Laborator biochimie clinic Imunologie

LP 5: Explorarea n laborator a metabolismului lipidic

Colesterol - liber (neesterificat) - esterificat Fosfolipide Trigliceride Acizi grai liberi (neesterificai)

Grup heterogen de compui chimici Insolubile n ap, solubile n solveni organici apolari (cloroform, tetraclorur de carbon, benzen) Rol - energetic (TG, AGL) - structural (fosfolipidele) - funcional (acizi biliari,hh.steroizi, prostaglandine/
leucotriene, etc)

15- 20% din masa corporal a unui adult normal conformat Sunt combinaii ale acizilor grai (AG)cu alcooli sau amine

Lipide totale
- test cu valoare orientativ Valori normale: 400-800 mg% crescute: dislipidemii primare,DZ, mixedem, sdr. nefrotic,
alcoolism cronic, pancreatit acut, boala Tangier

sczute: hipertireoz, stri careniale, infecii acute, anemii grave

Metod de determinare: fotometric

Colesterolul total
- parametru important n etiopatogenia aterosclerozei

- 2/3 sub form esterificat Valori

normale: 140-240 mg% crescute: obstrucii biliare, ciroz portal, hepatite acute, sdr. nefrotic,
pancreatit cronic, DZ, hipotireoz, hipercolesterolemie familial, dislipidemii

sczute: hepatopatii grave, uremii, stri septice, hipertireoz, boala Tangier,

anemii, macroglobulinemie Waldenstrm, analfalipoproteinemie, strii careniale Metod de determinare: fotometric/enzimatic

Colesterol liber (neeseterificat)

Valori
normale: <75 mg% crescute: obstrucii biliare, ciroz portal, colangite, pancreatit acut, hipercolesterolemie familial sczute: ca i colesterolul total

Metod de determinare: fotometric/enzimatic

Colesterol esterificat
Valori
normale: 60-100 mg% crescute: ca i colesterolul total sczute: ciroz hepatic, stri septice Metod de determinare: fotometric cuplat cu calcul matematic

Metoda enzimatic colorimetric

- determinarea cantitativ specific colesterolului total

Principiul metodei
Colesterol liber + Esteri de colesterol = Colestrol Total

Esteri colesterol + HO -->--colesterol esteraza--> colesterol liber+ acizi grai Colesterol + O >--colesterol oxidaza--> 3-colestenona + HO 2 HO + fenol + 4-aminoantipirina (AAP) >--peroxidaza(POD)--> chinonimina (rou) Incubare 5 minute la 37C (stabil 1 h) Se citete la =546 nm Es i Ep

Colesterolul total= (Ep/Es) x concentraia standardului (moli/l sau mg/dl)

Transformarea din mg/dl n mmoli/l: mmoli/l = mg/dl x 10/M colesterol , M colesterol=286

Fosfolipide

Valori normale: 160-285 mg% crescute: ciroz biliar, obstrucii biliare, sdr.nefrotic, DZ, hipercolesterolemie familial Metod de determinare: fotometric/enzimatic

Trigliceride
Valori normale: 62-120 mg% crescute: dislipidemii, pancreatit, sdr. nefrotic, microvasculite,
DZ decompensat, hipotireoz/mixedem, IMA

sczute: stri careniale, hipertireoz, lipodistrofii, anemii grave

Metod de determinare: enzimatic fotometric

Metoda enzimatic

Principiul metodei: TG lipaza--> AGL + Glicerol Glicerol + ATP-->Glicerol kinaza--> Glicerol-3-P +ADP Glicerol-3-P-->Glicerol fosfat oxidaza --> dihidroxiaceton fosfat+ HO HO+ 4-aminoantipirin + 4-cloro-fenolperoxidaz produs colorat (rou) Ep ~ concentraia TG din prob Valori -normale: <150 mg/dl - ridicate: 150-499 mg/dl - foarte ridicate: 500 mg/dl

Acizi grai liberi (AGL, neesterificai =FFA)

- substrat energetic din esuturile de depozit

- excesul transportat n plasm legat de albumin Valori normale: <20 mg% crescute (parametru de "faz acut"): vasculite, IMA, infarct pulmonar acut, pancreatit acut, pneumonii, colangite, colecistit, peritonit sczute: stri careniale Metod de determinare: enzimatic fotometric/ electroforetic

- agregate macromoleculare complexe, - solubile n ap - autoansamblarea necovalent a diverselor categorii de lipide cu proteine specifice (apoproteine-ApoA) -Rol: 1. transport moleculele de lipide de la locul de absorbie (intestinul subire) sau sintez (ficatul) la locurile de utilizare i stocare (esuturile periferice) 2. reglatori ai metabolismului lipidic

