatele de viteza ale reactiei. P+ reprezinta un radical cationic localizat pe inelul porfirinic sau pe catena polipeptidica

MECANISMUL DE RE-REDUCERE A PEROXIDAZEI (revenire la starea nativa) POATE FI REALIZAT PRIN INTERMEDIUL

ELECTROZILOR (DET) SI/SAU AL MEDIATORILOR (MET)

ks Compus I + 2e- + 2H+ HRP (Fe3+) + H2O (DET) (d)

Eappl (detectia H2O2) = 0,01 V vs. Ag/AgCl

ks, m 2 SH* + 2 e- + 2 H+
k1

2 SH2

(MET)

(e)

HRP (Fe ) + H2O2

IV +

3+

compus I (FeIV=O, P+)+ H2O

(a) (b) (c)

k2 Compus I (Fe =O, P )+ SH2 compus II (FeIV=O)+ SH* k3 Compus II (Fe =O)+ SH2 HRP (Fe3+) + SH* + H2O
IV

Ciclul reactiei bioelectrocatalitice de reducere a H2O2 catalizata de HRP si de inactivare a acesteia

H2 O2 2e-

forma nativa uzual neselectiv

compusul II 1 e-

H2 O

compusul I

compousul III (forma inactiva) exces de H2O2) selectiv Enzima schimba direct electroni cu electrodul (electrodul substituie substratele donoare de electroni din ciclul obisnuit de reactie al HRP).

E. Csoregi si colab. J. Biotechnol. 30 (1993) 315

Potentialul aplicat pentru detectia H2O2 Eappl. = 0,01 V fata de Ag/AgCl la pH = 7,0; Curenti de baza mici Oxigenul molecular nu este redus Interferente minime

Electrodul ca donor de e

1 e-

MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI

uzual neselectiv

2H+
P+ reprezinta un radical cationic localizat pe inelul porfirinic sau pe catena polipeptidica

compusul I si II=intermediari de reactie in stare oxidata,

*ELECTROCHIMIC NU SE POATE FACE DIFERENTA INTRE COMPUSUL I SI II

MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI

reactie electrochimca (b)

HO 2 2 POD nativa
k1

HO 2 ks
2e-

electrod

0,0 mV / Ag/AgCl

HO 2

reactie chimica (a)

Cmp I

2H +

experimental, observandu-se numai reactiile (a si b) redate schematic mai sus

ks = viteza transferului de electroni dintre RDE si formele oxidate ale enzimei (avand unitatile s-1).

MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI

HRP (Fe3+) + H2O2

compus I (FeIV=O, P+)+ H2O k2 IV + Compus I (Fe =O, P )+ SH2 compus II (FeIV=O)+ SH* k3 IV Compus II (Fe =O)+ SH2 HRP (Fe3+) + SH* + H2O

(a) (b) (c)

Compusi donori de electroni

NH2 OH

anilina
NH2 OH NH2 OH

fenolul
OH NH2

o-fenilendiamina
NH2

o-aminofenolul catecolul
OH OH

p- fenilendiamina

p-aminofenolul

NH2

OH

NH2

I3-

Fe(CN)64-

Mred si Mox sunt formele reduse si respectiv oxidate ale mediatorului

MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI

Mediatorul (SH2) transporta electronii intre enzima si electrod. Donorul oxidat enzimatic (SH) este redus de catre electrod.

BIOSENSORI BAZATI PE ADN PENTRU DETECTIA AGENTILOR TOXICI

In ultimii ani, acizii nucleici (ADN sau ARN) au fost din ce in ce mai utilizati

in recunoasterea si monitorizarea multor compusi de importanta analitica (poluanti, substante toxice, medicamente anticancer, secvente patogene de acizi nucleici etc.) datorita, in principal: stabilitatii mari si variabilitatii foarte mari

a secventelor de acizi nucleici.

Structura ADN-ului vADN-ul consta din:

compozitia chimica

Capat 5 terminal

4 baze azotate: Adenina (A), Guanina (G), Timina (T), si Citozina (C) Un rest de zahar (deoxiriboza) Grupare fosfat
Scheletul deoxiriboza-fosfat

Legturi de hidrogen Capat 3terminal

Capat 3terminal

G purine pirimidine

Capat 5 terminal

Baze purinice: A,G Baze pirimidinice: C, T

Structura ADN-ului: dublu helix ului (complementar)

ADN-ul prezinta o structura de elice dublu catenare cnstand din doua catene polinucleotidice care merg ele in directii opuse si care sunt mentinute impreuna prin legaturile de hidrogen dintre baze.
capatul 5

capatul 3

Dublul helix al ADN este constant datorit orientrii bazelor spre interior i a legturilor de hidrogen dintre ele

Stabilitatea ADN-ului este data de Legaturile de hidrogen dintre bazele pereche care apar la intervale regulate de-a lugul axei ADN-ului; Interactiile dintre bazele existente de-a lungul axei dublu elice Continutul, dimensiunea si ordinea bazelor; (cu cit continutul in G si C este mai mare cu atit molecula este mai stabilacresterea constantei de asociere)

Specificitatea ADN-ului este data de capacitatea nucleotidelor de a forma numai anumite perechi A-T si C-G

Structura ADN-ului: dublu helix (complementar)

Bazele sunt bine legate una deasupra alteia in asa fel incat santurile se intind pe intreaga suprafata a helixului.

Aceste caracteristici structurale, alaturi de complementaritatea perechilor de baze, au permis cercetatorilor sa realizeze o varietate de metode, de la simple la elegante pentru a determina cantitatea de ADN continuta intr-o anumita proba.

Coloranti: Bromura de etidiu Coloranti: Medicamente: Daunomicina, Adriamicina, Cloramfenicolul ,,, Medicamente: Daunomicina, Adriamicina, Poluanti: Proflavina, Antraciclina Poluanti: Proflavina, Proteine: tirozina Proteine: tirozina

Proprietati ale ADN-ului: reactia de hibridizare

ADN-ul hibridizeaz prin mperecherea bazelor azotate

Recunoasterea intre secvente complementare este dependenta de formarea unor legaturi de hidrogen stabile intre cele 2 catene.

M.I. Pividori et al., Biosensors & Bioelectronics 15 (2000) 291.

In cardrul reactiei de hibridizare legaturile de hidrogen apar la intervale regulate de lungul structurii ADN-ului, in timp ce legaturile Ag:Ac apar la nivelul unor centre specifice

Diferenta majora fata de reactia Ac-Ag unde apar interactii de tip ionic, hidrfob si de hidrogen.

TEHNOLOGIA GENOSENSORILOR ARE APLICATII

FUNDAMENTALE in INTELEGEREA BAZEI MOLECULARE A VIETII PRACTICE In MAPAREA GENETICA-ANALIZA SECVENTELOR DE GENE-la diferite organisme domeniu care contribuie la: Evidentierea mutatiilor genetice cu rol in - identificarea unor organisme modificate genetic - identificarea unor agenti patogeni (bacterii, virusuri) Elucidarea organizarii genomului uman - stabilirea unor diagnosticari prenatale - identificarea unor gene asociate unor posibile boli (de inima, cancer, etc) Elaborarea unor diagnosticari clinice timpurii si a unor terapii bazate pe modificarea genelor asociate diferitelor boli ereditare sau nu Detectia prezentei organismelor patogene/ infectioase in diferite medii (aer, apa,sol, alimente, plante, animale, tesuturi umane, etc) Modificarea genetica a diferitelor organisme Realizarea unor noi medicamente

Detectia agentilor patogeni din alimente, mediu si de interes medical Agentii patogeni responsabili pentru diferite maladii sau boli precum bacteriile si virusurile, sunt detectabili datorita secventei lor unice a ADN-ului

21 de familii de virusuri ce infecteaz oamenii infecteaz

Intr-un gram de sol se gasesc approx. 108 bacterii, numarul de specii bacteriene fiind de peste 10.000. Numarul de specii bacteriene din lume este estimat a fi mai mare ca 1000 de milioane.

Principiul care sta la baza functionarii unui Genosensor

Secveta genei tinta (cADN-ul sau ADN-ul de detectat) este indentificata prin intermediul unei gene receptoare (ssDNA) care impreuna formeaza un hibrid dublu catenar (dsDNA).

Reactia de hibridizare este Eficienta Specifica are loc in prezenta unui amestec foarte diferit de molecule de ADN necomplementare
E. Palecek, Talanta 56 (2002) 809-819

Semnalul de oxidare al bazelor din ADN

Guanina, Adenina Inozina, Adenina

Inozina este un analog electro-inactiv al guaninei, care se poate lega de citozina prin doua legaturi de hidrogen.

lead

electrod screen-printed

Adaugarea substratului enzimatic pentru

Masurarea Electrochimica

Tub magnetic

Determinarea secventelor specifice de ADN asigura baza detectiei pentru o mare varietate de infectii si boli ereditare.

In functionarea biosensorilor bazati pe ADN trebuiesc indeplinite doua criterii importante:

-Sensibilitate mare in detectia unei secvente de nucleotide -Specificitate mare: incluzind detectia unei sinure neimperechere intre baze, sau o singura mutatie a unei baze

IN PRACTICA sunt necesare metode de punere in evidenta a diferentelor dintre o gena salbatica si una mutanta, precum si a mutatiilor genetice la nivelul unei singure baze azotate.

Gena slbatic ATTCGACTGTACG TAAGCTGACATGC Tranziie (AT este nlocuit cu GC) ATTCGGCTGTACG TAAGCCGACATGC Transversie (AT este nlocuit cu TA) ATTCGTCTGTACG TAAGCAGACATGC Inserie (GC este inserat) ATTCGAGCTGTACG TAAGCTCGACATGC Deleie (AT este eliminat) A T T C G C T G T A C G T A A G C G A C A T G C

Mutatii posibile la nivelul unei singure baze azotate single point mutation

Detectia electrochimica a reactiei de hibridizare a permis identificarea a unei singure necomplementaritati la nivelul bazelor azotate

Patogeni de interes
Bacterii
Bacillus anthracis E. coli O157:H7 Salmonella Typhimurium, si S. Enteritidis Helicobacter pylori Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP)

Virusuri
Virusul viral de diaree bovina Adenovirusurile (HAdV 40/41) Virusul gripei aviare

Virusul gripal care apartine familiei orto-mixovirusurilor este o cauza majora a infectiei respiratorii. Acest virus are diferite tipuri de antigeni ca A, B si C care sunt grupati in functie de diferentele in matricea lor de proteine. Tipul A cauzeaza gripa aviara, tipurile B si C sunt cauzele epidemiilor umane.