-lipoproteinele (LP cu densitate mare, HDL)

- transportorul "colesterolului bun", antiaterogen Metod: - procentaj relativ din lipidogram n gel de agaroz - determinare indirect enzimatic a colesterolului din HDL (dup blocarea selectiv a LP cu ApoB100) Valori normale brbai: 20-25% sau >35 mg% femei: 25-30% sau >45 mg% Valori patologice/sczute: - primar: boala Tangier (epurare accelerat a LP cu ApoAII) - secundar: fumtori, sedentari/obezi, femei postmenopauz, alcoolici

Pre- lipoproteinele (cu densitate foarte mic, VLDL)

- transportori de TG endogene

Metod: - procentaj relativ din lipidogram Valori normale: 5-15% Valori patologice/crescute (dislipidemiile cu hipertrigliceridemie): hepatite cronice, ciroz hepatic, sdr. nefrotic, DZ decompensat, hipotiriodie, tratamente ndelungate cu diuretice de ans, beta-blocante neselective, corticosteroizi

-lipoproteinele (cu densitate mic, LDL)

- principalul transportor de colesterol esterificat din organism, cea mai aterogen dintre LP Metod: - procentaj relativ din lipidogram - determinare direct (specific/imunologic) - determinare din calcul (formula Friedewald) cu ApoB100 Valori normale: brbai: 60-70% sau <155mg% femei: 50-70% sau <155 mg% Valori patologice/crescute (dislipidemiile cu hipercolesterolemie): hipercolesterolemia familial sau cea poligenic, hipotiroidie, afeciuni hepato-biliare, tratamente hormonale (anticonceptive, corticosteroizi)

Chilomcroni exogeni (CM)

-grsimi neutre exogene, emulsionate n plasm Metod: - electroforetic/nefelometric Valori normale: <2% din totalul LP (n condiii obinuite apar doar postprandial n ser, n condiii patologice persist) crescute: sindromul chilomicronilor (lipsa congenital a LPL sau ApoCII) , coma diabetic, DZ decompensat, ciroza hepatic decompensat

Lipoproteina X (LP-X)
- lipoprotein patologic, discoidal, coninnd lipide biliare, bogat n fosfolipide, colesterol liber i diferite apoproteine Metod: - electroforetic (migreaz catodic n gel de agaroz) - imunologic (dubla difuziune Ouchterlony) Valori: - normal absent n serul persoanelor sntoase - prezent exclusiv n serul bolnavilor cu colestaz

Lipoproteina(a)[LP(a)]
- factor de risc independent pentru boala ateroclerotic - structur identic cu LDL+Apo(a) - similitudine structural cu plasminogenul - factor de risc lipidic i trombotic Metod: electroforetic/nefelometric Valori normale: <0,3g/l

Apoproteina AI (ApoAI)

- component proteic majoritar a HDL - factor de prognostic pozitiv n ateroscleroz, mai important dect HDL Metoda: nefelometric Valori normale: brbai: 1-2 g/l femei: 1,1-2,25 g/l

Apoproteina B (ApoB) -component proteic unic a LDL

- factor de prognostic negativ n ateroscleroz, chiar mai important dect LDL Metoda: nefelometric Valori normale: brbai: 0,65-1,35 g/l femei: 0,6-1,15 g/l

Vrsta

Colesterol total (mg %)

2-19 ani 20-29 ani 30-40 ani >40 ani

120 200 220 240

Metode directe
Metoda clearence-ului
Etapa 1: tampon cu putere ionic selectiv elibereaz colesterolul din CM, LDL i VLDL i l ndeprteaz prin aciunea colesterol esterazei i colesterol oxidazei Etapa 2: HDL colesterolul eliberat de reacia cu surfactanii este apoi ndeprtat de enzime

Principiul reactiei
1. ETAPA DE CLEARANCE a. CM, LDL, VLDL b. HO 2. ETAPA DE TESTARE a. HDL b. HO + 4AAP red

Colestenona + HO HO + O

Colestenona + HO 4AAP ox + HO

a. CE/COx b. Catalaza, (2 este inhibat n a doua etap de Azida de Sodiu) b. Peroxidaza - dezvoltarea culorii (Pigment Quinonic)

Metoda de referin
- rmne beta-cuantificarea (LDL numite lipoproteine beta migrante) - n prezent nu exist un consens - ultracentrifugarea i precipitarea prea laborioase i costisitoare erori sistematice cnd nivelul TG

Ecuaia Friedewald LDL=CT-HDL-(TG/5)

CT=colesterol total TG=trigliceride

Ecuaia corect doar atunci cnd:

- nivelul TG <400mg/dl - nu sunt prezeni chilomicroni - proba nu conine beta-VLDL - necesit probe recoltate dup o perioad de post !!! Estimarea LDL n afara acestor limitri duce la subestimri semificative ale acestuia.

Metode directe
Metoda clearence-ului
Etapa1: detergeni selectivi elibereaz colesterolul din Ch, HDL i VLDL care este apoi ndeprtat de aciunea colesterol estrazei i a colesterol oxidazei Etapa2: colesterolul din LDL este eliberat de surfactani i apoi ndeprtat de enzime
!!! cea mai des utilizat metod de determinare direct a LDL

Principiul metodei directe de dozare a LDL-Colesterolului cu etapa de Clearance

Principiul reactiei
1. ETAPA DE CLEARANCE a. CM, HDL, VLDL b HO 2. ETAPA DE TESTARE a. LDL b. HO + 4AAP red

Colestenona + HO HO + O

Colestenona + HO 4AAP ox + HO

a. CE/COx b. Catalaza, (2 este inhibat n a doua etap de Azida de Sodiu) b. Peroxidaza - dezvoltarea culorii (Pigment de Quinona)

Metoda de referin Ultracentrifugarea

- probe centrifugate pn la 18 ore la 10C, 40 000 rpm - chilomicronii, VLDL, LDL plutesc la suprafaa tubului - HDL, proteinele plasmatice sedimenteaz la baza tubului - permite separarea componentelor i estimarea consecutiv a fiecrei fraiuni de colesterol !!! Nu se utilizeaz de rutin n laboratoare - timpului ndelungat de prelucrare - costuri ridicate

Metoda de referin Ultracentrifugarea

- probe centrifugate pn la 18 ore la 10C, 40 000 rpm - chilomicronii, VLDL, LDL plutesc la suprafaa tubului - HDL, proteinele plasmatice sedimenteaz la baza tubului - permite separarea componentelor i estimarea consecutiv a fiecrei fraiuni de colesterol !!! Nu se utilizeaz de rutin n laboratoare - timpului ndelungat de prelucrare - costuri ridicate

n funcie de sarcina lor electric, n cmp electric lipoproteinele vor migra, producndu-se o separare clar (n ordinea scderii mobilitii) acestora n 4 fraciuni: - alfa - pre-beta - beta lipoproteine - chilomicroni Valori normale Alfa: 23.1-54.5% pre-Beta: 10.1-35.9% Beta: 30.6-53.9% Chilomicroni: 0- 1.9%

Dislipidemiille
- stri nsoite de modificri cantitative/calitative ale lipoproteinelor

Hiperlipidemiile
- stri patologice caracterizate prin cretere concentraiei TG i/sau colesterolului peste limitele acceptate ca normale pentru vrsta, sexul i starea de sntate a persoanei

Hipercolesterolemia izolat: LDL Hipertrigliceridemia: VLDL, mai rar Chilomicroni Hiperlipidemia combinat: LDL,VLDL, mult mai rar IDL

Colesterol total Indice Aterogenic HDL colestrol

Grupul de hiperlipidemie

Lipidele serice (mg/dl) Colesterol Trigliceride

Hipercolesterolemii: de grani moderate severe Hipertrigliceridemii: moderate severe

Hiperlipidemii mixte combinate: moderate severe

200-250 mg% 250-300 mg% 300 mg%

200 mg% 200 mg% 200 mg%

200 mg% 200 mg%

200-400 mg% 400 mg%

200-300 mg% 300 mg%

200-400 mg% 400 mg%

Analiza Lp
Fenotip Chilomicr. VLDL IDL LDL

Lipidele sanguine
Colesterol Triglicerid e

I IIa IIb III IV V

+++ + ++

N N ++ +/++ ++

++ -

N ++ ++ N N

N/+ ++ ++ ++ N/+ +

+++ N ++ ++ ++ +++

 I-a etap: Colesterol total + TG II-a etap: - analiza Colesterolului din lipoproteinele serice: LDL i HDL III-a etap: - lipidograma
(determinarea proporiei fraciunilor lipoproteice)

- Diagnosticul diferenial al dislipidemiilor mixte (tipurile IIb, III i V) -Identificarea prezenei n cantitate crescut Lp(a)

Regula 2:1:1 - scderea cu

2% a LDL-colesterolului duce la scderea cu 1% a riscului de instalare a bolii coronariene i la o regresie cu 1% a leziunilor deja prezente.